Étude de dispositifs électroniques moléculaires à l'aide de modèles simples

Cette thèse en électronique moléculaire porte essentiellement sur le développement d’une méthode pour le calcul de la transmission de dispositifs électroniques moléculaires (DEMs), c’est-à-dire des molécules branchées à des contacts qui forment un dispositif électronique de taille moléculaire. D’une part, la méthode développée vise à apporter un point de vue différent de celui provenant des méthodes déjà existantes pour ce type de calculs. D’autre part, elle permet d’intégrer de manière rigoureuse des outils théoriques déjà développés dans le but d’augmenter la qualité des calculs. Les exemples simples présentés dans ce travail permettent de mettre en lumière certains phénomènes, tel que l’interférence destructive dans les dispositifs électroniques moléculaires. Les chapitres proviennent d’articles publiés dans la littérature. Au chapitre 2, nous étudions à l’aide d’un modèle fini avec la méthode de la théorie de la fonctionnelle de la densité de Kohn-Sham un point quantique moléculaire. De plus, nous calculons la conductance du point quantique moléculaire avec une implémentation de la formule de Landauer. Nous trouvons que la structure électronique et la conductance moléculaire dépendent fortement de la fonctionnelle d’échange et de corrélation employée. Au chapitre 3, nous discutons de l’effet de l’ajout d’une chaîne ramifiée à des molécules conductrices sur la probabilité de transmission de dispositifs électroniques moléculaires. Nous trouvons que des interférences destructives apparaissent aux valeurs propres de l’énergie des chaînes ramifiées isolées, si ces valeurs ne correspondent pas à des états localisés éloignés du conducteur moléculaire. Au chapitre 4, nous montrons que les dispositifs électroniques moléculaires contenant une molécule aromatique présentent généralement des courants circulaires qui sont associés aux phénomènes d’interférence destructive dans ces systèmes. Au chapitre 5, nous employons l’approche « source-sink potential » (SSP) pour étudier la transmission de dispositifs électroniques moléculaires. Au lieu de considérer les potentiels de sources et de drains exactement, nous utilisons la théorie des perturbations pour trouver une expression de la probabilité de transmission, T(E) = 1 − |r(E)|2, où r(E) est le coefficient de réflexion qui dépend de l’énergie. Cette expression dépend des propriétés de la molécule isolée, en effet nous montrons que c’est la densité orbitalaire sur les atomes de la molécule qui sont connectés aux contacts qui détermine principalement la transmission du dispositif à une énergie de l’électron incident donnée. Au chapitre 6, nous présentons une extension de l’approche SSP à un canal pour des dispositifs électroniques moléculaires à plusieurs canaux. La méthode à multiples canaux proposée repose sur une description des canaux propres des états conducteurs du dispositif électronique moléculaire (DEM) qui sont obtenus par un algorithme auto-cohérent. Finalement, nous utilisons le modèle développé afin d’étudier la transmission du 1-phényl-1,3-butadiène branché à deux rangées d’atomes couplées agissant comme contacts à gauche et à la droite.

Molecular characterization of the contribution of autophagy to antigen presentation using quantitative proteomics

