Dynamic and Regulated Association of Caveolin with Lipid Bodies: Modulation of Lipid Body Motility and Function by a Dominant Negative Mutant

Caveolins are a crucial component of caveolae but have also been localized to the Golgi complex, and, under some experimental conditions, to lipid bodies (LBs). The physiological relevance and dynamics of LB association remain unclear. We now show that endogenous caveolin-1 and caveolin-2 redistribute to LBs in lipid loaded A431 and FRT cells. Association with LBs is regulated and reversible; removal of fatty acids causes caveolin to rapidly leave the lipid body. We also show by subcellular fractionation, light and electron microscopy that during the first hours of liver regeneration, caveolins show a dramatic redistribution from the cell surface to the newly formed LBs. At later stages of the regeneration process (when LBs are still abundant), the levels of caveolins in LBs decrease dramatically. As a model system to study association of caveolins with LBs we have used brefeldin A (BFA). BFA causes rapid redistribution of endogenous caveolins to LBs and this association was reversed upon BFA washout. Finally, we have used a dominant negative LB-associated caveolin mutant (cavDGV) to study LB formation and to examine its effect on LB function. We now show that the cavDGV mutant inhibits microtubule-dependent LB motility and blocks the reversal of lipid accumulation in LBs.

Cholesterol and Fatty Acids Regulate Dynamic Caveolin Trafficking through the Golgi Complex and between the Cell Surface and Lipid Bodies

Caveolins are a crucial component of plasma membrane (PM) caveolae but have also been localized to intracellular compartments, including the Golgi complex and lipid bodies. Mutant caveolins associated with human disease show aberrant trafficking to the PM and Golgi accumulation. We now show that the Golgi pool of mainly newly synthesized protein is detergent-soluble and predominantly in a monomeric state, in contrast to the surface pool. Caveolin at the PM is not recognized by specific caveolin antibodies unless PM cholesterol is depleted. Exit from the Golgi complex of wild-type caveolin-1 or -3, but not vesicular stomatitis virus-G protein, is modulated by changing cellular cholesterol levels. In contrast, a muscular dystrophy-associated mutant of caveolin-3, Cav3P104L, showed increased accumulation in the Golgi complex upon cholesterol treatment. In addition, we demonstrate that in response to fatty acid treatment caveolin can follow a previously undescribed pathway from the PM to lipid bodies and can move from lipid bodies to the PM in response to removal of fatty acids. The results suggest that cholesterol is a rate-limiting component for caveolin trafficking. Changes in caveolin flux through the exocytic pathway can therefore be an indicator of cellular cholesterol and fatty acid levels.

Porosidade e retenção de água em um argissolo sob manejos convencional e direto submetido a compressões unidimensionais

A dinâmica da ocupação do espaço poroso pela água e ar em solos sujeitos ao estresse mecânico ainda é pouco conhecida, principalmente quando as pressões situam-se sobre a reta de pré-consolidação. Assim, este trabalho foi realizado com o intuito de quantificar as mudanças no espaço poroso de um Argissolo sob dois sistemas de preparo, submetido a compressões unidimensionais, dando-se ênfase à densidade do solo e ao conteúdo de água retida em dois potenciais. Foram coletadas amostras sob os sistemas plantio convencional (SPC) e plantio direto (SPD), em triplicata e com estrutura preservada, do horizonte superficial Ap (0-0,075 m) de um Argissolo Vermelho-Amarelo distrófico abrúptico, do campus da Universidade Federal de Santa Maria, Rio Grande do Sul. Uniformizou-se o conteúdo de água das amostras a -32 kPa sobre placa porosa em membrana de Richards (panela de pressão), sendo submetidas, em célula odométrica com dreno aberto, às pressões uniaxiais finais de zero, 50, 100 e 200 kPa. Após o ensaio, torrões foram separados com as mãos por tração e submetidos, em quadruplicata, a dois potenciais de água (-1.600 e -100 kPa), utilizando-se membrana de Richards (célula). O volume das amostras e o teor de água gravimétrica foram determinados por pesagens sob empuxo e após secagem em estufa a 105 °C. Aplicou-se a análise de variância nos resultados, e uma análise de regressão foi aplicada quando necessária. A densidade do solo respondeu linearmente para o SPD e de forma quadrática para o SPD com o aumento das pressões. O conteúdo de água variou de forma quadrática com o aumento das pressões aplicadas em ambos os sistemas de preparo do solo. Explica-se 85 % da retenção de água do solo pela variação da pressão unidimensional aplicada, sendo a resposta positiva para o SPC e negativa para o SPD. As mudanças na densidade do solo e no conteúdo de água gravimétrica foram importantes em ambos os sistemas de preparo no potencial de água de -100 kPa. Pode-se inferir que o solo sob sistema de preparo convencional foi mais sensível ao estresse mecânico que aquele sob plantio direto, evidenciando a diminuição da porosidade e consequentemente da proporção de ar.

