BC047440 antisense eukaryotic expression vectors inhibited HepG2 cell proliferation and suppressed xenograft tumorigenicity

The biological functions of the BC047440 gene highly expressed by hepatocellular carcinoma (HCC) are unknown. The objective of this study was to reconstruct antisense eukaryotic expression vectors of the gene for inhibiting HepG2 cell proliferation and suppressing their xenograft tumorigenicity. The full-length BC047440 cDNA was cloned from human primary HCC by RT-PCR. BC047440 gene fragments were ligated with pMD18-T simple vectors and subsequent pcDNA3.1(+) plasmids to construct the recombinant antisense eukaryotic vector pcDNA3.1(+)BC047440AS. The endogenous BC047440 mRNA abundance in target gene-transfected, vector-transfected and naive HepG2 cells was semiquantitatively analyzed by RT-PCR and cell proliferation was measured by the MTT assay. Cell cycle distribution and apoptosis were profiled by flow cytometry. The in vivo xenograft experiment was performed on nude mice to examine the effects of antisense vector on tumorigenicity. BC047440 cDNA fragments were reversely inserted into pcDNA3.1(+) plasmids. The antisense vector significantly reduced the endogenous BC047440 mRNA abundance by 41% in HepG2 cells and inhibited their proliferation in vitro (P < 0.01). More cells were arrested by the antisense vector at the G1 phase in an apoptosis-independent manner (P = 0.014). Additionally, transfection with pcDNA3.1(+)BC047440AS significantly reduced the xenograft tumorigenicity in nude mice. As a novel cell cycle regulator associated with HCC, the BC047440 gene was involved in cell proliferation in vitro and xenograft tumorigenicity in vivo through apoptosis-independent mechanisms.

Tetramethylpyrazine potentiates arsenic trioxide activity against HL-60 cell lines

The objective of this study was to evaluate the effects of tetramethylpyrazine (TMP) in combination with arsenic trioxide (As2O3) on the proliferation and differentiation of HL-60 cells. The HL-60 cells were treated with 300 µg/mL TMP, 0.5 µM As2O3, and 300 µg/mL TMP combined with 0.5 µM As2O3, respectively. The proliferative inhibition rates were determined with MTT. Differentiation was detected by the nitroblue tetrazolium (NBT) reduction test, Wright’s staining and the distribution of CD11b and CD14. Flow cytometry was used to analyze cell cycle distribution. RT-PCR and Western blot assays were employed to detect the expressions of c-myc, p27, CDK2, and cyclin E1. Combination treatment had synergistic effects on the proliferative inhibition rates. The rates were increased gradually after the combination treatment, much higher than those treated with the corresponding concentration of As2O3 alone. The cells exhibited characteristics of mature granulocytes and a higher NBT-reducing ability, being a 2.6-fold increase in the rate of NBT-positive ratio of HL-60 cells within the As2O3 treatment versus almost a 13-fold increase in the TMP + As2O3 group. Cells treated with both TMP and As2O3 expressed far more CD11b antigens, almost 2-fold compared with the control group. Small doses of TMP potentiate As2O3-induced differentiation of HL-60 cells, possibly by regulating the expression and activity of G0/G1 phase-arresting molecules. Combination treatment of TMP with As2O3 has significant synergistic effects on the proliferative inhibition of HL-60 cells.

p16 (INK4a) has clinicopathological and prognostic impact on oropharynx and larynx squamous cell carcinoma

CDKN2A encodes proteins such as p16 (INK4a), which negatively regulate the cell-cycle. Molecular genetic studies have revealed that deletions in CDKN2A occur frequently in cancer. Although p16 (INK4a) may be involved in tumor progression, the clinical impact and prognostic implications in head and neck squamous cell carcinoma (HNSCC) are controversial. The objective of this study was to evaluate the frequency of the immunohistochemical expression of p16 (INK4a) in 40 oropharynx and 35 larynx from HNSCC patients treated in a single institution and followed-up at least for 10 years in order to explore potential associations with clinicopathological outcomes and prognostic implications. Forty cases (53.3%) were positive for p16 (INK4a) and this expression was more intense in non-smoking patients (P = 0.050), whose tumors showed negative vascular embolization (P = 0.018), negative lymphatic permeation (P = 0.002), and clear surgical margins (P = 0.050). Importantly, on the basis of negative p16 (INK4a) expression, it was possible to predict a probability of lower survival (P = 0.055) as well as tumors presenting lymph node metastasis (P = 0.050) and capsular rupture (P = 0.0010). Furthermore, increased risk of recurrence was observed in tumors presenting capsular rupture (P = 0.0083). Taken together, the alteration in p16 (INK4a) appears to be a common event in patients with oropharynx and larynx squamous cell carcinoma and the negative expression of this protein correlated with poor prognosis.

