Canine distemper virus : persistence and pathology in the central nervous system

Résumé : Le virus de la maladie de Carré (en anglais: canine distemper virus, CDV) qui est pathogène pour les chiens et autres carnivores, est très semblable au virus de la rougeole humaine (en anglais MV). Ces deux virus font partie du genre des Morbillivirus qui appartient à la famille des Paramyxoviridae. Ils induisent des complications dans le système nerveux central (SNC). Au stade précoce et aigu de l'infection du SNC, le CDV induit une démyélinisation (1). Ce stade évolue dans certains cas vers une infection chronique avec progression de la démyélinisation. Pendant le stade précoce, qui suit en général de trois semaines les premiers symptômes, le processus de démyélinisation est associé à la réplication du virus et n'est pas considéré comme inflammatoire (1). Par contre, au stade chronique, la progression des plaques de démyélinisation semble être plutôt liée à des processus immunogènes caractéristiques (2), retrouvés également dans la sclérose en plaques (SEP) chez les humains. Pour cette raison, le CDV est considéré comme un modèle pour la SEP humaine et aussi pour l'étude des maladies et complications induites par les Morbillivirus en général (3). Dans notre laboratoire, nous avons utilisé la souche A75/17-CDV, qui est considérée comme le modèle des souches neurovirulentes de CDV. Nous avons cherché en premier lieu à établir un système robuste pour infecter des cultures neuronales avec le CDV. Nous avons choisi les cultures primaires de l'hippocampe du nouveau-né de rat (4), que nous avons ensuite infecté avec une version modifiée du A75/17, appelée rgA75/17-V (5). Dans ces cultures, nous avons prouvé que le CDV infecte des neurones et des astrocytes. Malgré une infection qui se diffuse lentement entre les cellules, cette infection cause une mort massive aussi bien des neurones infectés que non infectés. En parallèle, les astrocytes perdent leur morphologie de type étoilé pour un type polygonal. Finalment, nous avons trouvé une augmentation importante de la concentration en glutamate dans le milieu de culture, qui laisse présumer une sécrétion de glutamate par les cultures infectées (6). Nous avons ensuite étudié le mécanisme des effets cytopathiques induits par le CDV. Nous avons d'abord démontré que les glycoprotéines de surface F et H du CDV s'accumulent massivement dans le réticulum endoplasmique (RE). Cette accumulation déclenche un stress du RE, qui est caractérisé par une forte expression du facteur de transcription proapoptotique CHOP/GADD 153 et de le la calreticuline (CRT). La CRT est une protéine chaperonne localisée dans le RE et impliquée dans l'homéostasie du calcium (Ca2+) et dans le repliement des protéines. En transfectant des cellules de Vero avec des plasmides codant pour plusieurs mutants de la glycoprotéine F de CDV, nous avons démontré une corrélation entre l'accumulation des protéines virales dans le RE et l'augmentation de l'expression de CRT, le stress du RE et la perte de l'homéostasie du Ca2+. Nous avons obtenu des résultats semblables avec des cultures de cellules primaires de cerveau de rat. Ces résultats suggèrent que la CRT joue un rôle crucial dans les phénomènes neurodégénératifs pendant l'infection du SNC, notamment par le relazgage du glutamate via le Ca2+. De manière intéressante, nous démontrons également que l'infection de CDV induit une fragmentation atypique de la CRT. Cette fragmentation induit une re-localisation et une exposition sélective de fragments amino-terminaux de la CRT, connus pour êtres fortement immunogènes à la surface des cellules infectées et non infectées. A partir de ce résultat et des résultats précédents, nous proposons le mécanisme suivant: après l'infection par le CDV, la rétention dans le RE des protéines F et H provoque un stress du RE et une perte de l'homéostasie du Ca2+. Ceci induit la libération du glutamate, qui cause une dégénération rapide du SNC (sur plusieurs jours ou semaines) correspondant à la phase aiguë de la maladie chez le chien. En revanche, les fragments amino-terminaux de la CRT libérés à la surface des cellules infectées peuvent avoir un rôle important dans l'établissement d'une démyélinisation d'origine immunogène, typique de la phase chronique de l'infection de CDV. Summary : The dog pathogen canine distemper virus (CDV), closely related to the human pathogen measles virus (MV), belongs to the Morbillivirus genus of the Paramyxoviridae family. Both CDV and NIV induce complications in the central nervous system (CNS). In the acute early stage of the infection in CNS, the CDV infection induces demyelination. This stage is sometimes followed by a late persistent stage of infection with a progression of the demyelinating lesions (1). The acute early stage occurs around three weeks after the infection and demyelinating processes are associated with active virus replication and are not associated to inflammation (1). In contrast during late persistent stage, the demyelination plaque progression seems to be mainly due to an immunopathological process (2), which characteristics are shared in many aspects with the human disease multiple sclerosis (MS). For these reasons, CDV is considered as a model for human multiple sclerosis, as well as for the study of Morbillivirus-mediated pathogenesis (3). In our laboratory, we used the A75/17-CDV strain that is considered to be the prototype of neurovirulent CDV strain. We first sought to establish a well characterized and robust model for CDV infection of a neuronal culture. We chose primary cultures from newborn rat hippocampes (4) that we infected with a modified version of A75/17, called rgA75/17-V (5). In these cultures, we showed that CDV infects both neurons and astrocytes. While the infection spreads only slowly to neighbouring cells, it causes a massive death of neurons, which includes also non-infected neurons. In parallel, astrocytes undergo morphological changes from the stellate type to the polygonal type. The pharmacological blocking of the glutamate receptors revealed an implication of glutamatergic signalling in the virus-mediated cytopathic effect. Finally, we found a drastic increase concentration of glutamate in the culture medium, suggesting that glutamate was released from the cultured cells (6). We further studied the mechanism of the CDV-induced cytopathic effects. We first demonstrated that the CDV surface glycoprotein F and H markedly accumulate in the endoplasmic reticulum (ER). This accumulation triggers an ER stress, which is characterized by increased expression of the proapoptotic transcription factor CHOP/GADD 153 and calreticulin (CRT). CRT is an ER resident chaperon involved in the Ca2+ homeostasis and in the response to misfolded proteins. Transfections of Vero cells with plasmids encoding various CDV glycoprotein mutants reveal a correlation between accumulation of viral proteins in the ER, CRT overexpression, ER stress and alteration of ER Ca2+ homeostasis. Importantly, similar results are also obtained in primary cell cultures from rat brain. These results suggest that CRT plays a crucial role in CNS infection, particularly due to CRT involvement in Ca2+ mediated glutamate releases, and subsequent neurodegenerative disorders. Very intriguingly, we also demonstrated that CDV infection induces an atypical CRT fragmentation, with relocalisation and selective exposure of the highly immunogenic CRT N-terminal fragments at the surface of infected and neighbouring non-infected cells. Altogether our results combined with previous findings suggest the following scenario. After CDV infection, F and H retention alter Ca2+ homeostasis, and induce glutamate release, which in turn causes rapid CNS degeneration (within days or a week) corresponding to the acute phase of the disease in dogs. In contrast, the CRT N-terminal fragments released at the surface of infected cells may rather have an important role in the establishment of the autoimmune demyelination in the late stage of CDV infection.

