Comparação de técnicas analíticas para a determinação de cálcio, magnésio e alumínio trocáveis em amostras de solos.

Comparação de métodos titulométrico e espectrofotométrico de emissão ótica por plasma indutivamente acoplado (ICP-OES) para a determinação de Ca, Mg e Al trocáveis em amostras de solos de referência, oriundas do Programa de Análise de Qualidade de Laboratórios de Fertilidade (PAQLF) que utilizam o método Embrapa. Comparação de métodos titulométrico e espectrofotométrico de emissão ótica por plasma indutivamente acoplado (ICP-OES) para a determinação de Ca, Mg e Al trocáveis em amostras de solos de referência, oriundas do Programa de Análise de Qualidade de Laboratórios de Fertilidade (PAQLF) que utilizam o método Embrapa.

Métodos de preparo de amostras e de determinação de carbono em solos tropicais.

Avaliação da eficiência de métodos de preparo de amostras e de determinação de carbono dos solos.

Técnicas de preparação de amostras para estudos de insetos com microscópio eletrônico de varredura.

2008

Pesquisa de Campylobacter fetus em amostras prepuciais de touros da região do Alentejo

A bactéria Campylobacter fetus divide-se em duas subespécies C. fetus fetus (Cff) e C. fetus venerealis (Cfv). Cfv é o agente patogénico responsável pela campilobacteriose genital bovina (CGB), uma doença que provoca infertilidade em vacas. Cff pode provocar abortos esporádicos, mas não provoca CGB. Neste trabalho procedeu-se à pesquisa de C. fetus por imunofluorescência direta (IFD) em 117 amostras prepuciais, recolhidas por raspagem, de touros pertencentes a 25 explorações na região do Alentejo. A prevalência real de CGB na amostra, considerando a sensibilidade e especificidade do teste, foi de 52,89% de animais e 80% de explorações. Foi também realizada uma comparação entre dois testes de diagnóstico de CGB, a IFD e o isolamento bacteriológico. O isolamento bacteriológico foi difícil de executar e a presença de bactérias contaminantes foi bastante problemática, levando a resultados falso-negativos. A sua correlação com a IFD foi muito baixa, tendo esta revelado ser muito mais sensível; #### Abstract Search for Campylobacter fetus in preputial samples of bulls from Alentejo region The bacteria Campylobacter fetus comprises two subspecies, C. fetus fetus (Cff) and C. fetus venerealis (Cfv). Cfv is the pathogen responsible for bovine genital campylobacteriosis (BGC), a disease that causes infertility in cows. Cff may lead to sporadic miscarriages, but does not cause BGC. In this work we searched for C. fetus by direct immunofluorescence (DIF) in 117 preputial samples, collected by scraping, from bulls from Alentejo region. The actual prevalence of BGC, considering the sensitivity and specificity of the test was 52.89% of animals and 80 % of farms. It was also performed a comparison between two BGC diagnostic tests, bacterial isolation and DIF. The bacterial isolation was difficult to perform and the presence of bacterial contaminants was very problematic, leading to false-negative results. The presence of bacterial contaminants in bacterial isolation was problematic, leading to false-negative results. Its correlation with DIF was quite low, and DIF proved to be much more sensitive.

Deteção eletroquímica da norfloxacina e trimetoprim em amostras de urina utilizando polímero molecularmente impresso modificado e grafeno