Determinação de fósforo microbiano: comparação entre métodos e coberturas florestais

Muitos trabalhos mostram a importância da biomassa microbiana do solo (BMS), principalmente como fonte/dreno de C e de N em plantações florestais; contudo, são escassos os trabalhos relacionados ao fósforo microbiano (PBM), sobretudo aqueles relativos aos métodos de determinação do PBM nesses ecossistemas. O presente trabalho foi realizado com o objetivo de avaliar métodos de determinação do PBM em solo com diferentes coberturas vegetais. O trabalho consistiu da análise de amostras de Latossolo Vermelho-Amarelo distrófico muito argiloso (LVAd) localizado no município de Viçosa (MG), coletadas nas profundidades de 0 a 5 e 5 a 10 cm, em áreas com as seguintes coberturas vegetais: pínus (Pinus taeda), eucalipto (Eucalyptus grandis) e floresta nativa. Para determinação do P microbiano, foram empregados os métodos fumigação-extração (FE), irradiação com micro-ondas-extração (IE) e irradiação com micro-ondas-extração com membrana de troca aniônica (EMTA). Em termos gerais, menores teores de PBM foram obtidos com o método irradiação-extração. Considerando a cobertura vegetal, foi detectada diferença significativa entre os três métodos sob floresta de eucalipto e floresta nativa, principalmente na camada superficial. Sob pínus, apenas o método IE diferiu dos demais, na camada subsuperficial. Menores coeficientes de variação (CV) foram obtidos com o FE, retratando maior precisão do método. Entretanto, o método IE mostrou-se, em termos operacionais, o mais adequado à determinação do PBM quando se tem maior número de amostras. Com relação às coberturas vegetais, a grande variabilidade observada nos CVs obtidos para cada cobertura, nos três métodos testados, inviabiliza a escolha de um único método que apresente maior precisão na avaliação do PBM.

Distribuição de massa molecular de ácidos húmicos e promoção do crescimento radicular

