Regulation and function of the cell wall polymer lipoteichoic acid in staphylococcus aureus

A thesis submitted for the Degree of Master in Medical microbiology

Distribuição espacial de populações de triatomíneos (Hemiptera: Reduviidae) em palmeiras da espécie Mauritia flexuosa no Distrito Federal, Brasil

Para determinar e analisar a distribuição espacial de populações silvestres de triatomíneos no Distrito Federal, Brasil, foram amostradas 150 palmeiras da espécie Mauritia flexuosa em seis veredas de diferentes paisagens (silvestre, rural e periurbana) na estação chuvosa. Os triatomíneos foram identificados morfologicamente, separados por sexo e estadio ninfal e examinados para verificar infecção por Trypanosoma cruzi e Trypanosoma rangeli. Vinte e oito (18,6%) palmeiras estavam infestadas por Rhodnius neglectus e 14 (9,5%) por Psammolestes tertius. A freqüência dessas espécies em palmeiras com e sem ninhos foi significativamente diferente, sendo superior nas palmeiras com ninhos de aves e mamíferos na copa. O maior número médio de insetos/palmeira foi observado nas áreas rurais, com estimativas de até 838 insetos/hectare. A composição etária das espécies apresentou um padrão diferente, Rhodnius neglectus com predomínio de ninfas e Psammolestes tertius com predomínio de adultos, sendo que muitos ovos de Rhodnius neglectus foram coletados indicando um evento reprodutivo em fevereiro de 2003. Entre os ninhos encontrados nas palmeiras, o do pássaro Phacellodomus ruber (Furnariidae) apresentou as maiores abundâncias de triatomíneos, ocorrendo em 42% das palmeiras. A abundância relativa de Rhodnius neglectus e Psammolestes tertius foi maior em áreas rurais que possuíram maior número de ninhos nas palmeiras e menor densidade de palmeiras por hectare. Nenhum dos 96 triatomíneos examinados estava infectado por Trypanosoma cruzi ou Trypanosoma rangeli, apesar de encontrarmos infecção de Rhodnius neglectus por esses parasitas em estudos anteriores.

An estimation of the frequency of gestational toxoplasmosis in the Brazilian Federal District

Acute infections by the protozoan Toxoplasma gondii during pregnancy (gestational toxoplasmosis) are known to cause serious health problems to the fetus (congenital toxoplasmosis). In Brasília, there have been few studies on the incidence of toxoplasmosis. This report summarizes a retrospective study performed on 2,636 selected pregnant women attended by the public health system of Guará, a satellite-city of Brasília. In this survey, 17 cases of gestational toxoplasmosis were detected; 15 of which were primary maternal infection and the remaining 2 were consistent with secondary maternal infection. These results suggest an annual seroconversion rate of 0.64 percent (90 percent confidence interval: 0.38, 0.90).

Formigas como vetores mecânicos de microorganismos no Hospital Escola da Universidade Federal do Triângulo Mineiro

Estudou-se patógenos associados às formigas encontradas no Hospital Escola da Universidade Federal do Triângulo Mineiro, Uberaba/MG. Três espécies de formiga foram identificadas: Tapinoma melanocephalum, Pheidole sp e Paratrechina longicornis. Os principais microorganismos encontrados foram Staphylococcus sp, bacilo Gram-positivo, Pseudomonas sp e Micrococcus sp. Os resultados das coletas foram analisados, segundo o número de colônias e os diferentes microrganismos isolados, aplicando teste t de Student. A análise estatística revelou diferença significativa apenas para Staphylococcus sp com p = 0,005. É possível que formigas e agentes patogênicos tenham associações mutualísticas, e que a análise dessa relação possa levar a novas estratégias de controle, com ênfase não apenas nos insetos, mas especialmente em qual agente está associada essa espécie de inseto.

Molecular regulation of secondary gorwth: searching for SHORT-ROOT function in cork formation

The analysis of molecular regulators involved in controlling the maintenance and function of plant meristems has been the subject of many studies. Some master regulators of these processes have been identified in Arabidopsis benefiting from the array of tools available for genetic and molecular analysis in this model plant. However, aspects such as secondary growth that are more extensively observed in woody plants, have been less studied. Secondary growth is responsible for the enlargement of the plant stems and roots and results from the activity of the lateral (secondary) meristems, vascular cambium and cork cambium (phellogen), which produce two important renewable natural resources, wood and cork, respectively.(...)