A norfloxacina e o trimetoprim são dois antibióticos antibacterianos usados para o tratamento de infeções urinárias, intestinais e respiratórias. A maioria dos fármacos exige uma dosagem que garanta os níveis de segurança e eficácia de atuação. A necessidade de dosear os medicamentos e os seus metabolitos é assim um controlo imperioso e em muitos casos regular no tratamento de um paciente. Neste trabalho desenvolveram-se dois sensores eletroquímicos para a deteção da norfloxacina (NFX) e do trimetoprim (TMP), usando como superfície de suporte o carbono vítreo. A busca de novos materiais que conferiram maior seletividade e sensibilidade aos sistemas de deteção e por outro lado apresentem menores riscos para o paciente quando usados em dispositivos que permitam uma análise point-of-care, é especialmente importante e pode ser uma parte crucial do processo de decisão clínica. Assim, os polímeros molecularmente impresos enquadram-se nesse perfil e o seu uso tem vindo a ser cada vez mais avaliado. A impressão molecular é uma tecnologia capaz de produzir polímeros que incorporam as moléculas do analito e que após remoção por solventes específicos, permitem dotá-los de locais específicos de reconhecimento estereoquímico. A seleção do pirrol como polímero molecularmente impresso (MIP) permitiu construir com sucesso os sensores para doseamento dos antibióticos. A fim de aumentar a sensibilidade do método incorporou-se grafeno na superfície do elétrodo. Este material tem vindo a ser largamente utilizado devido às suas propriedades: estrutura molecular, condutividade elétrica e aumento da superfície são algumas das características que mais despertam o interesse para a sua aplicação neste projeto. Os sensores desenvolvidos foram incorporados em sistemas eletroquímicos. Os métodos voltamétricos aplicados foram a voltametria cíclica, a voltametria de onda quadrada e ainda a impedância. As condições de análise foram otimizadas no que respeita à polimerização do pirrol (concentração do polímero, número de ciclos de eletropolimerização e respetivos potenciais aplicados, tempo de incubação, solvente de remoção do analito), ao pH da solução do fármaco, à gama de concentrações dos antibióticos e aos parâmetros voltamétricos dos métodos de análise. Para cada um dos antibióticos um elétrodo não-impresso foi também preparado, usando o procedimento de polimerização mas sem a presença da molécula do analito, e foi usado como controlo. O sensor desenvolvido para o trimetoprim foi usado no doseamento do fármaco em amostras de urina. As amostras foram analisadas sem qualquer diluição, apenas foram centrifugadas para remoção de proteínas e algum interferente. Os sensores construídos apresentaram comportamento linear na gama de concentrações entre 102 e 107 mol/L. Os resultados mostram boa precisão (desvios padrão inferiores a 11%) e os limites de deteção foram de 8,317 e 1,307 mol/L para a norfloxacina e o trimetoprim, respetivamente. Para validação do método foram ainda efetuados ensaios de recuperação tendo obtido valores superiores a 94%.

Contributo para a determinação simultânea, por cromatografia líquida de alta resolução, de carotenoides, vitamina A e vitamina E em amostras compostas por diferentes matrizes alimentares

Trabalho Final de Mestrado para obtenção do grau de Mestre em Engenharia Química e Biológica

Desenvolvimento de Métodos de Extração de Resíduos de Antimicrobianos e Quantificação em Amostras Alimentares

O leite é um alimento complexo, pela sua composição rico em água, proteínas, lípidos, vitaminas e minerais. Devido ao seu alto valor nutricional é fundamental para a amamentação de crianças e animais em crescimento, pois fornece componentes fundamentais para o desenvolvimento e manutenção da saúde. Os antimicrobianos são amplamente utilizados como uma medida terapêutica no tratamento de infeções bacterianas, profilaxia e como promotores de crescimento (aditivos). A presença de resíduos de antimicrobianos no leite pode representar riscos para a saúde humana, como reações alérgicas em indivíduos hipersensíveis e resistências. Os objetivos deste estudo são o desenvolvimento de novos métodos de limpeza e de pré-concentração para amostras de leite, por meio de extração em fase sólida (SPE), com a finalidade de realizar uma melhor identificação e quantificação de antimicrobiana por Cromatografia Líquida de Alta Performance (HPLC). Todos os métodos desenvolvidos são de fácil execução, com taxas de recuperação dos agentes antimicrobianos viáveis, com uma percentagem de recuperação a partir de 85%. O método cromatográfico utilizado para a deteção e quantificação (HPLC-DAD) têm os limites de deteção (LD) entre 2.43ng / mL e 1.62ng / mL e os limites de quantificação (LQ) entre 7,36 ng / mL e 4.92 ng / mL, o que significa este método vai de encontro às diretrizes estipuladas pela União Europeia para os agentes antimicrobianos estudados. A combinação dos métodos propostos de limpeza e pré-concentração por SPE e multirresíduo por HPLC-DAD permite, por conseguinte, a deteção e quantificação de resíduos de antibióticos no leite, tornando esta uma alternativa importante e útil no processo de controlo de qualidade para a indústria de alimentos e outras área.