Os ácidos húmicos (AH) estimulam diretamente vários processos fisiológicos que promovem o crescimento vegetal, especialmente do sistema radicular. O conhecimento da natureza química e do papel de AH na expressão de efeitos biofertilizantes e bioestimulantes é fundamental para o desenvolvimento de insumos biológicos à base de ácidos húmicos. O objetivo deste trabalho foi avaliar uma possível relação entre a distribuição de massa molecular aparente de AH isolados de vermicomposto e a magnitude de resposta na promoção do crescimento radicular. Para isso, foram obtidas subfrações (SF) dos AH por meio de cromatografia preparativa por exclusão de tamanho em gel de Sephadex G-50 (CGE). O processo preparativo foi validado pelo uso da cromatografia líquida de alta performance por exclusão de tamanho (HPSEC). As cinco frações obtidas foram testadas em diferentes concentrações (0; 0,0001; 0,001; 0,003; 0,005; e 0,01 mol L-1 de C) quanto à sua capacidade de estimular o crescimento radicular de plantas de Arabidopsis thaliana (ecótipo col. 4). Para plantas de milho (Zea mays hyb. UENF 506-6) foi utilizada a dose de 0,002 mol L-1 de C. O modelo quadrático descreveu a indução do crescimento radicular de Arabidopsis e a dose de AH, sendo 0,00511 mol L-1 de C o ponto de inflexão médio. Na concentração ótima, foi observada correlação inversa e significativa entre distribuição de massa molecular e indução do número de raízes laterais em Arabidopsis. No entanto, outros atributos, como área e comprimento radicular, não sofreram influência da massa molecular aparente. Em plântulas de milho, foi observado aumento no número de sítios de mitose e raízes laterais tanto no tratamento com AH como com suas subfrações. A atividade da H+-ATPase de membrana plasmática foi significativamente alterada pelo AH, porém não ocorreu o mesmo com todas as subfrações. A atividade de estimulação do crescimento radicular parece estar mais relacionada com a estrutura química das substâncias húmicas do que com a distribuição de massa molecular dos agregados húmicos.

Dejeto líquido bovino em plantio direto: perda de carbono e nitrogênio por escoamento superficial

A utilização de dejetos de animais na produção agrícola é uma alternativa de disposição do resíduo gerado na atividade pecuária, porém se aplicado inadequadamente pode causar problemas ambientais. Nesse sentido, o objetivo geral deste trabalho foi avaliar as concentrações e perdas de C e N por escoamento superficial em quatro doses de dejeto líquido bovino (0, 60, 120, 180 m³ ha-1 ano-1) aplicado em Latossolo franco-argiloarenoso com 13 % de declividade, manejado em plantio direto com soja, aveia-preta, milho e trigo, em sistema de rotação. O escoamento superficial foi coletado durante dois anos e sete meses em galões de 60 L após cada chuva, com geração de escoamento em pelo menos uma parcela. Os nutrientes solúveis foram determinados em amostra filtrada por uma membrana de éster de 0,45 µm e os nutrientes totais, em amostras não filtradas. A aplicação de dejeto líquido bovino reduziu as perdas de C orgânico e N por escoamento superficial, com consequências positivas para a qualidade da água em corpos hídricos a jusante. Porém, doses crescentes de dejeto tendem a aumentar a concentração dos referidos elementos e, por conseguinte, diminuir a qualidade da água. As concentrações médias ponderadas de nitrato estiveram abaixo do limite permitido pela legislação brasileira, porém as de amônio ficaram acima do máximo permitido, indicando a necessidade de práticas de controle e retenção do escoamento superficial, a fim de evitar a entrada do nitrato nos corpos d'água, mesmo em áreas sob plantio direto. Cabe ressaltar que esses dados foram obtidos em condição de baixo potencial poluidor, ou seja, relevo com 13 % de declividade, baixa precipitação e intervalo mínimo de dez dias entre a aplicação do dejeto e a ocorrência de chuva, com formação de escoamento superficial. Além disso, há a necessidade de estudos futuros para avaliar a lixiviação de nitrato.