Isolated limb perfusion with tumor necrosis factor and melphalan for non-resectable soft tissue sarcomas : long-term results on efficacy and limb salvage in a selected group of patients

Rapport de synthèse : Introduction : La perfusion isolée de membre (isolated limb perfusion, ou ILP) par TNF-alpha et melphalan, utilisés en association, est une stratégie de prise en charge chirurgicale des sarcomes non opérables des extrémités. Elle a été en partie développée au CHUV dans les années 1990, sous l'impulsion du Professeur F. Lejeune, ancien Chef du Service d'oncologie médicale (CePO). Les résultats des 31 premiers patients ont été publiés en 2000 dans l'European Journal of Surgical Oncology. Les données dans la littérature manquant sur les résultats à long terme, nous avons revu tous les patients traités au CHUV depuis 1992 pour tenter des de déterminer ces résultats à long terme, en se focalisant sur l'efficacité du traitement, symbolisée par le taux de sauvetage de membres, autrement condamnés à l'amputation ou à une chirurgie mutilante. Matériel et méthode : Etude rétrospective. De 1992 à mars 2006, 51 patients ont été traités par ILP dans notre institution, certains à deux reprises (58 ILP au total). Quatre-vingt-huit pour cent présentaient un sarcome de haut grade de malignité, et 84% une tumeur localement avancée (T2b NO Mo ou plus). Résultats : Le follow-up moyen est de 38.9 mois (4-159, médiane 22 mois), on note 21 % de complications immédiates et 23% de complications tardives ou chroniques. Une réponse complète (nécrose totale ou disparition de la tumeur) a été observée dans 25% des cas, une réponse partielle (>50% de nécrose ou de diminution de taille tumorale) dans 42%, une stabilité de la maladie dans 14% et une progression tumorale dans 14%. Un traitement adjuvant a été entrepris dans 31 % des cas, une résection des résidus tumoraux a pu être effectuée chez 65% des patients. On note un taux de récidive locale de 35% (après 20,3 mois en moyenne) et un taux de récidive à distance de 45% (après 13,4 mois en moyenne). Le disease-free survival est de 14,9 mois et la survie à 5 ans de 43,5%. Le taux d'amputation s'élève à 24%. Conclusion : La perfusion isolée de membre est un traitement grevé d'un taux élevé de complications, mais il peut étre entrepris dans les sarcomes les plus sévères avec un succès significatif. Ainsi, dans notre série, une chirurgie mutilante (en général l'amputation) a pu être épargnée à 76% des patients.

Maladie de Fabry. Analyse sémiologique de 17 familles en France et en Suisse

Etude de cohorte en France et en Suisse (7 centres). Analyse sémiologique des cas de maladie de Fabry (MF). Les cas index étaient 12 H, 5 F : âgemoyen au diagnostic 30 (9-58) et 34 ans (10-49), resp. Chez les H, le 1er symptôme était : acroparesthésies (acroP) (n=9) en moyenne à 8 ans (4-19). Le délai moyen premier symptôme-MF était de 17 ans (0-51), plus court en cas d'acroP qu'en cas d'autre symptôme révélateur (12.3 vs 19.6 ans). Les acroP « négligées » retardaient le diagnostic : angiokératomes (n=1, délai 28 ans), AVC du sujet jeune (n=2, délais 20 et 24 ans), insuffisance rénale terminale (n=1, délai 51 ans). Deux patients avaient une sémiologie complète : acroP, angiokératomes, hypohidrose, cornée verticillée, atteinte cérébrale, rénale (2 transplantations), cardiaque. Une hypoacousie était fréquente (n=6). Les errances diagnostiques ont été : SEP, neurobrucellose, PAN, cardiomyopathie hypertensive malgré l'absence d'HTA. Chez les F, le 1er symptôme était : acroP (n=3), cornée verticillée (n=1), angiokératomes (n=1). Le délai premier symptôme-MF était en moyenne de 15.6 ans (0-37). Tous les patients, à l'exception d'1 F, sont sous traitement enzymatique. Dans leurs familles, 47 autres cas (27H/20F) ont été diagnostiqués. La MF est à transmission dominante liée à l'X, avec expressivité variable. Elle atteint l'homme et la femme. Le diagnostic est trop tardif : l'interniste doit connaître la MF pour laquelle existe un traitement par alpha-galactosidase.

Almost routine prophylactic cholecystectomy during laparoscopic gastric bypass is safe

RAPPORT DE SYNTHESE : Introduction : les patients obèses morbides présentent un risque majeur de développer des calculs biliaires en raison d'une sécrétion accrue de cholestérol dans la bile. Ce risque, davantage élevé dans la phase de perte pondérale rapide consécutive à la chirurgie bariatrique ou lors de régimes amaigrissants, est souvent la cause de nombreux symptômes, voire de complications biliaires. Aussi l'association d'une cholécystectomie à la chirurgie bariatrique, notamment le bypass gastrique laparoscopique a-t-elle été proposée afin d'éviter ces complications parfois redoutables dans cette population fragile. Ce concept a cependant fait l'objet de démentis dans de récentes études où ce risque apparaîtrait moins élevé, et la cholécystectomie durant le by- pris gastrique laparoscopique pourrait être grevée de difficultés et présenter des risques opératoires non négligeables pour le patient. Patients et méthodes : notre série comporte 772 patients opérés entre 2000 et 2007 par by-pass gastrique laparoscopique, avec montage d'une anse en Y selon Roux. Ces patients obèses morbides avaient été sélectionnés sur la base d'une anamnèse concluante, d'un examen anthropométrique, d'un bilan sanguin et d'un ultrason abdominal. Une analyse rétrospective des résultats d'ultrason abdominal préopératoire et des rapports histopathologiques des vésicules biliaires en postopératoire a été réalisée chez les patients opérés avant 2004. Résultats : 58 patients (7,5 %) avaient déjà eu une cholécystectomie. L'US abdominal a révélé des calculs ou de la boue biliaire chez 81 patients (11,3 %), un polype chez un patient et une vésicule biliaire normale chez les patients restants. La cholécystectomie a été réalisée concomitamment au by-pass gastrique chez 66S patients (91,7 %) et des calculs biliaires retrouvés à l'examen per-opératoire des vésicules biliaires chez 25 patients (3,9 %), rapportant alors la prévalence de la cholélithiase à 21,2 % dans cette population. L'âge des patients porteurs de calculs biliaires était significativement plus élevé que celui des patients sans calculs biliares (43,5 contre 38,7 ans, P < 0,0001). A l'examen histopathologique, des anomalies ont été décrites dans 81,8 % des vésicules biliaires, consistant pour la plupart en cholécystite chronique et cholestérolose. Aucune complication post-opératoire n'a été associée à la cholécystectomie et le prolongement du temps opératoire était en moyenne de 19 minutes (4 - 45 minutes) sans aucun impact sur le séjour hospitalier. La cholécystectomie n'a pas été réalisée chez 59 patients (8,3 %) en raison de conditions opératoires défavorables, notamment une exposition insuffisante. Un traitement d'acide ursodésoxycholique a été prescrit sur une période de 6 mois et aucun de ces patients n'a manifesté de symptômes biliaires. Conclusion : la cholécystectomie peut être réalisée à titre prophylactique et en toute sécurité au cours du by-pass gastrique laparoscopique. Cet acte opératoire supplémentaire sans conséquence sur le séjour hospitalier, constitue selon la présente étude une forme de prophylaxie recommandable dans la prévention de la formation des calculs biliaires dans la phase de perte pondérale post-opératoire. Sa supériorité ou non par rapport à la prophylaxie médicamenteuse à l'acide ursodésoxycholique n'a pas encore été établie. Des études prospectives randomisées seraient nécessaires afin de confirmer l'avantage de l'une ou l'autre de ces deux alternatives.