L’autophagie est une voie hautement conservée de dégradation lysosomale des constituants cellulaires qui est essentiel à l’homéostasie cellulaire et contribue à l’apprêtement et à la présentation des antigènes. Les rôles relativement récents de l'autophagie dans l'immunité innée et acquise sous-tendent de nouveaux paradigmes immunologiques pouvant faciliter le développement de nouvelles thérapies où la dérégulation de l’autophagie est associée à des maladies auto-immunes. Cependant, l'étude in vivo de la réponse autophagique est difficile en raison du nombre limité de méthodes d'analyse pouvant fournir une définition dynamique des protéines clés impliquées dans cette voie. En conséquence, nous avons développé un programme de recherche en protéomique intégrée afin d’identifier et de quantifier les proteines associées à l'autophagie et de déterminer les mécanismes moléculaires régissant les fonctions de l’autophagosome dans la présentation antigénique en utilisant une approche de biologie des systèmes. Pour étudier comment l'autophagie et la présentation antigénique sont activement régulés dans les macrophages, nous avons d'abord procédé à une étude protéomique à grande échelle sous différentes conditions connues pour stimuler l'autophagie, tels l’activation par les cytokines et l’infection virale. La cytokine tumor necrosis factor-alpha (TNF-alpha) est l'une des principales cytokines pro-inflammatoires qui intervient dans les réactions locales et systémiques afin de développer une réponse immune adaptative. La protéomique quantitative d'extraits membranaires de macrophages contrôles et stimulés avec le TNF-alpha a révélé que l'activation des macrophages a entrainé la dégradation de protéines mitochondriales et des changements d’abondance de plusieurs protéines impliquées dans le trafic vésiculaire et la réponse immunitaire. Nous avons constaté que la dégradation des protéines mitochondriales était sous le contrôle de la voie ATG5, et était spécifique au TNF-alpha. En outre, l’utilisation d’un nouveau système de présentation antigènique, nous a permi de constater que l'induction de la mitophagie par le TNF-alpha a entrainée l’apprêtement et la présentation d’antigènes mitochondriaux par des molécules du CMH de classe I, contribuant ainsi la variation du répertoire immunopeptidomique à la surface cellulaire. Ces résultats mettent en évidence un rôle insoupçonné du TNF-alpha dans la mitophagie et permet une meilleure compréhension des mécanismes responsables de la présentation d’auto-antigènes par les molécules du CMH de classe I. Une interaction complexe existe également entre infection virale et l'autophagie. Récemment, notre laboratoire a fourni une première preuve suggérant que la macroautophagie peut contribuer à la présentation de protéines virales par les molécules du CMH de classe I lors de l’infection virale par l'herpès simplex virus de type 1 (HSV-1). Le virus HSV1 fait parti des virus humains les plus complexes et les plus répandues. Bien que la composition des particules virales a été étudiée précédemment, on connaît moins bien l'expression de l'ensemble du protéome viral lors de l’infection des cellules hôtes. Afin de caractériser les changements dynamiques de l’expression des protéines virales lors de l’infection, nous avons analysé par LC-MS/MS le protéome du HSV1 dans les macrophages infectés. Ces analyses nous ont permis d’identifier un total de 67 protéines virales structurales et non structurales (82% du protéome HSV1) en utilisant le spectromètre de masse LTQ-Orbitrap. Nous avons également identifié 90 nouveaux sites de phosphorylation et de dix nouveaux sites d’ubiquitylation sur différentes protéines virales. Suite à l’ubiquitylation, les protéines virales peuvent se localiser au noyau ou participer à des événements de fusion avec la membrane nucléaire, suggérant ainsi que cette modification pourrait influer le trafic vésiculaire des protéines virales. Le traitement avec des inhibiteurs de la réplication de l'ADN induit des changements sur l'abondance et la modification des protéines virales, mettant en évidence l'interdépendance des protéines virales au cours du cycle de vie du virus. Compte tenu de l'importance de la dynamique d'expression, de l’ubiquitylation et la phosphorylation sur la fonction des proteines virales, ces résultats ouvriront la voie vers de nouvelles études sur la biologie des virus de l'herpès. Fait intéressant, l'infection HSV1 dans les macrophages déclenche une nouvelle forme d'autophagie qui diffère remarquablement de la macroautophagie. Ce processus, appelé autophagie associée à l’enveloppe nucléaire (nuclear envelope derived autophagy, NEDA), conduit à la formation de vésicules membranaires contenant 4 couches lipidiques provenant de l'enveloppe nucléaire où on retrouve une grande proportion de certaines protéines virales, telle la glycoprotéine B. Les mécanismes régissant NEDA et leur importance lors de l’infection virale sont encore méconnus. En utilisant un essai de présentation antigénique, nous avons pu montrer que la voie NEDA est indépendante d’ATG5 et participe à l’apprêtement et la présentation d’antigènes viraux par le CMH de classe I. Pour comprendre l'implication de NEDA dans la présentation des antigènes, il est essentiel de caractériser le protéome des autophagosomes isolés à partir de macrophages infectés par HSV1. Aussi, nous avons développé une nouvelle approche de fractionnement basé sur l’isolation de lysosomes chargés de billes de latex, nous permettant ainsi d’obtenir des extraits cellulaires enrichis en autophagosomes. Le transfert des antigènes HSV1 dans les autophagosomes a été determine par protéomique quantitative. Les protéines provenant de l’enveloppe nucléaire ont été préférentiellement transférées dans les autophagosome lors de l'infection des macrophages par le HSV1. Les analyses protéomiques d’autophagosomes impliquant NEDA ou la macroautophagie ont permis de decouvrir des mécanismes jouant un rôle clé dans l’immunodominance de la glycoprotéine B lors de l'infection HSV1. Ces analyses ont également révélées que diverses voies autophagiques peuvent être induites pour favoriser la capture sélective de protéines virales, façonnant de façon dynamique la nature de la réponse immunitaire lors d'une infection. En conclusion, l'application des méthodes de protéomique quantitative a joué un rôle clé dans l'identification et la quantification des protéines ayant des rôles importants dans la régulation de l'autophagie chez les macrophages, et nous a permis d'identifier les changements qui se produisent lors de la formation des autophagosomes lors de maladies inflammatoires ou d’infection virale. En outre, notre approche de biologie des systèmes, qui combine la protéomique quantitative basée sur la spectrométrie de masse avec des essais fonctionnels tels la présentation antigénique, nous a permis d’acquérir de nouvelles connaissances sur les mécanismes moléculaires régissant les fonctions de l'autophagie lors de la présentation antigénique. Une meilleure compréhension de ces mécanismes permettra de réduire les effets nuisibles de l'immunodominance suite à l'infection virale ou lors du développement du cancer en mettant en place une réponse immunitaire appropriée.

