Cwc24p, a novel Saccharomyces cerevisiae nuclear ring finger protein, affects pre-snoRNA U3 splicing

U3 snoRNA is transcribed from two intron-containing genes in yeast, snR17A and snR17B. Although the assembly of the U3 snoRNP has not been precisely determined, at least some of the core box C/D proteins are known to bind pre-U3 co-transcriptionally, thereby affecting splicing and 3 `-end processing of this snoRNA. We identified the interaction between the box C/D assembly factor Nop17p and Cwc24p, a novel yeast RING finger protein that had been previously isolated in a complex with the splicing factor Cef1p. Here we show that, consistent with the protein interaction data, Cwc24p localizes to the cell nucleus, and its depletion leads to the accumulation of both U3 pre-snoRNAs. U3 snoRNA is involved in the early cleavages of 35 S pre-rRNA, and the defective splicing of pre-U3 detected in cells depleted of Cwc24p causes the accumulation of the 35 S precursor rRNA. These results led us to the conclusion that Cwc 24p is involved in pre-U3 snoRNA splicing, indirectly affecting pre-rRNA processing.

Overexpression of Nrp/b (nuclear restrict protein in brain) suppresses the malignant phenotype in the C6/ST1 glioma cell line

Upon searching for glucocorticoid-regulated cDNA sequences associated with the transformed to normal phenotypic reversion of C6/ST1 rat glioma cells, we identified Nrp/b (nuclear restrict protein in brain) as a novel rat gene. Here we report on the identification and functional characterization of the complete sequence encoding the rat NRP/B protein. The cloned cDNA presented a 1767 nucleotides open-reading frame encoding a 589 aminoacids residues sequence containing a BTB/POZ (broad complex Tramtrack bric-a-brac/Pox virus and zinc finger) domain in its N-terminal region and kelch motifs in its C-terminal region. Sequence analysis indicates that the rat Nrp/b displays a high level of identity with the equivalent gene orthologs from other organisms. Among rat tissues, Nrp/b expression is more pronounced in brain tissue. We show that overexpression of the Nrp/b cDNA in C6/ST1 cells suppresses anchorage independence in vitro and tumorigenicity in vivo, altering their malignant nature towards a more benign phenotype. Therefore, Nrp/b may be postulated as a novel tumor suppressorgene, with possible relevance for glioblastoma therapy. (C) 2009 Elsevier Ltd. All rights reserved.

Sdo1p, the yeast orthologue of Shwachman-Bodian-Diamond syndrome protein, binds RNA and interacts with nuclear rRNA-processing factors

The Shwachman-Bodian-Diamond syndrome protein (SBDS) is a member of a highly conserved protein family of not well understood function, with putative orthologues found in different organisms ranging from Archaea, yeast and plants to vertebrate animals. The yeast orthologue of SBDS, Sdo1p, has been previously identified in association with the 60S ribosomal subunit and is proposed to participate in ribosomal recycling. Here we show that Sdo1p interacts with nucleolar rRNA processing factors and ribosomal proteins, indicating that it might bind the pre-60S complex and remain associated with it during processing and transport to the cytoplasm. Corroborating the protein interaction data, Sdo1p localizes to the nucleus and cytoplasm and co-immunoprecipitates precursors of 60S and 40S subunits, as well as the mature rRNAs. Sdo1p binds RNA directly, suggesting that it may associate with the ribosomal subunits also through RNA interaction. Copyright (C) 2009 John Wiley & Sons, Ltd.

