Étude de l’effet de la metformine sur la survie cellulaire et sur la réparation de l’ADN chez la levure

Jusqu’à présent, la metformine a principalement été employée comme médicament contrôlant l’hyperglycémie des personnes atteintes de diabète de type II. Des études épidémiologiques ont démontré que les personnes, prenant de la metformine, développent moins de cancers. Par exemple, la prise de metformine réduit respectivement de 78% et de 46% les chances de développer un cancer hépatique ou pancréatique. Récemment, il a été montré que la metformine permet de réduire le développement de tumeur au niveau de la peau, suite à l’exposition à des rayons UVB. Dans cette étude, j’ai démontré que la présence de metformine permet une meilleure survie de la levure Saccharomyces cerevisiae suite à l’exposition à des rayons UVC ou UVA. De plus, j’ai démontré que la présence de metformine augmente le recrutement de l’histone Htz1 à la chromatine. Pour une souche htz1Δ, le niveau de survie suite à l’exposition aux rayons UVA est considérablement diminué. Htz1 permet le recrutement de Rad14 au site de dommages à l’ADN faits par les rayons UV. Htz1 est donc important pour la détection de ces sites. Enfin, le recrutement nucléaire de Rad14 en présence de metformine a considérablement augmenté. En absence de Rad14, le niveau de survie suite à l’exposition aux rayons UVA diminue significativement. Donc, Htz1 et Rad14 sont deux protéines clés dans la protection contre les rayons UV apportés par la metformine. En conclusion, avec les différents résultats de cette étude, il est possible de dire que la metformine permet une forme de protection contre les rayons UVC et UVA.

La génomique évolutive mitochondriale révèle des échanges génétiques et la ségrégation chez les Gloméromycètes

Les champignons mycorhiziens à arbuscules (CMA) sont des organismes microscopiques du sol qui jouent un rôle crucial dans les écosystèmes naturels et que l’on retrouve dans tous les habitats de la planète. Ils vivent en relation symbiotique avec la vaste majorité des plantes terrestres. Ils sont des biotrophes obligatoires, c'est-à-dire qu'ils ne peuvent croître qu'en présence d'une plante hôte. Cette symbiose permet entre autres à la plante d'acquérir des nutriments supplémentaires, en particulier du phosphore et du nitrate. Malgré le fait que cette symbiose apporte des services importants aux écosystèmes, la richesse des espèces, la structure des communautés, ainsi que la diversité fonctionnelle des CMA sont mal connues et l'approfondissement des connaissances dans ces domaines dépend d’outils de diagnostic moléculaire. Cependant, la présence de polymorphisme nucléaire intra-isolat combiné à un manque de données génomiques dans différents groupes phylogénétique de ces champignons complique le développement de marqueurs moléculaires et la détermination de l'affiliation évolutive à hauts niveaux de résolution (c.a.d. entre espèces génétiquement similaires et/ou isolats de la même espèce). . Pour ces raisons, il semble une bonne alternative d’utiliser un système génétique différent en ciblant le génome mitochondrial, qui a été démontré homogène au sein d'un même isolat de CMA. Cependant, étant donné le mode de vie particulier de ces organismes, une meilleure compréhension des processus évolutifs mitochondriaux est nécessaire afin de valoriser l'utilisation de tels marqueurs dans des études de diversité et en génétique des populations. En ce sens, mon projet de doctorat consistait à investiguerétudier: i) les vecteurs de divergences inter-isolats et -espèces génétiquement rapprochéesphylogénétiquement apparentées, ii) la plasticité des génomes mitochondriaux, iii) l'héritabilité mitochondriale et les mécanismes potentiels de ségrégation, ainsi que iv) la diversité mitochondriale intra-isolat in situ. À l'aide de la génomique mitochondriale comparative, en utilisant le séquençage nouvelle génération, on a démontré la présence de variation génétique substantielle inter-isolats et -espèces, engendrées par l'invasion d'éléments mobiles dans les génomes mitochondriaux des CMA, donnant lieu à une évolution moléculaire rapide des régions intergéniques. Cette variation permettait de développer des marqueurs spécifiques à des isolats de la même espèce. Ensuite, à l'aide d'une approche analytique par réseaux de gènes sur des éléments mobiles, on a été en mesure de démontrer des évènements de recombinaisons homologues entre des haplotypes mitochondriaux distincts, menant à des réarrangements génomiques. Cela a permis d'ouvrir les perspectives sur la dynamique mitochondriale et l'hétéroplasmie dans un même isolatsuggère une coexistence de différents haplotypes mitochondriaux dans les populations naturelles et que les cultures monosporales pourraient induirent une sous-estimation de la diversité allélique mitochondriale. Cette apparente contradiction avec l'homogénéité mitochondriale intra-isolat généralement observée, a amené à investiguer étudier les échanges génétiques à l'aide de croisements d'isolats génétiquement distincts. Malgré l'observation de quelques spores filles hétéroplasmiques, l'homoplasmie était le statut par défaut dans toutes les cultures monosporales, avec un biais en faveur de l'un des haplotypes parentaux. Ces résultats suggèrent que la ségrégation opère durant la formation de la spore et/ou le développement de la coloniedu mycélium. De plus, ils supportent la présence d'une machinerie protéique de ségrégation mitochondriale chez les CMAAMF, où l'ensemble des gènes impliqués dans ce mécanisme ont été retrouvé et sont orthologues aux autres champignons. Finalement, on est revenue aux sources avecon a étudié le polymorphisme mitochondrial intra-isolat à l'aide d'une approche conventionnelle de PCR en utilisant une Taq polymérase de haute fidélité, suivie de clonage et de séquençage Sanger, sur deux isolats de R. irregularis. Cela a permis l'observation d'hétéroplasmie in situ, ainsi que la co-expression de variantes de variantes de protéines'ARNm dans une souche in vitro. Les résultats suggèrent que d'autres études basées sur le séquençage nouvelle génération aurait potentiellement ignorée cette variation, offrant ainsi plusieurs nouveaux arguments permettant de considérer les CMA comme des organismes possédant une population de génomes mitochondriaux et nucléaires distincts.