Assemblage moléculaire régi par la formation de bifluorènes : vers la formation de réseaux organiques covalents retenus par des liaisons carbone-carbone

Les réseaux organiques covalents (COFs) sont des réseaux bidimensionnels et tridimensionnels assemblés seulement par des atomes légers, c’est-à-dire de la première et deuxième rangée du tableau périodique. Ceux-ci ont montré des propriétés de porosité pouvant être exploitées dans le stockage, dans la catalyse et dans la séparation moléculaire. La plupart de ces matériaux ont été obtenus par une réaction finale de condensation, ce qui nuit à leurs cristallisations, donc à l’homogénéité et à la caractérisation détaillée de ces matériaux. Les p-xylylènes de Thiele et Tschitschibabin sont des molécules qui ont suscité l’intérêt pour leurs structures et leurs propriétés magnétiques. Subséquemment, Wittig a démontré que le remplacement des fragments diphénylméthylène par des fragments fluorénylidène sur le p-xylylène de Thiele donne des molécules pouvant s’oligomériser pour former un tétramère. Dans notre étude, nous avons examiné l’assemblage de dérivés fluorénylidène dans le but d’obtenir un COF. Tout d’abord, un dérivé linéaire similaire à ce que Wittig a obtenu a été synthétisé afin de vérifier l’assemblage à partir d’un cœur spirobifluorényle. Ces molécules se sont assemblées en tétramère, comme prévu, et en hexamère. Ces deux résultats ont pu être rationalisés par une étude à l’état solide par diffraction des rayons-X. L’empilement tridimensionnel a également été étudié pour ces deux molécules. Subséquemment, des dérivés tétraédriques ont été synthétisés afin d’étudier leurs assemblages. Un premier dérivé est resté sous sa forme quinoïdale et ne s’est pas assemblé, alors qu’un second dérivé a mené à un dimère partiellement assemblé. La structure de ce dernier suggère la formation d’un polymère linéaire pour ce composé dans le cas où il aurait été possible de l’assembler complètement.

