In vitro evaluation of commercial fibrolytic enzymes for improving the nutritive value of low-quality forages.

The aim of this work was to assess the effects of four doses of three commercial fibrolytic enzymes on ruminal fermentation of rice straw, maize stover and Pennisetum purpureum clon Cuba CT115 hay in batch cultures of ruminal micro-organisms from sheep. One enzyme was produced by Penicillium funiculosum (PEN) and two were from Trichoderma longibrachiatum (TL1 and TL2). Each liquid enzyme was diluted 200 (D1), 100 (D2), 50 (D3) and 10 (D4) - fold and applied to each substrate in quadruplicate over time and incubated for 120 h in rumen fluid. The D4 dose of each enzyme increased (P<0.05) the fractional rate of gas production and organic matter effective degradability for all substrates, and TL2 had similar effects when applied at D3. In 9 h incubations, PEN at D4, TL1 at all tested doses, and TL2 at D2, D3 and D4 increased (P<0.05) volatile fatty acid production and dry matter degradability for all substrates. The commercial enzymes tested were effective at increasing in vitro ruminal fermentation of low-quality forages, although effective doses varied with the enzyme.

The influence of diet on the effectiveness of garlic oil and cinnamaldehyde to manipulate in vitro ruminal fermentation and methane production.

The objective of this study was to evaluate the effects of increasing doses [0 (control: CON), 20, 60, 180 and 540 mg/L incubation medium] of garlic oil (GO) and cinnamaldehyde (CIN) on in vitro ruminal fermentation of two diets. Batch cultures of mixed ruminal microorganisms were inoculated with ruminal fluid from four sheep fed a medium-concentrate diet (MC; 50 : 50 alfalfa hay : concentrate) or four sheep fed a high-concentrate diet (HC; 15 : 85 barley straw : concentrate). Diets MC and HC were representative of those fed to dairy and fattening ruminants, respectively. Samples of each diet were used as incubation substrates for the corresponding inoculum, and the incubation was repeated on 4 different days (four replicates per experimental treatment). There were GO × diet-type and CIN × diet-type interactions (P < 0.001–0.05) for many of the parameters determined, indicating different effects of both oils depending on the diet type. In general, effects of GO were more pronounced for MC compared with HC diet. Supplementation of GO did not affect (P > 0.05) total volatile fatty acid (VFA) production at any dose. For MC diet, GO at 60, 180 and 540 mg/L decreased (P < 0.05) molar proportion of acetate (608, 569 and 547 mmol/mol total VFA, respectively), and increased (P < 0.05) propionate proportion (233, 256 and 268 mmol/mol total VFA, respectively), compared with CON values (629 and 215 mmol/mol total VFA for acetate and propionate, respectively). A minimum dose of 180 mg of GO/L was required to produce similar modifications in acetate and propionate proportions with HC diet, but no effects (P > 0.05) on butyrate proportion were detected. Methane/VFA ratio was reduced (P < 0.05) by GO at 60, 180 and 540 mg/L for MC diet (0.23, 0.16 and 0.10 mol/mol, respectively), and by GO at 20, 60, 180 and 540 mg/L for HC diet (0.19, 0.19, 0.16 and 0.08 mol/mol, respectively), compared with CON (0.26 and 0.21 mol/mol for MC and HC diets, respectively). No effects (P = 0.16–0.85) of GO on final pH and concentrations of NH3-N and lactate were detected. For both diet types, the highest CIN dose decreased (P < 0.05) production of total VFA, gas and methane, which would indicate an inhibition of fermentation. Compared with CON, CIN at 180 mg/L increased (P < 0.05) acetate proportion for the MC (629 and 644 mmol/mol total VFA for CON and CIN, respectively) and HC (525 and 540 mmol/mol total VFA, respectively) diets, without affecting the proportions of any other VFA or total VFA production. Whereas for MC diet CIN at 60 and 180 mg/L decreased (P < 0.05) NH3-N concentrations compared with CON, only a trend (P < 0.10) was observed for CIN at 180 mg/L with the HC diet. Supplementation of CIN up to 180 mg/L did not affect (P = 0.18–0.99) lactate concentrations and production of gas and methane for any diet. The results show that effectiveness of GO and CIN to modify ruminal fermentation may depend on diet type, which would have practical implications if they are confirmed in vivo.

