Green tea catechin inhibits fatty acid synthase without stimulating carnitine Palmitoyltransferase-1 or inducing weight loss in experimental animals

Background: The enzyme fatty acid synthase (FASN) is highly expressed in many human carcinomas and its inhibition is cytotoxic to human cancer cells. The use of FASN inhibitors has been limited until now by anorexia and weight loss, which is associated with the stimulation of fatty acid oxidation. Materials and Methods: The in vitro effect of (-)-epigallocatechin-3-gallate (EGCG) on fatty acid metabolism enzymes, on apoptosis and on cell signalling was evaluated. In vivo, the effect of EGCG on animal body weight was addressed. Results: EGCG inhibited FASN activity, induced apoptosis and caused a marked decrease of human epidermal growth factor receptor 2 (HER2), phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K)/AKT and extracellular (signal)-regulated kinase (ERK) 1/2 proteins, in breast cancer cells. EGCG did not induce a stimulatory effect on CPT-1 activity in vitro (84% of control), or on animal body weight in vivo (99% of control). Conclusion: EGCG is a FASN inhibitor with anticancer activity which does not exhibit cross-activation of fatty acid oxidation and does not induce weight loss, suggesting its potential use as an anticancer drug.

Lethal weapons : novel approaches for receptor-targeted cancer cell elimination

The currently used forms of cancer therapy are associated with drug resistance and toxicity to healthy tissues. Thus, more efficient methods are needed for cancer-specific induction of growth arrest and programmed cell death, also known as apoptosis. Therapeutic forms of tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand (TRAIL) are investigated in clinical trials due to the capability of TRAIL to trigger apoptosis specifically in cancer cells by activation of cell surface death receptors. Many tumors, however, have acquired resistance to TRAIL-induced apoptosis and sensitizing drugs for combinatorial treatments are, therefore, in high demand. This study demonstrates that lignans, natural polyphenols enriched in seeds and cereal, have a remarkable sensitizing effect on TRAIL-induced cell death at non-toxic lignan concentrations. In TRAIL-resistant and androgen-dependent prostate cancer cells we observe that lignans repress receptor tyrosine kinase (RTK) activity and downregulate cell survival signaling via the Akt pathway, which leads to increased TRAIL sensitivity. A structure-activity relationship analysis reveals that the γ-butyrolactone ring of the dibenzylbutyrolactone lignans is essential for the rapidly reversible TRAIL-sensitizing activity of these compounds. Furthermore, the lignan nortrachelogenin (NTG) is identified as the most efficient of the 27 tested lignans and norlignans in sensitization of androgen-deprived prostate cancer cells to TRAIL-induced apoptosis. While this combinatorial anticancer approach may leave normal cells unharmed, several efficient cancer drugs are too toxic, insoluble or unstable to be used in systemic therapy. To enable use of such drugs and to protect normal cells from cytotoxic effects, cancer-targeted drug delivery vehicles of nanometer scale have recently been generated. The newly developed nanoparticle system that we tested in vitro for cancer cell targeting combines the efficient drug-loading capacity of mesoporous silica to the versatile particle surface functionalization of hyperbranched poly(ethylene imine), PEI. The mesoporous hybrid silica nanoparticles (MSNs) were functionalized with folic acid to promote targeted internalization by folate receptor overexpressing cancer cells. The presented results demonstrate that the developed carrier system can be employed in vitro for cancer selective delivery of adsorbed or covalently conjugated molecules and furthermore, for selective induction of apoptotic cell death in folate receptor expressing cancer cells. The tested carrier system displays potential for simultaneous delivery of several anticancer agents specifically to cancer cells also in vivo.

