Uso de marcadores RAPD na classificação de isolados de Phytophthora spp. causadores da podridão parda do cacaueiro no Brasil

Objetivou-se neste trabalho propor uma metodologia para a utilização de marcadores RAPD como uma ferramenta auxiliar na classificação de isolados de Phytophthora spp. causadores da podridão-parda do cacaueiro (Theobroma cacao) no Brasil. Existe uma necessidade constante de monitorar populações de Phytophthora spp. nas regiões cacaueiras do Brasil e a tarefa de classificação dos isolados é difícil e demorada. Com base em estudos de diversidade genética de isolados de Phytophthora capsici, P. palmivora e P. citrophthora por meio de marcadores RAPD, foram escolhidos três isolados de cada espécie como padrões e dois "primers" decâmeros mais informativos na diferenciação das espécies (OPA 13 e OPH 18). O DNA genômico dos isolados padrões e de três isolados não classificados foi extraído e amplificado, utilizando-se os dois "primers" decâmeros mais informativos. Os padrões de marcadores RAPD obtidos permitiram uma diferenciação visual clara dos isolados de cada espécie e mostraram-se úteis na classificação de isolados de Phytophthora spp. A metodologia proposta já está sendo utilizada no Centro de Pesquisas do Cacau, solucionando eventuais dúvidas resultantes da caracterização morfológica dos isolados.

Biologia molecular do processo de infecção por Agrobacterium spp.

Agrobacterium tumefaciens é o agente causal da galha-da-coroa, doença que afeta a maioria das plantas dicotiledôneas e caracteriza-se pelo crescimento de tumores na junção entre o caule e a raiz (coroa). A formação desses tumores é o resultado de um processo natural de transferência de genes de Agrobacterium spp. para o genoma da planta infetada. Esses genes estão contidos em um plasmídio de alto peso molecular (120 a 250 kb), denominado Ti ("tumor inducing"), presente em todas as linhagens patogênicas de Agrobacterium spp. Duas regiões do plasmídio Ti estão diretamente envolvidas na indução do tumor: a região-T, que corresponde ao segmento de DNA transferido para a célula vegetal, e a região de virulência (região vir), que contém genes envolvidos na síntese de proteínas responsáveis pelo processo de transferência da região-T. Esta região, uma vez transferida e integrada no genoma da célula vegetal, passa a ser denominada de T-DNA ("transferred DNA"). Os genes presentes no T-DNA codificam enzimas envolvidas na via de biossíntese de reguladores de crescimento, auxinas e citocininas. A síntese desses reguladores pelas células transformadas causa um desbalanço hormonal, levando à formação do tumor no local da infecção. Outro grupo de genes presentes no T-DNA codifica enzimas responsáveis pela síntese de opinas, que são catabolisadas especificamente pela bactéria colonizadora, como fonte de nutrientes. O conhecimento preliminar das bases moleculares envolvidas no processo de infecção de uma planta hospedeira por Agrobacterium spp., permitiu a utilização desta bactéria como vetor natural de transformação genética de plantas.

Caracterização enzimática e patogenicidade cruzada de Colletotrichum spp. associados a doenças de pós-colheita

A antracnose, causada por Colletotrichum spp., pode ocasionar grandes perdas a nível de campo e em pós-colheita sobre diversas culturas e seus produtos. O presente trabalho teve por objetivos testar a patogenicidade cruzada de isolados de C. gloeosporioides do caju (Anacardium occidentale) (CAJ), manga (Mangifera indica) (MG), mamão (Carica papaya) (MM), maracujá (Passiflora edulis) (MR) e C. musae da banana (Musa spp.) (BAJ); avaliar a produção de enzimas extracelulares (amilolítica, celulolítica, lipolítica e proteolítica) produzidas pelos isolados em substratos sólidos específicos; e detectar padrões eletroforéticos de proteínas totais e isoenzimas (alfa-esterase, beta-esterase, fosfatase ácida e leucina aminopeptidase). Na análise da patogenicidade cruzada, todos os isolados de Colletotrichum spp. induziram lesões necróticas, deprimidas sobre os frutos, exceto em maracujá que foi suscetível tão somente ao isolado MR. Quanto à produção de enzimas extracelulares hidrolíticas, os isolados de C. gloeosporioides produziram amilase, lipase, protease e celulase, sendo que esta última enzima não foi detectada em C. musae. Com relação à análise eletroforética de proteínas totais e isoenzimas, os isolados apresentaram variações no número e posição das bandas no gel de poliacrilamida em todos os sistemas, com exceção de leucina aminopeptidase, onde bandas monomórficas foram formadas, sem variação na intensidade e pouca variação na mobilidade relativa.

Controle químico da queima de folhas e da mela de estacas de eucalipto, causadas por Rhizoctonia spp.