Stoichiometry and thermodynamics of the interaction between the C-terminus of human 90 kDa heat shock protein Hsp90 and the mitochondrial translocase of outer membrane Tom70

A large majority of the 1000-1500 proteins in the mitochondria are encoded by the nuclear genome, and therefore, they are translated in the cytosol in the form and contain signals to enable the import of proteins into the organelle. The TOM complex is the major translocase of the outer membrane responsible for preprotein translocation. It consists of a general import pore complex and two membrane import receptors, Tom20 and Tom70. Tom70 contains a characteristic TPR domain, which is a docking site for the Hsp70 and Hsp90 chaperones. These chaperones are involved in protecting cytosolic preproteins from aggregation and then in delivering them to the TOM complex. Although highly significant, many aspects of the interaction between Tom70 and Hsp90 are still uncertain. Thus, we used biophysical tools to study the interaction between the C-terminal domain of Hsp90 (C-Hsp90), which contains the EEVD motif that binds to TPR domains, and the cytosolic fragment of Tom70. The results indicate a stoichiometry of binding of one monomer of Tom70 per dimer of C-Hsp90 with a K(D) of 360 30 nM, and the stoichiometry and thermodynamic parameters obtained suggested that Tom70 presents a different mechanism of interaction with Hsp90 when compared with other TPR proteins investigated. (C) 2011 Elsevier Inc. All rights reserved.

Nuclear magnetic resonance characterization of metabolite disorder in orange trees caused by citrus sudden death disease

Citrus sudden death (CSD) is a new disease of sweet orange and mandarin trees grafted on Rangpur lime and Citrus volkameriana rootstocks. It was first seen in Brazil in 1999, and has since been detected in more than four million trees. The CSD causal agent is unknown and the current hypothesis involves a virus similar to Citrus tristeza virus or a new virus named Citrus sudden death-associated virus. CSD symptoms include generalized foliar discoloration, defoliation and root death, and, in most cases, it can cause tree death. One of the unique characteristics of CSD disease is the presence of a yellow stain in the rootstock bark near the bud union. This region also undergoes profound anatomical changes. In this study, we analyse the metabolic disorder caused by CSD in the bark of sweet orange grafted on Rangpur lime by nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy and imaging. The imaging results show the presence of a large amount of non-functional phloem in the rootstock bark of affected plants. The spectroscopic analysis shows a high content of triacylglyceride and sucrose, which may be related to phloem blockage close to the bud union. We also propose that, without knowing the causal CSD agent, the determination of oil content in rootstock bark by low-resolution NMR can be used as a complementary method for CSD diagnosis, screening about 300 samples per hour.

Nuclear magnetic resonance water relaxation time changes in bananas during ripening: a new mechanism

BACKGROUND: Nuclear magnetic resonance studies of banana fragments during ripening show an increase on the water transverse relaxation time (T(2)) and a decrease in water self-diffusion coefficient (D). As T(2) and D are normally directly correlated, we studied these two properties in intact bananas during ripening, in an attempt to rule out the effect of injury on the apparent discrepancies in the behavior of T(2) and D. RESULTS: The results show that injury in bananas causes a decrease in T(2) of the water in vacuoles (T(2vac)). They also show that T(2vac) increased and D decreased during ripening, ruling out the injury effect. To explain the apparent discrepancies, we propose a new hypothesis for the increase in T(2) values, based on the reduction of Fe(3+) ions to Fe(2+) by galacturonic acid, produced by the hydrolysis of pectin and a decrease in internal oxygen concentration during ripening. CONCLUSION: As injury alters T(2) values it is necessary to use intact bananas to study relaxation times during ripening. The novel interpretation for the increase in T(2vac) based on reduction of Fe(+3) and O(2) concentration is an alternative mechanism to that based on the hydrolysis of starch in amyloplasts. (C) 2010 Society of Chemical Industry

Fast Acquisition of (13)C NMR Spectra using the Steady-state Free Precession Sequence

In this paper, we show that the steady-state free precession sequence can be used to acquire (13)C high-resolution nuclear magnetic resonance spectra and applied to qualitative analysis. The analysis of brucine sample using this sequence with 60 degrees flip angle and time interval between pulses equal to 300 ms (acquisition time, 299.7 ms; recycle delay, 300 ms) resulted in spectrum with twofold enhancement in signal-to-noise ratio, when compared to standard (13)C sequence. This gain was better when a much shorter time interval between pulses (100 ms) was applied. The result obtained was more than fivefold enhancement in signal-to-noise ratio, equivalent to more than 20-fold reduction in total data recording time. However, this short time interval between pulses produces a spectrum with severe phase and truncation anomalies. We demonstrated that these anomalies can be minimized by applying an appropriate apodization function and plotting the spectrum in the magnitude mode.