Regulation of cell fate by c-FLIP phosphorylation

Programmed cell death is an important physiological cellular process that maintains homeostasis and protects multicellular organisms from diseases. Apoptosis is the principal mode of cell death, which eliminates unwanted cells and an enormous effort has been made to understand the molecular mechanisms of the signaling pathway and its regulatory systems. Irregular apoptosis often has life-threatening consequences to humans, including cancer, autoimmune diseases and degenerative diseases. In cancer for example, cell death is an attractive target to eradicate uncontrollably proliferating cells that have disregard pro-apoptotic signaling. Targeted therapeutic approaches are not as effective as once expected, since now we know that the cell death pathways are not sole entities in cells, but are highly associated with various cellular processes. Proteins that regulate apoptosis can also control non-apoptotic signaling pathways. For example, c-FLIP is a protein that can either inhibit or promote caspase-8 activation, which is required to induce apoptosis. Not only has c-FLIP opposing effects on initiating apoptosis, but it also regulates various pro-survival signaling pathways in the cell. It is well known that protein expression level is a determinant of how c-FLIP can regulate different signaling pathways, but other regulatory mechanisms potentially affecting the role of c-FLIP are less well understood. This work addresses novel insights into the mechanisms of c-FLIP post-translational modifications and their functional consequences. We have identified that phosphorylation is an important inception for subcellular localization of c-FLIP, thereby dictating which apoptotic and non-apoptotic signaling pathways c-FLIP could regulate to promote cell survival. Furthermore, we have constructed mathematical models to unite independent studies to establish more systematic c-FLIP signaling pathways to understand the dynamics of extrinsically-induced apoptosis.

Death switch for gene therapy: application to erythropoietin transgene expression

The effectiveness of the caspase-9-based artificial "death switch" as a safety measure for gene therapy based on the erythropoietin (Epo) hormone was tested in vitro and in vivo using the chemical inducer of dimerization, AP20187. Plasmids encoding the dimeric murine Epo, the tetracycline-controlled transactivator and inducible caspase 9 (ptet-mEpoD, ptet-tTAk and pSH1/Sn-E-Fv’-Fvls-casp9-E, respectively) were used in this study. AP20187 induced apoptosis of iCasp9-modified C2C12 myoblasts. In vivo, two groups of male C57BI/6 mice, 8-12 weeks old, were injected intramuscularly with 5 µg/50 g ptet-mEpoD and 0.5 µg/50 g ptet-tTAk. There were 20 animals in group 1 and 36 animals in group 2. Animals from group 2 were also injected with the 6 µg/50 g iCasp9 plasmid. Seventy percent of the animals showed an increase in hematocrit of more than 65% for more than 15 weeks. AP20187 administration significantly reduced hematocrit and plasma Epo levels in 30% of the animals belonging to group 2. TUNEL-positive cells were detected in the muscle of at least 50% of the animals treated with AP20187. Doxycycline administration was efficient in controlling Epo secretion in both groups. We conclude that inducible caspase 9 did not interfere with gene transfer, gene expression or tetracycline control and may be used as a safety mechanism for gene therapy. However, more studies are necessary to improve the efficacy of this technique, for example, the use of lentivirus vector.

E3 ubiquitin ligase Cbl-b potentiates the apoptotic action of arsenic trioxide by inhibiting the PI3K/Akt pathway