Visando ao controle químico da queima de folhas e mela de estacas de eucalipto (Eucalyptus spp.) em viveiros florestais, avaliou-se a eficiência de 12 fungicidas em inibir in vitro o crescimento micelial de um isolado epifítico de Rhizoctonia solani AG1-IB (RH-2). Sete fungicidas que inibiram totalmente o crescimento micelial do fungo, a concentrações inferiores a 100 ppm, foram pré-selecionados: methyl-tolclophos, benomyl, pencycuron, iprodione, thiabendazol, thiram e captan. Avaliou-se, ainda, a sensibilidade (EC50 = dose provável que inibe o crescimento micelial em 50%) aos fungicidas methyl-tolclophos, benomyl, iprodione e pencycuron de mais oito isolados patogênicos ao eucalipto, que diferem entre si quanto a virulência, morfologia, grupo de anastomose, número de núcleos por célula vegetativa e padrões eletroforéticos de proteínas e isoenzimas. Embora variações nos valores de EC50 entre algumas combinações de fungicidas e isolados tenham ocorrido, todos os isolados foram sensíveis aos quatro fungicidas testados (EC50 < 11 ppm). Sob condições controladas, pulverizações com iprodione (1,5 g/l), benomyl (1 g/l), methyl-tolclophos (1,5 g/l), thiram ( 2,1 g/l), captan (2 g/l) e pencycuron (2 g/l) reduziram significativamente (alfa=5%) a incidência de folhas lesionadas por R. solani AG1, em brotações de mudas envasadas. Associadas à poda de limpeza, pulverizações de brotações de eucalipto em jardim clonal (no campo) com iprodione (1 g/l) ou com mistura de benomyl (0,5 g/l) + captan (1 g/l), alternada com mistura de benomyl (0,5 g/l) + thiram (1 g/l), reduziram a incidência da mela de estacas na casa de vegetação (alfa=5%).

Isolamento, caracterização cultural-morfológica, patogenicidade e serologia de Streptomyces spp. da batata

O presente trabalho testou quatro métodos de isolamento de Streptomyces spp. em tubérculos de batata (Solanum tuberosum) com sarna comum, superficial e profunda, caracterizando os isolados quanto a morfologia, serologia e patogenicidade. Para o isolamento foram testados: meio de cultura ágar-água a pH 10; meio contendo antibióticos; meio de asparagina e meio de quitina. O meio ágar-água pH 10 foi o mais eficaz no isolamento de Streptomyces spp. com média de 129 colônias/placa, além de ser de fácil preparo, menor custo e proporcionar melhor visualização das colônias. No meio de antibiótico verificou-se média de 54% dos fragmentos de tubérculos plaqueados com crescimento de Streptomyces spp. Já nos meios de asparagina e quitina a média foi de 36,3 e 2,5 colônias/placa, respectivamente. Para caracterização dos isolados obtidos utilizou-se o meio de extrato de levedura e malte. As colônias originadas apresentaram coloração que variou de cinza a marrom e de branco a creme, com ou sem produção de pigmento, com cadeias de esporos flexuosas ou espiraladas, de tamanho variável e produzindo ou não micélio aéreo em colônias com cadeias espiraladas. Dezenove isolados, representando esses diferentes tipos, foram inoculados na batata cv. Monalisa por infestação de solo autoclavado, antes da semeadura dos tubérculos-sementes. Sintomas típicos da doença foram verificados 14 semanas após a inoculação, para oito isolados. Anti-soros produzidos em coelhos contra três isolados fitopatogênicos apresentaram reação serológica (dupla difusão em gel-ágar de Ouchterlony) para os antígenos homólogos e para poucos antígenos heterólogos, porém os isolados de Streptomyces com patogenicidade confirmada não apresentaram antígenos em comum.

Identidade e propriedades de isolados de potyvírus provenientes de Capsicum spp.

Vinte isolados virais provenientes de Capsicum spp. foram coletados em Minas Gerais, São Paulo, Espírito Santo e Rio de Janeiro visando definir a etiologia dos mosaicos. Para a caracterização biológica realizou-se teste de gama de hospedeiros e inoculação em cultivares diferenciadoras de pimentão (Capsicum annuum). Dois isolados provenientes de batata (Solanum tuberosum) (PVY N-BR e PVY O-BR) foram utilizados como controles. Os resultados indicaram considerável grau de variabilidade biológica entre os isolados, embora todos tenham sido identificados preliminarmente como Potato virus Y (PVY). A reação das cultivares diferenciadoras classificou os isolados como patótipo 1 ou 1.2 de PVY. Anti-soros foram produzidos a partir de partículas virais purificadas de um isolado fraco e um forte. O uso desses anti-soros em ELISA indireto levou a resultados positivos contra os isolados testados. Os anti-soros reagiram também contra PVY N-BR e PVY O-BR, embora este último tenha apresentado reação mais fraca. Para caracterização molecular, seqüenciaram-se os genes da polimerase (NIb) e da proteína capsidial (cp), e da região 3' não-traduzida (3'NTR) de isolados biologicamente distintos. A análise filogenética confirmou a identidade de seis isolados como Pepper yellow mosaic virus (PepYMV), um potyvírus descrito recentemente infetando pimentão no Brasil. Esse resultado sugere que o PepYMV pode ser a espécie de potyvírus predominante em Capsicum spp. no Brasil. O fato de isolados de PepYMV apresentarem gama de hospedeiros semelhante à do PVY, e de os dois vírus apresentarem relacionamento sorológico, ressalta a utilidade da análise molecular para a classificação de potyvírus provenientes de Capsicum spp.