RNAi-mediated knockdown of FANCF suppresses cell proliferation, migration, invasion, and drug resistance potential of breast cancer cells

Fanconi anemia complementation group F protein (FANCF) is a key factor, which maintains the function of FA/BRCA, a DNA damage response pathway. However, the functional role of FANCF in breast cancer has not been elucidated. We performed a specific FANCF-shRNA knockdown of endogenous FANCF in vitro. Cell viability was measured with a CCK-8 assay. DNA damage was assessed with an alkaline comet assay. Apoptosis, cell cycle, and drug accumulation were measured by flow cytometry. The expression levels of protein were determined by Western blot using specific antibodies. Based on these results, we used cell migration and invasion assays to demonstrate a crucial role for FANCF in those processes. FANCF shRNA effectively inhibited expression of FANCF. We found that proliferation of FANCF knockdown breast cancer cells (MCF-7 and MDA-MB-435S) was significantly inhibited, with cell cycle arrest in the S phase, induction of apoptosis, and DNA fragmentation. Inhibition of FANCF also resulted in decreased cell migration and invasion. In addition, FANCF knockdown enhanced sensitivity to doxorubicin in breast cancer cells. These results suggest that FANCF may be a potential target for molecular, therapeutic intervention in breast cancer.

Berberine induces apoptosis via ROS generation in PANC-1 and MIA-PaCa2 pancreatic cell lines

Pancreatic cancer is the fourth leading cause of cancer death. Gemcitabine is widely used as a chemotherapeutic agent for the treatment of pancreatic cancer, but the prognosis is still poor. Berberine, an isoquinoline alkaloid extracted from a variety of natural herbs, possesses a variety of pharmacological properties including anticancer effects. In this study, we investigated the anticancer effects of berberine and compared its use with that of gemcitabine in the pancreatic cancer cell lines PANC-1 and MIA-PaCa2. Berberine inhibited cell growth in a dose-dependent manner by inducing cell cycle arrest and apoptosis. After berberine treatment, the G1 phase of PANC-1 cells increased by 10% compared to control cells, and the G1 phase of MIA-PaCa2 cells was increased by 2%. Whereas gemcitabine exerts antiproliferation effects through S-phase arrest, our results showed that berberine inhibited proliferation by inducing G1-phase arrest. Berberine-induced apoptosis of PANC-1 and MIA-PaCa2 cells increased by 7 and 2% compared to control cells, respectively. Notably, berberine had a greater apoptotic effect in PANC-1 cells than gemcitabine. Upon treatment of PANC-1 and MIA-PaCa2 with berberine at a half-maximal inhibitory concentration (IC50), apoptosis was induced by a mechanism that involved the production of reactive oxygen species (ROS) rather than caspase 3/7 activation. Our findings showed that berberine had anti-cancer effects and may be an effective drug for pancreatic cancer chemotherapy.

Rat visceral yolk sac cells: viability and expression of cell markers during maternal diabetes