Arsenic trioxide (ATO) is a strong inducer of apoptosis in malignant hematological cells. Inducible phosphatidyl inositol 3 kinase (PI3K)-Akt activation promotes resistance to ATO. In the present study, we evaluated whether E3 ubiquitin ligase Cbl-b, a negative regulator of PI3K activation, is involved in the action of ATO. The effect of ATO on cell viability was measured by the Trypan blue exclusion assay or by the 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) assay. Apoptosis was determined by flow cytometry and protein expression was assayed by Western blotting. ATO decreased the viability of HL60 cells and induced cellular apoptosis, which was accompanied by transient activation of Akt. The PI3K/Akt inhibitor, LY294002, significantly increased ATO-induced apoptosis (P < 0.05). In addition, ATO up-regulated the expression of Cbl-b proteins. Furthermore, ATO inhibited cell viability with an IC50 of 18.54 μM at 24 h in rat basophilic leukemia-2H3 cells. ATO induced cellular apoptosis with transient activation of Akt and Cbl-b was also up-regulated. Rat basophilic leukemia-2H3 cells transfected with a dominant negative (DN) Cbl-b mutation showed overexpression of Cbl-b (DN) and enhanced Akt activation. Compared with cells transfected with vector, ATO-induced apoptosis was decreased and G2/M phase cells were increased at the same concentration (P < 0.05). The PI3K/Akt inhibitor, LY294002, re-sensitized Cbl-b (DN) overexpressing cells to ATO and reversed G2/M arrest (P < 0.05). Taken together, these results suggest that Cbl-b potentiates the apoptotic action of ATO by inhibition of the PI3K/Akt pathway.

Retinal protective effects of topically administered agmatine on ischemic ocular injury caused by transient occlusion of the ophthalmic artery

Agmatine, an endogenous polyamine and putative neuromodulator, is known to have neuroprotective effects on various neurons in the central nervous system. We determined whether or not topically administered agmatine could reduce ischemic retinal injury. Transient ocular ischemia was achieved by intraluminal occlusion of the middle cerebral artery of ddY mice (30-35 g) for 2 h, which is known to also induce occlusion of the ophthalmic artery. In the agmatine group (N = 6), a 1.0 mM agmatine-containing ophthalmic solution was administered four times daily for 2 weeks before occlusion. In the control group (N = 6), a 0.1% hyaluronic acid ophthalmic solution was instilled at the same times. At 22 h after reperfusion, the eyeballs were enucleated and the retinal sections were stained by terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick-end labeling (TUNEL). Transient ocular ischemia induced apoptosis of retinal cells in the entire retinal layer, and topically administered agmatine can significantly reduce this ischemic retinal injury. The proportion of apoptotic cells was definitely decreased (P < 0.001; Kruskal-Wallis test). Overall, we determined that topical agmatine application effectively decreases retinal damage in an in vivo ocular ischemic injury model. This implies that agmatine is a good candidate as a direct neuroprotective agent for eyes with ocular ischemic diseases.

Co-culture of apoptotic breast cancer cells with immature dendritic cells: a novel approach for DC-based vaccination in breast cancer

A dendritic cell (DC)-based vaccine strategy could reduce the risk of recurrence and improve the survival of breast cancer patients. However, while therapy-induced apoptosis of hepatocellular and colorectal carcinoma cells can enhance maturation and antigen presentation of DCs, whether this effect occurs in breast cancer is currently unknown. In the present study, we investigated the effect of doxorubicin (ADM)-induced apoptotic MCF-7 breast cancer cells on the activation of DCs. ADM-induced apoptotic MCF-7 cells could effectively induce immature DC (iDC) maturation. The mean fluorescence intensity (MFI) of DC maturity marker CD83 was 23.3 in the ADM-induced apoptotic MCF-7 cell group compared with 8.5 in the MCF-7 cell group. The MFI of DC co-stimulatory marker CD86 and HLA-DR were also increased after iDCs were treated with ADM-induced apoptotic MCF-7 cells. Furthermore, the proliferating autologous T-lymphocytes increased from 14.2 to 40.3% after incubated with DCs induced by apoptotic MCF-7 cells. The secretion of interferon-γ by these T-lymphocytes was also increased. In addition, cell-cell interaction between apoptotic MCF-7 cells and iDCs, but not soluble factors released by apoptotic MCF-7 cells, was crucial for the maturation of iDCs. These findings constitute a novel in vitro DC-based vaccine strategy for the treatment of breast cancer by ADM-induced apoptotic MCF-7 cells.

