Caractérisation de la toxicocinétique de l’octylphénol chez le rat en vue d’une meilleure analyse de risque toxicologique des perturbateurs endocriniens

Le p-tert-octylphénol est un produit présent dans l’environnement et issu de la dégradation des alkylphénols éthoxylés. Ce composé a la capacité de se lier au récepteur œstrogénique et d’exercer ainsi un léger effet œstrogénique. Les objectifs de cette étude étaient de 1) développer une méthode d'identification de l'octylphénol dans le sang et les tissus à l'aide de la chromatographie en phase gazeuse jumelée à la spectrométrie de masse, 2) caractériser la toxicocinétique sanguine et tissulaire de l’octylphénol chez le rat Sprague-Dawley mâle et femelle et 3) développer un modèle toxicocinétique à base physiologique permettant de décrire la cinétique sanguine et tissulaire de l’octylphénol inchangé. Pour ce faire, des rats mâle et femelle Sprague-Dawley ont reçu des doses uniques d’octylphénol par les voies intraveineuse, orale et sous-cutanée. Deux autres groupes ont reçu des doses répétées d'octylphénol par voie orale pour une durée de 35 jours consécutifs pour les femelles ou 60 jours pour les mâles. Les concentrations sanguines et tissulaires d’octylphénol ont été mesurées à différents moments après administration à partir d’une méthode d’analyse développée dans nos laboratoires dans le cadre de ce projet. Les expériences impliquant des administrations uniques ont montré que les concentrations sanguines et tissulaires d'octylphénol étaient en général plus élevées chez les femelles que chez les mâles. Des expériences réalisées avec des microsomes hépatiques ont confirmé que ces différences étaient vraisemblablement reliées au métabolisme de l'octylphénol. Les expériences impliquant des administrations répétées ont montré qu'il n'y avait pas d'accumulation d'octylphénol dans l'organisme aux doses étudiées. Les résultats obtenus expérimentalement ont servi à développer et valider un modèle toxicocinétique à base physiologique. Ce modèle a permis de simuler adéquatement les concentrations sanguines et tissulaires d'octylphénol suite à des expositions intraveineuses, orales et sous-cutanées. En conclusion, cette étude a fourni des données essentielles sur la toxicocinétique de l'octylphénol. Ces données sont nécessaires pour établir la relation entre la dose externe et la dose interne et vont contribuer à une meilleure évaluation des risques liés à l'octylphénol.

Impacts fonctionnels des polymorphismes dans les promoteurs des gènes de l’apoptose

La susceptibilité ou la résistance aux cancers peuvent impliquer plusieurs mécanismes, incluant l’apoptose, la croissance cellulaire et la différenciation, la réplication et la réparation de l’ADN. Mon projet porte plus particulièrement sur l’apoptose. Une dérégulation dans les voies d’activation de l’apoptose entraîne une accumulation de cellules déréglées, créant ainsi un environnement propice à l’instabilité génétique et au développement du cancer. Comme l’apoptose est une voie biologique hautement régulée, nous proposons l’hypothèse que des polymorphismes « fonctionnels » dans les régions de régulations des gènes (rSNPs) perturberaient cette voie à cause de taux variables de transcrits et des protéines correspondantes dû à la modification des sites de reconnaissances des facteurs de transcription. Les principaux objectifs de mon projet sont : (i) identifier les SNPs présents dans la région promotrice des gènes d’apoptose; (ii) déterminer les haplotypes de promoteurs les plus fréquents présents dans la population générale; (rHaps) (iii) vérifier leurs impacts fonctionnels sur l’expression génique par des essais in vitro (gène rapporteur et retard sur gel). Cette étude permettra d’identifier des rSNPs et rHaps ayant un impact sur le niveau d’expression des gènes d’apoptose, au moins dans un contexte in vitro. Ces différences alléliques au niveau de l’expression de ces gènes d’apoptose pourraient contribuer à la susceptibilité interindividuelle de développer un cancer.

Lien entre l'hémostase et le développement néoplasique : rôle spécifique du facteur tissulaire et de l'inhibiteur du facteur tissulaire