Étude de l’évolution du tropisme et de la pression sélective exercée sur le gène de l’enveloppe du virus de l’immunodéficience humaine de type 1 au cours de la grossesse et à l’échelle de la population.

Introduction. Le VIH-1 évolue en fonction de la réponse immunitaire spécifique de l’hôte. La pression sélective exercée par la réponse immunitaire VIH-spécifique de l’hôte entraine l’évolution des gènes viraux et à terme détermine l’évolution de la maladie. Cette évolution du virus à l’échelle d’un individu façonne également l’évolution du virus à l’échelle de la population et détermine le devenir de l’épidémie. Le VIH utilise les corécepteurs d’entrée CCR5 (virus R5) et CXCR4 (virus X4) afin d’infecter la cellule cible, et l’évolution du tropisme du virus de R5 vers X4, appelé switch du tropisme, est associé à la progression de la maladie. Les virus R5 sont rencontrés en début d’infection tandis que les virus X4 apparaissent en fin de maladie chez un certain de nombre de patients et sont considérés comme plus virulents. La pression sélective immunitaire exercée sur le gène de l’enveloppe (env) peut donc entrainer l’évolution du tropisme du VIH. La grossesse est un état immunitaire particulier considéré comme étant principalement caractérisé par un biais Th2 nécessaire à l’établissement de la tolérance materno-fétale. Le switch de tropisme de R5 vers X4 en grossesse n’a jamais été documenté, de même que l’évolution des déterminants du tropisme à l’échelle de la population. Hypothèses. Les changements immunitaires associés à l’initiation et la progression de la grossesse engendrent des changements dans la pression immunitaire exercée sur l’enveloppe et peuvent favoriser le switch du tropisme. L’évolution du tropisme du VIH-1 peut être observé à l’échelle de la population au même titre que l’évolution de l’enveloppe virale. Objectifs. Analyser l’évolution du tropisme et décrire la pression sélective sur l’enveloppe des femmes enceintes infectées par le VIH-1. Analyser l’évolution des déterminants du tropisme à l’échelle de la population. Méthodes. Nous avons dans un premier temps analysé l’évolution des déterminants du tropisme et déterminé le génotype et phénotype du VIH-1 chez 19 femmes enceintes issues de la cohorte du centre maternel et infantile sur le SIDA de l’hôpital Sainte-Justine (CMIS). Nous avons ensuite caractérisé et comparé la pression sélective exercée sur env, par une méthode bayésienne, chez 31 femmes enceinte et 29 femmes non-enceintes. Enfin, nous avons analysé et comparé des déterminants du tropisme entre des séquences d’enveloppe contemporaines et anciennes, issues des bases de données du NCBI. Résultats. Nos résultats montrent la présence de virus X4 chez la moitié de notre cohorte, et un switch de tropisme de R5 vers X4 chez 5/19 sujets. Les séquences des femmes enceintes présentaient des taux de substitutions plus élevées que celles des femmes non-enceintes. La pression sélective dans la région C2 était plus faible chez les femmes enceintes que chez les femmes non-enceintes, et différait dans 4 positions entre ces 2 groupes. Cette sélection diminuait au cours de la grossesse chez les patientes traitées. Enfin, une accumulation de mutations X4 a été observée dans les séquences R5 contemporaines par rapport aux séquences R5 anciennes. Conclusion. Les changements immunitaires associés à la grossesse semblent induire des modifications subtiles dans la pression sélective exercée sur env, suffisant à influencer l’évolution du tropisme de R5 vers X4. Un switch du tropisme à l’échelle de la population impliquerait une épidémie évoluant vers une plus grande virulence du virus. Nos résultats sont d’importance en ce qui concerne la prophylaxie antirétrovirale pour la santé de la mère et la prévention de la transmission mère-enfant du VIH-1. Ils sont aussi importants concernant l’avenir de la thérapie antirétrovirale dans le contexte d’une épidémie évoluant vers une plus grande virulence

La construction de la conjugalité chez des conjoints de couples formés sur des sites de rencontre en ligne : une perspective interactionniste symbolique

Le couple est le commencement de la famille, la cellule fondamentale de la société et un des principaux lieux de solidarité pour les individus. Or, depuis quelques années l’irruption d’internet a permis l’instauration de rapports sociaux nouveaux que l’on peut identifier dans les façons de rencontrer quelqu’un ou de tomber amoureux. L’apparition des sites de rencontre a notamment permis à des individus de pouvoir faire la rencontre amoureuse de l’autre sur un site dédié et à convenance. Cette étude vise à une meilleure compréhension du phénomène social qu’est la construction de la conjugalité à partir de la rencontre sur des sites dédiés sur internet et partant des représentations des participants interrogés. Notre but était également de démontrer comme l’a souligné Marie-Chantal Doucet (2009) que l’action de l’individu sur les sites de rencontre en ligne n’est pas le fait de déterminations mais qu’il bénéficie plutôt d’une marge de jeu, lui permettant d’interpréter les codes et de donner un sens à ses actions et aux actions des autres car l’individu sur les sites de rencontre en ligne joue un personnage. Pour mener à bien cette étude, nous avons adopté un cadre théorique qui s’inscrit dans la perspective de l’interactionnisme symbolique en nous appuyant sur une approche par théorisation ancrée. Il ressort entre autre de l’enquête qualitative que nous avons menée que la construction conjugale est surtout le fruit de la rencontre en face à face car la rencontre en ligne proprement dite est marquée par le stigma et la marchandisation des corps que proposent les sites de rencontre ne sont pas propice au sentiment d’intimité favorable au développement du lien conjugal.