Ghrelin attenuates the growth of HO-8910 ovarian cancer cells through the ERK pathway

Ovarian cancer is one of the most common causes of death from gynecologic tumors and is an important public health issue. Ghrelin is a recently discovered bioactive peptide that acts as a natural endogenous ligand of the growth hormone secretagogue receptor (GHSR). Several studies have identified the protective effects of ghrelin on the mammalian reproductive system. However, little research has been done on the effects of ghrelin on ovarian cancer cells, and the underlying mechanisms of these effects. We sought to understand the potential involvement of mitogen-activated protein kinases (MAPKs) in ghrelin-mediated inhibition of growth of the ovarian line HO-8910. We applied different concentrations of ghrelin and an inhibitor of the ghrelin receptor (D-Lys3-GHRP-6) to HO-8910 cells and observed the growth rate of cells and changes in phosphorylation of the MAPKs ERK1/2, JNK and p38. We discovered that ghrelin-induced apoptosis of HO-8910 cells was though phosphorylated ERK1/2, and that this phosphorylation (as well as p90rsk phosphorylation) was mediated by the GHSR. The ERK1/2 pathway is known to play an essential part in the ghrelin-mediated apoptosis of HO-8910 cells. Hence, our study suggests that ghrelin inhibits the growth of HO-8910 cells primarily through the GHSR/ERK pathway.

Analysis of HIV-1 Vpr determinants responsible for cell growth arrest in Saccharomyces cerevisiae

Affiliation: Département de microbiologie et immunologie, Faculté de médecine, Université de Montréal

La calnexine: un élément clé dans l'apoptose chez la levure Schizosaccharomyces pombe.

La mort cellulaire programmée (PCD pour Programmed Cell Death) est un processus essentiel aux cellules. Le PCD a d’abord été caractérisé dans le développement cellulaire et peut être divisé en plusieurs groupes selon les caractéristiques observées. L’apoptose, un sous-groupe du PCD, est caractérisé par plusieurs distinctions morphologiques et signalétiques attribué tout d’abord aux organismes complexes pour son rôle dans le développement et dans le maintien de l’intégrité tissulaire. Depuis la dernière décennie, de nombreuses études font état de l’existence d’un programme apoptotique dans des organismes unicellulaires comme les levures. Ce programme apoptotique a surtout été étudié chez les levures Saccharomyces cerevisiae et Schizosaccharomyces pombe et partage certaines caractéristiques avec l’apoptose des mammifères. Par contre, l’apoptose associé aux levures est distinct à certains égards entre autre par l’absence de certains homologues présents chez les mammifères. L’intérêt au niveau de l’étude du phénomène apoptotique chez les levures est sans cesse grandissant par la facilité avec laquelle les levures peuvent être utilisées comme système modèle. L’apoptose peut être induit dans les cellules de différentes façons en réponse à des stimuli internes ou externes. L’accumulation de protéines mal repliées au niveau du réticulum endoplasmique (RE) causant un stress est un inducteur bien caractérisé de la voie apoptotique. La signalisation de l’apoptose dans un cas de stress au RE fait appel aux transducteurs des signaux de la voie du UPR ( Unfolded Protein Response). Récemment, il a été montré que la calnexine, une chaperone transmembranaire du RE connue et caractérisée surtout pour ses fonctions d’aide au repliement des protéines et au contrôle de qualité, joue un rôle dans la transduction du signal apoptotique en réponse au stress du RE chez mammifères. Le rôle de la calnexine dans ce cas consiste principalement en l’échafaudage pour le clivage par la caspase 8 de la protéine apoptotique Bap31. Nous avons tout d’abord démontré que le stress du RE et que la déficience en inositol, un précurseur essentiel de nombreuses molécules signalétiques, sont deux inducteurs de l’apoptose chez la levure S. pombe. Ces deux voies semblent induire l’apoptose par deux voies distinctes puisque seule la voie de la déficience en inositol induit l’apoptose de façon dépendante à la métacaspase Pca1p. La calnexine, essentielle à la viabilité chez la levure S. pombe, est impliquée dans ces deux phénomènes apoptotiques. L’apoptose induit par le stress du RE nécessite une version de la calnexine ancrée à la membrane du RE pour être optimal. De façon opposée, l’apoptose induit par une déficience en inositol nécessite la présence de la queue cytosolique ancrée à la membrane de la calnexine pour être retardé. Ces deux actions différentes imputables à une même protéine laisse croire à une double fonction pro et anti-apoptotique de celle-ci. Suite à la découverte de l’existence d’un clivage endogène de la calnexine en situation normale de croissance, un modèle a été élaboré expliquant les rôles distincts de la calnexine dans ces deux voies apoptotiques. Ce modèle fait état d’un rôle associé au clivage de la calnexine dans l’apoptose.