Pollution bactérienne autour des installations d'élevages intensifs d'animaux de rente

Les élevages intensifs d'animaux de rente, en particulier ceux de bovins et de porcins sont nombreux en France et sont concentrés dans certaines régions (Bretagne, Normandie, Massif central, Alpes, Pyrénées). Au total, on dénombre environ 20 millions de bovins répartis dans 280 000 exploitations et 25 millions de porcs répartis dans 30 000 exploitations. Ceci représente en moyenne 70 vaches/exploitation et 830 porcs/exploitation. De telles densités d'animaux réunis sur des surfaces de taille minimale, génèrent d'énormes quantités de déchets organiques, notamment de matières fécales qui contiennent une grande diversité de bactéries, pouvant parfois être pathogènes pour l'humain. Une partie de ces bactéries sont des bactéries gram négatif (entérobactéries) dont les parois contiennent des endotoxines (1). Ces endotoxines sont connues pour causer des problèmes respiratoires ou des problèmes toxiques (ODTS) (2), lorsqu'elles sont inhalées (Cole, Todd, Wing ; 2000). Jusqu'à présent, plusieurs études se sont attachées à évaluer l'exposition à ces bioaérosols (3) à l'intérieur des élevages d'animaux (vaches, chevaux, porcs, poules) et ont démontré la présence d'importantes concentrations de bactéries et d'endotoxines aéroportées. Cependant, très peu d'études ont estimé la dispersion de ces bioaérosols à l'extérieur des installations d'élevages. En 2008, une étude américaine avait caractérisé les bactéries aéroportées retrouvées dans,et autour, d'une douzaine d'exploitations porcines. Cette étude avait été discutée dans le cadre d'une note d'actualité scientifique précédente (BVS 9). Aujourd'hui, ces mêmes auteurs nous livrent des résultats concernant l'exposition aux endotoxines dans et autour de ces mêmes élevages de porcs (Ko et al., 2010). Une autre équipe de recherche chinoise a estimé la dispersion d'Escherichia coli dans l'environnement immédiat d'exploitations porcines (Yuan, Chai, Miao ; 2010). Cette bactérie, appelée aussi coliforme, fait partie de la flore intestinale normale de tous les animaux à sang chaud (mammifères et oiseaux). Sa mise en évidence dans certains milieux,notamment l'eau, est utilisée comme indicateur de contamination fécale. Finalement, une autre étude vient de paraître concernant les concentrations en endotoxines au cours de l'année, à proximité de stabulations ouvertes de vaches laitières (Dungan, Leytem, Bjorneberg ; 2010). Ce sont ces trois articles qui sont analysés ci-dessous. [Auteure]

Reproductibilité et discussion des différents biais d'un questionnaire de fréquence alimentaire adapté à une population de femmes suisses âgées (>75ans)

Résumé: Un des domaines de prédilection de la recherche préventive en ostéoporose, est l'alimentation. L'étude « EVANIBUS » s'inscrit dans le cadre de cette recherche. Un de ses buts est de cibler à travers un questionnaire de fréquence alimentaire chez une population féminine âgée de plus de 75 ans, l'alimentation à risque pour l'ostéoporose. Le choix du questionnaire pour cette étude s'est porté sur le «Food Frequency Questionnaire», élaboré et validé sur une population pré-ménopausique écossaise par Susan New. Ce questionnaire se répartit en différents groupes et sous-groupes alimentaires. A l'aide de tables nutritionnelles les principaux micronutriments essentiels à la santé osseuse contenus dans lés sous-groupes alimentaires ont été calculés. Avant d'utiliser un questionnaire de fréquence alimentaire dans une population différente, il est nécessaire de procéder à une adaptation et une nouvelle validation du questionnaire. Cependant, cette procédure nécessite la collaboration d'un spécialiste en nutrition. Pour cette raison, seule la reproductibilité du questionnaire a été testée. Le test choisi est la première et deuxième étape du test de Bland-Altman. La reproductibilité s'établit entre les 2 mesures (1 mois d'intervalle) de la fréquence moyenne de consommation obtenue pour chaque item (groupes et sous-groupes alimentaires). Les résultats montrent que seule une minorité d'item présente une acceptation des 2 étapes du test de Bland-Altman. Pour expliquer cette mauvaise reproductibilité, les biais systématiques ont été mis en évidence et analysés en détails. Les erreurs dues à la méthodologie sont également analysées. Ces dernières sont en principe évitables. C'est l'absence d'adaptation du questionnaire qui semble en être la cause principale. A cet effet des mesures de correction sont proposées, telles qu'un pilotage du questionnaire dans un échantillon de la population cible. L'analyse du questionnaire relève également une diminution globale de la consommation lors de la deuxième mesure. On émet alors, l'hypothèse d'une influence météorologique par l'intermédiaire d'une hausse des températures.

Incidence et pronostic des métastases ganglionnaires dans les sarcomes des membres

Introduction : Bien que rares chez l'adulte, les sarcomes des tissus mous restent une maladie au pronostic très sombre. En effet, leur survie globale à 5 ans est de 50 % chez la femme et de 41 % chez l'homme. De plus, ils sont particulièrement difficiles à traiter, en raison de leur agressivité, de leur résistance face aux chimiothérapies et à la radiothérapie et d'autre part leur localisation conduit souvent à des opérations mutilantes. Pour les sarcomes des membres, il existe une opération appelée perfusion isolée du membre (ILP). Cela consiste à réaliser une chimiothérapie par voie intra-artérielle, en isolant le membre qui est perfusé par une solution Melphalan et de Tumor Necrosis Factor α à l'aide d'une circulation extra-corporelle pour son oxygénation. Ce type de traitement est à visée palliative, évitant une amputation du membre atteint. Pour accéder aux vaisseaux permettant la canulation de la pompe, un curage ganglionnaire est généralement effectué. Patients et méthode : Pour cette étude rétrospective, nous avons analysé la base de données des 278 ILP réalisées au Centre Hospitalier Universitaire Vaudois (CHUV) à Lausanne depuis mai 1988. Nous avons extrait et analysé de cette étude rétrospective 57 ILP réalisées pour des sarcomes. L'étude porte sur 52 patients traités entre le 19 février 1992 et le 14 décembre 2011, après avoir exclu les patients n'ayant pas bénéficié d'un curage ganglionnaire et la seconde ILP pour 4 patients qui en ont eu 2. Pour chacun de ces patients, les protocoles opératoires, les rapports d'examens radiologiques ainsi que les rapports de pathologies ont été revus et analysés. Nous avons également effectué une revue de la littérature sur PubMed. Résultats : Il y avait 28 hommes (53.8%) et 24 femmes (46.2 %). L'âge moyen au moment de l'ILP était de 56,7 ans (écart-type 16,8). Seul 3 patients sur les 52 avaient des métastases à distance au moment du diagnostic. Le curage ganglionnaire radical a montré que 13 patients (25 %) avaient une atteinte des ganglions lymphatiques (N+). Parmi les types histologiques qui ont présenté au moins une métastase ganglionnaire, on retrouve 2 léomyosarcomes, 2 sarcomes indifférenciés (anciennement MFH), 3 sarcomes épithélioïdes, 4 angiosarcomes et 2 synoviosarcomes. Pour les patients N0, la survie globale moyenne estimée par la méthode de Kaplan et Meier a été de 95,98 mois (CI 95% 66,72-125,23 mois). Pour les patients N1 la survie globale moyenne a chuté à 28,72 mois (CI 95% 6,48-50,97). Le test du Log Rank donne un Chi2 de 9,659 (P=0,002). La moyenne de survie sans maladie a été de 38,03 mois pour le groupe (N0) et de 10,87 mois pour le groupe N1, (CI 95 % 25,75-50,3 et 1,87-19,88 respectivement) et une valeur de P= 0.006. Nous n'avons pas mis en évidence de différence de survie statistiquement significative (P=0.946) entre les types ou les grades histologiques, en raison de la taille du collectif. Conclusion : Bien que rares, les métastases ganglionnaires des sarcomes des membres ont un impact négatif sur la survie à long terme du patient. Les résultats obtenus montrent qu'un curage peut participer au traitement régional et confirme la nécessité de pratiquer systématiquement une lymphadénectomie radicale en vue d'offrir les meilleures chances de survie au patient. Il faudrait donc se poser la question si la présence de métastases ganglionnaires ne devrait pas modifier la prise en charge pour tendre vers un traitement plus agressif chez de tels patients. Ce qui n'est pas le cas à l'heure actuelle.