Il est reconnu, depuis une centaine d’années, que des désordres de la coagulation, regroupés sous le terme de coagulopathies, sont souvent associés au développement néoplasique. Pendant de nombreuses années, ces coagulopathies furent souvent reconnues comme une simple conséquence du développement du cancer. D’ailleurs, pour les cliniciens, l’apparition de ces anomalies sanguines constitue souvent le premier signe clinique d’un cancer occulte. Toutefois, l’étude approfondie du lien existant entre le système hémostatique et le cancer indique que différents facteurs hémostatiques vont interagir avec soit l’environnement tumoral ou soit la tumeur elle-même et influencer le développement du cancer. Au cours de nos travaux, nous avons porté une attention particulière à deux protéines jouant un rôle primordial dans l’hémostase. Le facteur tissulaire (TF) et l’inhibiteur du facteur tissulaire (TFPI) peuvent jouer des rôles pro- ou anti-néoplasique, et ce indépendamment de leurs fonctions hémostatiques normales. Dans le premier volet de cette thèse, nous avons étudié les propriétés antiangiogéniques de TFPI. L’angiogenèse, soit la formation de nouveaux vaisseaux sanguins à partir du réseau pré-existant, est reconnue comme étant une étape clée du développement tumoral. D’après nos travaux, le TFPI peut inhiber la formation de structures de type capillaire des cellules endothéliales (CEs) de la veine ombilicale humaine (HUVEC), et ce à une IC 50 de 5 nM, soit la concentration physiologique de l’inhibiteur. De plus, le TFPI bloque la migration des cellules endothéliales lorsque ces dernières sont stimulées par la sphingosine-1-phosphate (S1P), une molécule relâchée lors de l’activation des plaquettes sanguines. Cette inhibition de la migration cellulaire s’explique par l’effet du TFPI sur l’adhésion des CEs. En effet, TFPI inhibe la phosphorylation de deux protéines clées participant à la formation des complexes d’adhésion focales soit FAK (focal adhesion kinase) et PAX (paxilin). L’inhibition de ces deux protéines suggère qu’il y ait une réorganisation des complexes focaux, pouvant expliquer la perte d’adhérence. Finalement, des études de microscopie confocale démontrent que les cellules traitées au TFPI changent de morphologie au niveau du cytosquelette d’actine provoquant une désorganisation des structures migratoires (pseudopodes). Les effets du TFPI au niveau de la migration, de l’adhésion et de la morphologie cellulaire sont strictement spécifiques aux cellules endothéliales humaines, puisque aucun n’effet n’est observé en traitant des cellules cancéreuses de glioblastomes (GB) humains, qui sont normalement des tumeurs hautement vascularisées. En résumé, cette première étude démontre que le TFPI est un inhibiteur de l’angiogenèse. Dans le second volet de cette thèse, nous nous sommes intéressés aux différents rôles de TF, le principal activateur de la coagulation. Cette protéine est également impliquée dans le développement néoplasique et notamment celui des médulloblastomes (MB) chez l’enfant via des fonctions hémostatiques et non-hémostatiques. Nos travaux démontrent que l’expression de TF est induite par la voie de signalisation de HGF (hepatocyte growth factor) et de son récepteur Met. Cet effet de HGF/Met semble spécifique aux MB puisque HGF ne peut stimuler l’expression de TF au niveau des cellules cancéreuses de glioblastomes. TF, exprimé à la surface des cellules médulloblastiques (DAOY), est responsable de l’activité pro-thrombogénique de ces cellules, ainsi qu’un acteur important de la migration de ces cellules en réponse au facteur VIIa (FVIIa). De plus, en étudiant 18 spécimens cliniques de MB, nous avons établi un lien entre l’intensité d’expression de TF et de Met. L’importance de cette corrélation est également suggérée par l’observation que les cellules exprimant les plus forts taux de TF et de Met sont également les plus agressives en termes d’index de prolifération et de dissémination métastatiques. En résumé, ces travaux représentent le point de départ pour la mise au point de TF comme un marqueur diagnostique clinique dans les cas de tumeurs du cerveau pédiatriques. De plus, l’élucidation de la voie de signalisation moléculaire responsable de l’expression de TF permet de mieux comprendre la biologie et le fonctionnement de ces tumeurs et de relier le profil d’expression de TF aux phénotypes agressifs de la maladie. Il est reconnu que HGF peut également jouer un rôle protecteur contre l’apoptose. Dans le troisième volet de cette thèse, nous avons remarqué que cette protection est corrélée à l’expression de TF. En réduisant à néant l’expression de TF à l’aide de la technologie des ARN silencieux (siRNA), nous démontrons que HGF ne protège plus les cellules contre l’apoptose. Donc, TF médie l’activité anti-apoptotique de HGF. TF assume cette protection en inactivant la phosphorylation de p53 sur la sérine 15, empêchant ainsi la translocation de p53 au noyau. Finalement, l’expression de TF et son interaction avec le FVIIa, au niveau des cellules médulloblastiques favorise la survie de ces dernières et ce même si elles sont soumises à de fortes concentrations de médicaments couramment utilisées en cliniques. Ce troisième et dernier volet démontre l’implication de TF en tant que facteur impliqué dans la survie des cellules cancéreuses, favorisant ainsi le développement de la tumeur. Dans son ensemble, cette thèse vise à démontrer que les facteurs impliqués normalement dans des fonctions hémostatiques (TFPI et TF) peuvent contribuer à réguler le développement tumoral. Tout système physiologique et pathologique est dépendant d’un équilibre entre activateur et inhibiteur et la participation de TF et de TFPI à la régulation du développement néoplasique illustre bien cette balance délicate. Par sa contribution anti- ou pro-néoplasique le système hémostatique constitue beaucoup plus qu’une simple conséquence du cancer; il fait partie par l’action de TF des stratégies élaborées par les cellules cancéreuses pour assurer leur croissance, leur déplacement et leur survie, alors que TFPI tente de limiter la croissance tumorale en diminuant la vascularisation.

Activités antidiabétiques et neuroprotectrices du jus de bleuet biostransformé

Le bleuet démontre un potentiel thérapeutique dans le traitement du cancer et des maladies cardiovasculaires et neurodégénératives. Ces effets bénéfiques sont attribuables aux composés phénoliques abondants dans le bleuet, tels que les anthocyanines et les flavonoïdes. La biotransformation du jus de bleuet avec les bactéries Serratia vaccinii augmente sa teneur en composés phénoliques et son activité anti-oxydante, et modifie ses activités physiologiques. L’objectif de la présente étude est d’évaluer l’activité neuroprotectrice et le potentiel antidiabétique du jus de bleuet biostranformé (BJ). Le BJ est étudié dans différents tests dont : 1) La protection des neurones (N2a) contre le stress oxydatif (SO) induit par le peroxyde d’hydrogène; 2) La stimulation de la prise de glucose par les cellules musculaires (C2C12) et adipeuses (3T3-L1); 3) L’activité anti-hyperglycémique chez les souris obèses diabétiques KKAy. En effet, tandis que le jus de bleuet normal n’a aucun effet, le BJ augmente l’activité des enzymes anti-oxydantes, comme la catalase et la SOD (Superoxide Dimutase) et protège les neurones contre les changements de la signalisation des MAPKs et contre la toxicité induite par le peroxyde d’hydrogène. Le BJ augmente aussi la prise de glucose de 48% dans les cellules C2C12 et de 142% dans les cellules 3T3-L1. Cette augmentation n’est pas expliquée par une augmentation du calcium cytosolique mais plutôt par une stimulation de la phosphorylation de l’AMPK. De plus, le BJ inhibe l’adipogenèse chez les 3T3-L1. Le BJ diminue également l’hyperglycémie chez les souris obèses diabétiques KKAy et protège les jeunes souris pré-diabétiques contre le développement de l’obésité et du diabète. L’activité anti-hyperglycémique du BJ pourrait impliquer les adipokines puisque le BJ augmente le niveau d’adiponectine chez les souris diabétiques. Le BJ représente ainsi une approche prometteuse pour le traitement du diabète et les maladies neurodégénératives et une source de nouveaux agents thérapeutiques contre ces maladies.