Carbon-carbon bond formation : from transition metal catalysis to base-promoted homolytic aromatic substitution

Cette thèse de doctorat porte sur la catalyse à partir de métaux de transition et sur la substitution homolytique aromatique favorisée par une base visant à former de nouvelles liaisons C–C, et à ainsi concevoir de nouvelles structures chimiques. Au cours des vingt dernières années, des nombreux efforts ont été réalisés afin de développer des méthodologies pour la fonctionnalisation de liens C–H, qui soient efficaces et sélectives, et ce à faible coût et en produisant le minimum de déchets. Le chapitre d'introduction donnera un aperçu de la fonctionnalisation directe de liens C–H sur des centres sp2 et sp3. Il sera également discuté dans cette partie de certains aspects de la chimie radicalaire reliés a ce sujet. Les travaux sur la fonctionnalisation d’imidazo[1,5-a]pyridines catalysée par des compleces de ruthénium seront présentés dans le chapitre 2. Malgré l'intérêt des imidazo[1,5-a]azines en chimie médicinale, ces composés n’ont reçu que peu d'attention dans le domaine de la fonctionnalisation de liens C–H. L'étendue de la réaction et l'influence des effets stériques et électroniques seront détaillés. Les cyclopropanes représentent les 10ème cycles carbonés les plus rencontrés dans les petites molécules d’intérêt pharmacologique. Ce sont aussi des intermédiaires de synthèse de choix pour la création de complexité chimique. Malgré de grands progrès dans le domaine de la fonctionnalisation de liens C(sp3)–H, l'étude des cyclopropanes comme substrats dans les transformations directes est relativement nouvelle. Le chapitre trois présentera l'arylation intramoléculaire directe de cyclopropanes. Cette réaction est réalisée en présence de palladium, en quantité catalytique, en combinaison avec des sels d’argent. Des études mécanistiques ont réfuté la formation d'un énolate de palladium et suggéreraient plutôt une étape de métallation - déprotonation concertée. En outre, les cycles de type benzoazepinone à sept chaînons ont été synthétisés par l'intermédiaire d'une séquence d'activation de cyclopropane/ouverture/cyclisation. Une arylation directe intermoléculaire des cyclopropanes a été réalisée en présence d'un auxiliaire de type picolinamide (Chapitre 4). Les deux derniers chapitres de ce mémoire de thèse décriront nos études sur la substitution homolytique aromatique favorisée par une base. Le mécanisme de la réaction de cyclisation intramoléculaire d'halogénures d'aryle, réalisée en présence de tert-butylate de potassium, a été élucidé et se produit via une voie radicalaire (Chapitre 5). La transformation, exempte de métaux de transition, ne nécessite que la présence d’une base et de pyridine comme solvant. Cette réaction radicalaire a été étendue à la cyclisation d'iodures d'alkyle non activés en présence d'un catalyseur à base de nickel et de bis(trimethylsilyl)amidure de sodium comme base (Chapitre 6). Des études de RMN DOSY ont démontré une association entre le catalyseur, la base et le matériel de départ.