Identification and quantification techniques in mass spectrometry-based proteomics

Résumé La protéomique basée sur la spectrométrie de masse est l'étude du proteome l'ensemble des protéines exprimées au sein d'une cellule, d'un tissu ou d'un organisme - par cette technique. Les protéines sont coupées à l'aide d'enzymes en plus petits morceaux -les peptides -, et, séparées par différentes techniques. Les différentes fractions contenant quelques centaines de peptides sont ensuite analysées dans un spectromètre de masse. La masse des peptides est enregistrée et chaque peptide est séquentiellement fragmenté pour en obtenir sa séquence. L'information de masse et séquence est ensuite comparée à une base de données de protéines afin d'identifier la protéine d'origine. Dans une première partie, la thèse décrit le développement de méthodes d'identification. Elle montre l'importance de l'enrichissement de protéines comme moyen d'accès à des protéines de moyenne à faible abondance dans le lait humain. Elle utilise des injections répétées pour augmenter la couverture en protéines et la confiance dans l'identification. L'impacte de nouvelle version de base de données sur la liste des protéines identifiées est aussi démontré. De plus, elle utilise avec succès la spectrométrie de masse comme alternative aux anticorps, pour valider la présence de 34 constructions de protéines pathogéniques du staphylocoque doré exprimées dans une souche de lactocoque. Dans une deuxième partie, la thèse décrit le développement de méthodes de quantification. Elle expose de nouvelles approches de marquage des terminus des protéines aux isotopes stables et décrit la première méthode de marquage des groupements carboxyliques au niveau protéine à l'aide de réactifs composé de carbone 13. De plus, une nouvelle méthode, appelée ANIBAL, marquant tous les groupements amines et carboxyliques au niveau de la protéine, est exposée. Summary Mass spectrometry-based proteomics is the study of the proteome -the set of all expressed proteins in a cell, tissue or organism -using mass spectrometry. Proteins are cut into smaller pieces - peptides - using proteolytic enzymes and separated using different separation techniques. The different fractions containing several hundreds of peptides are than analyzed by mass spectrometry. The mass of the peptides entering the instrument are recorded and each peptide is sequentially fragmented to obtain its amino acid sequence. Each peptide sequence with its corresponding mass is then searched against a protein database to identify the protein to which it belongs. This thesis presents new method developments in this field. In a first part, the thesis describes development of identification methods. It shows the importance of protein enrichment methods to gain access to medium-to-low abundant proteins in a human milk sample. It uses repeated injection to increase protein coverage and confidence in identification and demonstrates the impact of new database releases on protein identification lists. In addition, it successfully uses mass spectrometry as an alternative to antibody-based assays to validate the presence of 34 different recombinant constructs of Staphylococcus aureus pathogenic proteins expressed in a Lactococcus lactis strain. In a second part, development of quantification methods is described. It shows new stable isotope labeling approaches based on N- and C-terminus labeling of proteins and describes the first method of labeling of carboxylic groups at the protein level using 13C stable isotopes. In addition, a new quantitative approach called ANIBAL is explained that labels all amino and carboxylic groups at the protein level.

Neurologie et voyages

Le mal de voyage, l'insomnie, les troubles du sommeil, la fatigue, le jet-lag et des troubles sensitifs transitoires sont des symptômes très fréquents lors des voyages et pour la plupart banals. Les maladies neurologiques déclenchées ou causées par le voyage sont rares et incluent des accidents vasculaires cérébraux (AVC) liés aux emboles paradoxaux après un voyage prolongé en avion, des crises d'épilepsie ou des troubles du sommeil déclenchés par le décalage horaire, des symptômes de décompression lors de la plongée ou montée en altitude. Dans cet article sont aussi discutées les maladies liées à la haute altitude(céphalée de haute altitude, mal aigu des montagnes), des troubles neurologiques liés à la déshydratation et à la chaleur ainsi que les infections acquises lors de voyages.

Effets bénéfiques du ranélate de strontium compare à l'alendronate sur le TBS chez les femmes ostéoporotiques ménopausées: une étude de 2 ans.

Introduction. - Le TBS ou Score Trabéculaire Osseux (TBS, Med- Imaps, France) est un index d'architecture osseuse apportant des informations indépendantes de la densité minérale osseuse (DMO), et calculé par la quantification des variations locales des niveaux de gris à partir d'examen de densitométrie (DXA) lombaire. Dans des études antérieures prospectives et cas-témoins, cet index a été considéré comme associé aux fractures. Nous avons comparé les effets du ranélate de strontium (RanSr) et de l'alendronate (ALN) sur l'architecture vertébrale à l'aide du TBS, chez des femmes ostéoporotiques ménopausées. Patients et méthodes. - Une analyse post hoc a été réalisée sur des DXA (Hologic and GE Lunar Devices) de 79 des 189 femmes incluses dans une étude en double aveugle et double placebo et réparties de façon randomisée entre un groupe à 2 g/jour de RanSr et un groupe à 70 mg/semaine d'ALN pendant 2 ans. Les paramètres de TBS ont été évalués en aveugle par TBS iNsight (v1,9) au niveau vertébral après 12 et 24 mois de traitement. Nous avons appliqué les règles de l'ISCD (International Society for Clinical Densitometry) pour chaque exclusion de vertèbre, de façon indépendante respectivement pour la DMO et le TBS. Des doubles mesures ayant été réalisées initialement, la reproductibilité est exprimée en % CV. Résultats. - Les caractéristiques initiales (moyenne ± DS) étaient identiques entre les groupes en termes d'âge, 69,2 ± 4,4 ans ; d'IMC, 23,8 ± 4,4 kg/m2 ; de T-score L1-L4, - 2,9 ± 0,9 et de TBS, 1,230 ± 0,09. Comme prévu, le coefficient de détermination entre la DMO et le TBS au niveau du rachis était très basse r2 = 0,12. Les reproductibilités brutes étaient respectivement de 1,1 et 1,6 % pour la DMO et le TBS au niveau vertébral. Après 1 et 2 ans, la DMO en L1-L4 a augmenté de façon significative de respectivement 5,6 % et 9 % dans le groupe RanSr et de respectivement 5,2 % et 7,6 % dans le groupe ALN. De même, le TBS au niveau vertébral a augmenté respectivement de 2,3 % (p < 0,001) et de 3,1 % (p < 0,001) dans le groupe RanSr et de 0,5 % (NS) et de 1 % (NS) dans le groupe ALN avec une différence entre groupe significative en faveur du RanSr (p = 0,04 et p = 0,03). Il n'y avait aucune corrélation entre la différence de DMO et de TBS à 1 ou 2 ans. Les deux traitements étaient bien tolérés. Discussion. - Ces résultats sur le TBS confortent des études précédentes qui sont en faveur de l'effet bénéfique du RanSr sur l'architecture osseuse. Conclusion. - Le ranélate de strontium a des effets plus importants que l'alendronate sur le score trabéculaire osseux, indice d'architecture osseuse au niveau vertébral, chez les femmes ayant une ostéoporose post-ménopausique, après 2 ans de traitement.