Peptides vasoactifs endogènes dans la prolifération accrue des cellules musculaires lisses vasculaires de rats spontanément hypertendus: rôle des facteurs de croissance.

Contribuant à la pathophysiologie des maladies vasculaires comme dans le cas de l’hypertension, le remodelage vasculaire est associé à une altération de la croissance des cellules musculaires lisses vasculaires (CMLV) (prolifération, taille, etc.). Or la prolifération des CMLV est augmentée par les peptides vasoactifs tels que l’angiotensine II (AngII) et l’endothéline-1 (ET-1). Ces peptides étant surexprimés lors de l’hypertension, cette étude fut entreprise pour déterminer leur contribution endogène ainsi que celles du facteur de croissance épidermique (EGF), du facteur de croissance insulinique (IGF-1) et du facteur de croissance dérivé des plaquettes (PDGF) à la prolifération accrue des CMLV et aux mécanismes sous-jacents. Des CMLV A-10 et des CMLV de rats WKY et SHR âgés de 12 semaines ont été utilisées pour cette étude. La prolifération cellulaire fut déterminée par incorporation de [3H]thymidine. La phosphorylation de ERK 1/2 et du récepteur de EGF fut déterminée par immunobuvardage. Les CMLV de SHR, comparées à celles de WKY, ont montré une prolifération accrue qui fut atténuée par le losartan, un antagoniste du récepteur AT1 de l’AngII et par le BQ-123 et le BQ-788, antagonistes des récepteurs ETA et ETB de l’ET-1. La prolifération accrue des CMLV de SHR fut ramenée à celle des WKY par les inhibiteurs des récepteurs au PDGF (AG-1295), au IGF-1 (AG-1024) et au EGF (AG-1478). La phosphorylation du récepteur au EGF, accrue dans les CMLV de rats SHR comparée à celle des WKY, fut atténuée par le losartan, le BQ-123, le BQ-788 et l’AG-1478, mais ne fut pas atténuée par l’AG-1295 et l’AG-1024. De plus, la phosphorylation accrue de ERK 1/2 dans les CMLV de rats SHR fut atténuée par le losartan, le BQ-123, le BQ-788 et les inhibiteurs des récepteurs aux facteurs de croissance. Parallèlement, le rôle de la transactivation de EGF-R dans la prolifération accrue induite par AngII et ET-1 fut aussi examiné dans les CMLV A-10. L’augmentation, induite par AngII et ET-1, de la prolifération et de la phosphorylation de ERK 1/2 dans les CMLV A-10 fut ramenée au niveau contrôle par AG-1478. Ces données suggèrent que les peptides vasoactifs endogènes induisent la prolifération accrue des CMLV par la signalisation des MAP kinases résultant de la transactivation de EGF-R.

Étude du rôle de l’auto-antigène nucléaire centromérique B (CENP-B) et des auto-anticorps anti-CENP-B dans l’activation des cellules musculaires lisses vasculaires : implication potentielle dans la pathophysiologie de la sclérose systémique

La sclérose systémique (ScS) est une maladie auto-immune dont l’un des principaux auto-anticorps, dirigé contre la protéine centromérique B (CENP-B), est fortement associé à l’hypertension artérielle pulmonaire, l’une des causes majeures de décès dû à la ScS. L’hypertension résulte de l’occlusion progressive des vaisseaux suite à une hyperactivation des cellules musculaires lisses (CML) de la paroi vasculaire. Cependant, les facteurs responsables de ce remodelage vasculaire restent inconnus. Plusieurs études récentes ont démontré que certains auto-antigènes possèdent des fonctions biologiques additionnelles lorsqu'ils se retrouvent dans le milieu extracellulaire. En effet, une fois libérés par nécrose ou apoptose, ces auto-antigènes adoptent une activité biologique qui s'apparente à celles des cytokines et peuvent ainsi participer aux processus normaux de réparation de blessure et/ou acquérir une activité pathogène qui contribue au développement de certaines maladies auto-immunes. Nos résultats suggèrent que la CENP-B peut être ajoutée à cette liste de molécules bifonctionnelles. À l'aide des techniques d'immunofluorescence, d'ELISA cellulaire et de cytométrie en flux, nous avons démontré que la CENP-B se liait spécifiquement à la surface des CML vasculaire de l’artère pulmonaire avec une plus grande affinité pour le phénotype contractile que synthétique. Cette liaison provoquait la migration des cellules ainsi que la sécrétion de cytokines pro-inflammatoires telles que l’interleukine 6 et 8. Les mécanismes par lesquels la protéine exerçait ces effets impliquaient la phosphorylation de FAK et Src ainsi que la voie des MAP kinases, avec ERK1/2 et p38. Des études de signalisation intracellulaire effectuées à l’aide de plusieurs inhibiteurs spécifiques ainsi que des études de désensibilisation nous ont permis d’identifier le récepteur de la CENP-B en plus d’identifier les mécanismes complets de sa signalisation membranaire. Nous avons démontré que la CENP-B se liait de manière spécifique aux CML vasculaire via le récepteur de chémokine 3 (CCR3) pour ensuite transactiver le récepteur EGF, selon un mécanisme métalloprotéase-dépendant qui implique le relargage du HB-EGF. Cette transactivation est un processus important dans l’activation de la voie des MAP kinases ainsi que dans la sécrétion d’IL-8 induite par la CENP-B. Finalement, nous avons démontré que les auto-anticorps anti-CENP-B pouvaient abolir cette cascade de signalisation, empêchant ainsi la CENP-B d’exercer son rôle de cytokine. L’identification de la CENP-B comme ligand du CCR3 ouvre donc plusieurs perspectives quant à l’étude du rôle pathogène des auto-anticorps anti-CENP-B dans la ScS.