Modificaciones técnicas en fermentadores de flujo continuo: efectos sobre la población de protozoos y la fermentación

Los sistemas in vitro de simulación de la fermentación ruminal constituyen herramientas muy útiles para el estudio de la función ruminal. El mantenimiento de poblaciones microbianas representativas de las existentes en el rumen de los animales es uno de los requisitos que deberían cumplir los sistemas in vitro, pero la disminución del número de protozoos en los fermentadores es un hecho bien constatado (Moumen et al., 2009; Martínez et al., 2011). Dado el importante papel que los protozoos desempeñan en la función ruminal, el diseño de modificaciones técnicas que permitan mantener estas poblaciones en fermentadores supondría un importante avance para su utilización en el estudio del ecosistema ruminal. El objetivo del presente trabajo fue analizar dos modificaciones técnicas para mejorar la retención de los protozoos en fermentadores de flujo continuo.

Utilización de enzimas fibrolíticas para mejorar la digestión de forrajes tropicales. II. Efectos en la fermetación ruminal in vitro y la degradabilidad

En muchos países tropicales los sistemas productivos de animales rumiantes se basan en una amplia utilización de recursos forrajeros. Sin embargo, estos recursos suelen tener una baja calidad, por lo que cualquier mejora de su valor nutritivo tendrá una repercusión positiva en la productividad de los animales. En los últimos años se han realizado numerosos estudios para evaluar diferentes enzimas fibrolíticas como aditivos para mejorar el valor nutritivo de forrajes, pero la mayoría de ellos han utilizado forrajes de elevada calidad y apenas existen estudios con forrajes de baja calidad. Por otra parte, los resultados han sido muy variables, ya que la efectividad de las enzimas se ve afectada por numerosos factores, siendo el tipo de forraje y el método de aplicación de las enzimas dos de los más importantes (Giraldo et al., 2008). El objetivo del presente estudio fue evaluar el efecto de tres enzimas fibrolíticas exógenas en la fermentación ruminal in vitro de tres forrajes tropicales cuando las enzimas se aplicaron 24 h antes o en el momento de la incubación.

Utilización de enzimas fibrolíticas para mejorar la digestión de forrajes tropicales. I. Influencia del método de aplciacion en la producción de gas in vitro y la composición química

Los forrajes tropicales presentan, en general, un menor valor nutritivo que los forrajes de zonas templadas. Sin embargo, su disponibilidad suele ser elevada y en numerosas ocasiones son el único recurso alimenticio disponible para los animales rumiantes. Esta situación limita la productividad de estos animales y por ello se han investigado diferentes estrategias para aumentar el valor nutritivo de los forrajes tropicales. Una de las metodologías propuestas para incrementar la utilización digestiva de los forrajes es el tratamiento de los mismos con enzimas fibrolíticas (Carro y Ranilla, 2001), pero todavía son escasos los estudios realizados con forrajes tropicales. El objetivo de este trabajo fue evaluar el efecto de tres preparados enzimáticos en la fermentación ruminal in vitro y la degradabilidad de tres forrajes tropicales.

Variance and covariance of actual relationship between relatives at one locus.

The relationship between pairs of individuals is an important topic in many areas of population and quantitative genetics. It is usually measured as the proportion of thegenome identical by descent shared by the pair and it can be inferred from pedigree information. But there is a variance in actual relationships as a consequence of Mendelian sampling, whose general formula has not been developed. The goal of this work is to develop this general formula for the one-locus situation,. We provide simple expressions for the variances and covariances of all actual relationships in an arbitrary complex pedigree. The proposed method relies on the use of the nine identity coefficients and the generalized relationship coefficients; formulas have been checked by computer simulation. Finally two examples for a short pedigree of dogs and a long pedigree of sheep are given.

La estimación de los árboles añosos en el Inventario Forestal Nacional

El estudio de los árboles añosos es fundamental para la estimación de la biodiversidad puesto que son nicho ecológico de numerosas especies indicadoras de aves, insectos, líquenes, hongos y briofitos. Sin embargo, no existen definiciones claras para su identificación en los Inventarios Forestales Nacionales debido a que la variable edad no es muestreada en la mayoría de los países y los datos que se recogen no son homogéneos. El objetivo de este trabajo es presentar una metodología aplicable en Inventarios Forestales Nacionales que permita determinar cuándo un árbol es añoso a partir de la medición de su diámetro normal. Esta metodología se fundamenta en modelos mixtos no lineales edad dominante-diámetro a través de los cuales se determinan diámetros límite específicos para cada especie. Se exponen ejemplos de dos especies de pinos de la península ibérica, uno de ámbito mediterráneo, Pinus halepensis Mill.y otro de ámbito eurosiberiano, las poblaciones atlánticas de Pinus pinaster Aiton. Este estudio posibilita la consideración de los árboles añosos en la toma de decisiones en los planes de gestión forestal.