A new electrocardiographic criteria for discriminating between Brugada types 2 and 3 patterns and incomplete right bundle branch block

Le syndrome de Brugada, une affection rythmique du sujet jeune potentiellement fatale, se manifeste sur l'ECG par un bloc de branche droit (BBD) complet, avec sus-décalage majeur du segment ST et inversion des ondes Τ de V1 à V3 appelé pattern de type 1. Cette présentation peut être intermittente. Les manifestations incomplètes du syndrome de Brugada sont appelées patterns de types 2 ou 3, et sont caractérisées par un BBD incomplet et un sus-décalage ST plus ou moins prononcé dans les dérivations V-, et V2 de l'ECG. Cette description, cependant, est aussi celle du BBD incomplet fréquemment rencontré chez les sujets jeunes, de moins de 40 ans, et présent dans 3% de la population. Bo nombre de ces sujets sont donc référés pour une recherche de syndrome de Brugada. Le but de cette thèse est donc d'évaluer de nouveaux critères permettant de discriminer les BBD incomplets, banals, des sujets porteurs d'un syndrome de Brugada de types 2 ou 3. Trente-huit patients avec un pattern de Brugada de types 2 et 3, référés pour un test médicamenteux utilisant un antiarythmique révélant un pattern de type 1 chez les sujets porteurs, ont été inclus dans l'étude. Avant le test médicamenteux, deux angles ont été mesurés sur les dérivations Vi et/ou V2 : a, l'angle entre une ligne verticale et la descente de l'onde r', et β, l'angle entre la montée de l'onde S et la descente de l'onde r'. Les mesure à l'état basai des deux angles, seules ou combinées avec la durée du QRS, on été comparées entre les patients avec une épreuve pharmacologique positive et ceux dont l'épreuve s'est révélée négative (i.e. servant de groupe contrôle car porteur d'un véritable BBD incomplet). Des courbes ROC ont été établies afin de déterminer les valeurs d'angles les plus discriminantes. La moyenne des angles β était significativement plus petite chez les 14 patients avec un test pharmacologique négatif comparé aux 24 patients avec un test positif. La valeur optimale pour l'angle β était de 58°, ce qui donnait une valeur prédictive positive de 73% et une valeur prédictive négative de 97% pour une conversion en pattern de type 1 lors du test pharmacologique. L'angle α était un peu moins sensible et spécifique que β. Quand les angles étaient combinés à la durée du QRS, on observait une discrète amélioration de la discrimination entre les deux populations. Notre travail permet donc, chez des patients suspects d'un syndrome de Brugada, de discriminer entre un BBD incomplet et les patterns de Brugada types 2 et 3 en utilisant un critère simple basé sur l'ECG de surface potentiellement applicable au lit du patient

Impact de l'organisation institutionnelle sur le déficit protéino-énergétique des patients dialysés hospitalisés

Introduction et but de l'étude. - Le Nutrition Day 2010 réalisédans le service de dialyse aiguë de notre CHU a montré un taux dedénutrition de 64 % chez le patient dialysé hospitalisé avec un déficitnutritionnel moyen le jour de dialyse de 1 000 kcal et 45 g deprotéines. Les horaires de repas dans l'unité d'hospitalisation et dedialyse au centre de dialyse se chevauchent. Le but de cette étude estd'évaluer l'impact de l'organisation institutionnelle sur l'apportprotéino-énergétique du patient hémodialysé hospitalisé.Matériel et Méthodes. - Étude exploratoire et transversale. Laconsommation alimentaire et les obstacles potentiels à l'alimentationd'origine logistique ont été relevés durant deux jours consécutifs,un jour de dialyse (JD) et un jour sans dialyse (JSD). Les motifsde non consommation ou de consommation partielle des repas etcollations ont été relevés auprès des patients immédiatement aprèsles repas principaux, au moyen d'entretiens semi-dirigés. Lesingesta ont été comparés aux besoins protéino-énergétiques pour lespatients hémodialysés (ESPEN, 2006). Une évaluation nutritionnellea été réalisée chez tous les patients.Résultats. - Vingt-six patients (85 % d'hommes) ont été inclus,âgés de 65,7 ± 10,6 ans (moy ± ET). Le BMI moyen est de 24,9± 5,9 kg/m2, le score de Charlson de 7,2 ± 2,7 et 54 % ont un NRS-2002 ≥ 3. Plus de deux tiers des patients (68 %) ont perdu du poidset 64 % sont dénutris. Au total, 147 repas et 56 collations ont été étudiés,dont 74 repas et 32 collations pour le JD. Le JD, 56 % des collationsne sont pas consommées contre 21 % le JSD. La couverturemoyenne des besoins énergétiques et protéiques le JD est respectivementde 48 % et 57 %, sans différence avec le JSD. Les motifs denon consommation les plus fréquemment cités sont, par ordredécroissant : satiété précoce, inappétence, dégoût des mets proposés,peurs et représentations alimentaires et mises à jeun pour procéduresmédicales. Ils sont identiques les JD et les JSD. Lesobstacles à l'alimentation inhérents au patient sont 2,6 fois plus fréquentsque ceux liés à l'organisation hospitalière. Une douleur(légère à modérée), une dyspnée et une xérostomie affectent respectivement100 %, 54 % et 48 % des patients, qui ne considèrent pasces symptômes comme une cause de non consommation alimentaire.Conclusion. - Les apports protéino-énergétiques sont insuffisantset près de deux tiers des sujets sont dénutris. L'organisationhospitalière n'est pas identifiée par les patients comme un obstacleexpliquant le déficit énergétique et protéique quotidien. Les obstaclesà l'alimentation orale sont principalement inhérents à l'état desanté des patients. L'instauration d'une alimentation spécifique auxpatients dialysés hospitalisés (« humide », fractionnée, enrichie enprotéines et en énergie) de même que la prescription plus systématiqued'un support nutritionnel devraient contribuer à la couverturede leurs besoins nutritionnels.