The function of the visceral yolk sac (VYS) is critical for embryo organogenesis until final fetal development in rats, and can be affected by conditions such as diabetes. In view of the importance of diabetes during pregnancy for maternal and neonatal health, the objective of this study was to assess fetal weight, VYS cell markers, and viability in female Wistar rats (200-250 g) with induced diabetes (alloxan, 37 mg/kg) on the 8th gestational day (gd 8). At gd 15, rats from control (n=5) and diabetic (n=5) groups were anesthetized and laparotomized to remove the uterine horns for weighing of fetuses and collecting the VYS. Flow cytometry was used for characterizing VYS cells, and for determining mitochondrial activity, cell proliferation, DNA ploidy, cell cycle phases, and caspase-3 activity. Fetal weight was reduced in the diabetic group. Expression of the cell markers CD34, VEGFR1, CD115, CD117, CD14, CCR2, CD90, CD44, STRO-1, OCT3/4, and Nanog was detected in VYS cells in both groups. In the diabetic group, significantly decreased expression of CD34 (P<0.05), CCR2 (P<0.001), and OCT3/4 (P<0.01), and significantly increased expression of CD90 (P<0.05), CD117 (P<0.01), and CD14 (P<0.05) were observed. VYS cells with inactive mitochondria, activated caspase-3, and low proliferation were present in the rats with diabetes. Severe hyperglycemia caused by maternal diabetes had negative effects on pregnancy, VYS cell viability, and the expression of cell markers.

Effect of estradiol and bisphenol A on human hepatoblastoma cell viability and telomerase activity

Sex hormones from environmental and physiological sources might play a major role in the pathogenesis of hepatoblastoma in children. This study investigated the effects of estradiol and bisphenol A on the proliferation and telomerase activity of human hepatoblastoma HepG2 cells. The cells were divided into 6 treatment groups: control, bisphenol A, estradiol, anti-estrogen ICI 182,780 (hereinafter ICI), bisphenol A+ICI, and estradiol+ICI. Cell proliferation was measured based on average absorbance using the Cell Counting-8 assay. The cell cycle distribution and apoptotic index were determined by flow cytometry. Telomerase activity was detected by polymerase chain reaction and a telomeric repeat amplification protocol assay. A higher cell density was observed in bisphenol A (P<0.01) and estradiol (P<0.05) groups compared with the control group. Cell numbers in S and G2/M phases after treatment for 48 h were higher (P<0.05), while the apoptotic index was lower (P<0.05) and telomerase activities at 48 and 72 h (P<0.05) were higher in these groups than in the control group. The cell density was also higher in bisphenol A+ICI (P<0.01) and estradiol+ICI (P<0.05) groups compared with the ICI group. Furthermore, cell numbers were increased in S and G2/M phases (P<0.05), while the apoptotic index was lower (P<0.05) and telomerase activities at 48 and 72 h were higher (P<0.05) in these groups than in the ICI group. Therefore, bisphenol A and estradiol promote HepG2 cell proliferation in vitro by inhibition of apoptosis and stimulation of telomerase activity via an estrogen receptor-dependent pathway.

Life without Phd? – Phd Oxygen Sensor Proteins in Hypoxic Carcinoma Cell Survival

The microenvironment within the tumor plays a central role in cellular signaling. Rapidly proliferating cancer cells need building blocks for structures as well as nutrients and oxygen for energy production. In normal tissue, the vasculature effectively transports oxygen, nutrient and waste products, and maintains physiological pH. Within a tumor however, the vasculature is rarely sufficient for the needs of tumor cells. This causes the tumor to suffer from lack of oxygen (hypoxia) and nutrients as well as acidification, as the glycolytic end product lactate is accumulated. Cancer cells harbor mutations enabling survival in the rough microenvironment. One of the best characterized mutations is the inactivation of the von Hippel-Lindau protein (pVHL) in clear cell renal cell carcinoma (ccRCC). Inactivation causes constitutive activation of hypoxia-inducible factor HIF which is an important survival factor regulating glycolysis, neovascularization and apoptosis. HIFs are normally regulated by HIF prolyl hydroxylases (PHDs), which in the presence of oxygen target HIF α-subunit to ubiquitination by pVHL and degradation by proteasomes. In my thesis work, I studied the role of PHDs in the survival of carcinoma cells in hypoxia. My work revealed an essential role of PHD1 and PHD3 in cell cycle regulation through two cyclin-dependent kinase inhibitors (CKIs) p21 and p27. Depletion of PHD1 or PHD3 caused a cell cycle arrest and subjected the carcinoma cells to stress and impaired the survival.

