Soro urêmico inibe a expressão in vitro da quimiocina SDF-1: possível impacto da toxicidade urêmica na lesão endotelial

Introdu1;ão: A disfun1;ão endotelial é importante na patogênese da doen1;a cardiovascular (DCV) relacionada à doen1;a renal crônica (DRC). Stromal cell-derived factor-1 (SDF-1) é uma quimiocina que mobiliza células endoteliais progenitoras (EPC) e em conjunto com a interleucina-8 (IL-8) podem ser usadas como marcadores de reparo e lesão tecidual. Objetivo: Neste trabalho, foi investigado o efeito do meio urêmico na expressão de SDF-1 e IL-8 in vivo e in vitro. Métodos: A inflama1;ão sistêmica foi avaliada por meio da proteína C-reativa (PCR) e interleucina-6 (IL-6). IL-8 e SDF-1 foram avaliados por ELISA como marcadores de disfun1;ão endotelial e reparo tecidual, respectivamente. Os estudos in vitro foram realizados em células endoteliais umbilicais humanas (HUVEC) expostas ao meio urêmico ou saudável. Resultados: Foram incluídos nesse estudo 26 pacientes em hemodiálise (HD) (17 &#177; 3 meses em diálise, 52 &#177; 2 anos, 38% homens e 11% diabéticos). As concentra1;ões séricas de PCR, IL-6, SDF-1 e IL-8 foram 4,9 &#177; 4,8 mg/ml, 6,7 &#177; 8,1 pg/ml, 2625,9 &#177; 1288,6 pg/ml e 128,2 &#177; 206,2 pg/ml, respectivamente. Houve correla1;ão positiva entre PCR e IL-6 (`1; = 0,57; p < 0,005) e entre SDF-1 e IL-8 (`1; = 0,45; p < 0,05). Os resultados in vitro demonstraram que a expressão de SDF-1 pelas HUVEC após 6 horas de tratamento com meio urêmico é menor comparada ao tratamento com meio saudável (p < 0,05). Após 12 horas de tratamento, ocorreu aumento de IL-8 quando as HUVECs foram expostas ao meio urêmico (p < 0,005). Conclusão: Sugerimos que SDF-1 e IL-8 nos pacientes em HD podem ser usados para mensurar a extensão do dano e consequente ativa1;ão vascular na uremia.

Novel cancer-related regulatory targets for the signalling sphingolipids sphingosine-1-phosphate and sphingosylphosphorylcholine

The signalling sphingolipid sphingosine-1-phosphate (S1P) is necessary for development of the immune system and vasculature and on a cellular level regulates migration, proliferation and survival. Due to these traits S1P has an important role in cancer biology. It is considered a primarily cancer-promoting factor and the enzyme which produces it, sphingosine kinase (SphK), is often over-expressed in tumours. S1P is naturally present in the blood, lymph, tissue fluids and cell cytoplasm and functions through its cell surface receptors (S1P1-5) and as an intracellular second messenger. Sphingosylphosphorylcholine (SPC) is closely related to S1P and has similar regulatory functions but has not been extensively studied. Both S1P and SPC are able to evoke either stimulatory or inhibitory effects on cancer cells depending on the context. The aim of this thesis work was to study novel regulatory targets of S1P and SPC, which mediate the effects of S1P/SPC signalling on cancer cell behaviour. The investigated targets are the transcription factor hypoxia-inducible factor 1 (HIF-1), the intermediate filament protein vimentin and components of the Hippo signalling pathway. HIF-1 has a central role in cancer biology, as it regulates a multitude of cancer-related genes and is potently activated by intratumoural hypoxia through stabilization of the regulatory subunit HIF-1α. Tumours typically harbour high HIF-1α levels and HIF-1, in turn, facilitates tumour angiogenesis and metastasis and regulates cancer cell metabolism. We found S1P to induce follicular thyroid cancer cell migration in normal oxygen conditions by increasing HIF-1α synthesis and stability and subsequently HIF-1 activity. Vimentin is a central regulator of cell motility and is also commonly over-expressed in cancers. Vimentin filaments form a cytoskeletal network in mesenchymal cells as well as epithelial cancer cells which have gone through epithelial-mesenchymal transition (EMT). Vimentin is heavily involved in cancer cell invasion and gives tumours metastatic potential. We saw both S1P and SPC induce phosphorylation of vimentin monomers and reorganization of the vimentin filament network in breast and anaplastic thyroid cancer cells. We also found vimentin to mediate the anti-migratory effect of S1P/SPC on these cells. The Hippo pathway is a novel signalling cascade which controls cancer-related processes such as cellular proliferation and survival in response to various extracellular signals. The core of the pathway consists of the transcriptional regulators YAP and TAZ, which activate predominantly cancer-promoting genes, and the tumour suppressive kinases Lats1 and Lats2 which inhibit YAP/TAZ. Increased YAP expression and activity has been reported for a wide variety of cancers. We found SPC to regulate Hippo signalling in breast cancer cells in a two-fold manner through effects on phosphorylation status, activity and/or expression of YAP and Lats2. In conclusion, this thesis reveals new details of the signalling function of S1P and SPC and regulation of the central oncogenic factors HIF-1 and vimentin as well as the novel cancer-related pathway Hippo.