Psychotropic drug prescriptions in hospitalized ederly psychiatric patients: comparison with adult psychiatric patients

RÉSUMÉ Comparaison dés habitudes de prescription de médicaments psychotropes dans des cliniques de psychiatrie adulte et de psychogériatrie Afin de pouvoir comparer l'utilisation de médicaments psychotropes et non psychotropes, la proportion des nouveaux et celle des anciens antidépresseurs ou antipsychotiques, ce travail a eu pour but d'étudier les prescriptions médicamenteuses dans deux groupes de patients hospitalisés, l'un en milieu psychiatrique adulte (de 18 à 64 ans), l'autre en milieu psychogériatrique (plus de 64 ans). Lors d'un jour de référence en Mai 2000, toutes les prescriptions médicamenteuses dans deux hôpitaux psychiatriques universitaires abritant l'un une population adulte, l'autre gériatrique, ont été relevées chez tous les patients. Le coût financier total par patient a été comparé en tenant compte de la proportion des médicaments non psychotropes. La médication de 61 patients adultes et de 82 patients gériatriques a ainsi été analysée. Le nombre moyen de médicaments non psychotropes par patient était plus élevé dans la population âgée (p< 0.001), ce qui se reflète également par une prescription totale de médicaments par patient en moyenne plus élevée dans cette population (p<0.001). L'utilisation de benzodiazépines était inférieure dans là population psychogériatrique (p<0.001), même si l'on y additionne celle en association avec les antidépresseurs (p<0.001). Le coût financier du traitement pharmacologique quotidien d'un patient adulte était significativement inférieur à celui d'un patient gériatrique dont la comédication somatique est nécessairement plus importante (9.3 ± 7.2 CHF/patient contre 14.1 ± 9.5 CHF/patient) (p<0.009). En conclusion, cette étude confirme l'importance des habitudes locales dans la prescription médicamenteuse par les médecins, à l'exception de l'utilisation des benzodiazépines pour lesquelles les psychogériâtres semblent moins favorables.

Atteintes de la chevill et du tarse postérieur dans les maladies métaboliques

De nombreuses maladies métaboliques peuvent atteindre la cheville et le tarse postérieur. Dans la phase aiguë, la goutte peut toucher l'arrière-pied, la cheville, le médio-tarse ou le tendon calcanéen. Une rougeur intense des tissus souscutanés du dos du pied peut être en rapport avec une inflammation liée à des microtophus sous-cutanés. Un diagnostic de certitude se fait par la mise en évidence de cristaux d'urate de sodium dans le liquide de ponction articulaire ou dans les tissus. L'imagerie par tomodensitométrie ou par échographie peut orienter de façon pratiquement certaine le diagnostic. Le traitement de la goutte de l'arrière-pied fait appel aux antiinflammatoires, aux anti-inflammatoires non stéroïdiens (AINS) et à la colchicine. Dans la phase chronique, un traitement hypo-uricémiant au long terme est à instaurer. L'hémochromatose se manifeste principalement sous forme d'une arthrose, liée souvent à une chondrocalcinose de la cheville et du tarse postérieur. L'enthésopathie hyperostosante diffuse peut causer des talalgies ou des douleurs du fascia plantaire liées à des exostoses. L'hypercholestérolémie familiale provoque souvent des xanthomes tendineux des tendons calcanéens. Des calcifications apatitiques de la région du talon peuvent s'observer, notamment chez des patients en hémodialyse chronique. Numerous metabolic diseases can affect the ankle and the hind-foot. In the acute phase, gout can affect the rear of the foot, the ankle, the mid-foot and the calcaneal (Achilles) tendon. Intense redness of the subcutaneous tissue of the back of the foot can be present in conjunction with inflammation associated with subcutaneous micro-tophaceous deposits. A definitive diagnosis is made by confirming the existence of sodium urate crystals in joint puncture fluid or in tissue. CT scan or ultrasonography images can also be used to provide a fairly definitive diagnosis. Treatment of gout of the rear of the foot requires the use of anti-inflammatory medication, NSAIDs and colchicine. In the chronic phase, long-term hypouricemic therapy is to be used. Haemochromatosis mainly shows in the form of arthritis, often associated with chondrocalcinosis of the ankle and hind-foot. A diffuse hyperostosis enthesopathy can cause talalgia or pain to the plantar fascia associated with exostoses. Familial hypercholesterolaemia often leads to tendinous xanthoma on the calcaneal tendons. Apatitic calcifications to the heel can also be observed, especially undergoing chronic haemodialysis.