Analysis of HIV-1 Vpr determinants responsible for cell growth arrest in Saccharomyces cerevisiae

Affiliation: Département de microbiologie et immunologie, Faculté de médecine, Université de Montréal

Régulation dépendante du cycle cellulaire de la réparation par excision de nucléotides

La réparation par excision de nucléotides (NER) est une voie critique chez l'homme pour enlever des lésions qui déforment l’hélice d'ADN et qui bloquent à la fois la réplication et la transcription. Parmi ces lésions, il y a les dimères cyclobutyliques de pyrimidines (CPDs) et les adduits pyrimidine (6-4) pyrimidone (6-4PPs) induient par les rayons ultraviolets. L'importance physiologique de la NER est mise en évidence par l’existence de la maladie Xeroderma pigmentosum (XP), causée par des mutations affectant des gènes impliqués dans cette voie de réparation. Les personnes atteintes sont caractérisées par une photosensibilité extrême et une forte prédisposition à développer des tumeurs cutanées (plus de 1000 fois). Les patients atteints du type variant de la maladie Xeroderma pigmentosum (XPV), apparemment compétents en réparation, portent plutôt des mutations dans le gène codant pour l'ADN polymérase η (polη). Polη est une ADN polymérase translésionnelle capable de contourner avec une grande fidélité certaines lésions telles que les CPDs, qui autrement bloquent les polymérases réplicatives. Ainsi, la polη prévient la formation de mutations et permet la reprise de la synthèse d'ADN. L'objectif principal de cette thèse est d'évaluer le rôle potentiel de voies de signalisation majeures dans la régulation de la NER, dont celles régulées par la kinase ATR (Ataxia Télangiectasia and Rad3-related kinase). Suite à l'irradiation UV, ATR est rapidement activée et phosphoryle des centaines de protéines qui régulent les points de contrôle du cycle cellulaire et joue un rôle notoire dans le maintient de la stabilité génomique. Nous avons postulé qu’ATR puisse réguler la NER de manière dépendante du cycle cellulaire. Cependant, tester cette hypothèse représente un grand défi car, pour des raisons techniques, les méthodes conventionnelles n’ont pas à ce jour été adaptées pour l'évaluation de la cinétique de réparation au cours des différentes phases du cycle cellulaire. Nous avons donc développé une méthode novatrice basée sur la cytométrie en flux permettant de quantifier avec grande précision la cinétique de réparation des 6-4PPs et CPDs dans chacune des phases G0/G1, S et G2/M. Avec cette nouvelle méthode, nous avons pu démontrer que l'inhibition d'ATR ou polη résulte en une très forte inhibition de la NER exclusivement durant la phase S du cycle cellulaire. Ces études ont révélé, pour la première fois, une fonction critique pour ces protéines dans le retrait des lésions qui bloquent la réplication. En outre, nous avons démontré que la synthèse d'ADN est indispensable pour l’inhibition de la réparation en phase-S, reflétant un lien potentiel entre la NER et la réplication. Curieusement, nous avons également montré que parmi six lignées cellulaires tumorales choisies aléatoirement, trois présentent une abrogation totale de la NER uniquement pendant la phase S, ce qui indique que de nombreux cancers humains pourraient être caractérisés par un tel défaut. Nos observations pourraient avoir d'importantes implications pour le traitement du cancer. En effet, le statut de la NER semble constituer un déterminant majeur dans la réponse clinique aux médicaments chimiothérapeutiques tels que le cisplatine, qui inhibent la croissance des cellules cancéreuses via l'induction de lésions à l’ADN.

Caractérisation de Cks1, régulateur du cycle cellulaire, dans le cancer épithélial de l'ovaire