Size-Control Regulation during Regeneration

Functional regeneration of organs upon injury is a key process for animals survival. Contrary to humans, some vertebrates are remarkably competent in regenerating after acute organ or appendage lesions. This advantageous skill allows overcoming limitations in repair even in adult stages, when tissues are fully developed, via a process of epimorphic regeneration. One such organism is the zebrafish, which can regenerate several organs, namely its heart, retina, spinal cord and fins. (...)

Characterization and regulation of a bacterial sugar phosphatase of the HAD superfamily, AraL, from Bacillus subtilis.

AraL from Bacillus subtilis is a member of the ubiquitous haloalkanoate dehalogenase, HAD, superfamily. The araL gene has been cloned, over-expressed in Escherichia coli and its product purified to homogeneity. The enzyme displays phosphatase activity, which is optimal at neutral pH (7.0) and 65 °C. Substrate screening and kinetic analysis showed AraL to have low specificity and catalytic activity towards several sugar phosphates, which are metabolic intermediates of the glycolytic and pentose phosphate pathways. Based on substrate specificity and gene context within the arabinose metabolic operon, a putative physiological role of AraL in detoxification of accidental accumulation of phosphorylated metabolites has been proposed. The ability of AraL to catabolise several related secondary metabolites requires regulation at the genetic level. Here, by site- directed mutagenesis, we show that AraL production is regulated by a structure in the translation initiation region of the mRNA, which most probably blocks access to the ribosome-binding site, preventing protein synthesis. Members of HAD subfamily IIA and IIB are characterised by a broad-range and overlapping specificity that anticipated the need for regulation at the genetic level. In this study we provide evidence for the existence of a genetic regulatory mechanism controlling AraL production.

Tuberculosis incidence and risk factors among patients living with HIV/AIDS in public health service institutions in Brasilia, Federal District

In order to estimate the incidence of and risk factors for developing tuberculosis, the clinical charts of a retrospective cohort of 281 HIV-positive adults, who were notified to the AIDS Program of the Health Department of Brasilia in 1998, were reviewed in 2003. All the patients were treatment-naive regarding antiretroviral therapy at the time of inclusion in the cohort. Twenty-nine patients were identified as having tuberculosis at the start of the study. Thirteen incident tuberculosis cases were identified during the 60 months of follow-up, with an incidence density rate of 1.24/100 person-years. Tuberculosis incidence was highest among patients with baseline CD4+ T-lymphocyte counts < 200 cells/µl who were not using antiretroviral therapy (incidence = 5.47; 95% CI = 2.73 to 10.94). Multivariate analysis showed that baseline CD4+ T-lymphocyte counts < 200 cells/µl (adjusted hazard ratio [AHR] = 5.09; 95% CI = 1.27 to 20.37; p = 0.02) and non-use of antiretroviral therapy (AHR = 12.17; 95% CI = 2.6 to 56.90; p = 0.001) were independently associated with increased risk of tuberculosis.

Estudo das características epidemiológicas e clínicas de pacientes portadores do vírus da imunodeficiência humana em Pronto Atendimento do Hospital das Clínicas da Universidade Federal de Minas Gerais

Este trabalho objetiva a análise prospectiva das características clínicas e epidemiológicas que levam os pacientes adultos com HIV/AIDS a procurarem atendimento clínico de urgência em Pronto Atendimento do Hospital das Clínicas da Universidade Federal de Minas Gerais. Noventa e nove pacientes perfizeram 118 internações. A idade foi em média 39,4 anos. A relação homem e mulher foi de 1,35:1. O tempo desde o diagnóstico até a admissão situou-se de forma mais freqüente entre 0-5 anos em 40,4% dos casos. A terapêutica anti-retroviral era usada regularmente em 56,8% das admissões. A contagem de linfócitos T CD4+ foi inferior a 200 células/mm³ em 45,7% dos pacientes. As queixas mais freqüentes foram aumento da temperatura corpórea, diarréia, tosse e dispnéia. O aparelho respiratório foi o mais acometido. As doenças oportunistas mais freqüentes foram pneumocistose, pneumonia comunitária, síndrome diarréica, e candidiase oral. A demanda de internações de pacientes com HIV representou 2,8% das admissões, com tempo médio de permanência hospitalar de 4,6 dias. Os pacientes possuíam, em sua maioria, contagem de linfócitos TCD4+ baixa, quase metade não usava a terapia anti-retroviral altamente eficaz. Houve tendência à feminização. As doenças relacionadas à AIDS continuam sendo as mais freqüentes no nosso meio.