Rôle du GPR91 dans la réponse à l'hypoxie-ischémie et l'importance de sa localisation intracellulaire

L'adaptation à l'environnement est essentielle à la survie cellulaire et des organismes en général. La capacité d'adaptation aux variations en oxygène repose sur des mécanismes de détection de l'hypoxie et une capacité à répondre en amorçant un programme d'angiogenèse. Bien que la contribution du facteur induit par l'hypoxie (HIF) est bien définie dans l'induction d'une telle réponse, d'autres mécanismes sont susceptibles d'être impliqués. Dans cette optique, les études démontrant l'influence du métabolisme énergétique sur le développement vasculaire sont de plus en plus nombreuses. L'un de ces composés, le succinate, a récemment été démontré comme étant le ligand du GPR91, un récepteur couplé aux protéines G. Parmi les différents rôles attribués à ce récepteur, notre laboratoire s'intéressa aux rôles du GPR91 dans la revascularisation observée suite à des situations d'hypoxie dont ceux affectant la rétine. Il existe cependant d'autres conditions pour lesquelles une revascularisation serait bénéfique notamment suite à un stress hypoxique-ischémique cérébral. Nos travaux ont pour objectifs de mieux comprendre le rôle et le fonctionnement de ce récepteur durant le développement et dans le cadre de pathologies affectant la formation de vaisseaux sanguins. Dans un premier temps, nous avons déterminé le rôle du GPR91 dans la guérison suite à un stress hypoxique-ischémique cérébral chez le nouveau-né. Nous montrons que ce récepteur est exprimé dans le cerveau et en utilisant des souris n'exprimant pas le GPR91, nous démontrons que dans un modèle d'hypoxie-ischémie cérébrale néonatal l'angiogenèse prenant place au cours de la phase de guérison dépend largement du récepteur. L'injection intracérébrale de succinate induit également l'expression de nombreux facteurs proangiogéniques et les résultats suggèrent que le GPR91 contrôle la production de ces facteurs. De plus, l'injection de ce métabolite avant le modèle d'hypoxie-ischémie réduit substantiellement la taille de l'infarctus. In vitro, des essaies de transcription génique démontrent qu'à la fois les neurones et les astrocytes répondent au succinate en induisant l'expression de facteurs bénéfiques à la revascularisation. En considérant le rôle physiologique important du GPR91, une seconde étude a été entreprise afin de comprendre les déterminants moléculaires régissant son activité. Bien que la localisation subcellulaire des RCPG ait traditionnellement été considérée comme étant la membrane plasmique, un nombre de publications indique la présence de ces récepteurs à l'intérieur de la cellule. En effet, tel qu'observé par microscopie confocale, le récepteur colocalise avec plusieurs marqueurs du réticulum endoplasmique, que celui-ci soit exprimé de façon endogène ou transfecté transitoirement. De plus, l’activation des gènes par stimulation avec le succinate est fortement affectée en présence d'inhibiteur du transport d'acides organiques. Nous montrons que le profil de facteurs angiogéniques est influencé selon la localisation ce qui affecte directement l'organisation du réseau tubulaire ex vivo. Finalement, nous avons identifié une région conservée du GPR91 qui agit de signal de rétention. De plus, nous avons découvert l'effet de l'hypoxie sur la localisation. Ces travaux confirment le rôle de régulateur maître de l'angiogenèse du GPR91 lors d'accumulation de succinate en condition hypoxique et démontrent pour la première fois l'existence, et l'importance, d'un récepteur intracellulaire activé par un intermédiaire du métabolisme. Ces données pavent donc la voie à une nouvelle avenue de traitement ciblant GPR91 dans des pathologies hypoxiques ischémiques cérébrales et soulèvent l'importance de tenir compte de la localisation subcellulaire de la cible dans le processus de découverte du médicament.

Impact de la maladie du greffon contre l’hôte sur la reconstitution immunitaire suite à une transplantation allogénique de cellules souches hématopoïétiques

La transplantation allogénique de cellules souches hématopoïétiques (ASCT) est couramment utilisée pour traiter différents cancers hématologiques. Malheureusement, l’effet bénéfique de cette technique est limité par la réaction du greffon contre l’hôte (GVHD) qui demeure la cause principale de mortalité post-greffe. La GVHD endommage différents organes et retarde la reconstitution immunitaire des lymphocytes T (LT) ce qui augmente les risques d’infection et de rechute. Le développement de nouveaux traitements permettant d’accélérer la reconstitution immunitaire augmenterait donc les chances de survie des patients greffés. Il existe deux façons de régénérer des LT: via la thymopoïèse qui consiste à produire de nouveaux LT, ou par la prolifération homéostatique (PH) qui implique l’expansion rapide des LT matures retrouvés dans le greffon. La PH requiert deux signaux essentiels: l’interleukine-7 (IL-7) et la présentation d’antigènes du soi par les cellules dendritiques (DC) via le complexe majeur d’histocompatibilité (CMH) I pour les LT CD8+ et le CMH II pour les LT CD4+. Dans un contexte d’ASCT, la chimiothérapie et la GVHD endommagent le thymus rendant la thymopoïèse inefficace. Par conséquent, la reconstitution immunitaire repose presque entièrement sur la PH des LT. L’objectif de cette thèse était de comprendre comment la GVHD affecte la reconstitution des LT. Grâce à un modèle murin, nous avons démontré que la PH des LT CD4+ est absente durant la GVHD et ce, dû à de faibles niveaux d’IL-7 et une diminution du nombre de DC. La perte des DC est en grande partie causée par des niveaux réduits de stromal derived factor-1α (SDF-1α) et par l’absence de progéniteurs de DC dans la moelle osseuse des souris en GVHD. Le traitement des souris en GVHD avec du SDF-1α permet d’augmenter le nombre de DC, et lorsqu’administré avec l’IL-7, améliore significativement la PH des LT CD4+. Contrairement aux LT CD4+, l’administration d’IL-7 seule est suffisante pour restaurer la PH des LT CD8+ durant la GVHD et ce, même en absence des DC. Ces différences s’expliquent pour deux raisons : 1) l’expression du CMH I, contrairement au CMH II, n’est pas limitée aux DC mais est également exprimée par les cellules stromales du receveur ce qui est suffisant pour induire la PH des LT CD8+ et 2) les LT CD8+ répondent à des concentrations plus faibles d’IL-7 systémique comparativement aux LT CD4+. En conclusion, l’ensemble de ces résultats permettra de mettre en place des études translationnelles sur le potentiel thérapeutique du SDF-1α et de l’IL-7 dans la reconstitution immunitaire des patients greffés.