Deteção de Neisseria gonorrhoeae em amostras de urina de utentes de uma consulta de venereologia

Introdução: A vigilância epidemiológica dos agentes infeciosos é fundamental como atividade de controlo das doenças sexualmente transmissíveis. A gonorreia é uma das infeções sexualmente transmissíveis (IST) mais comum e é causada pela bactéria Neisseria gonorrhoeae. Os dados sobre os diferentes microrganismos causadores de IST são escassos em Portugal e a vigilância tradicional não é suficiente. Em muitos casos de infeção por N. gonorrhoeae, os pacientes são tratados empiricamente através de uma abordagem sindromática por vezes sem recurso a análises laboratoriais que confirmem a infeção e, além disso, existem os casos assintomáticos que contribuem para a contínua propagação da infeção por N. gonorrhoeae. A gonorreia é tratável e curável mas não está disponível uma vacina. Consequentemente, o controlo desta doença depende da identificação e tratamento de indivíduos infetados e dos seus contactos na rede de transmissão. Por outro lado, quando é efetuada cultura os resultados apresentam ocasionalmente falsos negativos, devido às características exigentes de crescimento da N. gonorrhoeae in vitro ou à automedicação prévia do doente. Objetivos: Avaliar a ocorrência de infeções por Neisseria gonorrhoeae entre utentes de uma consulta de venereologia, nos primeiros seis meses de 2011. Métodos: Estudo transversal. Amostragem consecutiva, cálculo do número de amostras pela fórmula de Wald para um nível de confiança de 95% e um erro de previsão de 3,3%. Foram analisadas 145 amostras de urina utilizando técnicas de amplificação de ácidos nucleicos com alvos diferentes. A identificação de Neisseria gonorrhoeae foi efetuada pela deteção de uma sequência do pseudogene porA de N. gonorrhoeae por técnica de reação em cadeia da polimerase (PCR) em tempo real e pela deteção de uma sequência do gene ccpB de N. gonorrhoeae por técnica de PCR. Critérios de exclusão: recusa em participar ou apresentar problemas para o entendimento do consentimento livre e informado. Resultados: Foi detetada Neisseria gonorrhoeae em 8 doentes – 5,5 % de prevalência global. A prevalência entre indivíduos com infeção sexualmente transmissível prévia (n = 35) foi significativamente mais elevada (p = 0,032). Neste grupo detetou-se N. gonorrhoeae em 4 doentes (11,43 %). Em doentes com queixas de exsudado uretral (n = 29), foi detetada N. gonorrhoeae em seis (20,69 %), demonstrando que a prevalência entre os indivíduos com este sintoma é, também, significativamente mais elevada (p = 0,001). A coinfecção com Clamydia trachomatis foi observada em 1,4 % dos casos (2/145). A percentagem de casos assintomáticos foi de 12,5 % (1/8). As técnicas de PCR utilizadas neste estudo demonstraram-se igualmente especificas para a deteção de N. gonorrhoeae e ambas mais sensíveis relativamente à cultura. Neste estudo as estirpes isoladas em cultura apresentaram resistência a penicilina em 25 % dos casos, 37,5 % a tetraciclinas e 12,5 % eram produtoras de β-lactamases. Conclusões: A prevalência determinada neste estudo encontra-se superior ao esperado. Os resultados deste estudo indicam a existência de um importante problema de saúde pública e a necessidade de considerar a implementação de rastreios em grupos específicos de população. Este estudo confirma que as técnicas de PCR com os alvos porA e ccpB são satisfatórias para a deteção de Neisseria gonorrhoeae em amostras de urina. Apesar da percentagem de estirpes resistentes a tetraciclinas e penicilina ser elevada não foram demonstradas resistências a fluoroquinolonas ou cefalosporinas nas estirpes estudadas.