Collagen binding integrins and cancer testis antigens in prostate cancer and melanoma

Camilla Pelo Collagen Binding Integrins and Cancer Testis Antigens in Prostate Cancer and Melanoma Department of Biochemistry, MediCity Research Laboratory, University of Turku, Finland Annales Universitatis Turkuensis, Painosalama Oy, Turku, Finland 2016 ABSTRACT Prostate cancer is the second most common cancer in men worldwide. The incidence of melanoma, in turn, is increasing faster than any other cancer incidences. In Finland, more than 5000 prostate cancer and 1200 new melanoma cases are diagnosed each year. One approach to further understand the cellular processes involved in prostate cancer and melanoma is to gain better knowledge about alterations in gene expression and their potential impact on the progression of the diseases. This thesis is focused on expression studies in two gene families; integrins and cancer testis antigens (CT antigens), in human prostate adenocarcinoma and advanced human melanoma. Integrins are heterodimeric transmembrane receptors which regulate many important cellular processes such as cell proliferation, migration and survival. CT antigens are frequently expressed in different types of cancers, but are only expressed in testis in healthy individuals. CT antigens are also highly immunogenic proteins. Due to the properties mentioned above, integrins and CT antigens can function as target molecules for the development of cancer diagnostics and drugs. One of the main purposes of this thesis was to study the expression of the four collagen binding integrins α1β1, α2β1, α10β1, α11β1 and the cancer testis antigen 16 (CT16) in cancer cell lines and human tissues of prostate cancer and metastatic melanoma. Additional aims included studies on the biological role of CT16 and the abundance of CT16 in sera of advanced melanoma patients. The prognostic and diagnostic significance of CT16 and the collagen binding integrins were also evaluated. Expression studies on collagen binding integrins and the CT antigen CT16 in melanoma and prostate cancer were limited and the biological role of CT16 was unknown. In this thesis, the expression levels of α2β1 and α11β1 were found to be significantly altered in prostate cancer tissues. Integrin α2β1 decreased gradually during disease progression while α11 was elevated in prostate carcinoma compared to healthy tissues. In advanced melanoma, enhanced levels of α2 were associated with a significant shorter overall survival in advanced melanoma. In this thesis, CT16 was identified as a frequently expressed melanoma CT antigen with an anti-apoptotic function. To conclude, this thesis presents α2β1 and CT16, as potential and promising biomarkers for advanced melanoma. This thesis reports also the first functional study of CT16. Keywords: Collagen binding integrins, α1β1, α2β1, α10β1, α11β1, Cancer Testis antigens, CT16, melanoma, prostate cancer, expression

A five factor model of grief : a q-methodological study /

Q-methodology permitted 41 people to communicate their perspective of grief. In an attempt to clarify the research to date and to allow those who have experienced this human journey to direct the scientists, 80 statements were chosen to present to the participants based on the research from academic and counselling sources. Five different perspectives emerged from the Q-sorts and factor analysis. Each perspective was valuable for the understanding of different groups of mourners. They were interpreted using questionnaire data and interview information. They are as follows: Factor 1- Growth Optimism; Factor 2 - Schema Destruction and Negative Affect; Factor 3- Identification with the Deceased Person; Factor 4- Intact World view with High Clarity and High Social Support; Factor 5- Schema Destruction with High Preoccupation and Attention to Emotion. Some people grow in the face of grief, others hold on to essentially the same schemas and others are devastated by their loss. The different perspectives reported herein supply clues to the sources of these differing outcomes. From examination of Factor 1, it appears that a healthy living relationship helps substantially in the event of loss. An orientation toward emotions that encourages clarity, exemplified by Factor 4, without hyper-vigilance to emotion may be helpful as well. Strategies for maintaining schematic representations of the world with little alteration include: identification with the values of the deceased person, as in Factor 3 and reliance on social support and/or God as demonstrated by Factor 4. When the relationship had painful periods, social support may be accessed to benefit some mourners. When the person's frame of reference or higher order schemas are assaulted by the events of loss, the people most at risk for traumatic grief seem to be those with difficult relationships as indicated by Factor 5 individuals. When low social support, high attention to emotion with low clarity and little belief that feelings can be altered for the better are also attributes of the mourner devastating grief can result. In the end, there are groups of people who are forced to endure the entire process of schema destruction and devastation. Some appear to recover in part and others appear to stay in a form of purgatory for many years. The results of this study suggest that, those who experience devastating grief may be in the minority. In the future interventions could be more specifically addressed if these perspectives are replicated in a larger, more detailed study.

clc is co-expressed with clf or cntfr in developing mouse muscles

Affiliation: Jean-François Gauchat : Département de Pharmacologie, Faculté de médecine, Université de Montréal

Étude du rôle des gènes TGF-β1 et HSP-70 lors du processus de régénération du membre chez l’axolotl