Mécanismes cellulaires et moléculaires impliqués dans le développement des synapses GABAergiques périsomatiques et dans la plasticité corticale : rôle de l’activité neuronale et de proBDNF/p75NTR

Dans le cortex visuel des mammifères, une cellule à panier (BC) qui représente un sous-type majoritaire d’interneurones GABAergiques, innerve une centaine de neurones par une multitude de synapses localisées sur le soma et sur les dendrites proximales de chacune de ses cibles. De plus, ces cellules sont importantes pour la génération des rythmes gammas, qui régulent de nombreuses fonctions cognitives, et pour la régulation de la plasticité corticale. Bien que la fonction des BC au sein des réseaux corticaux est à l'étude, les mécanismes qui contrôlent le développement de leur arborisation complexe ainsi que de leurs nombreux contacts synaptiques n’ont pas été entièrement déterminés. En utilisant les récepteurs allatostatines couplés aux protéines G de la drosophile (AlstR), nous démontrons in vitro que la réduction de l'excitation ainsi que la réduction de la libération des neurotransmetteurs par les BCs corticales individuelles des souris, diminuent le nombre de cellules innervées sans modifier le patron d'innervation périsomatique, durant et après la phase de prolifération des synapses périsomatiques. Inversement, lors de la suppression complète de la libération des neurotransmetteurs par les BCs individuelles avec l’utilisation de la chaîne légère de la toxine tétanus, nous observons des effets contraires selon le stade de développement. Les BCs exprimant TeNT-Lc pendant la phase de prolifération sont caractérisées par des arborisations axonales plus denses et un nombre accru de petits boutons homogènes autour des somas innervés. Toutefois, les cellules transfectées avec TeNT-Lc après la phase de la prolifération forment une innervation périsomatique avec moins de branchements terminaux d’axones et un nombre réduit de boutons avec une taille irrégulière autour des somas innervés. Nos résultats révèlent le rôle spécifique des niveaux de l’activité neuronale et de la neurotransmission dans l'établissement du territoire synaptique des cellules GABAergiques corticaux. Le facteur neurotrophique dérivé du cerveau (BDNF) est un modulateur puissant de la maturation activité-dépendante des synapses GABAergiques. Grâce à l'activation et à la signalisation de son récepteur tyrosine kinase B (TrkB), la liaison de mBDNF module fortement la prolifération des synapses périsomatiques GABAergiques formés par les BCs. Par contre, le rôle du récepteur neurotrophique de faible affinité, p75NTR, dans le développement du territoire synaptique des cellules reste encore inconnu. Dans ce projet, nous démontrons que la suppression de p75NTR au niveau des BCs individuelles in vitro provenant de souris p75NTRlox induit la formation d'une innervation périsomatique exubérante. BDNF est synthétisé sous une forme précurseur, proBDNF, qui est par la suite clivée par des enzymes, y compris la plasmine activée par tPA, pour produire une forme mature de BDNF (m)BDNF. mBDNF et proBDNF se lient avec une forte affinité à TrkB et p75NTR, respectivement. Nos résultats démontrent qu’un traitement des cultures organotypiques avec la forme résistante au clivage de proBDNF (mut-proBDNF) réduit fortement le territoire synaptique des BCs. Les cultures traitées avec le peptide PPACK, qui inactive tPA, ou avec tPA altèrent et favorisent respectivement la maturation de l’innervation synaptique des BCs. Nous démontrons aussi que l’innervation exubérante formée par les BCs p75NTR-/- n’est pas affectée par un traitement avec mut-proBDNF. L’ensemble de ces résultats suggère que l'activation de p75NTR via proBDNF régule négativement le territoire synaptique des BCs corticaux. Nous avons ensuite examiné si mut-proBDNF affecte l’innervation périsomatique formée par les BCs in vivo, chez la souris adulte. Nous avons constaté que les boutons GABAergiques périsomatiques sont significativement diminués dans le cortex infusé avec mut-proBDNF par rapport à l’hémisphère non-infusé ou traité avec de la saline. En outre, la plasticité de la dominance oculaire (OD) est rétablie par ce traitement chez la souris adulte. Enfin, en utilisant des souris qui ne possèdent pas le récepteur p75NTR dans leurs BCs spécifiquement, nous avons démontré que l'activation de p75NTR via proBDNF est nécessaire pour induire la plasticité de la OD chez les souris adultes. L’ensemble de ces résultats démontre un rôle critique de l'activation de p75NTR dans la régulation et le maintien de la connectivité des circuits GABAergiques, qui commencent lors du développement postnatal précoce jusqu’à l'âge adulte. De plus, nous suggérons que l'activation contrôlée de p75NTR pourrait être un outil utile pour restaurer la plasticité dans le cortex adulte.

Neurotensinergic modulation of glutamatergic neurotransmission in VTA neurons.