Les polymorphismes des gènes encodant les protéines apoptotiques Bim et Bax : leur rôle dans la réponse thérapeutique chez les enfants ayant la leucémie lymphoblastique aiguë

INTRODUCTION Des réponses thérapeutiques variables aux glucocorticoïdes (GCs) sont observées parmi les patients atteints de la leucémie lymphoblastique aiguë (LLA). Les protéines Bax et Bim ont déjà montré un rôle important dans l’apoptose des cellules leucémiques. L’expression de Bax était plus basse chez les patients leucémiques résistants au médicament, de même une sensibilité diminuée aux GCs a été associée avec une expression réduite de Bim. La différence dans l’expression pourrait être due à des polymorphismes présents dans ces gènes et donc être associés avec la résistance aux GCs. MÉTHODE Dix-huit polymorphismes en régions régulatrices, 2 polymorphismes exoniques et 7 polymorphismes en région 3’UTR de ces gènes ont été analysés chez les témoins (n=50) et ont permis de déterminer un nombre minimal de polymorphismes suffisants pour définir les haplotypes (tagSNPs). Ces 8 polymorphismes ont ensuite été génotypés chez 286 enfants atteints de la LLA et ont été testés pour l’issue de la maladie par l’analyse de survie. RÉSULTATS Une survie sans évènement et une survie sans rechute diminuées ont été observées pour l’haplotype 3 (p=0,03 et p=0,02). Une survie globale diminuée a été associée avec l’homozygotie pour l’allèle exonique T298C>T (p=0,03), de même que pour les haplotypes 1 et 4 (p=0,04 et p=0,02) du gène Bim. CONCLUSION Les polymorphismes ont été associés avec une survie diminuée chez des enfants atteints de LLA. Il reste à tester d’autres polymorphismes présents dans ces deux gènes ainsi qu’à définir leurs fonctions afin de comprendre leurs rôles dans la réponse aux GCs.