Pollution stress on aquatic microbial communities

Thousands of chemical compounds enter the natural environment but many have unknown effects and consequences, in particular at low concentrations. This thesis work contributes to our understanding of pollution effects by using bacteria as test organisms. Bacteria are important for this question because some of them degrade and transform pollutants into less harmful compounds, but secondly because they themselves can be inhibited in their reproduction by exposure to toxic compounds. When inhibitory effects occur this may change the composition of the microbial com¬munity in the long run, leading to altered or diminished ecosystem services by those communities. As a result chemicals of anthropogenic origin may accumulate and per¬sist in the environment, and finally, affect higher organisms as well. In addition to acquiring basic understanding of pollutant effects at low concentrations on bacterial communities an applied goal of this thesis work was to develop bacteria-based tests to screen new organic chemicals for toxicity and biodégradation. In the first part of this work we developed a flow cytometry-based assay on SYT09 plus ethidium-bromide or propidium-iodide stained cells of Pseudomonas ûuorescens exposed or not to a variety of pollutants under oligotrophic growth conditions. Flow cytometry (FC) allows fast and accurate counting of bacterial cells under simul¬taneous assessment of their physiological state, in particular in combination with different fluorescent dyes. Here we employed FC and fluorescent dyes to monitor the effect that pollutants may exert on Pseudomonas ûuorescens SV3. First we designed an oligotrophic growth test, which enabled us to follow population growth at low densities (104 - 10 7 cells per ml) using 0.1 mM sodium acetate as carbon source. Cells in the oligotrophic milieu were then exposed or not to a variety of common pollutants, such as 2-chlorobiphenyl (2CBP), naphthalene (NAH), 4-chlorophenol (4CP), tetradecane (TD), mercury chloride (HgCl2) or benzene, in different dosages. Exposed culture samples were stained with SYT09 (green fluorescent dye binding nucleic acids, generally staining all cells) in combination with propidium iodide (PI) or ethidium bromide (EB), both dyes being membrane integrity indicators. We ob- served that most of the tested compounds decreased population growth in a dosage- dependent manner. SYT09/PI or SYT09/EB staining then revealed that chemical exposure led to arisal of subpopulations of live and injured or dead cells. By modeling population growth on the total cell numbers in population or only the subpopulation of live cells we inferred that even in stressed populations live cells multiply at rates no different to unexposed controls. The net decrease in population growth would thus be a consequence of more and more cells being not able to multiply at all, rather than all cells multiplying at slower rates. In addition, the proportion of injured cells correlated to the compound dosage. We concluded that the oligotrophic test may be useful to asses toxicity of unknown chemicals on a variety of model bacteria. Mul¬tiple tests can be run in parallel and effects are rapidly measured within a period of 8 hours. Interestingly, in the same exposure tests with P. fluorescens SV3 we observed that some chemicals which did not lead to a reduction of net population growth rates did cause measurable effects on live cells. This was mainly observed in cells within the live subpopulation as an increase of the EB fluorescence signal. We showed that SYT09/EB is a more useful combination of dyes than SYT09/PI because PI fluorescence tend to increase only when cells are effectively dead, but not so much in live cells (less then twofold). In contrast, EB geometric mean fluorescence in live cells increased up to eightfold after exposure to toxic compounds. All compounds even at the lowest concentration caused a measurable increase in EB geometric mean fluorescence especially after 2 h incubation time. This effect was found to be transient for cells exposed to 2CBP and 4CP, but chronic for cells incubated with TD and NAH (ultimately leading to cell death). In order to understand the mechanism underlying the observed effects we used known membrane or energy uncouplers. The pattern of EB signal increase in chemical-exposed populations resembled mostly that of EDTA, although EB fluorescence in EDTA-treated or pasteurized cells was even higher than after exposure to the four test chemicals. We conclude that the ability of cells to efflux EB under equilibrium conditions is an appropriate measure for the potential of a chemical to exert toxicity. Since most bacterial species possess efflux systems for EB that all require cellular energy, our test should be more widely relevant to infer toxicity effects of chemical exposure on the physiological status of the bacterial cell. To better understand the effect of toxicant exposure on efflux defense systems, we studied 2-hydroxybiphenyl toxicity to Pseudomonas azeiaica HBP1. We showed that 2-HBP exerts toxicity even to P. azelaica HBP1, but only at concentrations higher than 0.5 mM. Above this concentration transient loss of membrane polarization and integrity occurred, which we conclude from staining of growing cells with fluorescent dyes. Cells finally recover and resume growth on 2HBP. The high resistance of P. azelaica HBP1 to 2-HBP was found to be the result of an efficient MexABOprM- type efflux pump system counteracting passive influx of this compound into the membrane and cellular interior. Mutants with disrupted mexA, mexB and oprM genes did no longer grow on 2-HBP at concentrations above 100 μΜ, whereas below this concentration we found 2-HBP-concentration dependent decrease of growth rate. The MexAB-OprM system in P. azeiaica HBP1 is indeed an efflux pump for ethidium bromide as well. By introducing gfp reporter fusions responsive to intracellular 2- HBP concentrations into HBP1 wild-type or the mutants we demonstrated that 2HBP enters into the cells in a similar way. In contrast, the reporter system in the wild-type cells does not react to 2-HBP at an outside concentration of 2.4 μΜ, whereas in mutant cells it does. This suggests that wild-type cells pump 2-HBP to the outside very effectively preventing accumulation of 2-HBP. 2HBP metabolism, therefore, is not efficient enough to lower the intracellular concentration and prevent toxicity. We conclude that P. azelaica HBP1 resistance to 2-HBP is mainly due to an efficient efflux system and that 2HBP in high concentrations exerts narcotic effects on the bacterial membrane. In the part of this thesis, we investigated the possibilities of bacteria to degrade pollutants at low concentrations (1 mg per L and below). As test components we used 2-hydroxybiphenyl, antibiotics and a variety of fragrances, many of which are known to be difficult to biodegrade. By using accurate counting of low numbers of bacterial cells we could demonstrate that specific growth on these compounds is possible. We demonstrated the accuracy of FC counting at low cell numbers (down to 103 bacterial cells per ml). Then we tested whether bacterial population growth could be specifically monitored at the expense of low substrate concentrations, us¬ing P. azelaica HBP1. A perfect relationship was found between growth rate, yield and 2-HBP concentrations in the range of 0.1 up to 5 mg per L. Mixing P. azelaica within sludge, however, suggested that growth yields in a mixed community can be much lower than in pure culture, perhaps because of loss of metabolic intermediates. We then isolated new strains from activated sludge using 2-HBP or antibiotics (Nal, AMP, SMX) at low concentrations (0.1-1 mg per L) as sole carbon and energy sub¬strate and PAO microdishes. The purified strains were then examined for growth on their respective substrate, which interestingly, showed that all strains can not with¬stand higher than 1 or 10 mg per L concentrations of target substrate. Thus, bacteria must exist that contribute to compound degradation at low pollutant concentrations but are inhibited at higher concentrations. Finally we tested whether specific biomass growth (in number of cells) at the expense of pollutants can also be detected with communities as starting material. Hereto, we focused on a number of fragrance chemicals and measured community biomass increase by flow cytometry cell counting on two distinct starter communities: (i) diluted Lake Geneva water, and dilute activated sludge from a wastewater treatment plant. We observed that most of the test compounds indeed resulted in significant biomass increase in the starter community compared to a no-carbon added control, but activated sludge and lake Geneva water strongly differed (almost mutually ex¬clusive) in their capacity to degrade the test chemicals. In two cases for activated sludge the same type of microbial community developed upon compound exposure, as concluded from transcription fragment length polymorphism analysis on community purified and PCR amplified 16S rRNA gene fragments. To properly test compound biodegradability it is thus important to use starter communities of different origin. We conclude that FC counting can be a valuable tool to screen chemicals for their biodegradability and toxicity. - Des milliers de produits chimiques sont libérés dans l'environnement mais beaucoup ont des effets inconnus, en particulier à basses concentrations. Ce travail de thèse contribue à notre comprehension des effets de la pollution en utilisant des bacteries comme des organismes-tests. Les bacteries sont importantes pour etudier cette ques¬tion car certaines d'entre elles peuvent degrader ou transformer les polluants, mais également parce qu'elles-mmes peuvent tre inhibees dans leur reproduction après avoit ete exposees à ces composes toxiques. Quand des effets inhibiteurs ont lieu, la composition de la communauté microbienne peut tre changee à long terme, ce qui mène à une reduction du service d'ecosystème offert par ces communautés. En consequence, après leur liberation dans l'environnement, les produits chimiques d'origine anthropogenique peuvent soit s'y accumuler et per¬sister, exerant ainsi des effets encore inconnus sur les organismes vivants. En plus d'acquérir des connaissances de base