Caracterização e diversidade genética de isolados de Phytophthora spp. do cacaueiro com base em marcadores RAPD

Objetivou-se neste trabalho estudar a diversidade genética entre isolados das três principais espécies do gênero Phytophthora causadoras da podridão-parda do cacaueiro (Theobroma cacao) no Brasil, utilizando marcadores moleculares RAPD. Foram utilizados 22 isolados de Phytophthora spp., sendo oito de P. capsici, cinco de P. palmivora e nove de P. citrophthora. DNA genômico de cada isolado foi extraído e amplificado utilizando-se sete "primers" decâmeros, os quais geraram 191 marcadores RAPD. Distâncias genéticas e análises de agrupamento realizadas com base nestes marcadores permitiram uma diferenciação clara dos isolados de cada espécie e mostraram diferentes níveis de diversidade intra-específica. Ficou evidente o potencial dos marcadores RAPD como uma ferramenta auxiliar na classificação dos isolados e, também, em estudos de diversidade genética intra-específica.

Estabilidade da resistência de Capsicum spp. ao oídio em telado e casa de vegetação

Oídio (Oidiopsis taurica) é uma importante doença do pimentão (Capsicum annuum) e outras espécies de Capsicum. O objetivo deste trabalho foi identificar fontes de resistência no germoplasma de Capsicum spp. e relatar suas reações ao oídio em ambientes de telado e de casa de vegetação. Em telado, com inoculação artificial, testaram-se 104 genótipos de C. annuum, C. chinense, C. baccatum e C. frutescens. A avaliação foi repetida em canteiros de casa de vegetação com inoculação natural. Em telado, inoculou-se via atomização de 10(4) conídios/ml e em casa de vegetação manteve-se como fonte de inóculo plantas de pimentão previamente infetadas. Os genótipos foram agrupados em cinco níveis de resistência, a partir de leituras periódicas de incidência, esporulação, severidade e intensidade total da doença, e da determinação das respectivas áreas abaixo das curvas de progresso da doença. Cerca de 77% dos genótipos avaliados em telado foram altamente (AS) ou moderadamente suscetíveis (MS); 8% moderadamente resistentes (MR); 11% resistentes (R); e 4% foram altamente resistentes (AR). Cerca de 72% dos genótipos avaliados em casa de vegetação foram AS ou MS; 11% MR; 9% R; e 8% foram AR. Todos os genótipos classificados como AS tanto em telado quanto em casa de vegetação pertencem à espécie C. annuum. De modo geral, o ranking de resistência ao oídio permaneceu constante nos dois ambientes. Capsicum baccatum, C. frutescens e C. chinense apresentaram maior número de genótipos resistentes. Os principais genótipos AR foram CNPH 39, 161, 363 e 601 (C. baccatum); CNPH 579, 596 e 597 (C. frutescens); CNPH 55 (C. chinense); CNPH 280, 289, 434, 570 e 600 (C. chinense) e CNPH 1424 (C. annuum).

Sobrevivência de micélio e escleródios de Rhizoctonia solani tratados com Trichoderma spp., em restos de cultura de Eucalyptus sp.

Este trabalho objetivou estudar a sobrevivência de micélio e escleródios de Rhizoctonia solani AG1-1C, em restos de cultura de eucalipto (Eucalyptus spp.) e avaliar a eficiência dos isolados Trichoderma longibrachiatum (UFV-1) e T. inhamatum (UFV-2 e UFV-3), comprovadamente antagônicos a R. solani, em reduzir a sobrevivência do patógeno, em condições de campo. Ao longo de 12 meses de avaliação, a sobrevivência de R. solani em folhas de eucalipto infetadas não foi afetada por fatores ambientes e tampouco por possíveis antagonistas de ocorrência natural. Por outro lado, a sobrevivência dos escleródios decresceu progressivamente, atingindo cerca de 26%. Não se constatou influência dos isolados de Trichoderma spp. na sobrevivência de R. solani em folhas infetadas de eucalipto. Entretanto, redução significativa e contínua na viabilidade de escleródios, foi observada, equiparando-se ao tratamento com fungicida, aos 25 dias após inoculação dos antagonistas, sendo os três isolados igualmente efetivos. Já, a sobrevivência no tratamento com fungicida, atingiu níveis significativamente baixos na primeira avaliação, mas sua eficiência foi reduzida ao longo do período experimental. Redução progressiva e contínua na sobrevivência de escleródios da testemunha foi também constatada, mas inferior a quaisquer dos tratamentos.