Doses de enxofre e tempo de incubação na dinâmica de formas de enxofre no solo

A disponibilidade de enxofre (S) depende da dinâmica de suas formas no solo. Visando estudar o equilíbrio entre as reservas de S lábil e S não lábil, amostras de 10 solos foram incubadas com cinco doses de sulfato de cálcio (0, 20, 50, 80 e 120 mg dm-3 de S), durante 1, 8, 15, 30, 60 e 90 d. Para a determinação do S lábil, utilizou-se membrana de resina de troca aniônica em forma de lâmina. O S extraído com 48 h de agitação foi denominado de enxofre rapidamente lábil (SRL). O teor obtido com tempo de agitação superior a 48 h foi denominado de enxofre lentamente lábil e o não lábil (SLL+SNL), pela diferença entre o S do solo (extraído após calcinação) e SRL. A resistência que o solo oferece à passagem do S da reserva do SRL para a do SLL+SNL foi denominada de capacidade-tampão do S lábil (CTSL), sendo obtida pelo inverso do coeficiente angular das equações lineares do teor de SRL em função do teor de SLL+SNL. Constatou-se que tempo de incubação (reatividade) e as doses de S, na forma de sulfato de cálcio, influenciam a dinâmica do S entre as reservas de SRL e SLL+SNL. A CTSL é sensível às mudanças no equilíbrio entre as reservas de S no solo. O aumento da CTSL dos solos relacionou-se, principalmente, com a capacidade máxima de adsorção de sulfato, teor de carbono orgânico, goethita e gibbsita da fração argila dos solos estudados.

Expression cloning of a rat hepatic reduced glutathione transporter with canalicular characteristics

Using the Xenopus oocyte expression system, we have previously identified an approximately 4-kb fraction of mRNA from rat liver that expresses sulfobromophthalein-glutathione (BSP-GSH)-insensitive reduced glutathione (GSH) transport (Fernandez-Checa, J., J. R. Yi, C. Garcia-Ruiz, Z. Knezic, S. Tahara, and N. Kaplowitz. 1993. J. Biol. Chem. 268:2324-2328). Starting with a cDNA library constructed from this fraction, we have now isolated a single clone that expresses GSH transporter activity. The cDNA for the rat canalicular GSH transporter (RcGshT) is 4.05 kb with an open reading frame of 2,505 nucleotides encoding for a polypeptide of 835 amino acids (95,785 daltons). No identifiable homologies were found in searching various databases. An approximately 96-kD protein is generated in in vitro translation of cRNA for RcGshT. Northern blot analysis reveals a single 4-kb transcript in liver, kidney, intestine, lung, and brain. The abundance of mRNA for RcGshT in rat liver increased 3, 6, and 12 h after a single dose of phenobarbital. Insensitivity to BSP-GSH and induction by phenobarbital, unique characteristics of canalicular GSH secretion, suggest that RcGshT encodes for the canalicular GSH transporter.

Avaliação da disponibilidade de fósforo no solo para a cultura do milho

Conduziu-se um experimento, em 1994, em casa de vegetação com seis solos do Estado do Rio Grande do Sul, com o objetivo de avaliar a disponibilidade de fósforo no solo extraído pelos métodos duplo ácido (Mehlich-1), resinas em esferas (RE), em cápsulas (RC) e em membrana (RM) e papéis de filtro impregnados com óxido de ferro em solo umedecido a 75% da capacidade de campo (D1) e solo saturado (D2). Os solos foram previamente incubados com quatro doses de fósforo, e cultivados com milho durante 28 dias. Os coeficientes de determinação obtidos entre o fósforo absorvido pelas plantas de milho e o fósforo extraído foram: 0,85 para o Mehlich-1; 0,82 para o RE; 0,84 para o RC; 0,89 para o RM; 0,75 para o D1 e 0,70 para o D2. As quantidades de fósforo extraídas pelos métodos das resinas foram altamente correlacionadas entre si (r=0,98) e com as extraídas pelo método D1 (r=0,89). Os resultados permitiram concluir que os métodos testados foram igualmente eficientes na extração do fósforo do solo e para avaliar a disponibilidade deste elemento para a cultura do milho.

Emerging functions of myelin associated proteins during development neuronal plasticity and and neurpdegeneration.