Les urodèles amphibiens, dont fait partie l’axolotl (Ambystoma mexicanum), ont la capacité de régénérer leurs organes et membres suite à une amputation, tout au long de leur vie. La patte est l’organe dont le processus de régénération est le mieux caractérisé et ce dernier est divisé en deux phases principales. La première est la phase de préparation et commence immédiatement suite à l’amputation. Elle renferme des étapes essentielles au processus de régénération comme la guérison de la plaie et la formation d’une coiffe apicale ectodermique. Par la suite, les fibroblastes du derme et certaines cellules musculaires vont revenir à un état pluripotent via un processus appelé dédifférenciation cellulaire. Une fois dédifférenciées, ces cellules migrent et s’accumulent sous la coiffe apicale pour former le blastème. Lors de la phase de redéveloppement, les cellules du blastème se divisent puis se redifférencient pour régénérer la partie amputée. Fait intéressant, la régénération d’un membre ou la guérison d’une plaie chez l’axolotl ne mène jamais à la formation d’une cicatrice. Afin d’en apprendre plus sur le contrôle moléculaire de la régénération, les gènes Heat-shock protein-70 (Hsp-70) et Transforming growth factor-β1 (Tgf-β1) ont été sélectionnés. Ces gènes jouent un rôle important dans la réponse au stress et lors de la guérison des plaies chez les mammifères. HSP-70 est une chaperonne moléculaire qui est produite pour maintenir l’intégrité des protéines cellulaires lorsqu’un stress se présente. TGF-β1 est une cytokine produite suite à une blessure qui active la réponse inflammatoire et qui stimule la fermeture de la plaie chez les amniotes. Les résultats présentés dans cette thèse démontrent que Hsp-70 est exprimé et régulé lors du développement et de la régénération du membre chez l’axolotl. D’autre part, nos expériences ont mené à l’isolation de la séquence codante pour Tgf-β1 chez l’axolotl. Nos résultats montrent que Tgf-β1 est exprimé spécifiquement lors de la phase de préparation dans le membre en régénération. De plus, le blocage de la voie des Tgf-β avec l’inhibiteur pharmacologique SB-431542, lors de la régénération, mène à l’inhibition du processus. Ceci démontre que la signalisation via la voie des Tgf-β est essentielle à la régénération du membre chez l’axolotl.

Interactions protéiques et relation dynamique entre phosphorylation / sumoylation / ubiquitination des protéines TIF1α, β et PML: détection in vivo par BRET

Trois protéines de la famille TRIM (Motif TRIpartite), TIF1α, β (Transcriptional Intermediary Factor 1) et PML (ProMyelocytic Leukaemia¬), font l’objet de cette étude. TIF1α est connu comme un coactivateur des récepteurs nucléaires et TIF1β comme le corépresseur universel des protéines KRAB-multidoigt de zinc dont le prototype étudié ici est ZNF74. PML possède divers rôles dont le plus caractérisé est celui d’être l’organisateur principal et essentiel des PML-NBs (PML-Nuclear Bodies), des macrostructures nucléaires très dynamiques regroupant et coordonnant plus de 40 protéines. Il est à noter que la fonction de TIF1α, β et PML est régulée par une modification post-traductionnelle, la sumoylation, qui implique le couplage covalent de la petite protéine SUMO (Small Ubiquitin like MOdifier) à des lysines de ces trois protéines cibles. Cette thèse propose de développer des méthodes utilisant le BRET (Bioluminescence Resonance Energy Transfert) afin de détecter dans des cellules vivantes et en temps réel des interactions non-covalentes de protéines nucléaires mais aussi leur couplage covalent à SUMO. En effet, le BRET n’a jamais été exploré jusqu’alors pour étudier les interactions non-covalentes et covalentes de protéines nucléaires. L’étude de l’interaction de protéines transcriptionnellement actives est parfois difficile par des méthodes classiques du fait de leur grande propension à agréger (famille TRIM) ou de leur association à la matrice nucléaire (ZNF74). L’homo et l’hétérodimérisation de TIF1α, β ainsi que leur interaction avec ZNF74 sont ici testées sur des protéines entières dans des cellules vivantes de mammifères répondant aux résultats conflictuels de la littérature et démontrant que le BRET peut être avantageusement utilisé comme alternative aux essais plus classiques basés sur la transcription. Du fait de l’hétérodimérisation confirmée de TIF1α et β, le premier article présenté ouvre la possibilité d’une relation étroite entre les récepteurs nucléaires et les protéines KRAB- multidoigt de zinc. Des études précédentes ont démontré que la sumoylation de PML est impliquée dans sa dégradation induite par l’As2O3 et dépendante de RNF4, une E3 ubiquitine ligase ayant pour substrat des chaînes de SUMO (polySUMO). Dans le second article, grâce au développement d’une nouvelle application du BRET pour la détection d’interactions covalentes et non-covalentes avec SUMO (BRETSUMO), nous établissons un nouveau lien entre la sumoylation de PML et sa dégradation. Nous confirmons que le recrutement de RNF4 dépend de SUMO mais démontrons également l’implication du SBD (Sumo Binding Domain) de PML dans sa dégradation induite par l’As2O3 et/ou RNF4. De plus, nous démontrons que des sérines, au sein du SBD de PML, qui sont connues comme des cibles de phosphorylation par la voie de la kinase CK2, régulent les interactions non-covalentes de ce SBD mettant en évidence, pour la première fois, que les interactions avec un SBD peuvent dépendre d’un évènement de phosphorylation (“SBD phospho-switch”). Nos résultats nous amènent à proposer l’hypothèse que le recrutement de PML sumoylé au niveau des PML-NBs via son SBD, favorise le recrutement d’une autre activité E3 ubiquitine ligase, outre celle de RNF4, PML étant lui-même un potentiel candidat. Ceci suggère l’existence d’une nouvelle relation dynamique entre phosphorylation, sumoylation et ubiquitination de PML. Finalement, il est suggéré que PML est dégradé par deux voies différentes dépendantes de l’ubiquitine et du protéasome; la voie de CK2 et la voie de RNF4. Enfin une étude sur la sumoylation de TIF1β est également présentée en annexe. Cette étude caractérise les 6 lysines cibles de SUMO sur TIF1β et démontre que la sumoylation est nécessaire à l’activité répressive de TIF1β mais n’est pas impliquée dans son homodimérisation ou son interaction avec la boîte KRAB. La sumoylation est cependant nécessaire au recrutement d’histones déacétylases, dépendante de son homodimérisation et de l’intégrité du domaine PHD. Alors que l’on ne connaît pas de régulateur physiologique de la sumoylation outre les enzymes directement impliquées dans la machinerie de sumoylation, nous mettons en évidence que la sumoylation de TIF1β est positivement régulée par son interaction avec le domaine KRAB et suggérons que ces facteurs transcriptionnels recrutent TIF1β à l’ADN au niveau de promoteur et augmentent son activité répressive en favorisant sa sumoylation.