Pathogenicity evaluation of Cytospora eucalypticola isolated from Eucalyptus spp: cankers in Uruguay

Cytospora eucalypticola has been frequently associated with twig and stem cankers and as endophyte of Eucalyptus globulus and E. grandis in Uruguay. Mycelium discs of two C. eucalypticola isolates obtained from actively growing colonies were inoculated, both superficially and on experimentally wounded stems of E. globulus and E. grandis. No inoculated and control plants have shown any discoloration, gumosis or necrosis nor did they display lesions ten months after inoculation. Callus tissue was formed, partially or wholly occluding the wounds. The ability to penetrate healthy tissues and the inability to produce lesions evidenced that the presence of C. eucalypticola in twig and stem cankers could result from saprotrophic expansion of the endophytic mycelium in dying tissues, cankers probably being produced by different environmental stress conditions.

Seleção de acessos e progênies de Citrullus spp. para resistência a três potyvirus

Visando selecionar acessos e progênies de melancia (Citrullus spp.) como fontes de resistência aos potyvirus: Papaya ringspot virus tipo watermelon (PRSV-W), Watermelon mosaic virus (WMV) e Zucchini yellow mosaic virus (ZYMV), oito genótipos foram avaliados, sendo seis dos acessos (87-019, 87-029, 91-080, PI-244018, 91-043 e PI-195927) e dois do acesso PI-244019 (PI-244019A e PI-244019B) do Banco Ativo de Germoplasma (BAG) de cucurbitáceas do Nordeste brasileiro, da Embrapa Semi-Árido em Petrolina-PE. Também foram avaliadas progênies endogâmicas e de polinização livre derivadas desses acessos. As avaliações foram realizadas em de casa de vegetação, mediante inoculações mecânicas, e avaliação por Elisa, no Laboratório de Virologia Vegetal da UFC. As plantas não infetadas foram selecionadas e cultivadas na Estação Experimental de Bebedouro na Embrapa Semi-Árido em Petrolina-PE, onde ocorreram inoculações naturais de vírus por vetores. Foram constatadas plantas não infetadas com o PRSV-W nos acessos 87-019, PI-244019A, 91-080, PI-244018, PI-244019B e PI-195927; plantas não infetadas com o WMV nos acessos 87-019 e 87-029 e plantas não infetadas com o ZYMV nos acessos PI-244019A, 87-029, 91-080, 91-043, PI-244019B e PI-195927. As progênies apresentaram comportamento diferenciado, com percentagem de plantas selecionadas variando de 20 a 100% nas progênies avaliadas para resistência a PRSV-W e 60 a 100% nas progênies avaliadas para resistência a WMV. Nenhuma das progênies testadas apresentou resistência ao ZYMV, evidenciando possível diferença entre a resistência ao PRSV-W e ao WMV apresentada nas progênies e a resistência apresentada ao ZYMV, visto que as progênies foram submetidas ao mesmo número de autofecundações.

Immunolocalisation of secreted-excreted products of Meloidogyne spp. using polyclonal and monoclonal antibodies

Molecules expressed at the surface cuticle (SC) of plant parasitic nematodes represent the primary plant-nematode interface, and together with secreted-excreted (S-E) products are probably the first signals perceived by the host. These molecules, which are released into plant tissue, probably play important roles in the host-parasite interactions. Characterisation of these antigens will help in the identification of nematode targets useful for novel control strategies, which interfere with the nematode infection of plants. Three monoclonal (MAbs) and three polyclonal (PAbs) antibodies produced to S-E products of Meloidogyne spp. and Heterodera avenae were used to examine their reactivity towards M. incognita and/or M. arenaria second stage juveniles and adult females. The three PAbs showed cross-reactivity with M. incognita and M. arenaria. Antibody Roth-PC 373 strongly recognised molecules present in the SC, amphids and intestine, antibody Roth-PC 389 recognised the nematode amphids and metacorpus, while antibody Roth-PC 419 bound to molecules present in the subventral glands. Reactivity of the MAbs was only tested against M. arenaria. Monoclonal antibody Roth-MAb T116C1.1 showed intense reactivity with molecules present in the amphidial and phasmidial glands. Monoclonal antibodies Roth-MAb T46.2 and T42D.2 labeled the nematode amphids and molecules present in the nematode oesophagus (metacorpus), respectively.