Adult mammalian central nervous system (CNS) axons have a limited regrowth capacity following injury. Myelin-associated inhibitors (MAIs) limit axonal outgrowth and their blockage improves the regeneration of damaged fiber tracts. Three of these proteins, Nogo-A, MAG and OMgp, share two common neuronal receptors: NgR1, together with its co-receptors (p75(NTR), TROY and Lingo-1), and the recently described paired immunoglobulin-like receptor B (PirB). These proteins impair neuronal regeneration by limiting axonal sprouting. Some of the elements involved in the myelin inhibitory pathways may still be unknown, but the discovery that blocking both PirB and NgR1 activities leads to near-complete release from myelin inhibition, sheds light on one of the most competitive and intense fields of neuroregeneration study during in recent decades. In parallel with the identification and characterization of the roles and functions of these inhibitory molecules in axonal regeneration, data gathered in the field strongly suggest that most of these proteins have roles other than axonal growth inhibition. The discovery of a new group of interacting partners for myelin-associated receptors and ligands, as well as functional studies within or outside the CNS environment, highlights the potential new physiological roles for these proteins in processes such as development, neuronal homeostasis, plasticity and neurodegeneration.

Mapping of the binding domains of the axon guidance receptor Unc5B to Netrin-1 and FLRT3

Anàlisi de les interaccions, a nivell neuronal, que tenen lloc durant el desenvolupament embrionari entre el receptor Unc5B (receptor present a la membrana) i les proteïnes Netrin-1 i FLRT3 (fibronectin and leucine-rich transmembrane proteins). La interacció entre aquest receptor i Netrin-1 ha estat profundament estudiada fins al moment, de manera que es coneix que aquesta promou una repulsió en la guia d’axons durant el desenvolupament embrionari. A més, la interacció està implicada en la senyalització per a diferents processos com l’angiogènesi i la supervivència cel·lular. Per altra banda, la interacció entre neurones Unc5B positives i FLRT3, promou un retard en la migració de les neurones. Diversos estudis demostren que aquest retard en la migració està relacionat amb certes patologies mentals.

Relação entre toxicidade de proteínas Vip3Aa e sua capacidade de ligação a receptores intestinais de lepidópteros-praga

Resumo:O objetivo deste trabalho foi avaliar a toxicidade de novas proteínas Vip3Aa e sua capacidade de ligação a vesículas de membrana da microvilosidade apical (VMMA) do intestino de lagartas neonatas de Spodoptera frugiperda, Anticarsia gemmatalise Heliothis virescens. Proteínas expressas pelos genes vip3Aa42 e vip3Aa43 mostraram-se tóxicas a S. frugiperda (CL50 de 78,2 e 113 ng cm-2, respectivamente) e A. gemmatalis(CL50 de 239,2 e 57,5 ng cm-2, respectivamente), e pouco tóxicas a H. virescens (CL50>5.000 ng cm-2). Os ensaios de ligação às VMMA mostraram que as proteínas unem-se de forma efetiva aos receptores nas vesículas das espécies avaliadas, mas essa capacidade de ligação somente é efetiva na ativação da toxicidade para as populações avaliadas de S. frugiperdae A. gemmatalis.

Toxicidade e capacidade de ligação de proteínas Cry1 a receptores intestinais de Helicoverpa armigera (Lepidoptera: Noctuidae)

Resumo: O objetivo deste trabalho foi avaliar a toxicidade e a capacidade de ligação das proteínas Cry1Aa, Cry1Ab, Cry1Ac e Cry1Ca, de Bacillus thuringiensis, a receptores intestinais de Helicoverpa armigera. Realizou-se análise de ligação das proteínas ativadas às vesículas de membrana da microvilosidade apical (VMMA) do intestino médio deH. armigera, além de ensaios de competição heteróloga para avaliar sua capacidade de ligação. Cry1Ac destacou-se como a proteína mais tóxica, seguida por Cry1Ab e Cry1Aa. A proteína Cry1Ca não foi tóxica às lagartas e, portanto, não foi possível determinar os seus parâmetros de toxicidade CL50 e CL90. As proteínas Cry1Aa, Cry1Ab e Cry1Ac são capazes de se ligar a um mesmo receptor nas membranas intestinais, o que aumenta o risco do desenvolvimento de resistência cruzada. Portanto, a utilização conjunta dessas proteínas deve ser evitada.