Characterization of two sorting nexins : sorting nexin-11 and sorting nexin-30

À l’intérieur de la cellule sillonnent d’innombrables molécules, certaines par diffusion et d’autres sur des routes moléculaires éphémères, empruntées selon les directives spécifiques de protéines responsables du trafic intracellulaire. Parmi celles-ci, on compte les sorting nexins, qui déterminent le sort de plusieurs types de protéine, comme les récepteurs, en les guidant soit vers des voies de dégradation ou de recyclage. À ce jour, il existe 33 membres des sorting nexins (Snx1-33), tous munies du domaine PX (PHOX-homology). Le domaine PX confère aux sorting nexins la capacité de détecter la présence de phosphatidylinositol phosphates (PIP), sur la surface des membranes lipidiques (ex : membrane cytoplasmique ou vésiculaire). Ces PIPs, produits de façon spécifique et transitoire, recrutent des protéines nécessaires à la progression de processus cellulaires. Par exemple, lorsqu’un récepteur est internalisé par endocytose, la région avoisinante de la membrane cytoplasmique devient occupée par PI(4,5)P2. Ceci engendre le recrutement de SNX9, qui permet la progression de l’endocytose en faisant un lien entre le cytoskelette et le complexe d’endocytose. Les recherches exposées dans cette thèse sont une description fonctionnelle de deux sorting nexins peux connues, Snx11 et Snx30. Le rôle de chacun de ces gènes a été étudié durant l’embryogenèse de la grenouille (Xenopus laevis). Suite aux résultats in vivo, une approche biomoléculaire et de culture cellulaire a été employée pour approfondir nos connaissances. Cet ouvrage démontre que Snx11 est impliqué dans le développement des somites et dans la polymérisation de l’actine. De plus, Snx11 semble influencer le recyclage de récepteurs membranaires indépendamment de l’actine. Ainsi, Snx11 pourrait jouer deux rôles intracellulaires : une régulation actine-dépendante du milieu extracellulaire et le triage de récepteurs actine-indépendant. De son côté, Snx30 est impliqué dans la différentiation cardiaque précoce par l’inhibition de la voie Wnt/β-catenin, une étape nécessaire à l’engagement d’une population de cellules du mésoderme à la ligné cardiaque. L’expression de Snx30 chez le Xénope coïncide avec cette période critique de spécification du mésoderme et le knockdown suscite des malformations cardiaques ainsi qu’à d’autres tissus dérivés du mésoderme et de l’endoderme. Cet ouvrage fournit une base pour des études futures sur Snx11 et Snx30. Ces protéines ont un impact subtil sur des voies de signalisation spécifiques. Ces caractéristiques pourraient être exploitées à des fins thérapeutiques puisque l’effet d’une interférence avec leurs fonctions pourrait être suffisant pour rétablir un déséquilibre cellulaire pathologique tout en minimisant les effets secondaires.

Design, synthèse et application en catalyse verte d’un ligand alkyl imidazolium β-cyclodextrine

Le 21e siècle est le berceau d’une conscientisation grandissante sur les impacts environnementaux des processus utilisés pour synthétiser des molécules cibles. Parmi les avancées qui ont marqué ces dernières décennies, il est également question de réduction de déchets, de conservation de l’énergie et de durabilité des innovations. Ces aspects constituent les lignes directrices de la chimie verte. De ce fait, il est impératif de développer des stratégies de synthèse dont les impacts environnementaux sont bénins. Dans ce mémoire nous présentons la synthèse, la caractérisation et l’étude des propriétés catalytiques en milieu aqueux d’un ligand composé d’une unité -cyclodextrine native, d’une unité imidazolium et d’une chaine alkyle à 12 carbones. Ce ligand hybride s’auto-assemble dans l’eau sous forme de micelles, permettant ainsi d’effectuer en sa présence des couplages de Suzuki-Miyaura dans l’eau, avec de bons rendements. La fonctionnalisation de la face primaire de la -cyclodextrine par un noyau alkyl-imidazolium, précurseur de ligand de type carbène N-hétérocyclique, a permis le développement d’un système catalytique vert et hautement recyclable. Dans un deuxième temps, nous présentons l’utilisation du même ligand hybride dans des couplages de Heck dans l’eau, démontrant ainsi la versatilité du ligand.

Early growth response protein 1 (Egr-1) expression by Insulin-like growth factor 1 (IGF-1) involves MAPKs and PKB pathways