Deletion of the RNR4 gene causes hyperresistance to the carcinogen 4-NQO in the yeast model

La stabilité génomique, qui est essentielle à la vie, est possible grâce à la réplication et la réparation de l’ADN. Une des enzymes responsables de la réplication et de la réparation de l’ADN est la ribonucleotide reductase (RNR), qui est retrouvée chez la levure et chez l’humain. Cette enzyme catalyse la formation de déoxyribonucléotides et maintien le pool de dNTP requis pour la réparation et la réplication de l’ADN. L’enzyme RNR est un tétramère α2β2 constitué d’une grande (R1, α2) et d’une petite (R2, β2) sous-unité. Chez S. cerevisiae, les gènes RNR1 et RNR3 encodent la sous-unité α2 (R1). L’activité catalytique de RNR dépend d’une interaction avec le fer et de la formation d’un complexe entre R1 et R2. L’expression de toutes les sous-unités est inductible par les dommages causés à l’ADN. Dans cette étude, nous démontrons que des cellules qui n’expriment pas une des sous-unités, Rnr4, du complexe RNR sont sensibles à divers agents endommageant l’ADN, tels que le méthyl méthane sulfonate, la bléomycine, le péroxyde d’hydrogène et les rayons ultraviolets (UVC 254 nm). Au contraire, le mutant est résistant au 4-nitroquinoline-1- oxide (4-NQO), un composé qui engendre des lésions encombrantes. Par conséquent, le mutant rnr4Δ démontre une réduction marquée en mutations induites par le 4-NQO comparativement à la souche parentale. Nous voulions identifier la voie de réparation de l’ADN qui conférait cette résistance au 4-NQO ainsi que les protéines impliquées. Les voies BER, NER et MMR n’ont pas aboli la résistance au 4-NQO de la souche rnr4Δ. La protéine recombinante Rad51 ne joue pas un rôle critique dans la réparation de l’ADN et dans la résistance au 4-NQO. La délétion du gène REV3, qui encode une polymérase de contournement, impliquée dans la réparation post-réplication, a partiellement aboli la résistance au 4-NQO dans rnr4Δ. Ces résultats suggèrent que la polymérase Rev3 et possiblement d’autres polymérases translésion (Rev1, Rev7, Rad30) pourraient être impliquées dans la réparation de lésions encombrantes dans l’ADN dans des conditions de carence en dNTP. La réparation de l’ADN, un mécanisme complexe chez la levure, implique une vaste gamme de protéines, dont certaines encore inconnues. Nos résultats indiquent qu’il y aurait plus qu’une protéine impliquée dans la résistance au 4-NQO. Des investigations plus approfondies seront nécessaires afin de comprendre la recombinaison et la réparation post-réplication.

Le rôle de la leptine dans le métabolisme anormal des ostéoblastes de patients atteints d’ostéoarthrose

L’ostéoarthrose (OA) est une pathologie qui touche les articulations principalement chez les personnes âgées. Il devient capital de mieux cerner cette pathologie à cause des coûts économiques qu’elle engendre mais surtout à cause du vieillissement de la population. Cette maladie se caractérise par une dégradation du cartilage articulaire, une sclérose osseuse, une inflammation de la membrane synoviale ainsi que la présence d’ostéophytes. L’étiologie de cette pathologie est restée nébuleuse car la recherche sur la maladie touchait principalement le cartilage articulaire. Toutefois, le rôle clé de l’os sous-chondral dans l’OA est maintenant reconnu. L’obésité étant un facteur de risque de l’OA, nous avons émis l’hypothèse que la leptine, une adipocytokine clé dans l’obésité, joue un rôle important dans l’OA. En effet, la leptine modifie le phénotype des ostéoblastes (Ob) normaux humain et puisque les Ob OA humains ont un phénotype altéré, notre objectif était de déterminer le rôle potentiel de la leptine dans ces cellules. Pour ce faire, nous avons préparé des cultures primaires d’Ob issus de la plaque sous-chondral du plateau tibial de patients OA et d’individus normaux (N). L’expression de la leptine et de son récepteur actif (OB-Rb) ont été mesurées par RT-PCR en temps réel, et leur production a été mesurée par ELISA et immunobuvardage (IB). La prolifération des Ob OA a été déterminée par incorporation de BrdU. La phosphorylation de p42/44 MAPK dans les Ob OA a été déterminée par IB. Le phénotype des Ob fut déterminé par la mesure de l’activité de la phosphatase alcaline (ALP) et la sécrétion d’ostéocalcine (OC), en présence ou non de leptine. De plus, les effets des ARNs d’interférences (SiRNA) anti-leptine et anti OB-Rb sur le phénotype des Ob OA furent déterminés via leur impact sur l’activité de l’ALP et sur la sécrétion d’OC. L’effet dose-réponse de la leptine sur les expressions d’OB-Rb, du facteur de croissance TGF-1 ou encore sur sa propre expression furent déterminées par RT-PCR en temps réel. Pour terminer, la signalisation de la leptine a été étudiée en évaluant l’effet dose réponse de celle-ci sur la production des protéines JAK2 et STAT3 phosphorylées par IB. Les résultats obtenus ont montrés que les Ob OA expriment et produisent plus de leptine que les Ob N. Au niveau phénotypique, ces Ob OA possèdent une activité de l’ALP ainsi qu’une sécrétion d’OC plus importante que celles observées chez les Ob N. L’ajout d’anticorps inactivant l’interaction leptine et OB-Rb ou d’inhibiteurs chimiques comme tyrphostin ou piceatannol diminuèrent l’activité de l’ALP ainsi que la sécrétion d’OC dans les Ob OA. Par contre, l’ajout de leptine exogène aux Ob OA augmenta l’activité de l’ALP sans pour autant faire varier la sécrétion d’OC. La leptine à des doses de 1ng/ml à 10mg/ml stimula la prolifération des Ob OA ainsi que la phosphorylation de p42/44 MAPK. La leptine exogène diminua l’expression de TFG-1 tandis qu’elle stimula la phosphorylation de JAK2 et STAT3 ou encore sa propre expression de manière dose-dépendante. Cependant, l’expression d’OB-Rb diminua de manière dose-dépendante. Enfin, le traitement des Ob OA avec des Si leptine ou Si OB-Rb diminua l’activité d’ALP, la sécrétion d’OC, l’expression de la leptine, l’expression d’OB-RB ainsi que l’expression du facteur TGF-1. L’ensemble de ces données démontre que la leptine endogène des Ob OA est sous contrôle des facteurs de croissance et qu’elle contribue à maintenir le phénotype anormal de l’os sous-chondral OA. De plus, ceci suggère que la leptine serait un acteur important dans la régulation du remodelage osseux.