A microextracção em fase sólida como técnica de preparação de amostras em química analítica e toxicologia : teoria e aplicações

Amicroextracção em fase sólida, SPME, é uma técnica de adsorção/dessorção desenvolvida na Universidade de Waterloo (Ontario, Canadá) que elimina a necessidade de utilização de solventes orgânicos ou instrumentos complicados para a extracção e concentração de compostos voláteis e não voláteis a partir de amostras líquidas ou gasosas.ASPME origina resultados lineares dentro de um amplo intervalo de concentrações, é compatível com qualquer tipo de equipamento de cromatografia gasosa, com colunas de enchimento ou capilares, ou ainda cromatografia gasosa-espectrometria de massa. Pode, inclusivamente ser utilizado com injectores split/splitless ou directos. Na análise de urina, sangue ou outras matrizes biológicas, a preparação das amostras é normalmente necessário extraír e concentrar os analitos de interesse, o que é efectuado com recurso à extracção líquido-líquid, extracção em fase sólida, ou outras técnicas. Estes procedimentos apresentam várias desvantagens, onde se incluem o tempo excessivo de preparação e gasto desnecessário de solventes orgânicos. A SPME elimina a maior parte destes inconvenientes, já que é uma técnica rápida e que não necessita de solventes orgânicos ou de equipamentos complicados para ser levada a cabo. Esta técnica pode ser utilizada para monitorizar analitos em amostras líquidas ou gasosas, podendo ser acoplada à cromatografia gasosa, cromatografia gasosa-espectrometria de massa ou cromatografia líquida de alta eficiência. Embora inicialmente direccionada para a determinação de compostos orgânicos no meio ambiente, as suas vantagens nas análises clínicas, forenses e de alimentos têm vindo a ser postas em evidência. Desta forma, com este trabalho pretende-se conhecer mais aprofundadamente esta técnica bem como rever as suas principais aplicações no campo da toxicologia e da química analítica.

Avaliação da contaminação de amostras de soja com resíduos de agrotóxicos pelo método QuEChERS acetato com análise por meio de CLAE-EM/EM

O presente estudo teve por finalidade avaliar a situação atual do consumo de alimentos à base de soja disponíveis no mercado em relação à presença de resíduos de agrotóxicos. A metodologia foi validada para efetuar a determinação de 122 resíduos de pesticida na matriz soja e de 124 substâncias na matriz extrato solúvel de soja. As curvas analíticas estudadas nas duas matrizes apresentaram linearidade na faixa de trabalho analisada (0,002 a 0,200 μg.mL-1). A exatidão e a precisão em dois níveis de fortificação apresentaram valores de 70 % a 119 % de recuperação e de CV (%) de 1 a 18. O Limite de Quantificação (LQ) apresentou resultados satisfatórios (0,005 a 0,215 mg.kg-1 matriz soja e 0,006 a 0,028 mg.kg-1 matriz extrato solúvel de soja) em relação aos Limites Máximos de Resíduo (LMRs) quando existentes. Para realizar o estudo, foram selecionadas 42 amostras de soja e materiais à base de soja. As amostras foram adquiridas, no período de 2011 a 2012, em estabelecimentos comerciais na região metropolitana do Rio de Janeiro. Esta avaliação exploratória de contaminação evidenciou o uso inapropriado dos agrotóxicos ciprodinil, pirimifós-metílico, ciazofamida e butóxido de piperonila na soja e de estar em desacordo com a legislação vigente.