Novas fases amorfas de carbono produzidas por irradiação iônica de filmes de C/sub 60/, [alfa]-C e [alfa]-C:H

Neste trabalho estuda-se a formação de novas fases de carbono amorfo através da irradiação iônica de filmes de fulereno, a-C e a-C:H polimérico. Os efeitos da irradiação iônica na modificação das propriedades ópticas e mecânicas dos filmes de carbono irradiados são analisados de forma correlacionada com as alterações estruturais a nivel atômico. O estudo envolve tanto a análise dos danos induzidos no fulereno pela irradiação iônica a baixas fluências, correspondendo a baixas densidades de energia depositada, quanto a investigação das propriedades físico-químicas das fases amorfas obtidas após irradiações dos filmes de fulereno, a-C e a-C:H com altas densidades de energia depositada. As propriedades ópticas, mecânicas e estruturais das amostras são analisadas através de técnicas de espectroscopia Raman e infravermelho, espectrofotometria UV-VIS-NIR, microscopias ópticas e de força atômica, nanoindentação e técnicas de análise por feixe de íons, tais como retroespalhamento Rutherford e análises por reação nuclear. As irradiações produzem profundas modificações nas amostras de fulereno, a-C e a-C:H, e por conseqüência significativas alterações em suas propriedades ópticas e mecânicas. Após máximas fluências de irradiação fases amorfas rígidas (com dureza de 14 e 17 GPa) e com baixos gaps ópticos (0,2 e 0,5 eV) são formadas. Estas estruturas não usuais correspondem a arranjos atômicos com 90 a 100% de estados sp2. Em geral fases sp2 são planares e apresentam baixa dureza, como predito pelo modelo de “cluster”. Entretanto, os resultados experimentais mostram que as propriedades elásticas das novas fases formadas são alcançadas através da criação de uma estrutura sp2 tridimensional. A indução de altas distorções angulares, através da irradiação iônica, possibilita a formação de anéis de carbono não hexagonais, tais como pentágonos e heptágonos, permitindo assim a curvatura da estrutura. Utilizando um modelo de contagem de vínculos é feita uma análise comparativa entre a topologia (estrutura geométrica) de ligações C-sp2 e as propriedades nanomecânicas. São comparados os efeitos de estruturas sp2 planares e tridimensionais (aleatórias) no processo de contagem de vínculos e, conseqüentemente, nas propriedades elásticas de cada sistema. Os resultados mostram que as boas propriedades mecânicas das novas fases de carbono formadas seguem as predições do modelo de vínculos para uma rede atômica sp2 tridimensional. A formação de uma fase amorfa dura e 100% sp2 representa uma importante conquista na procura de novas estruturas rígidas de carbono. A síntese da estrutura desordenada sp2 tridimensional e vinculada aqui apresentada é bastante incomum na literatura. O presente trabalho mostra que o processo de não-equilíbrio de deposição de energia durante a irradiação iônica permite a formação de distorções angulares nas ligações sp2-C, possibilitando a criação de estruturas grafíticas tridimensionais.