Oportunidades perdidas de avaliação sorológica para a infecção pelo vírus da imunodeficiência humana na rotina de atendimento ambulatorial do Hospital Universitário de Brasília, Distrito Federal

Foram estudados os fatores envolvidos na oferta de sorologia para detectar a infecção pelo vírus de imunodeficiência humana, no atendimento de adultos no ambulatório do Hospital Universitário de Brasília, por meio de aplicação de questionários específicos a 53 médicos e 347 usuários. Os resultados revelaram que 96,8% dos usuários identificaram como fator de risco para adquirir a infecção as relações sexuais desprotegidas e 13,6% desconheciam a possibilidade de transmissão vertical. Em relação à exposição dos usuários aos fatores de risco, 88,2% praticaram relações sexuais desprotegidas, 22,2% tiveram diagnóstico de outras doenças de transmissão sexual e 22,2% tinham recebido transfusões sangüíneas. Os fatores de risco mais questionados pelos médicos foram a prática de relações sexuais desprotegidas e o diagnóstico prévio de hepatite B ou C (35,9% para ambos). Dezoito por cento dos usuários receberam oferta de testes no Hospital Universitário de Brasília; 15,8% foram testados e 7,4% dos indivíduos testados não tiveram acesso ao resultado. Noventa e um por cento dos médicos referiram sentir-se confortáveis ao oferecer testes e apenas 30,4% oferecem-nos rotineiramente. O estudo confirma a perda de oportunidades de testagem sorológica para detectar a infecção no Hospital Universitário de Brasília e reforça a necessidade de implementar medidas para corrigir o problema.

Monitoramento do mosquito Aedes aegypti (Linnaeus, 1762) (Diptera: Culicidae), por meio de ovitrampas no Campus da Universidade Federal de Mato Grosso, Cuiabá, Estado de Mato Grosso

A dengue é uma das mais importantes arboviroses que atinge o homem e constitui um sério problema de saúde nas áreas tropicais, cujas condições climáticas são favoráveis à ocorrência de focos de Aedes aegypti. Armadilhas de oviposição acrescidas de infusão de feno foram instaladas em 19 pontos no Campus da Universidade Federal de Mato Grosso com o objetivo de verificar mensalmente o nível de infestação do vetor da dengue e a influência dos fatores abióticos. Os resultados obtidos foram comparados com dados abióticos de temperatura e umidade relativa do ar, e de precipitação pluviométrica, mensais e dos dias que as armadilhas permaneceram no campo. A chuva é o único fator abiótico que apresenta influência no nível de infestação dos vetores da dengue no local. Existem diferenças significativas entre as quantidades de ovos de Aedes aegypti encontrados em diferentes locais de coleta na mesma área de estudo. O número de ovos encontrados em cada ponto ao longo do ano não obedece a um padrão de distribuição único.

Transcriptional regulation of the mannosyltransferase-encoding gene pigm in inherited glycosylphosphatidylinositol (GPI) deficiency