Análise das regiões polimórficas do gene HASPB (K26) de Leishmania infantum em amostras clínicas positivas para leishmaniose visceral e coinfecção LV/HIV

A leishmaniose visceral (LV) é uma doença grave que afeta a população de vários países, onde o Brasil apresenta a maior prevalência da infecção nas Américas. Com o estudo do gene codificante da proteína B de superfície (HASPB ou K26) de Leishmania infantum é possível identificar as variações polimórficas intraespecíficas e, assim, será possível consolidar a descrição de um perfil polimórfico presente no Estado de Pernambuco. O objetivo do trabalho foi analisar as regiões polimórficas do gene HASPB (K26) de Leishmania infantum em amostras clínicas positivas para leishmaniose visceral e coinfecção LV/HIV. O sistema K26 PCR foi otimizado utilizando concentrações variadas de DNA genômico de L. infantum. Foi realizado o screening de amostras clínicas de DNA através de dois sistemas de PCR simples, kDNA e ITS1/RFLP, para ensaios posteriores com a K26 PCR nas amostras positivas. A curva de dissociação de alta definição (qPCR-HRM) foi empregada na localização de temperaturas de melting específicas para L. infantum. Os amplicons do gene K26 foram sequenciados e alinhados as sequencias selecionadas em base de dados. A K26 PCR apresentou limiar de detecção de 1 pg para amplicon de 700 pb. A especificidade dos primers foi avaliada experimentalmente e in silico, apresentando anelamento inespecífico com DNA humano. Em paralelo, foram selecionadas 78 amostras de DNA através dos dois sistemas screening, sendo 17 caracterizadas como L. infantum. Os ensaios com DNA das amostras clínicas para o sistema K26 PCR revelaram bandas espúrias. A análise através qPCR-HRM em DNA genômico do parasita resultou em amplificação com Tm de 88,2 °C, já o ensaio com amostra clínica revelou duas amplificações com distintas temperaturas de melting, 84,6 e 88,2 °C. Três amplicons do gene K26 foram sequenciados e alinhados a cinco sequencias da base de dados, indicando 38,2 % de similaridade. Pode-se concluir que o sistema K26 PCR é recomendável para análise dos polimorfismos genéticos, contanto que o DNA seja extraído diretamente de espécies isoladas em meio de cultura.

Otimização da RT-PCR Multiplex para detecção de vírus dengue em amostras de Aedes aegypti infectados artificialmente

A dengue é a mais importante doença viral transmitida por mosquitos, no que diz respeito à morbidade e mortalidade, que afeta os seres humanos. Este vírus é transmitido pelos vetores Aedes albopictus e Aedes aegypti, este último é o principal vetor nas Américas. O controle da doença se baseia na vigilância laboratorial e vigilância entomológica. A vigilância laboratorial visa aprimorar a capacidade do diagnóstico, detectando precocemente a circulação viral e monitorando os sorotipos circulantes. Dentro deste tipo de vigilância, a RT-PCR é um método bastante usado no diagnóstico da doença em humanos e mosquitos, porém, a má conservação do material pode comprometer a integridade do RNA e trazer resultados falso-negativos. O desenvolvimento de melhores métodos de vigilância do vírus dengue (DENV) em mosquitos é de grande valor para os programas de controle. Desta maneira, o presente projeto visou otimizar a técnica de RT-PCR Multiplex para detecção de DENV em amostras de Ae. aegypti infectadas artificialmente pelo vírus. Primers que amplificam uma região de 80 pb do gene rpL8 de mosquito foram desenhados no site Primer3 e avaliados na ferramenta online Multiple Primer Analyzer, junto com primers que amplificam os sorotipos DENV. Não houve competição de primers e foi observado bandas distintas no gel de agarose. Foi avaliado o efeito de diferentes formas de preservação do material genético das amostras (RNAlater®, freezer -80°C e nitrogênio líquido) por 7 dias, onde não houve diferenças significativas em relação à integridade do RNA. O efeito de diferentes formas de extração de RNA (Kit da QIAGEN® , TRIzol® e Chomczymski-Sacchi) também foi avaliado e o método ChomczymskiSacchi obteve o melhor desempenho. A otimização desta técnica permitirá uma maior confiabilidade nos resultados, já que além da detecção dos sorotipos, haverá uma confirmação da qualidade do RNA, aprimorando a capacidade do diagnóstico e auxiliando a prevenção e controle da transmissão da dengue.