Les cellules stromales multipotentes accélèrent la guérison de plaies cutanées chez les souris irradiées via la sécrétion de la chimiokine SDF-1α

Le traitement du cancer à l’aide d’une exposition aux radiations ionisantes (RI) peut mener au développement de plusieurs effets secondaires importants, dont un retard de réparation et de régénération des tissus. Les mécanismes responsables de ces effets demeurent largement inconnus encore aujourd’hui, ce qui a pour effet de limiter le développement d’approches thérapeutiques. À l’aide d’un modèle de guérison de plaie cutanée chez la souris, nous avons cherché à déterminer les mécanismes par lesquels l’exposition aux RI limite la régénération de la peau. Nos résultats démontrent que l’induction de la "stromal-derived growth factor 1α" (SDF-1α), une cytokine normalement surexprimée dans les tissus hypoxiques, est sévèrement diminuée dans les plaies de souris irradiées versus non-irradiées. Ce défaut corrèle avec un retard de guérison des plaies et est encore évident plusieurs mois suivant l’exposition aux RI, suggérant qu’il y a une altération permanente de la capacité de la peau à se réparer. Parce que SDF-1α est secrété principalement par les fibroblastes du derme, nous avons évalué le potentiel des cellules stromales multipotentes (MSCs), qui sont reconnues pour secréter des niveaux élevés de SDF-1α, à accélérer la régénération de la peau chez les souris irradiées. L’injection de MSCs en périphéries des plaies a mené à une accélération remarquable de la guérison de la peau chez les souris exposées aux RI. Les actions des MSCs étaient principalement paracrines, dû au fait que les cellules n’ont pas migré à l’extérieur de leur site d’injection et ne se sont pas différentiées en kératinocytes. L’inhibition spécifique de l’expression de SDF-1α a mené à une réduction drastique de l’efficacité des MSCs à accélérer la fermeture de plaie indiquant que la sécrétion de SDF-1α par les MSCs est largement responsable de leur effet bénéfique. Nous avons découvert aussi qu’un des mécanismes par lequel SDF-1α accélère la guérison de plaie implique l’augmentation de la vascularisation au niveau de la peau blessée. Les résultats présentés dans ce mémoire démontrent collectivement que SDF-1α est une importante cytokine dérégulée au niveau des plaies cutanées irradiées, et que le déclin du potentiel de régénération des tissus qui est observé suivant une exposition au RI peut être renversé, s’il est possible de restaurer le microenvironnement de la blessure avec un support stromal adéquat.

Manipulation of the ubiquitin-proteasome system by HIV-1 : role of the accessory protein Vpr