Imunorreatividade à proteína c-FOS na medula espinal lombossacral e no gânglio da raiz dorsal de râs Rana catesbeiana 3 dias após a secção nervosa periférica

A dor constitui uma experiência complexa, mediada por distintos sistemas de transmissão sendo integrados por diversos mecanismos neurais. Um dos modelos mais empregados para o estudo da dor neuropática é a secção nervosa periférica, a qual resulta em alterações neuroquímicas e neuroanatômicas em neurônios sensoriais primários e em seus territórios de projeção. Após a secção do nervo ciático, os mamíferos apresentam um aumento na expressão de genes precocemente expressos, como o c-Fos e o c-Jun, no corno dorsal da medula espinal. Animais não mamíferos, como os anfíbios, também vem sendo utilizados como modelos para os estudos dos mecanismos acerca da nocicepção. No presente estudo foi analisado o padrão de imunorreatividade à proteína c-Fos na medula espinal lombossacral e no gânglio da raiz dorsal (GRD) de rãs Rana catesbeiana em condições basais, bem como de rãs submetidas à manipulação e à secção do nervo ciático. Para isso foram utilizados animais adultos, de ambos os sexos, sendo que os mesmos foram sacrificados 3 dias após o procedimento cirúrgico. A técnica imunoistoquímica utilizada foi a do anticorpo não marcado de Sternberger (1979), sendo utilizado anticorpo primário do tipo policlonal, na concentração de 1:700. As alterações no padrão de imunorreatividade a esta proteína no GRD dos três grupos experimentais foram quantificadas através das técnicas de densitometria óptica e contagem neuronal. Para a quantificação da proteína c-Fos na medula espinal lombossacral dos 3 grupos experimentais, utilizou-se a técnica de western blot. Em GRD, a imunorreatividade foi mais pronunciada no citoplasma de neurônios de pequeno (10-20μm), médio (25-35μm), e grande 40-50μm) diâmetro dos 3 grupos experimentais. A manipulação e a secção do nervo ciático provocou aumento no número de núcleos imunorreativos de células de pequeno diâmetro. A densitometria óptica foi significativamente maior no citoplasma das células dos GRDs localizados ipsilateralmente quando comparada com aquela das células pertencentes aos GRDs localizados contralateralmente à lesão. Todavia, não houve diferenças estatisticamente significativa entre a imunorreatividade nuclear nos GRDs entre os 3 grupos experimentais. O número de células imunorreativas nestes gânglios não mostrou mudanças significativas nos 3 grupos experimentais. Na medula espinal, a imunorreatividade à proteína c-Fos ocorreu predominantemente em núcleos localizados nos campos terminais dorsal e ventral, na banda mediolateral, na região ventral medial do corno ventral e nos funículos lateral e ventral medial. Os neurônios motores sempre foram imunorreativos. A manipulação e a secção do nervo ciático resultaram em um acréscimo no número de núcleos imunorreativos localizados nos campos terminais dorsal e ventral, e banda mediolateral, sendo este aumento maior na região do campo terminal dorsal. As demais regiões não mostraram modificações significantes no padrão de imunorreatividade da proteína c-Fos. A expressão desta proteína não modificou significativamente nos 3 grupos experimentais. Estes resultados mostram que, em rãs, similar ao que ocorre em mamíferos, a ativação de fibras aferentes primárias ativam a proteína c-Fos. No entanto, diferente de mamíferos, esta proteína ocorre no citoplasma de células sensoriais. Assim, apesar das rãs constituírem excelentes modelos para o estudo do papel do c-Fos nos mecanismos da transmissão nociceptiva, os estudos futuros abordando esta questão deverão considerar esta particularidade das rãs.

Effects of Hormonal Supplementation on Nuclear Maturation and Cortical Granules Distribution of Canine Oocytes During Various Reproductive Stages

Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP)

Aberrant expression of E-cadherin and beta-catenin proteins in placenta of bovine embryos derived from somatic cell nuclear transfer