Le cancer épithélial de l’ovaire est le cancer gynécologique le plus létal. La survie à 5 ans est de 30-40% chez les patientes atteintes d’une tumeur invasive(TOV), comparativement à 95% chez les patientes diagnostiquées pour une tumeur à faible potentiel de malignité (LMP). Au laboratoire, l’analyse de l’expression des gènes de la micropuce à ADN HuFL d’Affymetrix a révélé que Cks1 est un gène dont l’expression varie entre les tumeurs LMP et TOV. En effet, ce régulateur du cycle cellulaire est surexprimé dans les tumeurs TOV par rapport aux tumeurs LMP. Nous avons donc déplété Cks1 dans des lignées cellulaires tumorales invasives du cancer de l’ovaire dérivées au laboratoire, soit la TOV112D et la TOV1946, en utilisant des shRNAs sous le contrôle d’un répresseur inductible à la tétracycline. Puis, nous avons dérivé des clones stables inductibles à la tétracycline. Les résultats obtenus nous indiquent que la déplétion de Cks1 n’a pas d’effet sur la prolifération et la migration cellulaires, ni sur la formation de structures tridimensionnelles in vitro. Ainsi, nous pouvons conclure que Cks1 ne joue pas un rôle clé dans la progression tumorale par rapport aux paramètres testés. Or, des études supplémentaires seraient nécessaires pour expliquer les différences biologiques observées entre les deux types de tumeurs étudiées, et justifier cette variation observée de l’expression de Cks1.

Manipulation of the ubiquitin-proteasome system by HIV-1 : role of the accessory protein Vpr

Le virus de l’immunodéficience humaine de type 1 (VIH-1), l’agent étiologique du SIDA, est un rétrovirus complexe arborant plusieurs protéines accessoires : Nef, Vif, Vpr, et Vpu. Celles-ci sont impliquées dans la modulation de la réplication virale, dans l’évasion immunitaire et dans la progression de la pathogenèse du SIDA. Dans ce contexte, il a été démontré que la protéine virale R (Vpr) induit un arrêt de cycle cellulaire en phase G2. Le mécanisme par lequel Vpr exerce cette fonction est l’activation, ATR (Ataxia telangiectasia and Rad3 related)-dépendante, du point de contrôle de dommage à l’ADN, mais les facteurs et mécanismes moléculaires directement impliqués dans cette activité demeurent inconnus. Afin d’identifier de nouveaux facteurs cellulaires interagissant avec Vpr, nous avons utilisé une purification d’affinité en tandem (TAP) pour isoler des complexes protéiques natifs contenant Vpr. Nous avons découvert que Vpr s’associait avec CRL4A(VprBP), un complexe cellulaire d’E3 ubiquitine ligase, comprenant les protéines Cullin 4A, DDB1 (DNA damage-binding protein 1) et VprBP (Vpr-binding protein). Nos études ont mis en évidence que le recrutement de la E3 ligase par Vpr était nécessaire mais non suffisant pour l’induction de l’arrêt de cycle cellulaire en G2, suggérant ainsi que des événements additionnels seraient impliqués dans ce processus. À cet égard, nous apportons des preuves directes que Vpr détourne les fonctions de CRL4A(VprBP) pour induire la polyubiquitination de type K48 et la dégradation protéosomale de protéines cellulaires encore inconnues. Ces événements d’ubiquitination induits par Vpr ont été démontrés comme étant nécessaire à l’activation d’ATR. Finalement, nous montrons que Vpr forme des foyers ancrés à la chromatine co-localisant avec VprBP ainsi qu’avec des facteurs impliqués dans la réparation de l’ADN. La formation de ces foyers représente un événement essentiel et précoce dans l’induction de l’arrêt de cycle cellulaire en G2. Enfin, nous démontrons que Vpr est capable de recruter CRL4A(VprBP) au niveau de la chromatine et nous apportons des preuves indiquant que le substrat inconnu ciblé par Vpr est une protéine associée à la chromatine. Globalement, nos résultats révèlent certains des ménanismes par lesquels Vpr induit des perturbations du cycle cellulaire. En outre, cette étude contribue à notre compréhension de la modulation du système ubiquitine-protéasome par le VIH-1 et son implication fonctionnelle dans la manipulation de l’environnement cellulaire de l’hôte.