Le virus de l’immunodéficience humaine de type 1 (VIH-1), l’agent étiologique du SIDA, est un rétrovirus complexe arborant plusieurs protéines accessoires : Nef, Vif, Vpr, et Vpu. Celles-ci sont impliquées dans la modulation de la réplication virale, dans l’évasion immunitaire et dans la progression de la pathogenèse du SIDA. Dans ce contexte, il a été démontré que la protéine virale R (Vpr) induit un arrêt de cycle cellulaire en phase G2. Le mécanisme par lequel Vpr exerce cette fonction est l’activation, ATR (Ataxia telangiectasia and Rad3 related)-dépendante, du point de contrôle de dommage à l’ADN, mais les facteurs et mécanismes moléculaires directement impliqués dans cette activité demeurent inconnus. Afin d’identifier de nouveaux facteurs cellulaires interagissant avec Vpr, nous avons utilisé une purification d’affinité en tandem (TAP) pour isoler des complexes protéiques natifs contenant Vpr. Nous avons découvert que Vpr s’associait avec CRL4A(VprBP), un complexe cellulaire d’E3 ubiquitine ligase, comprenant les protéines Cullin 4A, DDB1 (DNA damage-binding protein 1) et VprBP (Vpr-binding protein). Nos études ont mis en évidence que le recrutement de la E3 ligase par Vpr était nécessaire mais non suffisant pour l’induction de l’arrêt de cycle cellulaire en G2, suggérant ainsi que des événements additionnels seraient impliqués dans ce processus. À cet égard, nous apportons des preuves directes que Vpr détourne les fonctions de CRL4A(VprBP) pour induire la polyubiquitination de type K48 et la dégradation protéosomale de protéines cellulaires encore inconnues. Ces événements d’ubiquitination induits par Vpr ont été démontrés comme étant nécessaire à l’activation d’ATR. Finalement, nous montrons que Vpr forme des foyers ancrés à la chromatine co-localisant avec VprBP ainsi qu’avec des facteurs impliqués dans la réparation de l’ADN. La formation de ces foyers représente un événement essentiel et précoce dans l’induction de l’arrêt de cycle cellulaire en G2. Enfin, nous démontrons que Vpr est capable de recruter CRL4A(VprBP) au niveau de la chromatine et nous apportons des preuves indiquant que le substrat inconnu ciblé par Vpr est une protéine associée à la chromatine. Globalement, nos résultats révèlent certains des ménanismes par lesquels Vpr induit des perturbations du cycle cellulaire. En outre, cette étude contribue à notre compréhension de la modulation du système ubiquitine-protéasome par le VIH-1 et son implication fonctionnelle dans la manipulation de l’environnement cellulaire de l’hôte.

Structure quaternaire des récepteurs de chimiokines CXCR4 et CCR2 et interaction avec leurs effecteurs

Thèse réalisée en cotutelle avec l'université Montpellier2 dans le laboratoire de pharmacologie moléculaire de Jean-Philippe Pin à l'institut de génomique fonctionnelle (IGF), Montpellier, France.

Association de polymorphismes dans le gène GPIHBP1 avec l’hypertriglycéridémie

L’hypertriglycéridémie (hyperTG) est une dyslipidémie fréquente, caractérisée par une augmentation de la concentration plasmatique en triglycérides (TG). L’hyperTG est considérée comme un facteur de risque indépendant de la maladie cardiovasculaire, particulièrement de la maladie coronarienne athérosclérotique. Plusieurs facteurs environnementaux et génétiques ont été associés avec l’hyperTG. Cependant, près de 90% des cas d’hyperTG primaire sont encore incomplètement caractérisés au niveau moléculaire. Dernièrement, la protéine GPIHBP1 (glycosylphosphatidylinositol-anchored high-density lipoprotein-binding protein 1), qui a un rôle clef dans le métabolisme des TG, a été associée à l’expression d’hyperTG sévère et rare chez l’humain. Ce mémoire présente les résultats de nos travaux qui ont été effectués afin d’identifier de nouvelles bases moléculaires associées à l’expression de l’hyperTG dans le locus du gène GPIHBP1. Nous avons observé que le polymorphisme GPIHBP1 g.-469G>A (rs72691625), dont la fréquence de l’allèle mineure a été évaluée à 19,6% dans notre échantillon, serait associé à l’expression d’hyperTG (TG ≥ 2mmol/L) dans une population canadienne-française. Ce polymorphisme est associé à un risque 1,67 fois plus grand d’exprimer une triglycéridémie ≥ 2mmol/L chez les porteurs hétérozygotes et 5,7 fois plus grand chez les porteurs homozygotes, comparativement aux non-porteurs. Ce risque d’hyperTG serait exacerbé par la présence concomitante d’une mutation hypertriglycéridémiante dans le gène codant pour la lipoprotéine lipase. La présence de ce polymorphisme serait particulièrement associée à l’expression de la dysbêtalipoprotéinémie familiale et de l’hypertriglycéridémie familiale endogène. GPIHBP1 g.-469G>A est le premier polymorphisme fréquent identifié dans le promoteur du gène à être associé avec l’expression d’hyperTG. GPIHBP1 émerge de plus en plus comme un gène candidat intéressant pour la recherche de nouvelles bases moléculaires pouvant expliquer certaines formes d’hyperTG primaire fréquente.