Un remodelage vasculaire anormal est à la base de la pathogenèse des maladies cardio-vasculaires (MCV) telles que l’athérosclérose et l’hypertension. Des dysfonctionnements au niveau de la migration, l’hypertrophie et la prolifération des cellules musculaires lisses vasculaires (CMLV) sont des évènements cellulaires qui jouent un rôle primordial dans le remodelage vasculaire. L’insulin-like growth factor 1 (IGF-1), puissant facteur mitogène, contribue au développement des MCV, notamment via l’activation des protéines MAPK et PI3-K/PKB, composantes clés impliquées dans les voies de croissance cellulaire. Ces molécules sont également impliquées dans la modulation de l’expression de nombreux facteurs de transcription, incluant le facteur Egr-1. Egr-1 est régulé à la hausse dans différents types de maladies vasculaires impliquant les voies de signalisation de croissance et de stress oxydant qui par ailleurs peuvent être déclenchées par l’IGF-1. Cependant, la question d’une possible modulation de l’expression d’Egr-1 dans les CMLV demeure inabordée; plus spécifiquement, la caractérisation de la voie de signalisation reliant l’action d’IGF-1 à l’expression d’Egr-1 reste à établir. Dans cette optique, l’objectif de cette étude a été d’examiner l’implication de MAPK, PKB et des dérivés réactifs de l’oxygène (DRO) dans l’expression d’Egr-1 induite par l’IGF-1 dans les CMLV. L’IGF-1 a induit une augmentation marquée du niveau protéique de l’Egr-1 en fonction du temps et de la concentration utilisés. Cette augmentation a été inhibée en fonction des doses d’agents pharmacologiques qui ciblent les voies de signalisation de MAPK, PKB et DRO. De plus, l’expression du facteur de transcription, Egr-1, en réponse de l’IGF-1, a été atténuée suite à un blocage pharmacologique des processus cellulaires responsables de la synthèse d’ARN et de synthèse protéique. Pour conclure, on a démontré que l’IGF-1 stimule l’expression d’Egr-1 via les voies de signalisation, impliquant ERK1/2/JNK, PI3K/PKB. On a également proposé que les DRO jouent un rôle important dans ce processus. Dans l’ensemble, nous avons suggéré un nouveau mécanisme par lequel l’IGF-1 promeut la prolifération et l’hypertrophie cellulaire, processus à la base des anomalies vasculaires.

Signature optique d’effet Stark dans une bicouche de CuPc:C60

Les hétérojonctions formées de deux matériaux, un donneur et un accepteur (D/A), sont la base de la majorité des mélanges photovoltaïques organiques. Les mécanismes de séparation des charges dans ces systèmes représentent aujourd'hui l'un des sujets les plus chauds et les plus débattus dans ce domaine. Nous entrons au coeur de ce débat en choisissant un système D/A à base de phtalocyanine de cuivre (CuPc) et de fullerène (C60). Pour sonder les états excités de nos molécules et obtenir de l'information sur les phénomènes à l'interface D/A, nous réalisons une expérience pompe-sonde, appelée absorption photoinduite (PIA). Nous y mesurons le changement fractionnaire de transmission au travers de l'échantillon. Les mesures de PIA sont réalisées à l'état de quasi équilibre, à T=10K. Nous observons une modulation prononcée dans la région du photoblanchiment de l'état fondamental qui nous indique que la pompe induit un décalage du spectre d'absorption de l'état fondamental. Ce décalage peut être expliqué par deux processus : soit l'échantillon est chauffé par la pompe (effet thermique) ou bien des charges sont créées à l'interface entre les deux matériaux (effet Stark). La dépendance en température du spectre d'absorption entre 10K et 290K montre une signature thermique pour un changement de température de 80K. Grâce au ratio des raies Raman anti-Stokes et Stokes, nous démontrons que la pompe chauffe l'échantillon de 34 K, température insuffisante pour attribuer notre signal à un effet thermique. Nous évaporons ensuite la bicouche CuPc/C60 sur de l'ITO et du saphir, substrats qui possèdent des conductivités thermiques différentes et nous observons le même signal de PIA, excluant par le fait même l'hypothèse de l'effet thermique. Puisque notre étude est comparable à la spectroscopie à effet Stark, nous procédons à une analyse similaire en comparant notre signal de PIA au spectre de la transmittance et à ses dérivés première et seconde. Nous observons alors que notre signal reproduit presque parfaitement la dérivée seconde de la transmittance. Ces résultats sont conformes à une signature optique d'effet Stark due à la création de charges à l'interface D/A.

Validation et conditionnement d'un test PAMPA amélioré pour l'évaluation de la perméabilité membranaire de médicaments.