Mejora de la calidad y conectividad del hábitat forestal del oso pardo en la Cordillera Cantábrica: propuesta metodológica e implicacionesde gestión

Desarrollo de estrategias de gestión forestal que mejoren la calidad del hábitat para el oso pardo cantábrico y la conectividad dentro y entre sus subpoblaciones.

Evolución temporal de las comunidades microbianas ruminales y los parámetros fermentativos en fermentadores Rusitec

Los fermentadores Rusitec (Czerkawski y Breckenridge, 1977) son uno de los tipos de fermentadores más ampliamente utilizados para simular in vitro la fermentación ruminal y permiten realizar estudios de larga duración (semanas). Sin embargo, debido a la prolongada extensión en el tiempo de este tipo de estudios se producen cambios cuantitativos y cualitativos en las poblaciones de microorganismos. Existen algunos estudios que han puesto de manifiesto la disminución de la población de protozoos a lo largo del período de incubación (Carro et al., 1995; Martínez et al., 2011), pero no existe información sobre otras poblaciones microbianas, a pesar de que uno de los requisitos que deberían cumplir los sistemas in vitro es mantener poblaciones microbianas representativas de las existentes en el rumen de los animales. Por ello, el objetivo del presente trabajo fue estudiar la evolución en el tiempo de la abundancia de bacterias, hongos, protozoos y arqueas, así como de los parámetros ruminales en fermentadores Rusitec.

Influencia e la inclusión de fibra en el pienso sobre los rendimientos produtivos de pollitas rubias de 1 a 35 días de edad.

La fibra dietética representa la fracción indigestible de los ingredientes del pienso por lo que diluye el contenido en nutrientes del mismo (Rougière y Carré, 2010). Además, un aumento en el nivel de fibra del pienso puede reducir el consumo voluntario (Sklan et al., 2003), alterar el perfil de la flora gastrointestinal y aumentar la incidencia de procesos entéricos (Janssen and Carré, 1985). Sin embargo, estudios recientes muestran que la inclusión de ciertas fuentes de fibras a niveles adecuados podrían mejorar los rendimientos productivos y reducir la incidencia de problemas digestivos en aves (Mateos, 2012). En broilers, la inclusión de fibra adicional en el pienso mejoró la fisiología digestiva, aumentando el tamaño de la molleja, reduciendo el pH de la digesta de este órgano (Sacranie et al., 2012) y mejorando de los rendimientos productivos (González-Alvarado et al., 2010). Fuentes de fibra insoluble tales como la cascarilla de avena (CAV), la cascarilla de girasol (CGI) y la paja de cereales (PCE) podrían mejorar la fisiología del tracto gastrointestinal (TGI) y la digestibilidad de ciertos nutrientes cuando se incluyen en el pienso en cantidades moderadas (Hetland et al., 2003). Por otro lado, fuentes de fibra soluble, tal como la pulpa de remolacha (PRE), incrementan la viscosidad intestinal, lo que podría reducir el consumo de pienso (Jiménez-Moreno et al., 2010). Los autores no han encontrado estudio alguno sobre los efectos de la inclusión de fibra adicional en el pienso sobre los rendimientos productivos de pollitas comerciales. El objetivo del presente trabajo fue estudiar el efecto de incluir diversas fuentes de fibra a diferentes niveles en el pienso sobre los rendimientos productivos de pollitas de 1 a 35 d de edad.