Mécanismes d'activation de la voie lysosomale durant l'apoptose chimio-induite

L’apoptose est une forme de mort cellulaire essentielle au développement et au maintien de l’homéostase chez les animaux multicellulaires. La machinerie apoptotiq ue requiert la participation des caspases, des protéases conservées dans l’évolution et celle des organelles cytoplasmiques. Les lysosomes subissent des ruptures partielles, labilisation de la membrane lysosomale (LML), qui entraînent l’activation des cathepsines dans le cytoplasme de cellules cancéreuses humaines en apoptose induite par la camptothecin (CPT), incluant les histiocytes humains U-937. Ces modifications lysosomales se manifestent tôt durant l’activation de l’apoptose, concomitamment avec la perméabilisation de la mitochondrie et l’activation des caspases. Une étude protéomique quantitative et comparative a permis d’identifier des changements précoces dans l’expression/localisation de protéines lysosomales de cellules U-937 en apoptose. Lors de deux expériences indépendantes, sur plus de 538 protéines lysosomales identifiées et quantifiées grâce au marquage isobarique iTRAQ et LC-ESIMS/ MS, 18 protéines augmentent et 9 diminuent dans les lysosomes purifiés de cellules en cours d’apoptose comparativement aux cellules contrôles. Les candidats validés par immuno-buvardage et microscopie confocale incluent le stérol-4-alpha-carboxylate 3- déhydrogénase, le prosaposin et la protéine kinase C delta (PKC-d). Des expériences fonctionnelles ont démontrées que la translocation de PKC-d aux lysosomes est requise pour la LML puisque la réduction de son expression par ARN interférents ou l’inhibition de son activité à l’aide du rottlerin empêche la LML lors de l’apoptose induite par la CPT. La translocation de PKC-d aux lysosomes conduit à la phosphorylation et l’activation de la sphingomyelinase acide lysosomale (ASM), et à l’accroissement subséquent du contenu en céramide (CER) à la membrane lysosomale. Cette accumulation de CER endogène aux lysosomes est un évènement critique pour la LML induite par la CPT car l’inhibition de l’activité de PKC-d ou de ASM diminue la formation de CER et la LML.Ces résultats révèlent un nouveau mécanisme par lequel la PKC-d active l’ASM qui conduit à son tour à l’accumulation de CER à la membrane lysosomale et déclenche la LML et l’activation de la voie lysosomale de l’apoptose induite par la CPT. En somme, ce mécanisme confirme l’importance du métabolisme des sphingolipides dans l’activation de la voie lysosomale de l’apoptose.

Étude de la fonction anti-apoptotique de la sous-unité R1 de la ribonucléotide réductase des virus de l’herpès simplex

L’élimination des cellules infectées par apoptose constitue un mécanisme de défense antivirale. Les virus de l’herpès simplex (HSV) de type 1 et 2 encodent des facteurs qui inhibent l’apoptose induite par la réponse antivirale. La sous-unité R1 de la ribonucléotide réductase d’HSV-2 (ICP10) possède une fonction anti-apoptotique qui protège les cellules épithéliales de l’apoptose induite par les récepteurs de mort en agissant en amont ou au niveau de l’activation de la procaspase-8. Puisqu’une infection avec un mutant HSV-1 déficient pour la R1 diminue la résistance des cellules infectées vis à vis du TNFα, il a été suggéré que la R1 d’HSV-1 (ICP6) pourrait posséder une fonction anti-apoptotique. Le but principal de cette thèse est d’étudier le mécanisme et le potentiel de la fonction anti-apoptotique de la R1 d’HSV-1 et de la R1 d'HSV-2. Dans une première étude, nous avons investigué le mécanisme de la fonction anti-apoptotique de la R1 d’HSV en utilisant le TNFα et le FasL, deux inducteurs des récepteurs de mort impliqués dans la réponse immune anti-HSV. Cette étude a permis d’obtenir trois principaux résultats concernant la fonction anti-apoptotique de la R1 d’HSV. Premièrement, la R1 d’HSV-1 inhibe l’apoptose induite par le TNFα et par le FasL aussi efficacement que la R1 d’HSV-2. Deuxièmement, la R1 d’HSV-1 est essentielle à l’inhibition de l’apoptose induite par le FasL. Troisièmement, la R1 d’HSV interagit constitutivement avec la procaspase-8 d’une manière qui inhibe la dimérisation et donc l’activation de la caspase-8. Ces résultats suggèrent qu’en plus d’inhiber l’apoptose induite par les récepteurs de mort la R1 d’HSV peut prévenir l’activation de la caspase-8 induite par d’autres stimuli pro-apoptotiques. Les ARN double-brins (ARNdb) constituant un intermédiaire de la transcription du génome des HSV et activant l’apoptose par une voie dépendante de la caspase-8, nous avons testé dans une seconde étude l’impact de la R1 d’HSV sur l’apoptose induite par l’acide polyriboinosinique : polyribocytidylique (poly(I:C)), un analogue synthétique des ARNdb. Ces travaux ont montré qu’une infection avec les HSV protège les cellules épithéliales de l’apoptose induite par le poly(I:C). La R1 d’HSV-1 joue un rôle majeur dans l’inhibition de l’activation de la caspase-8 induite par le poly(I:C). La R1 d’HSV interagit non seulement avec la procaspase-8 mais aussi avec RIP1 (receptor interacting protein 1). En interagissant avec RIP1, la R1 d’HSV-2 inhibe l’interaction entre RIP1 et TRIF (Toll/interleukine-1 receptor-domain-containing adapter-inducing interferon β), l’adaptateur du Toll-like receptor 3 qui est un détecteur d’ARNdb , laquelle est essentielle pour signaler l’apoptose induite par le poly(I:C) extracellulaire et la surexpression de TRIF. Ces travaux démontrent la capacité de la R1 d’HSV à inhiber l’apoptose induite par divers stimuli et ils ont permis de déterminer le mécanisme de l’activité anti-apoptotique de la R1 d’HSV. Très tôt durant l’infection, cFLIP, un inhibiteur cellulaire de la caspase-8, est dégradé alors que la R1 d’HSV s’accumule de manière concomitante. En interagissant avec la procapsase-8 et RIP1, la R1 d’HSV se comporte comme un inhibiteur viral de l’activation de la procaspase-8 inhibant l’apoptose induite par les récepteurs de mort et les détecteurs aux ARNdb.