Rôles des kinases IKK et IKK-related dans les maladies inflammatoires chroniques : implications dans l’athérosclérose et la réponse hypoxique

L’inflammation est un procédé complexe qui vise l’élimination de l’agent causal de dommages tissulaires en vue de faciliter la réparation du tissu affecté. La persistance de l’agent causal ou l’incapacité à résoudre l’inflammation mène à un dérèglement homéostatique chronique qui peut avoir une incidence sur la morbidité et la mortalité. L’athérosclérose est une condition inflammatoire chronique des vaisseaux sanguins dont l’origine est multifactorielle. L’hypertension et l’état infectieux représentent respectivement des facteurs de risque classiques et émergents du développement de cette maladie. Les fondements initiaux de l’inflammation font intervenir l’immunité innée, la première ligne de défense dont disposent les cellules pour répondre à un signal de danger. Le but de cette thèse est d’examiner le rôle pro-inflammatoire d’une famille de kinases essentielles à l’immunité innée, soit celle des kinases de IkappaB (IKK) et des kinases IKK-related. Les kinases IKKalpha et IKKbeta forment le complexe IKK avec la molécule adaptatrice NEMO/IKKgamma. Ce complexe est chargé d’effectuer la phosphorylation de l’inhibiteur de NF-kappaB, IkappaBalpha, ce qui mène à sa dégradation et à la libération du facteur de transcription NF-kappaB. Nous montrons que le peptide vasoactif angiotensine II (AngII) induit l’activité phosphotransférase d’IKKbeta dans les VSMC par immunoprécipitation de NEMO puis essai kinase in vitro. Grâce à une approche ARN interférence (ARNi) dirigée contre IKK, nous montrons que cette kinase est responsable de la phosphorylation de p65/RelA. Nous montrons que le mécanisme d’induction de NF-kappaB par l’AngII est atypique, puisqu’il ne module pas IkappaBalpha, et montrons à l’aide d’inhibiteurs pharmacologiques que l’activation de p65 est indépendante des voies MEK-ERK-RSK, PI3K et de la transactivation du récepteur de l’EGF. Les kinases IKK-related Tank-binding kinase 1 (TBK1) et IKK-i sont quant à elles principalement activées suite à une infection bactérienne ou virale. Ces kinases phosphorylent directement le facteur de transcription interferon regulatory factor (IRF)-3. Nous montrons que le cytomégalovirus humain, un pathogène associé à l’athérosclérose, a la capacité d’induire l’activation de TBK1 dans les VSMC. L’usage d’ARNi dirigé contre TBK1 et IKKi montre que les 2 kinases sont impliquées dans l’activation d’IRF-3. De plus, nous montrons à l’aide d’une lignée de VSMC exprimant une version dominante négative d’IRF-3 que ce dernier est essentiel à la synthèse des chimiokines RANTES et IP-10, tel qu’analysé par RT-PCR. Par ailleurs, il a récemment été montré que les kinases IKK-related étaient étroitement liées à la transformation oncogénique, et que TBK1 était pro-angiogénique. Or, l’angiogenèse est le plus souvent modulée par la réponse hypoxique qui est d’ailleurs commune à la majorité des processus inflammatoires. Le facteur de transcription hypoxia inducible factor (HIF)-1 module l’angiogenèse, l’inflammation et la survie cellulaire. Nous montrons à l’aide de cellules Tbk1 et Ikbke -/- et d’une approche lentivirale que TBK1 est spécifiquement impliquée dans l’induction traductionnelle de HIF-1alpha en condition de stress hypoxique. L’expression de TBK1 est induite sous ces conditions, et cette kinase module la phosphorylation de ERK, RSK, Akt et TSC1. Les résultats originaux présentés dans cette thèse montrent donc que les kinases IKK et IKK-related exercent leurs actions pro-inflammatoires par des mécanismes distincts.

Caractérisation du motif acidique de la sous-unité p28 de l’IL-27 et étude des propriétés partagées entre cette protéine, le CNTF, CLC/CLF et l’interleukine-6

L’interleukine 6 (IL-6) est une cytokine qui joue un rôle essentiel dans l’inflammation. Son récepteur (IL-6R) est composé de la chaîne non signalétique IL-6Rα et de la chaîne transductrice du signal gp130, commune aux cytokines de la famille IL-6. La liaison de l’IL-6 à son récepteur permet l’activation de plusieurs voies de signalisation, notamment des voies Jak/STAT1 et préférentiellement Jak/STAT3. De façon complémentaire, nous avons démontré que l’IL-6 est capable d’activer la voie Jak/STAT5 dans les lymphocytes T CD4. L’activation de cette voie de signalisation pourrait être impliquée dans le rétrocontrôle des effets pro-inflammatoires de l’IL-6 sur les cellules T CD4. Le facteur neurotrophique ciliaire (CNTF) et la « cardiotrophin-like cytokine/cytokine-like factor 1 » (CLC/CLF) sont deux cytokines de la famille de l’IL-6 qui signalent à travers un récepteur commun, le récepteur au CNTF (CNTFR), composé du CNTFRα, « leukaemia inhibitory factor receptor β » (LIFRβ) et gp130. Toutes deux exercent des actions au niveau du système immunitaire, or la chaîne CNTFRα de leur récepteur n’y est pas exprimée. Il a été montré que le CNTFR humain peut également activer un récepteur formé des sous-unités IL-6Rα, LIFRβ et gp130. Nous avons comparé les effets du CNTF et du CLC/CLF de souris sur des transfectants exprimant LIFRβ et gp130 et les chaines α connues de la famille IL-6 (IL-6Rα, IL-11Rβ et CNTFRα). Nos résultats indiquent que le CNTF de souris, comme le CNTF humain est capable d’activer un récepteur formé de l’IL-6Rα, LIFRβ et gp130. Toutefois cette propriété n’est pas partagée par CLC/CLF et le récepteur impliqué dans les effets de cette cytokine sur le système immunitaire reste donc à identifier. L’IL-27 appartient à la famille de l’IL-6 composée d’une sous-unité cytokinique, p28, associée à un récepteur soluble « l’Epstein-Barr virus-induced gene 3» (EBI3). La sous-unité p28 peut s’associer avec le récepteur soluble CLF pour former une cytokine capable d’activer les lymphocytes T. Dans le but de caractériser cette cytokine, nous avons montré que p28/CLF agit aussi sur les lymphocytes B et permet leur différenciation en plasmocytes. Le partage de l’IL-6R par l’IL-6 et p28/CLF semble être à l’origine de la similarité des effets de ces deux cytokines. De plus, nous avons observé des effets semblables à ceux de l’IL-6 suite à l’association de la sous-unité p28 seule avec la chaîne IL-6Rα. En effet, afin de mieux caractériser la cytokine p28/CLF, nous avons étudié les effets dus au recrutement de la chaîne IL-6Rα par la sous-unité p28. Les cytokines de la famille de l’IL-6 sont composées de quatre hélices α disposées de façon anti-parallèle deux à deux. La sous-unité p28 possède, au niveau d’une boucle reliant deux hélices α, un motif de plusieurs acides glutamiques consécutifs (motif polyE) qui n’est retrouvé dans aucune autre cytokine de cette famille. Nous avons démontré que ce motif est impliqué dans la liaison de cette sous-unité avec l’hydroxyapatite et l’os. Cette caractéristique de p28 pourrait permettre un ciblage de l’IL-27 (p28/EBI3) et de p28/CLF préférentiellement vers la niche endostéale des cellules souches et des cellules immunitaires.