sur les effets des polluants à basses concentra¬tions sur les communautés microbiennes, un but applique de cette thèse était de développer des tests bases sur les bacteries afin d'identifier de nouveau composes pour leur toxicité ou leur biodégradation. Dans la première partie de ce travail, nous avons developpe un test base sur la cytometrie de flux (FC) sur des cellules de Pseudomonas fluorescens colorees par du bromure d'ethidium ou de l'iodure de propidium et exposees ou non à une palette de polluants sous des conditions de croissance oligotrophique. La cytometrie de flux est une technique qui connaît de nombreuses applications dans la microbiologie environ¬nementale. Cela est principalement du au fait qu'elle permet un comptage rapide et precis ainsi que l'évaluation de l'état physiologique, en particulier lorsqu'elle est combinée h des colorations fluorescentes. Ici, nous avons utilise la technique FC et des colorants fluorescents afin de mesurer l'effet que peuvent exercer certains pollu¬ants sur Pseudomonas ûuorescens SV3 . D'abord nous avons conu des tests oligo- trophiques qui nous permettent de suivre la croissance complète de cellules en culture h des densites faibles (104 -10 7 cellules par ml), sur de l'acetate de sodium à 0.1 mM, en presence ou absence de produits chimiques (2-chlorobiphenyl (2CBP), naphthalène (NAH), 4-chlorophenol (4CP), tetradecane (TD), chlorure de mercure(II) (HgCl2)) à différentes concentrations. Afin de montrer le devenir des bacteries tant au niveau de la cellule individuelle que celui de la population globale, après exposition à des series de composes chimiques, nous avons compte les cellules colorees avec du SYT09 (col¬orant fluorescent vert des acides nucléiques pour la discrimination des cellules par rapport au bruit de fond) en combinaison avec l'iodure de propidium (PI) ou le bromure d'ethidium (EB), indicateurs de l'intégrité de la membrane cellulaire avec FC. Nous avons observe que de nombreux composes testes avaient un effet sur la croissance bacterienne, resultant en une baisse du taux de reproduction de la pop¬ulation. En outre, la double coloration que nous avons utilisee dans cette etude SYT09/PI ou SYT09/EB a montre que les produits chimiques testes induisaient une reponse heterogène des cellules dans la population, divisant celle-ci en sous- populations "saine", "endommagee" ou "morte". Les nombres de cellules à partir du comptage et de la proportion de celles "saines" et "endommagees/mortes" ont ensuite ete utilises pour modeliser la croissance de P. ûuorescens SV3 exposee aux produits chimiques. La reduction nette dans la croissance de population est une consequence du fait que de plus en plus de cellules sont incapables de se reproduire, plutt que du fait d'une croissance plus lente de l'ensemble de la population. De plus, la proportion de cellules endommagees est correllee au dosage du compose chimique. Les résultats obtenus nous ont permis de conclure que le test oligotrophique que nous avons developpe peut tre utilise pour l'évaluation de la toxicité de produits chimiques sur différents modèles bacteriens. Des tests multiples peuvent tre lances en parallèle et les effets sont mesures en l'espace de huit heures. Par ailleurs, nous en déduisons que les produits chimiques exercént un effet sur la croissance des cellules de P. ûuorescens SV3, qui est heterogène parmi les cellules dans la population et depend du produit chimique. Il est intéressant de noter que dans les mmes tests d'exposition avec P. ûuorescens SV3, nous avons observe que certains composes qui n'ont pas conduit à une reduction du taux de la croissance nette de la population, ont cause des effets mesurables sur les cellule saines. Ceci a ete essentiellement observe dans la portion "saine" des cellules en tant qu'augmentation du signal de la fluorescence de 1ΈΒ. D'abord nous avons montre que SYT09/EB était une com¬binaison de colorants plus utile que celle de SYT09/PI parce que la fluorescence du PI a tendance à augmenter uniquement lorsque les cellules sont effectivement mortes, et non pas dans les cellules saines (moins de deux fois plus). Par opposi¬tion, la fluorescence moyenne de l'EB dans les cellules saines augmente jusqu'à huit fois plus après exposition aux composes toxiques. Tous les composes, mme aux plus basses concentrations, induisent une augmentation mesurable de la fluorescence moy¬enne de 1ΈΒ, plus particulièrement après deux heures d'incubation. Cet effet s'est revele tre transitoire pour les cellules exposees aux 2CNP et 4CP, mais est chro¬nique pour les cellules incubees avec le TD et le NAH (entranant la mort cellulaire). Afin de comprendre les mécanismes qui sous-tendent les effets observes, nous avons utilise des decoupleurs d'energie ou de membrane. L'augmentation du signal EB dans les populations causee par des produits chimiques ressemblait à celle exerce par le chelateur des ions divalents EDTA. Cependant, les intensités du signal EB des cellules exposees aux produits chimiques testees n'ont jamais atteint les valeurs des cellules traitees avec l'EDTA ou pasteurises. Nous en concluons que le test oli- gotrophique utilisant la coloration (SYT09/)EB des cellules exposees ou non à un produit chimique est utile afin d'evaluer l'effet toxique exerce par les polluants sur la physiologie bacterienne. Afin de mieux comprendre la reaction d'un système de defense par pompe à efflux après exposition à une toxine, nous avons étudié la toxicité du 2-hydroxybiphenyl (2-HBP) sur Pseudomonas azeiaica HBP1. Nous avons montre que le 2-HBP exerce une toxicité mme sur HBP1, mais uniquement à des concentrations supérieures à 0.5 mM. Au-dessus de cette concentration, des pertes transitoires d'intégrité et de polarization membranaire ont lieu, comme cela nous a ete montre par coloration des cellules en croissance. Les cellules sont finalement capables de se rétablir et de reprendre leur croissance sur 2-HBP. La forte resistance de P. azeiaica HBP1 h 2-HBP physiologie bacterienne s'est revele tre le résultat d'un système de pompe h efflux de type MexABOprM qui contre-balance l'influx passif de ce compose h travers la membrane. Nous avons montre, en construisant des mutants avec des insertions dans les gènes mexA, mexB and oprM et des fusions avec le gène rapporteur gfp, que l'altération de n'importe quelle partie du système d'efflux conduisait à accroître l'accumulation de 2-HBP dans la cellule, en comparaison avec la souche sauvage HBP1, provoquant une diminution de la resistance au 2-HBP ainsi qu'une baisse du taux de reproduction des cellules. Des systèmes d'efflux similaires sont répandus chez de nombreuses espèces bactériennes. Ils seraient responsables de la resistance aux produits chimiques tels que les colorants fluorescents (bromure d'ethidium) et des antibiotiques. Nous concluons que la resistance de P. azelaica HBP1 à 2-HBP est principalement due à un système d'efflux efficace et que 2-HBP, à des concentrations elevees, exerce un effet deletère sur la membrane bacterienne. En se basant sur le comptage des cellules avec la FC, nous avons developpe ensuite une methode pour evaluer la biodegradabilite de polluants tels que le 2-HBP ainsi que les antibiotiques (acide nalidixique (Nal), ampicilline (AMP) ou sulfamethoxazole (SMX)) à de faibles concentrations lmg par L et moins), par le suivi de la croissance spécifique sur le compose de cultures microbiennes pures et mixtes. En utilisant un comptage precis de faibles quantités de cellules nous avons pu demontrer que la croissance spécifique sur ces composes est possible. Nous avons pu illustrer la precision du comptage par cytometrie de flux à faible quantité de cellules (jusqu'à 10 3 cellules par ml). Ensuite, nous avons teste s'il était possible de suivre dynamiquement la croissance de la population de cellules sur faibles concentrations de substrats, en utilisant P. azelaica HBP1. Une relation parfaite a ete trouvee entre le taux de croissance, le rendement et les concentrations de 2-HBP (entre 0.1 et 5 mg par L). En mélangeant HBP1 à de la boue active, nous avons pu montrer que le rendement en communauté mixtes pouvait tre bien inférieur qu'en culture pure. Ceci étant peut tre le résultat d'une perte d'intermédiaires métaboliques. Nous avons ensuite isole de nouvelles souches à partir de la boue active en utilisant le 2-HBP ou des antibiotiques (Nal, AMP, SMX) h basses concentrations (0.1-1 mg par L) comme seules sources de carbone et d'energie. En combinaison avec ceci, nous avons également utilise des microplaques PAO. Les souches purifiees ont ensuite ete examinees pour leurs croissances sur leurs substrats respectifs. De faon intéressante, toutes ces souches ont montre qu'elles ne pouvaient pas survivre à des concentrations de substrats supérieures à 1 ou 10 mg par L. Ainsi, il existe des bacteries qui contribuent à la degradation de composes à basses concentrations de polluant mais sont inhibes lorsque ces concentrations deviennent plus hautes. Finalement, nous avons cherche à savoir s'il est possible de detecter une croissance spécifique à une biomasse au depend d'un polluant, en partant d'une communauté microbienne. Ainsi, nous nous sommes concentre sur certains composes et avons mesure l'augmentation de la biomasse d'une communauté grce à la cytometrie de flux. Nous avons compte deux communautés de depart distinctes: (i) une dilution d'eau du Lac Léman, et une dilution de boue active d'une station d'épuration. Nous avons observe que la plupart des composes testes ont entrane une augmentation de la biomasse de depart par rapport au control sans addition de source de carbone. Néanmoins, les échantillons du lac Léman et de la station d'épuration différaient largement (s'excluant mutuellement l'un l'autre) dans leur capacité à degrader les composes chimiques. Dans deux cas provenant de la station d'épuration, le mme type de communauté microbienne s'est developpe après exposition aux composes, comme l'a démontré l'analyse TRFLP sur les fragments d'ARN 16S purifie de la communauté et amplifie par PCR. Afin de tester correctement la biodegradabilite d'un compose, il est donc important d'utiliser des communautés de depart de différentes origines Nous en concluons que le comptage par cytometrie de flux peut tre un outil de grande utilité pour mettre en valeur la biodegradabillite et la toxicité des composes chimiques.