Chaperonas moleculares y tolerancia a estrés abiótico en especies arbóreas

Las temperaturas extremas, la sequía y otros estreses abióticos limitan la producción forestal de forma significativa, causando grandes pérdidas económicas en el sector. Los árboles, al ser organismos sésiles, han desarrollado una serie de estrategias para percibir dichos factores, activando respuestas defensivas apropiadas. Entre ellas ocupa un lugar preeminente la síntesis de proteínas con actividad chaperona molecular. Las chaperonas moleculares interaccionan con proteínas desnaturalizadas total o parcialmente, promoviendo su correcto plegamiento y ensamblaje. Las chaperonas moleculares que se sintetizan de forma predominante en plantas, pero no en otros eucariotas, pertenecen a la familia sHSP (small heat-shock proteins). Se trata de una familia inusualmente compleja y heterogénea, cuyos miembros son de pequeño tamaño (16-42 kD) y poseen un dominio “alfa-cristalina” muy conservado. Estas proteínas están implicadas en protección frente a estrés abiótico mediante la estabilización de proteínas y membranas, si bien su mecanismo de acción se conoce de forma incompleta. A pesar del evidente potencial aplicado de las proteínas sHSP, son muy escasos los estudios realizados hasta el momento con un enfoque netamente biotecnológico. Por otra parte, casi todos ellos se han llevado a cabo en especies herbáceas de interés agronómico o en especies modelo, como Arabidopsis thaliana. De ahí que las sHSP de arbóreas hayan sido mucho menos caracterizadas estructural y funcionalmente, y ello a pesar del interés económico y ecológico de los árboles y de su prolongada exposición vital a múltiples factores estresantes. La presente Tesis Doctoral se centra en el estudio de sHSP de varias especies arbóreas de interés económico. El escrutinio exhaustivo de genotecas de cDNA de órganos vegetativos nos ha permitido identificar y caracterizar los componentes mayoritarios de tallo en dos especies productoras de madera noble: nogal y cerezo. También hemos caracterizado la familia completa en chopo, a partir de su secuencia genómica completa. Mediante expresión heteróloga en bacterias, hemos analizado el efecto protector de estas proteínas in vivo frente a distintos tipos de estrés abiótico, relevantes para el sector productivo. Los resultados demuestran que las proteínas sHSP-CI: (i) aumentan la viabilidad celular de E.coli frente a casi todos estos factores, aplicados de forma individual o combinada; (ii) ejercen un rol estabilizador de las membranas celulares frente a condiciones adversas; (iii) sirven para mejorar la producción de otras proteínas recombinantes de interés comercial. El efecto protector de las proteínas sHSP-CI también ha sido analizado in planta, mediante la expresión ectópica de CsHSP17.5-CI en chopos. En condiciones normales de crecimiento no se han observado diferencias fenotípicas entre las líneas transgénicas y los controles, lo que demuestra que se pueden sobre-expresar estas proteínas sin efectos pleiotrópicos deletéreos. En condiciones de estrés térmico, por el contrario, los chopos transgénicos mostraron menos daños y un mejor crecimiento neto. En línea con lo anterior, las actividades biológicas de varias enzimas resultaron más protegidas frente a la inactivación por calor, corroborando la actividad chaperona propuesta para la familia sHSP y su conexión con la tolerancia al estrés abiótico. En lo que respecta a la multiplicación y propagación de chopo in vitro, una forma de cultivo que comporta estrés para las plantas, todas las líneas transgénicas se comportaron mejor que los controles en términos de producción de biomasa (callos) y regeneración de brotes, incluso en ausencia de estrés térmico. También se comportaron mejor durante su cultivo ex vitro. Estos resultados tienen gran potencial aplicado, dada la recalcitrancia de muchas especies vegetales de interés económico a la micropropagación y a la manipulación in vitro en general. Los resultados derivados de esta Tesis, aparte de aportar datos nuevos sobre el efecto protector de las proteínas sHSP citosólicas mayoritarias (clase CI), demuestran por vez primera que la termotolerancia de los árboles puede ser manipulada racionalmente, incrementando los niveles de sHSP mediante técnicas de ingeniería genética. Su interés aplicado es evidente, especialmente en un escenario de calentamiento global. ABSTRACT Abiotic stress produces considerable economic losses in the forest sector, with extreme temperature and drought being amongst the most relevant factors. As sessile organisms, plants have acquired molecular strategies to detect and recognize stressful factors and activate appropriate responses. A wealth of evidence has correlated such responses with the massive induction of proteins belonging to the molecular chaperone family. Molecular chaperones are proteins which interact with incorrectly folded proteins to help them refold to their native state. In contrast to other eukaryotes, the most prominent stress-induced molecular chaperones of plants belong to the sHSP (small Heat Shock Protein) family. sHSPs are a widespread and diverse class of molecular chaperones that range in size from 16 to 42k Da, and whose members have a highly conserved “alpha-crystallin” domain. sHSP proteins play an important role in abiotic stress tolerance, membrane stabilization and developmental processes. Yet, their mechanism of action remains largely unknown. Despite the applied potential of these proteins, only a few studies have addressed so far the biotechnological implications of this protein family. Most studies have focused on herbaceous species of agronomic interest or on model species such as Arabidopsis thaliana. Hence, sHSP are poorly characterized in long-lived woody species, despite their economic and ecological relevance. This Thesis studies sHSPs from several woody species of economic interest. The most prominent components, namely cytosolic class I sHSPs, have been identified and characterized, either by cDNA library screening (walnut, cherry) or by searching the complete genomic sequence (poplar). Through heterologous bacterial expression, we analyzed the in vivo protective effects of selected components against abiotic stress. Our results demonstrate that sHSP-CI proteins: (i) protect E. coli cells against different stressful conditions, alone or combined; (ii) stabilize cell membranes; (iii) improve the production of other recombinant proteins with commercial interest. The effects of CsHSP17.5-CI overexpression have also been studied in hybrid poplar. Interestingly, the accumulation of this protein does not have any appreciable phenotypic effects under normal growth conditions. However, the transgenic poplar lines showed enhanced net growth and reduced injury under heat-stress conditions compared to vector controls. Biochemical analysis of leaf extracts revealed that important enzyme activities were more protected in such lines against heat-induced inactivation than in control lines, lending further support to the chaperone mode of action proposed for the sHSP family. All transgenic lines showed improved in vitro and ex vitro performance (calli biomass, bud induction, shoot regeneration) compared to controls, even in the absence of thermal stress. Besides providing new insights on the protective role of HSP-CI proteins, our results bolster the notion that heat stress tolerance can be readily manipulated in trees through genetic engineering. The applied value of these results is evident, especially under a global warming scenario.