RESUMO:O glicosilfosfatidilinositol (GPI) é um complexo glicolipídico utlizado por dezenas de proteínas, o qual medeia a sua ancoragem à superfície da célula. Proteínas de superfície celular ancoradas a GPI apresentam várias funções essenciais para a manutenção celular. A deficiência na síntese de GPI é o que caracteriza principalmente a deficiência hereditária em GPI, um grupo de doenças autossómicas raras que resultam de mutações nos genes PIGA, PIGL, PIGM, PIGV, PIGN, PIGO e PIGT, os quais sao indispensáveis para a biossíntese do GPI. Uma mutação pontual no motivo rico em GC -270 no promotor de PIGM impede a ligação do factor de transcrição (FT) Sp1 à sua sequência de reconhecimento, impondo a compactação da cromatina, associada à hipoacetilação de histonas, e consequentemente, impedindo a transcrição de PIGM. Desta forma, a adição da primeira manose ao GPI é comprometida, a síntese de GPI diminui assim como as proteínas ligadas a GPI à superficie das células. Pacientes com Deficiência Hereditária em GPI-associada a PIGM apresentam trombose e epilesia, e ausência de hemólise intravascular e anemia, sendo que estas duas últimas características definem a Hemoglobinúria Paroxística Nocturna (HPN), uma doença rara causada por mutações no gene PIGA. Embora a mutação que causa IGD seja constitutiva e esteja presente em todos os tecidos, o grau de deficiência em GPI varia entre células do mesmo tecido e entre células de tecidos diferentes. Por exemplo nos granulócitos e linfócitos B a deficiência em GPI é muito acentuada mas nos linfócitos T, fibroblastos, plaquetas e eritrócitos é aproximadamente normal, daí a ausência de hemólise intravascular. Os eventos transcricionais que estão na base da expressão diferencial da âncora GPI nas células hematopoiéticas são desconhecidos e constituem o objectivo geral desta tese. Em primeiro lugar, os resultados demonstraram que os níveis de PIGM mRNA variam entre células primárias hematopoiéticas normais. Adicionalmente, a configuração dos nucleossomas no promotor de PIGM é mais compacta em células B do que em células eritróides e tal está correlacionado com os níveis de expressão de PIGM, isto é, inferior nas células B. A presença de vários motivos de ligação para o FT específico da linhagem megacariocítica-eritróide GATA-1 no promotor de PIGM sugeriu que GATA-1 desempenha um papel regulador na sua transcrição. Os resultados mostraram que muito possivelmente GATA-1 desempenha um papel repressor em vez de activador da expressão de PIGM. Resultados preliminares sugerem que KLF1, um factor de transcrição restritamente eritróide, regula a transcrição de PIGM independentemente do motivo -270GC. Em segundo lugar, a investigação do papel dos FTs Sp demonstrou que Sp1 medeia directamente a transcrição de PIGM em ambas as células B e eritróide. Curiosamente, ao contrário do que acontece nas células B, em que a transcrição de PIGM requer a ligação do FT geral Sp1 ao motivo -270GC, nas células eritróides Sp1 regula a transcrição de PIGM ao ligar-se a montante e não ao motivo -270GC. Para além disso, demonstrou-se que Sp2 não é um regulador directo da transcrição de PIGM quer nas células B quer nas células eritróides. Estes resultados explicam a ausência de hemólise intravascular nos doentes com IGD associada a PIGM, uma das principais características que define a HPN. Por último, resultados preliminares mostraram que a repressão da transcrição de PIGM devida à mutação patogénica -270C>G está associada com a diminuição da frequência de interacções genómicas em cis entre PIGM e os seus genes “vizinhos”, sugerindo adicionalmente que a regulação de PIGM e desses genes é partilhada. No seu conjunto, os resultados apresentados nesta tese contribuem para o conhecimento do controlo transcricional de um gene housekeeping, específico-detecido, por meio de FTs genéricos e específicos de linhagem.-------------ABSTRACTC: Glycosylphosphatidylinositol (GPI) is a complex glycolipid used by dozens of proteins for cell surface anchoring. GPI-anchored proteins have various functions that are essential for the cellular maintenance. Defective GPI biosynthesis is the hallmark of inherited GPI deficiency (IGD), a group of rare autosomal diseases caused by mutations in PIGA, PIGL, PIGM, PIGV, PIGN, PIGO and PIGT, all genes indispensable for GPI biosynthesis. A point mutation in the -270GC-rich box in the core promoter of PIGM disrupts binding of the transcription factor (TF) Sp1 to it, imposing nucleosome compaction associated with histone hypoacetylation, thus abrogating transcription of PIGM. As a consequence of PIGM transcriptional repression, addition of the first mannose residue onto the GPI core and thus GPI production are impaired; and expression of GPI-anchored proteins on the surface of cells is severely impaired. Patients with PIGM-associated IGD suffer from life-threatening thrombosis and epilepsy but not intravascular haemolysis and anaemia, two defining features of paroxysmal nocturnal haemoglobinuria (PNH), a rare disease caused by somatic mutations in PIGA. Although the disease-causing mutation in IGD is constitutional and present in all tissues, the degree of GPI deficiency is variable and differs between cells of the same and of different tissues. Accordingly, GPI deficiency is severe in granulocytes and B cells but mild in T cells, fibroblasts, platelets and erythrocytes, hence the lack of intravascular haemolysis.The transcriptional events underlying differential expression of GPI in the haematopoietic cells of PIG-M-associated IGD are not known and constitute the general aim of this thesis. Firstly, I found that PIGM mRNA levels are variable amongst normal primary haematopoietic cells. In addition, the nucleosome configuration in the promoter of PIGM is more compacted in B cells than in erythroid cells and this correlated with the levels of PIGM mRNA expression, i.e., lower in B cells. The presence of several binding sites for GATA-1, a mega-erythroid lineage-specific transcription factor (TF), at the PIGM promoter suggested that GATA-1 has a role on PIGM transcription. My results showed that GATA-1 in erythroid cells is most likely a repressor rather than an activator of PIGM expression. Preliminary data suggested that KLF1, an erythroid-specific TF, regulates PIGM transcription but independently of the -270GC motif. Secondly, investigation of the role of the Sp TFs showed that Sp1 directly mediates PIGM transcriptional regulation in both B and erythroid cells. However, unlike in B cells in which active PIGM transcription requires binding of the generic TF Sp1 to the -270GC-rich box, in erythroid cells, Sp1 regulates PIGM transcription by binding upstream of but not to the -270GC-rich motif. Additionally, I showed that Sp2 is not a direct regulator of PIGM transcription in B and erythroid cells. These findings explain lack of intravascular haemolysis in PIGM-associated IGD, a defining feature of PNH. Lastly, preliminary work shows that transcriptional repression of PIG-M by the pathogenic -270C>G mutation is associated with reduced frequency of in cis genomic interactions between PIGM and its neighbouring genes, suggesting a shared regulatory link between these genes and PIGM. Altogether, the results presented in this thesis provide novel insights into tissuespecific transcriptional control of a housekeeping gene by lineage-specific and generic TFs.