Implication des canaux K+ dans les processus de réparation de l’épithélium respiratoire sain et fibrose kystique

La pathologie de la fibrose kystique (FK) est causée par des mutations du gène codant pour le canal Cl- CFTR. Au niveau respiratoire, cette dysfonction du transport transépithélial de Cl- occasionne une altération de la composition et du volume du liquide de surface des voies aériennes. Une accumulation de mucus déshydraté favorise alors la colonisation bactérienne et une réponse inflammatoire chronique, entraînant des lésions épithéliales sévères au niveau des voies aériennes et des alvéoles pouvant culminer en défaillance respiratoire. Le principal objectif de mon projet de maîtrise était d’étudier les processus de réparation de l’épithélium alvéolaire sain, l’épithélium bronchique sain et FK à l’aide d’un modèle in vitro de plaies mécaniques. Nos résultats démontrent la présence d’une boucle autocrine EGF/EGFR contrôlant les processus de migration cellulaire et de réparation des lésions mécaniques. D’autre part, nos expériences montrent que l’EGF stimule l’activité et l’expression des canaux K+ KATP, KvLQT1 et KCa3.1 des cellules épithéliales respiratoires. L’activation de ces canaux est cruciale pour les processus de réparation puisque la majeure partie de la réparation stimulée à l’EGF est abolie en présence d’inhibiteurs de ces canaux. Nous avons également observé que les cellules FK présentent un délai de réparation, probablement causé par un défaut de la réponse EGF/EGFR et une activité/expression réduite des canaux K+. Nos résultats permettent de mieux comprendre les mécanismes de régulation des processus de réparation de l’épithélium sain et FK. De plus, ils ouvrent de nouvelles options thérapeutiques visant à promouvoir, à l’aide d’activateurs de canaux K+ et de facteurs de croissance, la régénération de l’épithélium respiratoire chez les patients atteints de FK.

Mécanismes traductionnels impliqués dans la potentialisation à long-terme de la transmission synaptique des cellules pyramidales de l’hippocampe chez le rongeur.

La mémoire et l’apprentissage sont des phénomènes complexes dont on ne comprend pas encore bien l’origine au niveau cellulaire et moléculaire. Cependant, il est largement admis que des changements plus simples au niveau synaptique, tels que la potentialisation à long-terme (long-term potentiation ou LTP) pourraient constituer la base cellulaire de la formation des nouveaux souvenirs. Ces mécanismes sont couramment étudiés au niveau de l’hippocampe, une région du lobe temporal reconnue comme étant nécessaire à la formation de la mémoire explicite chez les mammifères. La LTP est classiquement définie comme un renforcement durable de l’efficacité de connexions synaptiques ayant été stimulées de façon répétée et soutenue. De plus, on peut distinguer deux formes de LTP: une LTP précoce, qui repose sur la modification de protéines déjà formées, et une LTP tardive, qui requiert, elle, la synthèse de nouvelles protéines. Cependant, bien que de nombreuses études se soient intéressées au rôle de la traduction pour la maintenance de la LTP, les mécanismes couplant l’activité synaptique à la machinerie de synthèse protéique, de même que l’identité des protéines requises sont encore peu connus. Dans cette optique, cette thèse de doctorat s’est intéressée aux interactions entre l’activité synaptique et la régulation de la traduction. Il est par ailleurs reconnu que la régulation de la traduction des ARNm eukaryotiques se fait principalement au niveau de l’initiation. Nous avons donc étudié la modulation de deux voies majeures pour la régulation de la traduction au cours de la LTP : la voie GCN2/eIF2α et la voie mTOR. Ainsi, nos travaux ont tout d’abord démontré que la régulation de la voie GCN2/eIF2α et de la formation du complexe ternaire sont nécessaires à la maintenance de la plasticité synaptique et de la mémoire à long-terme. En effet, l’activité synaptique régule la phosphorylation de GCN2 et d’eIF2α, ce qui permet de moduler les niveaux du facteur de transcription ATF4. Celui-ci régule à son tour la transcription CREB-dépendante et permet ainsi de contrôler les niveaux d’expression génique et la synthèse de protéines nécessaires pour la stabilisation à long-terme des modifications synaptiques. De plus, la régulation de la voie mTOR et de la traduction spécifique des ARNm 5’TOP semble également jouer un rôle important pour la plasticité synaptique à long-terme. La modulation de cette cascade par l’activité synaptique augmente en effet spécifiquement la capacité de traduction des synapses activées, ce qui leur permet de traduire et d’incorporer les protéines nécessaires au renforcement durable des synapses. De telles recherches permettront sans doute de mieux comprendre la régulation des mécanismes traductionnels par l’activité synaptique, ainsi que leur importance pour la maintenance de la potentialisation à long-terme et de la mémoire à long-terme.