L’aire tegmentaire ventrale (VTA) contient une forte densité de terminaisons neurotensinergiques ainsi que des récepteurs à la surface des neurones dopaminergiques et non-dopaminergiques. Le VTA a été impliqué dans des maladies comme la schizophrénie, les psychoses et l’abus de substance. Les drogues d’abus sont connues pour induire le phénomène de sensibilisation - un processus de facilitation par lequel l’exposition à un stimulus produit une réponse augmentée lors de l’exposition subséquente au même stimulus. La sensibilisation se développe dans le VTA et implique mécanismes dopaminergiques et glutamatergiques. Il a été montré que les antagonistes neurotensinergiques bloquaient le développement de la sensibilisation et certains mécanismes de récompense et ces effets pourraient être médiés indirectement par une modulation de la neurotransmission glutamatergique. Cependant, on connaît peu les mécanismes de modulation de la transmission glutamatergique par la neurotensine (NT) dans le VTA. Le but de la présente thèse était d’étudier la modulation neurotensinergique de la neurotransmission glutamatergique dans les neurones dopaminergiques et non-dopaminergiques du VTA. Pour ce faire, nous avons utilisé la technique du patch clamp dans la cellule entière dans des tranches horizontales du VTA pour étudier les effets de différents agonistes et antagonistes neurotensinergiques. Les neurones ont été identifié comme Ih+ (présumés dopaminergiques) ou Ih- (présumés non-dopaminergiques) selon qu’ils exprimaient ou non un courant cationique activé par l’hyperpolarisation (Ih). Des techniques d’immunocytochimie ont été utilisées pour marquer les neurones et vérifier leur localisation dans le VTA. Dans une première étude nous avons trouvé que la neurotensine indigène (NT1-13) ou son fragment C-terminal, NT8-13, induisait une augmentation comparable des courants postsynaptiques excitateurs glutamatergiques (CPSEs) dans les neurones Ih+ ou Ih- du VTA. L'augmentation induite dans les neurones Ih+ par la NT8-13 a été bloquée par le SR48692, un antagoniste des récepteurs NTS1, et par le SR142948A, un antagoniste des récepteurs NTS1 et NTS2, suggérant que l'augmentation était médiée par l’activation des récepteurs NTS1. Dans les neurones Ih- l'augmentation n’a été bloquée que par le SR142948A indiquant une implication des récepteurs NTS2. Dans une deuxième étude, nous avons testé les effets de la D-Tyr[11]NT (un analogue neurotensinergique ayant différentes affinités de liaison pour les sous-types de récepteurs neurotensinergiques) sur les CPSEs glutamatergiques dans les neurones Ih+ et Ih- en parallèle avec une série d’expériences comportementales utilisant un paradigme de préférence de place conditionnée (PPC) menée dans le laboratoire de Pierre-Paul Rompré. Nous avons constaté que la D-Tyr[11]NT induisaient une inhibition dépendante de la dose dans les neurones Ih+ médiée par l'activation de récepteurs NTS2. En revanche, la D-Tyr[11]NT a produit une augmentation des CPSEs glutamatergiques médiée par des récepteurs NTS1 dans les neurones Ih-. Les résultats des expériences comportementales ont montré que des microinjections bilatérales de D-Tyr[11]NT dans le VTA induisait une PPC bloquée uniquement par la co-injection de SR142948A et SR48692, indiquant un rôle pour les deux types de récepteurs, NTS1 et NTS2. Cette étude nous a permis de conclure que i) la D-Tyr[11]NT agit dans le VTA via des récepteurs NTS1 et NTS2 pour induire un effet de récompense et ii) que cet effet est dû, au moins en partie, à une augmentation de la neurotransmission glutamatergique dans les neurones non-dopaminergiques (Ih-). Dans une troisième étude nous nous sommes intéressés aux effets de la D-Tyr[11]NT sur les réponses isolées médiées par les récepteurs N-méthyl-D-aspartate (NMDA) et acide α-amino-3- hydroxy-5-méthyl-4-isoxazolepropionique (AMPA) dans les neurones du VTA. Nous avons constaté que dans les neurones Ih+ l’amplitude des CPSEs NMDA et AMPA étaient atténuées de la même manière par la D-Tyr[11] NT. Cette modulation des réponses était médiée par les récepteurs NTS1 et NTS2. Au contraire, dans les neurones Ih-, l’amplitude des réponses NMDA et AMPA étaient augmentées en présence de D-Tyr[11]NT et ces effets dépendaient de l’activation des récepteurs NTS1 localisés sur les terminaisons glutamatergiques. Ces résultats fournissent une preuve supplémentaire que le NT exerce une modulation bidirectionnelle sur la neurotransmission glutamatergique dans les neurones du VTA et met en évidence un nouveau type de modulation peptidergique des neurones non-dopaminergiques qui pourrait être impliqué dans la sensibilisation. En conclusion, la modulation neurotensinergique de la neurotransmission glutamatergique dans les neurones dopaminergiques et non-dopaminergiques du VTA se fait en sens opposé soit, respectivement, par une inhibition ou par une excitation. De plus, ces effets sont médiés par différents types de récepteurs neurotensinergiques. En outre, nos études mettent en évidence une modulation peptidergique de la neurotransmission glutamatergique dans le VTA qui pourrait jouer un rôle important dans les mécanismes de lutte contre la toxicomanie.

Rôle de la PKC delta dans la fonction plaquettaire en réponse à la thrombine via le récepteur GPIb alpha

La famille des protéines kinases C (PKC) est essentielle pour la fonction plaquettaire en réponse à la thrombine qui signale et active les plaquettes via les proteases activated receptors (PAR-1 et PAR-4) et le GPIbα. Ces derniers constituent les récepteurs de moyenne/faible et de hautes affinités pour la thrombine, respectivement. L’isoforme PKCδ régule positivement ou négativement la fonction des plaquettes tout dépendamment de la nature du stimulus. Cependant, son importance dans la fonction plaquettaire en réponse à la thrombine en aval de la GPIbα reste inconnue. L’objectif principal de ce projet de doctorat était de déterminer l'implication de l'axe thrombine/GPIbα/PKCδ dans la fonction plaquettaire et d’évaluer le rôle de cet axe dans la régulation de la thrombose. Dans les plaquettes humaines, le prétraitement avec l'inhibiteur spécifique de la PKCδ δ(V1-1)TAT, a significativement potentialisé l'activation et l’agrégation des plaquettes en réponse à de faibles concentrations de α-thrombine, mais pas en réponse à la γ-thrombine ou aux agonistes des PARs. Ce phénomène de potentialisation a été associé à une sécrétion accrue de granules, de génération de thromboxane A2 (TXA2) et une phosphorylation de la PKCδ sur la Tyr311, qui ont toutes été prévenues par l’inhibition spécifique du GPIbα à l’aide d’un anticorps monoclonal bloquant. En outre, l'inhibition de la p38 MAPK, ERK1/2 et le TXA2 a inversé ce processus de potentialisation. Les plaquettes murines déficientes en PKCδ étaient aussi plus réactives à la thrombine et ont montré une augmentation significative de l'agrégation, alors qu’une étude menée in vivo chez la souris PKCδ- /- a montré, suite à une stimulation par α-thrombine, une réaction thrombotique accrue caractérisée par une diminution significative du temps de saignement ainsi qu’une formation de thrombo-embolies pulmonaires. En bloquant le GPIbα, ces effets ont été renversés. Cette étude ouvre de nouvelles perspectives quant au rôle de la PKCδ dans les plaquettes en aval de GPIbα, où elle régule négativement la fonction plaquettaire en réponse à la thrombine. Ainsi, l'axe thrombine/GPIbα/PKCδ dans les plaquettes pourrait représenter un régulateur critique de la fonction plaquettaire et l'hémostase, et le dysfonctionnement de cette voie pourrait conduire à des événements thrombotiques.