Estudo da transmissão da leishmaniose tegumentar americana no Distrito Federal

O objetivo do estudo foi caracterizar a leishmaniose tegumentar em pacientes do Distrito Federal, investigar infecção subclínica nos moradores das localidades dos pacientes e identificar as espécies de flebotomíneos e leishmanias. Foram selecionados pacientes atendidos no Hospital Universitário de Brasília de agosto de 2006 a junho de 2007. Parentes e vizinhos dos mesmos foram submetidos à intradermorreação de Montenegro e imunofluorescência indireta. Foram capturados flebotomíneos nas localidades de origem dos pacientes e identificados quanto às espécies, bem como foram identificadas as espécies de leishmanias encontradas nos pacientes. Foram registrados 10 casos autóctones de leishmaniose tegumentar. Em 32 moradores, foi realizada intradermorreação, com positividade de 71,8%. Trinta e sete imunofluorescências realizadas foram negativas. Foram capturadas Lutzomyia whitmani, inclusive no domicílio/peridomicílio e Lutzomyia flaviscutellata. O percentual de positividade das intradermorreações de Montenegro sugere infecção subclínica dos moradores. A captura do vetor Lutzomyia whitmani no peri/intradomicílio sugere transmissão peri/intradomicíliar.

Malária vivax com tempo de incubação prolongado, detectada no Distrito Federal: relato de três casos

Foram detectados três casos de malária vivax em Brasília, Distrito Federal, área considerada indene, procedentes da Amazônia, seis meses após estarem residindo em Brasília. Período de incubação prolongado tem sido descrito apenas para infecções por cepas de Plasmodium vivax de clima temperado. Não foi possível genotipar os parasitos.

Autochthonous visceral leishmaniasis in Brasília, Federal District, Brazil

INTRODUCTION: Visceral leishmaniasis is a public health threat in Brazil considering the high lethality rates and increasing geographical dispersion to large urban conglomerates over the past 25 years. This study aimed to confirm suspected autochthonous cases of visceral leishmaniasis reported from 2005 to 2009 among individuals living in Brasilia, Federal District. METHODS: A retrospective review of the surveillance data obtained on a regular basis and clinical records of the reported cases were performed in 2009. RESULTS: Data from entomological and canine surveys revealed the presence of both Lutzomyia longipalpis and positive serology for Leishmania in dogs within 19 of the 21 neighborhoods where human cases occurred since 2005. The review of surveillance data and medical records, together with the entomological and canine survey data, permitted confirmation of 21 autochthonous human cases in the Federal District. The disease predominantly affected children (12/21) and those from the Sobradinho region (16/21); the typical presentation of fever, hepatosplenomegaly and pancytopenia was observed in 67% of cases. Three deaths occurred during the study period. Leishmania (Leishmania) chagasi was successfully isolated from one human case and twelve canine cases. CONCLUSIONS: Visceral leishmaniasis should be considered endemic in Brasilia based on the documented epidemiological behavior herein described and the confirmed autochthony of human cases.