Comparaison des mécanismes de régulation des isoformes a et b des récepteurs 5-HT4

Les actions thérapeutiques des antidépresseurs, disponibles actuellement, requièrent plusieurs semaines de traitement. Ce délai est dû aux adaptations des sites pré et post-synaptiques qui, respectivement, augmentent la disponibilité synaptique des monoamines sérotonine et noradrénaline (5-HT et NA), et entraînent les changements neuroplastiques modifiant la fonction neuronales dans les régions limbiques. Il a été récemment observé, chez un modèle animal de dépression, que l’agoniste RS67333 des récepteurs sérotoninergiques de type 5-HT4 produisait des changements comportementaux, électrophysiologiques, cellulaires et biochimiques, tel qu’observé chez les antidépresseurs. Ces changements apparaissent seulement après 3 jours de traitement tandis que les antidépresseurs nécessitent souvent plusieurs semaines. De plus, l’activation des récepteurs 5-HT4 ne générait pas de tolérance, et cela pendant 21 jours de traitement. Seulement, les propriétés de signalisation et de régulation de ces récepteurs sont très loin d’êtres établies. Nous avons alors voulu mieux caractériser ces deux aspects de leur fonction, en se concentrant d’avantage sur les isoformes a et b, fortement exprimés dans le système limbique. Pour cela, nous avons voulu évaluer d’abord leur capacité de production d’AMPc dans un système hétérologue. Les essais d’accumulation d’AMPc démontrent que les deux isoformes sont capables de moduler positivement et négativement des niveaux d’AMPc en présence de 5-HT. Par contre, la stimulation au RS67333 induit seulement une augmentation du niveau d’AMPc dans les deux cas. Ensemble, ces observations indiquent que les deux isoformes sont capables de coupler à l’adénylate cyclase à travers les protéines Gαs et Gαi. La quantification des récepteurs internalisés a montré que l’isoforme b internalisait plus efficacement que l’isoforme a suite à l’incubation à la 5-HT (61 ± 3 % pour le b vs 40 ± 2 % pour le a). Les protéines kinases PKA et PKC n’étaient pas impliquées dans cette différence, toutefois, la PKC a été trouvée essentielle à l’internalisation des deux isoformes. L’internalisation de l’isoforme b par 5-HT n’a pas été affecté par la surexpression de forme inactive de GRK2 (GRK2- K220R) et a été partiellement inhibé par un mutant négative de la β-arrestine (βarr(319-418)), tandis que l’internalisation de l’isoforme a a été bloquée par les deux. Ces observations indiquent que les mécanismes d’internalisation des deux isoformes du récepteur 5-HT4 les plus abondants dans le système nerveux central sont distincts. Des comportements spécifiques à chaque isoforme ont aussi été constatés au niveau de la régulation fonctionnelle suite à l’exposition au RS67333, qui désensibilise seulement l’isoforme b. D’après nos observations, nous avons conclu que les isoformes a et b diffèrent dans leur propriétés de signalisation et de régulation. L’incapacité du RS67333 à désensibiliser l’isoforme a fournit un substrat moléculaire pour les effets antidépressifs prolongés de cet agoniste dans les études pré-cliniques.

The role of DcR3 in systemic lupus erythematosus and islet β-Cell viability and function