Les tests PAMPA et les tests Caco-2 sont des essais in vitro de l’évaluation de la perméabilité intestinale des médicaments. Ils sont réalisés lors de la phase de découverte du médicament. Les tests PAMPA ne sont pas biologiquement représentatifs de la paroi intestinale, mais ils sont rapides et peu coûteux. Les tests Caco-2 nécessitent plus de 21 jours pour la culture cellulaire et des installations spécifiques sont requises. Ils sont constitués d’une monocouche d’entérocytes à confluence et donc plus biologiquement représentatifs. Il y a un besoin pour le développement d’un essai qui est biologiquement représentatif de la membrane intestinale humaine, rapide et peu coûteux. Le premier but de ce projet était de développer une méthode analytique qui permettrait l’évaluation simultanée de huit médicaments témoins utilisés pour la validation de l’essai de perméabilité. Le deuxième but de ce projet était donc d’améliorer la membrane des tests PAMPA pour proposer un nouveau test : le néoPAMPA. Contrairement au test PAMPA traditionnel, cette membrane est constituée de trois composantes : (1) un filtre poreux qui agit à titre de support, (2) un coussin polydopamine chargé négativement qui sert d’ancrage et qui assure la fluidité de la bicouche et (3) une bicouche lipidique formée par fusion de vésicules. Une méthode analytique HPLC-MS/MS a été validée selon les spécifications de la FDA et de la EMA. Cette méthode a permis de quantifier simultanément les huit médicaments standards utilisés pour le test néoPAMPA. Le test PAMPA traditionnel a été mis en place à titre d’essai control. Les coefficients de perméabilité mesurés pour les huit médicaments au travers de la membrane PAMPA comparaient favorablement aux résultats de la littérature. Les composantes de la membrane néoPAMPA ont été optimisées. Les conditions optimales retenues étaient les filtres de polycarbonate hydrophile ayant des pores de 15 nm, les plaques Costar 12 puits comme dispositif des tests de perméabilité, une bicouche lipidique composée de 70 % DOPC et de 30 % cholestérol cationique ainsi qu’une déposition des liposomes en présence de 150 mM NaCl suivi d’un équilibre d’1 h en présence d’une solution saturée en DOPC. Les stabilités de la cassette de médicaments et des liposomes sont insuffisantes pour le conditionnement commercial des membranes néoPAMPA. Les différentes optimisations réalisées ont permis d’améliorer la membrane néoPAMPA sans toutefois la rendre fonctionnelle. La membrane néoPAMPA n’est toujours pas en mesure de discriminer des molécules en fonction de leur perméabilité attendue.

Étude des conceptions alternatives et des processus de raisonnement des étudiants de chimie du niveau collégial sur la molécule, la polarité et les phénomènes macroscopiques