Régulation du facteur de transcription FOXK1 par O-GlcNAcylation : implications dans la différenciation adipocytaire

Les modifications post-traductionnelles telles que la phosphorylation, l’OGlcNAcylation et l’ubiquitination jouent des rôles critiques dans la coordination des fonctions protéiques et par conséquent influencent grandement de nombreux processus cellulaires. Il est à noter que ces modifications sont hautement dynamiques et finement regulées. Par exemple, l’ubiquitination peut être réversible via l’action des déubiquitinases comme le suppresseur de tumeurs BAP1. Parmis les gènes codant pour les déubiquitinases, BAP1 est la plus souvent mutée dans le cancer. Des études récentes ont démontré l’importance des dynamiques de modifications post-traductionnelles dans la régulation du complexe BAP1. En plus, BAP1 forme un complexe multi-protéiques contenant plusieurs régulateurs transcriptionnels comme la protéine polycomb OGT et les facteurs de transcription FOXK1 et FOXK2. OGT est une enzyme unique qui catalyze l’ajout d’un groupement O-GlcNAc sur ses substrats afin d’en moduler l’activité enzymatique, les interactions protéines-protéines et leur localisation cellulaire. Cette modification est aussi liée au métabolisme puisque son substrat donneur, l’UDP-GlcNAc, est dérivé de la voie biosynthétique des hexosamines. Parallèlement, FOXK1/2 ont aussi été démontrés comme étant critiques à des processus métaboliques telles que la myogenèse et l’autophagie. Lors de nos études, nous avons identifié FOXK1 comme un nouveau substrat d’OGT. De plus, les niveaux d’O-GlcNAcylation de FOXK1 fluctuent lors de l’entrée/sortie du cycle cellulaire. En outre, nous avons identifié l’importance de FOXK1 dans l’adipogenèse et observé que l’interaction FOXK1/BAP1 est affectée par le métabolisme cellulaire. En résumé, nos études ont révélé l’importance d’OGT dans la régulation de certaines composantes du complexe BAP1, ce qui aidera à la compréhension de l’effet suppresseur de tumeur de BAP1 ainsi que son mécanisme d'action dans différents processus tel que le remodelage de la chromatine.

Caractérisation et surexpression des fimbriae de type chaperon-placier de Salmonella enterica sérovar Typhi

Salmonella enterica sérovar Typhi (S. Typhi) est l’agent responsable de la fièvre typhoïde et cause environ 200 000 morts et 27 millions de cas annuellement. C’est un pathogène entérique dont le réservoir est restreint à l’Homme. Les raisons de cette restriction d’hôte sont méconnues et pourraient dépendre de l’expression de facteurs d’adhésion à des étapes importantes au cours de la pathogenèse. L’annotation bioinformatique du génome de S. Typhi identifie 12 fimbriae de type chaperon-placier (FCP), un curli ainsi qu’un pilus de type IV. L’objectif de ce projet de recherche est d’étudier ces systèmes d’adhésion peu caractérisés. D’abord, le niveau d’expression de ces gènes a été évalué dans différentes conditions de culture in vitro en utilisant une approche de gènes rapporteurs. L’expression des 14 systèmes d’adhésion a été détectée. Nos résultats indiquent qu’une carence en fer favorise l’expression des opérons bcf et csg. Indépendamment du fer, l’expression de bcf, csg, pil, sef, sta, stc, stg et sth est influencée par la richesse nutritive du milieu. L’incubation en milieu LB liquide favorise l’expression de la plupart des systèmes d’adhésion par rapport à un milieu LB liquide sans agitation ou un milieu LB solide. En somme, l’expression des systèmes d’adhésion de S. Typhi a été observée et est influencée par des conditions environnementales. Dans un second volet, nous avons tent de surexprimer les différents systèmes d’adhésion chez une souche d’E. coli ou de S. Typhi afimbriaire. Avec cette approche, nous avons été en mesure de démontrer que l’opéron tcf encode pour un fimbria fonctionnel que l’on a pu observer en microscopie électronique. L’expression de tcf chez une souche afimbriaire d’E. coli et S. Typhi a également diminué leur capacité d’adhésion à des cellules épithéliales intestinales humaines lors d’essais in vitro. Nos observations démontrent que l’expression des systèmes d’adhésion retrouvés chez S. Typhi est influencée par les conditions enviroi9onnementales. Au moins un de ces systèmes est fonctionnel. Ceci suggère une contribution des systèmes d’adhésion retrouvés chez S. Typhi lors de l’interaction de ce pathogène avec l’humain.