Le récepteur DcR3 (Decoy receptor 3) est un membre de la famille des récepteurs aux facteurs de nécrose tumorale (TNF). Il est fortement exprimé dans les tissus humains normaux ainsi que les tumeurs malignes. DcR3 est un récepteur pour trois ligands de la famille du TNF tels que FasL, LIGHT et TL1A. Étant une protéine soluble donc dépourvue de la portion transmembranaire et intracytoplasmique, le récepteur DcR3 est incapable d’effectuer une transduction de signal intracellulaire à la suite de son interaction avec ses ligands. De ce fait, DcR3 joue un rôle de compétiteur pour ces derniers, afin d’inhiber la signalisation via leurs récepteurs fonctionnels tels que Fas, HVEM/LTbetaR et DR3. Lors de nos précédentes études, nous avons pu démontrer, que DcR3 pouvaist moduler la fonction des cellules immunitaires, et aussi protéger la viabilité des îlots de Langerhans. À la suite de ces résultats, nous avons généré des souris DcR3 transgéniques (Tg) en utilisant le promoteur du gène β-actine humaine afin d’étudier plus amplement la fonction de ce récepteur. Les souris Tg DcR3 ont finalement développé le syndrome lupus-like (SLE) seulement après l’âge de 6 mois. Ces souris présentent une variété d'auto-anticorps comprenant des anticorps anti-noyaux et anti-ADN. Elles ont également manifesté des lésions rénales, cutanées, hépatiques et hématopoïétiques. Contrairement aux modèles de lupus murin lpr et gld, les souris DcR3 sont plus proche du SLE humain en terme de réponse immunitaire de type Th2 et de production d'anticorps d'anti-Sm. En péus, nous avons constaté que les cellules hématopoïétiques produisant DcR3 sont suffisantes pour causer ces pathologies. DcR3 peut agir en perturbant l’homéostasie des cellules T pour interférer avec la tolérance périphérique, et ainsi induire l'autoimmunité. Chez l'humain, nous avons détecté dans le sérum de patients SLE des niveaux élevés de la protéine DcR3. Chez certains patients, comme chez la souris, ces niveaux sont liés directement aux titres élevés d’IgE. Par conséquent, DcR3 peut représenter un facteur pathogénique important du SLE humain. L’étude des souris Tg DcR3, nous a permis aussi d’élucider le mécanisme de protection des îlots de Langerhans. Le blocage de la signalisation des ligands LIGHT et TL1A par DcR3 est impliqué dans une telle protection. D'ailleurs, nous avons identifié par ARN microarray quelques molécules en aval de cette interaction, qui peuvent jouer un rôle dans le mécanisme d’action. Nous avons par la suite confirmé que Adcyap1 et Bank1 joue un rôle critique dans la protection des îlots de Langerhans médiée par DcR3. Notre étude a ainsi élucidé le lien qui existe entre la signalisation apoptotique médiée par Fas/FasL et la pathogénèse du SLE humain. Donc, malgré l’absence de mutations génétiques sur Fas et FasL dans le cas de cette pathologie, DcR3 est capable de beoquer cette signalisation et provoquer le SLE chez l’humain. Ainsi, DcR3 peut simultanément interférer avec la signalisation des ligands LIGHT et TL1A et causer un phénotype plus complexe que les phénotypes résultant de la mutation de Fas ou de FasL chez certains patients. DcR3 peut également être utilisé comme paramètre diagnostique potentiel pour le SLE. Les découvertes du mécanisme de protection des îlots de Langerhans par DcR3 ouvrent la porte vers de nouveaux horizons afin d'explorer de nouvelles cibles thérapeutiques pour protéger la greffe d'îlots.

Étiopathogenèse de la scoliose idiopathique de l'adolescent : implication de la mélatonine et de l'ostéopontine

La scoliose idiopathique de l’adolescent (SIA) est une maladie dont la cause est encore inconnue, et qui génère des déformations complexes du rachis, du thorax et du bassin. La prévalence est de 4% dans la population adolescente au Québec. Cette pathologie affecte surtout les filles durant leur poussée de croissance pubertaire. Parmi plusieurs hypothèses émises, l’hypothèse neuroendocrinienne, impliquant une déficience en mélatonine comme agent étiologique de la SIA a suscité beaucoup d’intérêt. Cette hypothèse découle du fait que l’ablation de la glande pinéale chez le poulet produit une scoliose ressemblant sous plusieurs aspects à la pathologie humaine. La pertinence biologique de la mélatonine dans la scoliose est controversée, étant donné que la majorité des études chez l’homme n’ont pu mettre en évidence une diminution significative des niveaux de mélatonine circulante chez les patients scoliotiques. Nous avons démontré un dysfonctionnement dans la signalisation de la mélatonine au niveau des tissus musculo-squelettiques chez une série de patients atteints de SIA (Moreau & coll. 2004). Nous avons confirmé ce défaut chez un plus grand nombre de patients ainsi qu’en utilisant une nouvelle technologie (spectroscopie cellulaire diélectrique) n’ayant pas recours à un prétraitement des cellules donnant ainsi des résultats plus précis. Cette technique a montré la présence des mêmes groupes fonctionnels identifiés auparavant par la technique d’AMPc. Le dysfonctionnement de la signalisation de la mélatonine est dû à une phosphorylation accrue des protéines G inhibitrices. Ce défaut pourrait être causé par un déséquilibre de l’activité des kinases et phosphatases capables de réguler la phosphorylation des protéines Gi. Parmi ces kinases, PKCd a suscité initialement notre intérêt vu qu’elle peut phosphoryler les protéines Gi. Nous avons démontré que cette kinase interagit avec le récepteur de la mélatonine MT2 et que cette interaction varie selon le groupe fonctionnel auquel un patient SIA appartient. Par la suite nos travaux se sont dirigés vers la découverte d’effecteurs cellulaires régulés par la mélatonine et plus spécifiquement l’ostéopontine (OPN), compte tenu de son rôle présumé comme mécanorécepteur et dans certaines structures jouant un rôle dans la proprioception, le contrôle postural et la fonction vestibulaire. L’OPN a été identifiée initialement par sa surexpression au niveau protéique et de l’ARNm dans la musculature paraspinale uniquement chez les poulets scoliotiques. Nous avons également utilisé un autre modèle animal, la souris C57Bl/6 naturellement déficiente en mélatonine. Nous avons généré des souris bipèdes en amputant les membres antérieurs de souris OPN KO, des souris CD44 KO ainsi que des souris contrôles C57Bl/6. Nos résultats ont montré qu’aucune souris OPN KO (n=50) ou CD44 KO (n=60) ne développe la maladie, contrairement aux souris contrôles C57Bl/6 (n=50) dont 45% deviennent scoliotiques. Ces résultats nous ont poussés à investiguer le rôle de cette protéine dans l’étiopathogenèse de la maladie chez l’humain. Nos résultats ont montré une augmentation des niveaux circulants d’OPN chez les patients atteints de la SIA et que l’élevation en OPN corrélait avec la sévérité de la maladie. Nos études chez les enfants asymptomatiques nés de parents scoliotiques et qui sont plus à risque de développer la maladie ont aussi démontré des différences significatives au niveau des concentrations en OPN en comparaison avec les sujets sains. En effet, plusieurs enfants à risque présentaient des niveaux d’OPN supérieurs à 800ng/ml suggérant un plus grand risque de développer une scoliose indiquant aussi que l’augmentation des niveaux en OPN précède le début de la maladie.