Contribution des protéines issues du liquide synovial dans la protection et la survie des PMN humains : chimioprotection : étude comparative des mécanismes d’action impliqués par rapport au GM-CSF

Les polymorphonucléaires neutrophiles (PMNs) représentent une arme primordiale dans la défense contre divers agents pathogènes; notamment les bactéries, les champignons, les cellules tumorales de même que les cellules infectées par des virus. Cependant, certaines pathologies reliées à l’inflammation chronique soulèvent l’implication des neutrophiles notamment dans l’arthrite rhumatoïde. La réponse inflammatoire persistante générée par l’activation et la survie des neutrophiles engendre une destruction des tissus environnants suite à la sécrétion non contrôlée de leurs produits cytotoxiques. Même si l’activation chronique des neutrophiles est néfaste dans plusieurs pathologies, elle pourrait s’avérer un bon outil en cas de neutropénie, comme c’est souvent le cas les patients ayant reçu des traitements de chimiothérapie. Ce projet fait suite aux travaux doctoraux de Lagraoui (1999). Il vise à identifier le(s) facteur(s) du liquide synovial qui augmente la survie des neutrophiles ainsi que le mécanisme d’action impliqué dans ce processus. Similairement au facteur semi-pur isolés par Lagraoui (1999), le milieu conditionné concentré (MCC) augmente la survie des PMNs de 75% (39% ± 9.5 vs 68% ± 2.5, p<0.01). Suivant le séquençage du MCC parallèlement au facteur semi-pur actif, deux protéines ont été identifiées à la fois dans le MCC et dans le facteur semi-pur soient : l’albumine et la fétuine. Notre projet vise donc à comparer les effets de l’albumine et de la fétuine à ceux du GM-CSF dans l’optique d’une thérapie alternative au GM-CSF en tant qu’adjuvant de chimiothérapie. La présence d’albumine, de fétuine ou de GM-CSF chez les PMNs incubés 24 heures avec la Mutamycin® induit une diminution du nombre de cellules en apoptose par rapport à la Mutamycin® (Ctrl : 43% ± 10; A : 74% ± 3; F : (82% ± 6 et GM : 74% ± 7; p<0.01). L’effet de l’albumine dépend de la voie de la kinase PI3 mais également celle la kinase ERK, alors que celle de la fétuine dépend de la kinase PI3. Similairement l’EPO, l’albumine et la fétuine supporte la différentiation des HSCs en précurseurs érythrocytaires de type BFU-E. Dans un modèle murin de chiomioprotection, l’albumine augmente la concentration cellulaire rapport au groupe contrôle des leukocytes de la rate (66 ±8 x106c/ml vs 81 ±16 x106c/ml) et du sang (3.6 ±0.4 x106c/ml vs 5.7 ±2.3 x106c/ml). Donc, in vitro, l’albumine et la fétuine sont comparables au GM-CSF au niveau fonctionalité et mécansimes d’action. Cependant, vu leur manque de spécificité, l’application thérapeutique en tant qu’adjuvant de chiomiothérapie de l’albumine et la fétuine est peu prometteuse. Par contre, les maladies dégénératives et les évènements ischémiques pourraient s’avérer de bonnes cibles thérapeutiques, principalement pour l’albumine.