Régulation du cycle cellulaire par le récepteur natriurétique de type C dans les cellules du muscle lisse vasculaire : mécanismes moléculaires

Nous avons précédemment montré que l’activation du récepteur natriurétique de type C (NPR-C) par son agoniste spécifique, le C-ANP4-23, atténue l’augmentation de la prolifération des cellules du muscle lisse vasculaire (CMLV) induite par les peptides vasoactifs (Ang II, ET-1 et l’AVP). Puisque les CMLV provenant de rats spontanément hypertendus (SHR) montrent elles aussi un taux de prolifération plus élevé que leur contrôle, les CMLV de rats Wystar-Kyoto (WKY), nous avons entrepris cette étude dans le but de déterminer si C-ANP4-23 peut également diminuer le taux élevé de prolifération des CMLV de SHR et, le cas échéant déterminer les mécanismes responsables de cette réponse. Nos résultats montrent que le taux de prolifération des CMLV de SHR est significativement plus élevé que celui des CMLV de WKY et que la présence de C-ANP4-23 diminue de manière-dose dépendante le taux de prolifération des CMLV de SHR. En plus, l’expression des protéines de la phase G1 du cycle cellulaire, la cycline D1, la kinase dépendante des cyclines 2 (cdk2) et la forme phosphorylée de la protéine du rétinoblastome (pRb) est augmentée dans les CMLV de SHR comparativement aux CMLV de WKY et est atténué par C-ANP4-23. De plus, nos résultats montrent que les inhibiteurs du complexe cycline D1/cdk4 (NSC 625987) et cdk2 (NU2058) diminue le taux de prolifération élevé des CMLV de SHR. Les CMLV de SHR montrent également un taux de phosphorylation de ERK1/2 et d’AKT et est atténué par C-ANP4-23. De plus, le taux d’expression élevé des protéines cycline D1, cdk2 et pRb des CMLV de SHR est diminué par la toxine pertussis qui inactive la protéine Giα, le PD 98095, un inhibiteur de MEK de la voie des MAPK, du wortmannin, un inhibiteur de la PI3-K et finalement du losartan, un antagoniste du récepteur AT1. Ces résultats suggèrent que l’activation du récepteur NPR-C par C-ANP4-23 diminue le taux de prolifération élevé des CMLV de SHR par une régulation à la baisse des composantes du cycle cellulaire via l’inhibition de la protéine Giα et des voies signalétique MAP kinase/PI3-K.

Implication de la voie ERK3/4-MK5 dans la phase G2/M du cycle cellulaire

La division cellulaire est influencée par les différents stimuli provenant de l’extérieur ou de l’intérieur de la cellule. Plusieurs réseaux enzymatiques élaborés au cours de l’évolution relayent l’information générée par ces signaux. Les modules MAP kinases sont extrêmement importants au sein de la cellule. Chez l’humain, 14 MAP kinases sont regroupées en sept voies distinctes intervenant dans le contrôle d’une myriade de processus cellulaires. ERK3/4 sont des homologues de ERK1/2 pour lesquelles on ne connaît que très peu de choses concernant leurs fonctions et régulation. Ces MAP kinases sont dites atypiques puisqu’elles ont des particularités structurales et des modes de régulation qui diffèrent des autres MAP kinases classiques. Ainsi, notre laboratoire a démontré que l’activité de ERK3 est régulée par le système ubiquitine-protéasome et qu’elle pourrait avoir un rôle à jouer dans le contrôle de la différenciation et la prolifération cellulaire. La première étude présentée décrit la régulation de ERK3 au cours du cycle cellulaire. Nous avons observé que ERK3 est hyperphosphorylée et s’accumule spécifiquement au cours de la mitose. Des analyses de spectrométrie de masse ont mené à l’identification de quatre sites de phosphorylation situés à l’extrémité du domaine C-terminal. Nous avons pu démontrer que la kinase mitotique CDK1/cycline B phosphoryle ces sites et que les phosphatases CDC14A et CDC14B les déphosphorylent. Finalement, nous démontrons que la phosphorylation mitotique de ERK3 a pour effet de la stabiliser. Au début de mes études doctorales, la kinase MK5 fut identifiée comme premier partenaire et substrat de ERK3. MK5 a très peu de fonctions connues. Des données dans la littérature suggèrent qu’elle peut moduler le cycle cellulaire dans certaines conditions. Par exemple, MK5 a récemment été identifié comme inducteur de la sénescence induite par l’oncogène Ras. Dans la deuxième étude, nous décrivons une nouvelle fonction de MK5 dans le contrôle du cycle cellulaire. Nous démontrons par des expériences de gain et perte de fonction que MK5 ralentit l’entrée en mitose suite à un arrêt de la réplication. Cette fonction est dépendante de l’activité enzymatique de MK5 qui régule indirectement l’activité de CDK1/cycline B. Finalement, nous avons identifié Cdc25A comme un nouveau substrat in vitro de MK5 dont la surexpression supprime l’effet de MK5 sur l’entrée en mitose. En conclusion, nos résultats décrivent un nouveau mécanisme de régulation de ERK3 au cours de la mitose, ainsi qu’une nouvelle fonction pour MK5 dans le contrôle de l’entrée en mitose en réponse à des stress de la réplication. Ces résultats démontrent pour la première fois l’implication de ces protéines au cours de la transition G2/M. Nos travaux établissent de nouvelles pistes d’études pour mieux comprendre les rôles encore peu définis des kinases ERK3/4-MK5.