Biogenesis of the C. elegans germline syncytium: from nucleation to maturation

La vie commence par la fusion des gamètes pour générer un zygote, dans lequel les constituants à la fois de l'ovocyte et des spermatozoïdes sont partagés au sein d'un syncytium. Le syncytium consiste en des cellules ou tissus dans lesquels des cellules nucléées individuelles distinctes partagent un cytoplasme commun. Alors que l’avantage du syncytium durant la fécondation est tout à fait évident, les syncytia se produisent également dans de nombreux contextes de développement différents dans les plantes, les champignons et dans le règne animal, des insectes aux humains, pour des raisons qui ne sont pas immédiatement évidentes. Par exemple, la lignée germinale de nombreuses espèces de vertébrés et d'invertébrés, des insectes aux humains, présente une structure syncytiale, suggérant que les syncytia constituent des phases conservées de développement de la lignée germinale. Malgré la prévalence commune des syncytia, ces derniers ont cependant confondu les scientifiques depuis des décennies avec des questions telles que la façon dont ils sont formés et maintenus en concurrence avec leurs homologues diploïdes, et quels sont les avantages et les inconvénients qu'ils apportent. Cette thèse va décrire l'utilisation de la lignée germinale syncytiale de C. elegans afin d'approfondir notre compréhension de l'architecture, la fonction et le mode de formation des tissus syncytiaux. Les cellules germinales (CGs) dans la lignée germinale de C. elegans sont interconnectées les unes aux autres par l'intermédiaire de structures appelées des anneaux de CG. En utilisant l'imagerie des cellules vivantes, nous avons d'abord analysé l'architecture syncytiale de la lignée germinale au long du développement et démontré que la maturation de l'anneau de CG se produit progressivement au cours de la croissance des larves et que les anneaux de CG sont composés de myosine II, de l'anilline canonique ANI-1, et de la courte isoforme d’anilline ANI-2, qui n'a pas les domaines de liaison à l’actine et à la myosine, depuis le premier stade larvaire, L1. Parmi les composants de l'anneau de CG, ANI-2 est exprimé au cours du développement et exclusivement enrichi entre les deux CGs primordiales (CGPs) au cours de l'embryogenèse de C. elegans, indiquant qu’ANI-2 est un composant bona fide des anneaux de CG. Nous avons en outre montré que les anneaux de CG sont largement absents dans les animaux mutants pour ani-2, montrant que leur maintien repose sur l'activité d'ANI-2. Contrairement à cela, nous avons trouvé que la déplétion d’ANI-1 a augmenté à la fois le diamètre des anneaux de CG et la largeur du rachis. Fait intéressant, la déplétion d’ANI-1 dans les mutants d’ani-2 a sauvé les défauts d'anneaux de CG des gonades déficientes en ani-2, ce qui suggère que l'architecture syncytiale de la lignée germinale de C. elegans repose sur un équilibre de l'activité de ces deux protéines Anilline. En outre, nous avons montré que lors de leur entrée à l'âge adulte, les mutants ani-2 présentent de sévères défauts de multinucléation des CGs qui découlent de l'effondrement des membranes de séparation des CGs individuelles. Cette multinucléation a coïncidé avec le début de la diffusion cytoplasmique, dont le blocage réduit la multinucléation des gonades mutantes pour ani-2, suggérant que les anneaux de CG résistent au stress mécanique associé au processus de diffusion cytoplasmique. En accord avec cela, nous avons trouvé aussi que la gonade peut soutenir la déformation élastique en réponse au stress mécanique et que cette propriété repose sur la malléabilité des anneaux de CGs. Dans une étude séparée afin de comprendre le mécanisme de formation du syncytium, nous avons suivi la dynamique de division de la cellule précurseur de la lignée germinale, P4 en deux CGP dans l’embryon de C. elegans. Nous avons démontré que les CGPs commencent la cytocinèse de manière similaire aux cellules somatiques, en formant un sillon de clivage, qui migre correctement et transforme ainsi l'anneau contractile en anneau de « midbody ring » (MBR), une structure qui relie de manière transitoire les cellules en division. Malgré cela, les CGPs, contrairement à leurs homologues somatiques, ne parviennent pas à accomplir la dernière étape de la cytocinèse, qui est la libération abscission-dépendante du MBR. Au lieu de cela, le MBR persiste à la frontière entre les CGPs en division et subit une réorganisation et une maturation pour se transformer finalement en structures en forme d'anneau qui relient les cellules en division. Nous montrons en outre que les composants du MB/MBR; UNC-59Septin, CYK-7, ZEN-4Mklp1, RHO-1RhoA sont localisés à des anneaux de CG au long du développement de la lignée germinale du stade L1 à l'âge adulte, ce qui suggère que les anneaux de CG sont dérivés des MBR. Bien qu'il reste encore beaucoup à faire pour comprendre pleinement le mécanisme précis de la formation du syncytium, le maintien, ainsi que la fonction du syncytium, nos résultats appuient un modèle dans lequel la stabilisation du MBR et la cytocinèse incomplète pourraient être une option conservée dans l’évolution pour la formation du syncytium. En outre, notre travail démontre que les régulateurs de la contractilité peuvent jouer un rôle dans la maturation et l’élasticité de l'anneau de CG au cours du développement de la lignée germinale, fournissant un ajout précieux pour une plus ample compréhension de la syncytiogenèse et de sa fonction.

Role of Reactive Gliosis and Neuroinflammation in Experimental Glaucoma

Le glaucome est la principale cause de cécité irréversible dans le monde. Chez les patients atteints de cette pathologie, la perte de la vue résulte de la mort sélective des cellules ganglionnaires (CGR) de la rétine ainsi que de la dégénérescence axonale. La pression intraoculaire élevée est considérée le facteur de risque majeur pour le développement de cette maladie. Les thérapies actuelles emploient des traitements pharmacologiques et/ou chirurgicaux pour diminuer la pression oculaire. Néanmoins, la perte du champ visuel continue à progresser, impliquant des mécanismes indépendants de la pression intraoculaire dans la progression de la maladie. Il a été récemment démontré que des facteurs neuroinflammatoires pourraient être impliqués dans le développement du glaucome. Cette réponse est caractérisée par une régulation positive des cytokines pro-inflammatoires, en particulier du facteur de nécrose tumorale alpha (TNFα). Cependant, le mécanisme par lequel le processus neuroinflammatoire agit sur la mort neuronale reste à clarifier. L’hypothèse principale de ce doctorat propose que les facteurs pro-inflammatoires comme le TNFα et la phosphodiestérase 4 (PDE4) interagissent avec les mécanismes moléculaires de la mort neuronale, favorisant ainsi la survie et la protection des CGRs au cours du glaucome. Dans la première partie de ma thèse, J’ai utilisé un modèle in vivo de glaucome chez des rats Brown Norway pour montrer que l’expression du TNFα est augmentée après l'induction de l'hypertension oculaire. L'hypothèse spécifique de cette étude suggère que les niveaux élevés de TNFα provoquent la mort des CGRs en favorisant l'insertion de récepteurs AMPA perméables au calcium (CP-AMPAR) à la membrane cytoplasmique. Pour tester cette hypothèse, j’ai utilisé un inhibiteur sélectif de la forme soluble du TNFα, le XPro1595. L'administration de cet agent pharmacologique a induit une protection significative des somas et des axones des neurones rétiniens. L'évaluation de la perméabilité au cobalt a montré que le TNFα soluble est impliqué dans l'insertion de CP-AMPAR à la membrane des CGRs lors du glaucome. L’exposition des neurones à une pression oculaire élevée est à l’origine de la hausse de la densité membranaire des CP-AMPARs, grâce à une diminution de l’expression de la sous-unité GluA2. La présence de GluA2 au sein du récepteur ne permet pas l’entrée du calcium à l’intérieur de la cellule. L'administration intraoculaire d’antagonistes spécifiques des CP-AMPARs promeut la protection des somas et des axones des CGRs. Ces résultats montrent que les CP-AMPARs jouent un rôle important dans la pathologie du glaucome. Dans la deuxième partie de ma thèse, j’ai caractérisé l'effet neuroprotecteur d’un inhibiteur de la PDE4, l’ibudilast, dans notre modèle de glaucome. L'hypothèse spécifique s’oriente vers une atténuation de la réponse neuroinflammatoire et de la gliose par l’administration d’ibudilast, favorisant ainsi la protection neuronale. Les résultats montrent que dans les rétines glaucomateuses, l’ibudilast diminue la gliose et l'expression de plusieurs facteurs tels que le TNFα, l'interleukine-1β (IL-1β), l’interleukine-6 (IL-6) et le facteur inhibiteur de la migration des macrophages (MIF). Chez les rats glaucomateux, nous avons observé une expression notable de PDE4A dans les cellules de Müller, qui est en corrélation avec l'accumulation de l’AMP cyclique (AMPc) dans ces cellules après un traitement d’ibudilast. Finalement, nous avons démontré que la protection des CGRs via l’administration d’ibudilast est un mécanisme dépendent de l’AMPc et de la protéine kinase A (PKA). En conclusion, les résultats présentés dans cette thèse identifient deux mécanismes différents impliqués dans la perte des CGRs au cours du glaucome. Ces mécanismes pourraient fournir des perspectives potentielles pour le développement de nouvelles stratégies de traitement du glaucome.