Bioassay-guided fractionation of Larix laricina du Roi, and antidiabetic potentials of ethanol and hot water extracts of seventeen medicinal plants from the traditional pharmacopeia of the James Bay Cree

Nous avons utilisé une approche ethnobotanique pour identifier des espèces de plantes utilisées par les Cris afin de traiter les symptômes du diabète de type 2. Larix laricina du Roi (L. laricina) a récemment été identifiée comme une des meilleures plantes qui a stimulé le transport de glucose dans les cellules C2C12 et fortement potentialisé la différenciation des 3T3-L1 en indiquant une sensibilité potentiellement accrue à l’insuline. Ensuite, ces études de criblage ont été effectuées sur des extraits éthanolique (EE) en utilisant une série de bioessais in vitro. Cependant, les préparations traditionnelles des plantes sont souvent faites avec l’eau chaude. Le but de cette thèse de doctorat était d’isoler les principes actifs de L. laricina par un fractionnement guidé par l’adipogenèse; d’évaluer et de comparer l’activité et les mécanismes antidiabétiques des EE et des extraits aqueux (HWE) de ces 17 plantes. Pour le fractionnement de L. laricina, on a isolé plusieurs composés connus et identifié un nouveau composé actif cycloartane triterpene, qui a amélioré fortement l’adipogenèse et a été responsable en partie de l’activité adipogénique (potentiellement similaire à l’effet sensibilisateur à l’insuline des glitazone) de l’extrait éthanolique issu de l’écorce de L. laricina. Pour le métabolisme lipidique, nos résultats ont confirmé que 10 parmi les 17 EE ont augmenté la différenciation des adipocytes alors que 2 extraits seulement l’ont inhibée. Les HWE ont montré une faible activité adipogénique ou antiadipogénique. Les EE de R. groenlandicum et K. angustifolia ont le PPAR γ (peroxisome proliferator-activated receptor γ), le SREBP-1 (sterol regulatory element binding protein-1) et le C/EBP (CCAAT-enhancer binding proteins) α, alors que ceux de P. balsamifera et A. incana les ont inhibés. L’effet inhibiteur de P. balsamifera a également été prouvé d’avoir impliqué l’activation de la protéine kinase activée par l’AMP (AMPK). Les EE et HWE de R. groenlandicum ont stimulé les mêmes facteurs de transcription alors que les extraits aqueux d’autres plantes sélectionnées ont perdu ces effets en comparaison avec leurs extraits éthanoliques respectifs. L’analyse phytochimique a également identifié le groupe des espèces actives et inactives, notamment lorsque les espèces ont été séparées par famille de plante. Finalement concernant l’homéostasie de glucose, nos résultats ont confirmé que plusieurs EE ont stimulé le transport de glucose musculaire et inhibé l’activité de la glucose-6-phosphatase (G6Pase) hépatique. Certains des HWE ont partiellement ou complètement perdu ces activités antidiabétiques par rapport aux EE, tandis qu’une seule plante (R.groenlandicum) a juste conservé un potentiel similaire entre les EE et HWE dans les deux essais. Dans les cellules musculaires, les EE de R.groenlandicum, A. incana et S. purpurea ont stimulé le transport de glucose en activant la voie de signalisation de l’AMPK et en augmentant le niveau d’expression des GLUT4. En comparaison avec les EE, les HWE de R.groenlandicum ont montré des activités similaires; les HWE de A. incana ont complètement perdu leur effet sur tous les paramètres étudiés; les HWE de S. purpurea ont activé la voie de l’insuline au lieu de celle de l’AMPK pour augmenter le transport de glucose. Dans les cellules H4IIE, les EE et HWE des 5 plantes ont activé la voie de l’AMPK, et en plus les EE et HWE de 2 plantes ont activé la voie de l’insuline. La quercétine-3-O-galactoside et la quercétine 3-O-α-L-arabinopyranoside ont été identifiées comme des composés ayant un fort potentiel antidiabétique et donc responsables de l'activité biologique des plantes HWE actifs avec le transport du glucose. En conclusion, on a isolé plusieurs composés connus et identifié un nouveau triterpène actif à partir du fractionnement de L. laricina. Nous avons fourni également une preuve directe pour l'évaluation et la comparaison d'une action analogue à l'insuline ou insulino-sensibilisateur des EE et HWE de plantes médicinales Cris au niveau de muscle, de foie et de tissus adipeux. Une partie de leur action peut être liée à la stimulation des voies de signalisation intracellulaire insulino-dépendante et non-insulino-dépendante, ainsi que l’activation de PPARγ. Nos résultats indiquent que les espèces de plantes, les tissus ou les cellules cibles, ainsi que les méthodes d'extraction sont tous des déterminants significatifs de l'activité biologique de plantes médicinales Cris sur le métabolisme glucidique et lipidique.