Identification du rôle et des modifications post-traductionnelles modulant l’export nucléaire de l’hélicase virale E1 au cours du cycle de réplication du virus du papillome humain

Les virus du papillome humain (VPH) sont de petits virus à ADN double brin infectant les épithéliums de la peau et des muqueuses. La réplication nécessaire au maintien de leur génome dans les cellules infectées dépend des protéines virales E1 et E2. Au cours de la réplication, E1 est recrutée à l’origine de réplication par E2 afin d’être assemblée en doubles hexamères capables de dérouler l’ADN. E1 contient un domaine C-terminal responsable de l’activité ATPase/hélicase, un domaine central de liaison à l’origine et une région N-terminale régulant la réplication in vivo. Cette région contient des signaux de localisation et d’export nucléaire qui modulent le transport intracellulaire de E1. Chez le virus du papillome bovin (VPB), il a été proposé que ce transport est régulé par la sumoylation de E1. Finalement, la région N-terminale de E1 contient un motif de liaison aux cyclines permettant son interaction avec la cycline E/A-Cdk2. La phosphorylation de E1 par cette dernière régule différemment l’export nucléaire des protéines E1 du VPB et du VPH. Dans la première partie de cette étude, nous avons démontré que bien que la protéine E1 des VPH interagit avec Ubc9, l’enzyme de conjugaison de la voie de sumoylation, cette voie n’est pas requise pour son accumulation au noyau. Dans la seconde partie, nous avons déterminé que l’accumulation nucléaire de E1 est plutôt régulée pas sa phosphorylation. En fait, nous avons démontré que l’export nucléaire de E1 est inhibé par la phosphorylation de sérines conservées de la région N-terminale de E1 par Cdk2. Puis, nous avons établi que l’export nucléaire de E1 n’est pas nécessaire à l’amplification du génome dans les kératinocytes différenciés mais qu’il est requis pour le maintien du génome dans les kératinocytes non différenciés. En particulier, nous avons découvert que l’accumulation nucléaire de E1 inhibe la prolifération cellulaire en induisant un arrêt du cycle cellulaire en phase S et que cet effet anti-prolifératif est contrecarrée par l’export de E1 au cytoplasme. Dans la troisième partie de cette étude, nous avons démontré que l’arrêt cellulaire induit par E1 dépend de sa liaison à l’ADN et à l’ATP, et qu’il est accompagné par l’activation de la voie de réponse aux dommages à l’ADN dépendante de ATM (Ataxia Telangiectasia Mutated). Ces deux événements semblent toutefois distincts puisque la formation d’un complexe E1-E2 réduit l’activation de la voie de réponse aux dommages par E1 sans toutefois prévenir l’arrêt de cycle cellulaire. Finalement, nous avons démontré que la réplication transitoire de l’ADN viral peut avoir lieu dans des cellules arrêtées en phase S, indépendamment de l’activation de la voie de réponse aux dommages à l’ADN et de la kinase ATM. Globalement, nos résultats démontrent que l’export nucléaire de E1 est régulé par sa phosphorylation et non par sa sumoylation. Ils démontrent également que l’export nucléaire de E1 est essentiel au maintien du génome dans les kératinocytes, possiblement parce qu’il prévient l’inhibition de la prolifération cellulaire et l’activation de la voie de réponse aux dommages à l’ADN en limitant l’accumulation de E1 au noyau.