Etude des propriétés physicochimiques des vecteurs nanoparticulaires

Cette thèse rapporte l’étude des propriétés physicochimiques des nanoparticles polymériques et leur impact sur l’interaction avec les cellules vivantes. Nous nous sommes tout spécialement attachés à étudier l’effet des propriétés adhésives et mécaniques des nanoparticules sur leur capacité de pénétration de la membrane cellulaire. Pour ce faire, nous avons tout d’abord utilisé des nanoparticules d’acide polylactique (PLA) fonctionnalisées en surface avec un ligand des sélectines E et P. Le greffage du ligand sur la particule s’est fait par une nouvelle méthode expérimentale garantissant la présence du ligand à la surface de la particule durant toute sa durée de vie. Cette méthode consiste à mélanger un polymère fonctionnalisé avec le ligand avec un autre polymère non fonctionnalisé. La présence du ligand à la surface des nanoparticules formées à partir de ce mélange de polymères a été confirmée par analyse ToF SIMS. Nous avons pu prouver que les particules possédant le ligand greffé à leur surface démontraient une capacité adhésive supérieure à leurs homologues non fonctionnalisés sur des cellules endothéliales HUVEC activées par différentes drogues. De plus, le captage des particules par les cellules HUVEC est modulé par le niveau d’expression des récepteurs selectine E et P et aussi par la quantité de ligand libre. Ces résultats montrent clairement que le greffage du ligand confère aux particules des propriétés adhésives accrues et spécifiques ce qui permet leur usage postérieure comme vecteur pharmaceutique capable de cibler un récepteur particulier à la surface d’une cellule. Nous avons aussi démontré que l’interaction entre les nanoparticules et la membrane cellulaire peut aussi être contrôlée aussi bien par les propriétés mécaniques de la cellule que de la nanoparticule. Dans une première étape, nous avons mesuré à l’aide de l’appareil de forces de surface l’élasticité de cellules macrophagiques déposées sur différents substrats. En contrôlant l’interaction entre la cellule et le substrat sur lequel elle repose nous avons montré qu’il était possible de modifier à ii volonté les propriétés mécaniques cellulaire. Une augmentation de l’élasticité cellulaire s’accompagne d’une augmentation systématique de l’internalisation de nanoparticules de PLA non fonctionnalisées. Ceci suggère un rôle prépondérant des propriétés mécaniques du cortex cellulaire dans le captage des nanoparticules de PLA. Dans une seconde étape, nous avons étudié l’effet des propriétés mécaniques des nanoparticules sur leur capacité de pénétration cellulaire. Pour ce faire, nous avons synthétisé des particules d’hydrogel dont l’élasticité était contrôlée par le degré d’agent réticulant inclus dans leur formulation. Le contrôle des propriétés mécaniques des nanoparticules a été confirmé par la mesure du module de Young des particules par microscopie de force atomique. L’impact des propriétés mécaniques de ces particules sur leur capacité de pénétration dans les cellules vivantes a été étudié sur des cellules macrophagiques de souris. Les résultats ont montré que la cinétique d’internalisation, la quantité de particules internalisées et le mécanisme d’internalisation dépendent tous du module de Young des nanoparticules. Aucune différence dans le trajet intracellulaire des particules n’a pu être observée malgré le fait que différentes voies d’internalisation aient été observées. Ce dernier résultat peut s’expliquer par le fait que les nanoparticules sont internalisées par plusieurs voie simultanément ce qui facilite leur accumulation dans les organelles digestives intracellulaires. Un modèle simple permettant d’expliquer ces résultats a été proposé et discuté.

Effet de chaperones pharmacologiques sur les formes mutantes du récepteur mélanocortine de type 4 responsables de l'obésité morbide précoce

Le récepteur mélanocortine de type 4 (MC4R) est un récepteur couplé aux protéines G impliqué dans la régulation de la prise alimentaire et de l’homéostasie énergétique. Quatre-vingt pour cent des mutants du MC4R reliés à l’obésité morbide précoce (OMP) sont retenus à l’intérieur de la cellule. Le système de contrôle de qualité (SCQ) est probablement responsable de cette rétention, par la reconnaissance d’une conformation inadéquate des mutants. Le rétablissement de l’expression à la surface cellulaire et de la fonctionnalité de ces mutants est donc d’intérêt thérapeutique. Dans cette optique, des composés lipophiles spécifiques pour le MC4R ont été sélectionnés sur la base de leur sélectivité. Nous avons démontré qu’ils agissent à titre de chaperone pharmacologique (CP) en rétablissant l’expression à la surface cellulaire et la fonctionnalité des récepteurs mutants S58C et R165W, et qu’ils favorisent leur N-glycosylation complexe (maturation). Le suivi par BRET du site d’action des CP du MC4R suggère une action en aval de l’interaction calnexine-MC4R. De manière générale, une CP peut avoir un effet différent selon le mutant traité en induisant des conformations distinctes du récepteur plus ou moins aptes à se dissocier du SCQ et à activer la voie de signalisation, et un mutant peut répondre différemment selon la CP utilisée par des différences d’affinité pour le ligand, la CP et les effecteurs. Une meilleure compréhension du mode d’action des CP pourrait aider au développement de nouvelles approches thérapeutiques non seulement pour l’OMP, mais aussi pour d’autres maladies conformationnelles causées par le mauvais repliement de protéines.