Avaliação de duas técnicas de reação em cadeia da polimerase na detecção do Mycobacterium tuberculosis em diferentes amostras biológicas

A tuberculose (TB) é uma doença infecto-contagiosa causada pelo bacilo Mycobacterium tuberculosis e que permanece como um importante problema de saúde pública mundial, sendo a TB pulmonar a forma mais comum de apresentação da doença. O diagnóstico precoce e tratamento adequado são essenciais para a eficácia dos programas públicos de controle da TB. Novos metodologias mais rápidas, sensíveis e específicas, como a reação em cadeia da polimerase (PCR), vem sendo propostas no diagnóstico da doença. O objetivo desse estudo foi avaliar o desempenho de duas PCR, a PCR em tempo real (qPCR) e a Nested PCR em único tubo (STNPCR), em diferentes amostras biológicas, no diagnóstico da tuberculose pulmonar, além de compará-las com as metodologias convencionais (baciloscopia e cultura) e entre si. Para isso foram analisados 125 pacientes que tiveram amostras de sangue (125 amostras de plasma e 116 amostras de PBMC), urina (n=125) e escarro (n=125) coletadas, totalizando a análise de 491 amostras biológicas. Amostras de escarro e urina foram descontaminadas pelo método de Petroff NAOH 4 por cento modificado e semeadas em meio de cultura Lõwenstein-Jensen (LJ), enquanto as amostras de sangue eram separadas em plasma e PBMC. Após processamento, deu-se a extração de DNA através do kit comercial da Qiagen seguida de amplificação pelas duas metodologias de PCR. Para análise estatística calculou-se a sensibilidade, especificidade, valores preditivos positivo e negativo e índice kappa das técnicas. A STNPCR apresentou, em amostras de sangue, sensibilidade de 26,3 por cento e especificidade de 97,7 por cento. Em amostras de urina observou-se uma S = 7,9 por cento e E = 98,9 por cento e em escarro S = 21,1 por cento e E = 98,9 por cento. Quando analisadas as asmotras em paralelo, a sensibilidade da STNPCR foi igual a 44,7 por cento enquanto sua especificidade foi 97,7 por cento. Já a qPCR, em amostras de sangue, obteve sensibilidade igual a 26,3 por cento e especificidade de 95,4 por cento. Em amostras de urina a sensibilidade obtida foi 47,4 por cento e a especificidade 79,3 por cento e, em escarro, S = 36,8 por cento e E = 95,4 por cento. Quando analisada em paralelo, a sensibilidade da qPCR foi 65,8 por cento e a especificidade foi 79,3 por cento. A baciloscopia de escarro apresentou sensibilidade de 41,7 por cento e especificidade de 100 por cento, enquanto as culturas em urina e escarro apresentaram sensibilidade e especificidade, respectivamente, de 10,5 por cento e 100 por cento e 60,5 por cento e 96,6 por cento. Pode-se concluir que a qPCR apresentou melhor desempenho quando comparada à STNPCR e também bom desempenho quando comparada às metodologias convencionais, e que quando analisa-se mais de um tipo de amostras biológica, a eficácia das técnicas é aumentada. Espera-se que com a utilização dessa técnica molecular, seja possível a melhor elucidação dos casos de TB pulmonar, promovendo maior taxa de tratamento dos pacientes e menor risco de transmissão da doença