La Rapamycine inhibe l’expression de l’ARNm de l’ADAMTS-4 induit par les cytokines dans les chondrocytes articulaires

Introduction: Durant la pathogenèse d’ostéoarthrose (OA), les cytokines pro-inflammatoires IL-1β (Interleukin-1 beta) et TNF-α (Tumor necrosis factor alpha) stimulent la dégradation des agrécanes par l’aggrécanase-1 ou ADAMTS-4 (a disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin motif). Ces cytokines peuvent stimuler plusieurs voies de signalisation conduisant ainsi à l’augmentation de l’expression des ADAMTS dans les chondrocytes humains. Les TIMPs (tissue inhibitor of metalloproteinases) présentent des inhibiteurs endogènes de l’ADAMTS. Nous avons démontré que la Rapamycine (un immunosuppresseur et un inhibiteur du mamalian target of Rapamycin (mTOR)) peut avoir des effets bénéfiques dans cette pathologie. Notre étude examine l’effet de la Rapamycine sur l’expression de l’ADAMTS-4 induit par les cytokines, son implication dans certaines voies de signalisation, et son effet sur l’expression du TIMP-3. Méthodes: Des chondrocytes normaux sont traités avec la Rapamycine seule ou stimulés aussi avec l’IL-1β et le TNF-α. Les effets de la Rapamycine sur l’expression de l’ADAMTS-4 et du TIMP-3 ont été étudiés par l’analyse RT-PCR et l’activité enzymatique a été étudiée par la technique d’ELISA. Les effets de la Rapamycine sur certaines voies de signalisation ont été étudiés par le Western blot. Résultats: Nous avons trouvé que la Rapamycine inhibe l’expression de l’ARNm de l’ADAMTS-4 induit par les cytokines pro-inflammatoires dans les chondrocytes humains. L’activité enzymatique de l’ADAMTS-4 induit par l’IL-1β a été légèrement diminuée par la Rapamycine. En plus, cette dernière a montré de différents effets sur plusieurs voies de signalisation stimulées par l’IL-1β et le TNF-α telles que les voies des MAPKs (Mitogen activated protein kinase), de l’AKT, et de la p70 S6 kinase. La Rapamycine a inhibé partiellement l’activation de la phosphorylation de l’ERK1/2 MAPK (extracellular signal-regulated protein kinase MAPK) en présence du TNF-α seulement. En outre, la Rapamycine a inhibé la phosphorylation des protéines p38 MAPK, JNK (c-Jun N-terminal kinase), et AKT activée par l’IL-1β seulement. En plus, la phosphorylation de la protéine p70 S6K stimulée par l’IL-1β et le TNF-α a été inhibée par la Rapamycine. D’autre part, nous avons démontré que le niveau du TIMP-3 a été augmenté en présence de la Rapamycine. Conclusion: Ces résultats suggèrent que la Rapamycine peut bloquer l’action de l’ADAMTS-4 via l’inhibition de l’activation des MAPKs, de l’AKT, et de la p70 S6K. La Rapamycine pourrait ainsi être considérée pour la prévention de la perte du cartilage chez les patients ostéoarthritiques.