Abnormal placental development is common in the bovine somatic cell nuclear transfer (SCNT)-derived fetus. In the present study, we characterised the expression of E-cadherin and beta-catenin, structural proteins of adherens junctions, in SCNT gestations as a model for impaired placentation. Cotyledonary tissues were separated from pregnant uteri of SCNT (n - 6) and control pregnancies (n - 8) obtained by artificial insemination. Samples were analysed by western blot, quantitative RT-PCR (qRT-PCR) and immunohistochemistry. Bovine trophectoderm cell lines derived from SCNT and control embryos were analysed to compare with the in utero condition. Although no differences in E-cadherin or beta-catenin mRNA abundance were observed in fetal tissues between the two groups, proteins encoded by these genes were markedly under-expressed in SCNT trophoblast cells. Immunohistochemistry revealed a different pattern of E-cadherin and total beta-catenin localisation in SCNT placentas compared with controls. No difference was observed in subcellular localisation of dephosphorylated active-beta-catenin protein in SCNT tissues compared with controls. However, qRT-PCR confirmed that the wingless (WNT)/beta-catenin signalling pathway target genes CCND1, CLDN1 and MSX1 were downregulated in SCNT placentas. No differences were detected between two groups of bovine trophectoderm cell lines. Our results suggest that impaired expression of E-cadherin and beta-catenin proteins, along with defective beta-catenin signalling during embryo attachment, specifically during placentation, is a molecular mechanism explaining insufficient placentation in the bovine SCNT-derived fetus.

Aplicações da tomografia de ressonância magnética nuclear como método não-destrutivo para avaliar os efeitos de injúrias mecânicas em goiabas 'Paluma' e 'Pedro Sato'

Objetivou-se determinar o potencial do uso da tomografia de ressonância magnética, como método não-destrutivo, para avaliar os efeitos das injúrias mecânicas em goiabas. Foram utilizados frutos no estádio de maturação de vez das cultivares Paluma e Pedro Sato. Na injúria por impacto, os frutos foram deixados cair, em queda livre, de uma altura de 1,20 m, sofrendo dois impactos, em lados opostos de sua porção equatorial. Na injúria por compressão, os frutos foram submetidos a um peso de 29,4 N, por 15 minutos. Para a injúria por corte, foram efetuados dois cortes, no sentido longitudinal dos frutos, de exatamente 30 mm de comprimento por 2 mm de profundidade. Os frutos injuriados foram armazenados sob condições de ambiente (22 ± 2 °C e 40 %UR). Foram realizadas análises com tomógrafo de ressonância magnética Varian Inova de 2 Tesla. As imagens foram obtidas a partir da detecção dos prótons de hidrogênio (¹H). Para cada fruto, foram obtidos tomogramas simétricos a partir do centro do fruto. A tomografia de ressonância magnética nuclear mostrou-se uma ferramenta eficaz na detecção de injúrias internas de frutos. O estresse físico causado pelo impacto produziu um colapso interno nos lóculos desses frutos (internal bruising), levando à perda da integridade celular e a conseqüente liquefação dos tecidos placentários. A cultivar Pedro Sato mostrou uma suscetibilidade maior à injúria por impacto que a 'Paluma'. A injúria por compressão tornou-se mais evidente no pericarpo externo do fruto, de ambas as cultivares. A injúria por corte levou a lignificação dos tecidos no local injuriado e deformações superficiais devido à perda acentuada de matéria fresca no local da lesão, evidentes no sexto dia de avaliação.

Distinctively variable sequence-based nuclear DNA markers for multilocus phylogeography of the soybean- and rice-infecting fungal pathogen Rhizoctonia solani AG-1 IA

Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP)

New insights into trypanosomatid U5 small nuclear ribonucleoproteins

Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP)

Presence of autoantibodies against small nuclear ribonucleoprotein epitopes in Chagas' patients' sera

We investigated the possibility that Chagas' patients develop an autoimmune response to human UsnRNPs (small nuclear ribonucleoprotein) or Sm epitopes. Using purified human UsnRNPs, we detected anti-human UsnRNPs antibodies in sera from patients suffering from Chagas' disease. The antibodies it-ere also detected using peptide enzyme-linked immunosorbent assays containing the Sm-motif 1 domain. The latter technique showed that 61% (31/51) of the Chagas' patients' sera contained antibodies against Sm-motif I. The detection of anti-UsnRNPs autoantibodies in Chagas patients' sera strongly encourages further studies using animal models to determine how these autoantibodies appear.