Digestibilidad y respuesta ovárica de conejas reproductoras alimentadas con dietas suplementadas con ácidos grasos poliinsaturados n-3

Aumentar el número de gazapos destetados por coneja y parto es un objetivo importante para incrementar la rentabilidad del sector cunícola industrial con efectos directos. La mejora genética de la prolificidad en las líneas de madres ha demostrado ser una estrategia eficaz para alcanzar este objetivo; sin embargo otras vías, como la influencia de diferentes fuentes de grasa en las dietas de conejas reproductoras, han sido muy poco estudiadas. Los ácidos grasos (AG) n-3 interfieren en la fisiología reproductiva porque pueden modular las enzimas involucradas en el metabolismo de las prostaglandinas y del colesterol que es el precursor de los esteroides como la progesterona (revisado en Gulliver et al., 2012). El objetivo de este trabajo es estudiar si la suplementación con AG poliinsaturados (PUFA) n-3 de las dietas de conejas durante la recría puede afectar a la tasa de ovulación y a la síntesis esteroidogénica ovárica determinada mediante las concentraciones de progesterona plasmática.

Variation among origins in nutrient composition and protein quality of soybean meals

Investigación sobre las variaciones en la composición y en la calidad de las proteinas de la alimentación animal basada en la soja en función de los orígenes

Ensayo de fertilización foliar sobre regenerado de pino rodeno en Cuéllar (Segovia)

El regenerado de Pinus pinaster Ait. en la tierra de pinares segoviana presenta frecuentemente, en estado de monte bravo, un desarrollo deficiente de la guía y de las ramas del tercio superior de la copa. El objetivo del presente estudio es tratar de determinar si este deficiente desarrollo está relacionado con alguna carencia nutricional. Para ello se realiza un ensayo de fertilización foliar y se analiza su influencia sobre la Longitud de las acículas y la Longitud de los ramillos desarrollados en el periodo vegetativo siguiente a la fertilización. Se consideran cuatro localizaciones diferentes y tres tratamientos distintos (Testigo, T, sin fertilización; fertilización simple, F; y fertilización doble, FF).

Nuevas ecuaciones de cubicación para pino silvestre en "aguas vertientes" (El Espinar, Segovia).

El monte "Aguas Vertientes" (El Espinar) es el nº 138 del C.U.P. de Segovia. Se trata de una masa natural de pino silvestre, con abundante melojo en sus cotas inferiores. Su primer Proyecto de Ordenación fue redactado en 1904, estando actualmente redactada y en fase de aprobación la novena revisión. La madera de pino obtenida es elaborada en un aserradero cercano, perteneciente a la misma entidad propietaria. Durante los últimos años los responsables de dicho aserradero vienen manifestando que la cubicación en pie realizada por la administración forestal presenta errores de magnitud suficiente como para ser necesaria su corrección. Este trabajo fin de carrera ha consistido en comprobar la fiabilidad de los valores modulares empleados hasta ahora, y elaborar nuevas ecuaciones de cubicación. Para ello se ha manejado una muestra de 234 pinos repartidos en malla cuadrada y cubicados en pie mediante el método de Pressler-Bitterlich. Como resultado, se propone una ecuación de doble entrada (función de diámetro normal y altura) para todo el monte; y una ecuación de una entrada (función de diámetro normal) para cotas superiores e inferiores a 1.500 m. Los nuevos modelos son validados mediante una muestra independiente.