Les mécanismes de régulation du métabolisme lipidique par les peptides QRFP (pyroglutamylated RF-amide peptides)

Plusieurs cibles thérapeutiques dans le développement de médicaments contre l’obésité visent une diminution de l’appétit et de la masse adipeuse et à augmenter la dépense énergétique. L’appétit et le métabolisme énergétique sont régulés par certains neuropeptides qui agissent au niveau du système nerveux central, notamment dans l’hypothalamus. Parmi ces neuropeptides, les peptides RF-amide ou QRFP (pyroglutamylated RF-amide peptides), ainsi nommés par la présence du motif conservé Arg-Phe-NH2 dans le domaine C-terminal, induisent une hyperphagie et une augmentation de la masse adipeuse lorsqu’administrés par voie centrale. Les formes bioactives de ces peptides comprennent principalement 43 (QRFP-43) et 26 (QRFP-26) acides aminés. Outre les peptides QRFP, leurs récepteurs, les GPR103 de la famille des récepteurs à 7 passages transmembranaires couplés aux protéines G, sont exprimés dans l’hypothalamus. Plus récemment, des études ont montré la sécrétion de ces neuropeptides, et la présence du GPR103, dans le tissu adipeux. Cependant, le rôle de la voie signalétique (QRFP/GPR103) dans la régulation du métabolisme lipidique au niveau périphérique est peu connu. Les travaux de cette thèse ont porté sur la caractérisation des effets adipogéniques périphériques des neuropeptides QRFP. En premier lieu, nos travaux ont montré que les adipocytes 3T3-L1 et les adipocytes murins isolés des dépôts adipeux blancs expriment le prépro-QRFP et uniquement le récepteur GPR103B, un des deux sous-types de récepteurs présents chez la souris. De plus, nous avons montré que l’expression du récepteur est régulée par une diète riche en lipides réduisant l’expression du prépro-QRFP, mais augmentant celle du GPR103B dans les dépôts lipidiques. Chez l’humain, les adipocytes de l’omentum expriment autant le GPR103 que le prépro-QRFP. Nous avons de plus étudié la fonctionnalité du GPR103B dans les adipocytes 3T3-L1 par l’utilisation d’ARN interférents. Nous avons observé que ce récepteur médie les effets adipogéniques des QRFPs en augmentant l’expression du récepteur nucléaire PPAR-gamma (peroxisome proliferator-activated receptor gamma) et le facteur de transcription C/EBP-alpha (CCAAT-enhancer binding protein alpha) résultant en une accumulation des triglycérides. Nous avons aussi mis en évidence les effets anti-lipolytiques des QRFPs. En effet, les QRFP inhibent fortement la lipolyse induite avec l’isoprotérénol. L’étude des mécanismes moléculaires à l’origine des effets anti-lipolytiques du QRFP-43 a montré l’activation de la voie de signalisation PI3-K/PKB (phosphatidylinositol 3-kinase/protéine kinase B) en réponse à la stimulation du GPR103B. La réponse anti-lipolytique induite par le QRFP-43 est associée à une diminution de la phosphorylation de la périlipine A (PLIN1a) et de la lipase hormono-sensible (HSL). Nos études ont élucidé les mécanismes conduisant à l’inhibition de la phosphorylation de la PLIN1a en réponse à l’activation du GPR103B, impliquant l’inhibition de la migration de la cavéoline 1 et de la sous unité catalytique de la protéine kinase A (PKA) au niveau des gouttelettes lipidiques, ainsi que l’inhibition de l’activité des Src kinases et de la protéine kinase C (PKC). En conclusion, nos travaux ont montré que les QRFP-43 et -26 exercent un effet adipogénique et anti-lipolytique dans les adipocytes, mettant ainsi en évidence le rôle des neuropeptides QRFPs dans la régulation du métabolisme lipidique au niveau adipocytaire.