Vers une meilleure compréhension de la pathogenèse de la maladie osseuse reliée à la fibrose kystique

Les patients atteints de la fibrose kystique (FK) ont désormais un âge médian de survie dépassant la cinquantaine. Par contre, avec ce vieillissement surviennent de nouvelles complications dont l'une des plus prévalente est la maladie osseuse associée à la FK. Les souris dont le Cftr est invalidé génétiquement présentent une densité osseuse amoindrie qui découle d’un débalancement du remodelage osseux caractérisé par une diminution de la formation et une augmentation de la résorption osseuse. L'observation que plusieurs modèles murins FK ont un phénotype ostéopénique et ce, même en absence de certains facteurs étiologiques (inflammation chronique, prise de glucocorticoïdes, insuffisance pancréatique etc.) laisse croire que le Cftr, le gène muté dans la FK, joue un rôle non-négligeable dans le métabolisme osseux. Le présent projet étudiera l’impact de l’absence du CFTR, sur les ostéoblastes (Ob) et ostéoclastes (Oc) dans un modèle murin de FK, soit les souris Cftr-/- de souche BALB/c. De plus, les Ob, sont reconnus comme ayant un effet modulateur sur le microenvironnement leucocytaire de la moelle osseuse (MO). Ce projet visera également à investiguer l’impact de l’absence du CFTR sur la niche leucocytaire de la MO. Nos résultats de densitométrie osseuse et de microtomographie à rayons X ont confirmé que les souris Cftr -/- ont une densité osseuse et un contenu minéral osseux abaissé, une diminution du volume osseux trabéculaire, un nombre amoindri de travées osseuses et une plus grande séparation entre les travées comparé aux souris Cftr+/+. Afin de mieux comprendre ce phénotype osseux, nous avons vérifié et confirmé que l’expression génique et protéique du CFTR est présente chez des Ob dérivés de la MO, mais est absent au niveau des Oc dérivés de la MO. Ces observations corroborent nos résultats portant sur la différenciation des cellules osseuses où nous avons démontré que seule la différenciation et fonction ostéoblastique sont affectées par l'absence du CFTR. Ce défaut ostéoblastique semble influencer négativement la leucopoïèse puisque nous observons une quantité moindre de cellules T, de macrophages et de cellules dendritiques chez les souris Cftr -/- vs. Cftr +/+. À la lumière de ces résultats, l'absence du CFTR semble avoir un impact important sur les ostéoblastes et la moelle osseuse.

Caractérisation du rôle transcriptionnel et épigénétique de l’O-GlcNAcylation des histones et du facteur de transcription FOXK1

L’O-GlcNAcylation est une modification post-traductionnelle qui consiste en l’ajout covalent du N-acetylglucosamine au groupement hydroxyle des sérines et thréonines des protéines nucléaires et cytoplasmiques. Ce type de glycosylation atypique est régulé de manière très dynamique par l’action de l’O-GlcNAc transférase (OGT) et de l’O-GlcNAcase (OGA) qui catalysent et hydrolysent cette modification respectivement. Aujourd’hui, OGT émerge comme un régulateur transcriptionnel et senseur critique du métabolisme où les protéines ciblées par l’O-GlcNAcylation couvrent la presque totalité des voies de signalisation cellulaire. Récemment, des études ont aussi proposé qu’OGT soit impliquée dans la régulation épigénétique par l’O-GlcNAcylation des histones. Dans le but de caractériser le rôle fonctionnel d’OGT dans la régulation épigénétique, nous avons revisité le concept d’O-GlcNAcylation des histones et, de manière surprenante, n’avons pu confirmer cette observation. En fait, nos données indiquent que les outils disponibles pour détecter l’O-GlcNAcylation des histones génèrent des artéfacts. De ce fait, nos travaux supportent plutôt un modèle où la régulation épigénétique médiée par OGT se fait par l’O-GlcNAcylation de régulateurs transcriptionnels recrutés à la chromatine. Parmi ceux-ci, OGT s’associe au complexe suppresseur de tumeurs BAP1. En étudiant le rôle d’OGT dans ce complexe, nous avons identifié le facteur de transcription FOXK1 comme un nouveau substrat d’OGT et démontrons qu’il est régulé par O-GlcNAcylation durant la prolifération cellulaire. Enfin, nous démontrons que FOXK1 est aussi requis pour l’adipogenèse. Ensemble, nos travaux suggèrent un rôle important d’OGT dans la régulation du complexe BAP1.