La chimie est un sujet difficile étant donné ses concepts nombreux et souvent peu intuitifs. Mais au-delà de ces difficultés d’ordre épistémologique, l’apprentissage de la chimie peut être en péril lorsqu’il s’appuie sur des fondations instables, mêlées de conceptions alternatives. Les conceptions alternatives sont les représentations internes, tacites, des étudiants, qui sont en désaccord avec la théorie scientifiquement acceptée. Leur présence dans leur esprit peut nuire à la compréhension conceptuelle, et elle peut mener les étudiants à expliquer le comportement de la matière incorrectement et à faire des prédictions inexactes en chimie. Les conceptions alternatives sont réputées répandues et difficiles à repérer dans un cadre traditionnel d’enseignement. De nombreuses conceptions alternatives en chimie ont été mises en lumière par différents groupes de chercheurs internationaux, sans toutefois qu’une telle opération n’ait jamais été réalisée avec des étudiants collégiaux québécois. Le système d’éducation postsecondaire québécois représentant un contexte unique, une étude des difficultés particulières de ces étudiants était nécessaire pour tracer un portrait juste de la situation. De plus, des chercheurs proposent aujourd’hui de ne pas faire uniquement l’inventaire des conceptions, mais de s’attarder aussi à étudier comment, par quel processus, elles mènent à de mauvaises prédictions ou explications. En effet, ils soutiennent que les catalogues de conceptions ne peuvent pas être facilement utilisés par les enseignants, ce qui devrait pourtant être la raison pour les mettre en lumière : qu’elles soient prises en compte dans l’enseignement. Toutefois, aucune typologie satisfaisante des raisonnements et des conceptions alternatives en chimie, qui serait appuyée sur des résultats expérimentaux, n’existe actuellement dans les écrits de recherche. Plusieurs chercheurs en didactique de la chimie suggèrent qu’une telle typologie est nécessaire et devrait rendre explicites les modes de raisonnement qui mettent en jeu ces conceptions alternatives. L’explicitation du raisonnement employé par les étudiants serait ainsi la voie permettant de repérer la conception alternative sur laquelle ce raisonnement s’appuie. Le raisonnement est le passage des idées tacites aux réponses manifestes. Ce ne sont pas toutes les mauvaises réponses en chimie qui proviennent de conceptions alternatives : certaines proviennent d’un manque de connaissances, d’autres d’un agencement incorrect de concepts pourtant corrects. Comme toutes les sortes de mauvaises réponses d’étudiants sont problématiques lors de l’enseignement, il est pertinent de toutes les considérer. Ainsi, ces préoccupations ont inspiré la question de recherche suivante : Quelles conceptions alternatives et quels processus de raisonnement mènent les étudiants à faire de mauvaises prédictions en chimie ou à donner de mauvaises explications du comportement de la matière? C’est pour fournir une réponse à cette question que cette recherche doctorale a été menée. Au total, 2413 étudiants ont participé à la recherche, qui était divisée en trois phases : la phase préliminaire, la phase pilote et la phase principale. Des entrevues cliniques ont été menées à la phase préliminaire, pour explorer les conceptions alternatives des étudiants en chimie. Lors de la phase pilote, des questionnaires à choix multiples avec justification ouverte des réponses ont été utilisés pour délimiter le sujet, notamment à propos des notions de chimie les plus pertinentes sur lesquelles concentrer la recherche et pour mettre en lumière les façons de raisonner des étudiants à propos de ces notions. La phase principale, quant à elle, a utilisé le questionnaire à deux paliers à choix multiples « Molécules, polarité et phénomènes » (MPP) développé spécifiquement pour cette recherche. Ce questionnaire a été distribué aux étudiants via une adaptation de la plateforme Web ConSOL, développée durant la recherche par le groupe de recherche dont fait partie la chercheuse principale. Les résultats montrent que les étudiants de sciences de la nature ont de nombreuses conceptions alternatives et autres difficultés conceptuelles, certaines étant très répandues parmi leur population. En particulier, une forte proportion d’étudiants croient que l’évaporation d’un composé entraîne le bris des liaisons covalentes de ses molécules (61,1 %), que tout regroupement d’atomes est une molécule (78,9 %) et que les atomes ont des propriétés macroscopiques pareilles à celles de l’élément qu’ils constituent (66,0 %). D’un autre côté, ce ne sont pas toutes les mauvaises réponses au MPP qui montrent des conceptions alternatives. Certaines d’entre elles s’expliquent plutôt par une carence dans les connaissances antérieures (par exemple, lorsque les étudiants montrent une méconnaissance d’éléments chimiques communs, à 21,8 %) ou par un raisonnement logique incomplet (lorsqu’ils croient que le seul fait de posséder des liaisons polaires rend nécessairement une molécule polaire, ce qu’on observe chez 24,1 % d’entre eux). Les conceptions alternatives et les raisonnements qui mènent à des réponses incorrectes s’observent chez les étudiants de première année et chez ceux de deuxième année du programme de sciences, dans certains cas avec une fréquence diminuant entre les deux années, et dans d’autres, à la même fréquence chez les deux sous-populations. Ces résultats permettent de mitiger l’affirmation, généralement reconnue dans les écrits de recherche, selon laquelle les conceptions alternatives sont résistantes à l’enseignement traditionnel : selon les résultats de la présente recherche, certaines d’entre elles semblent en effet se résoudre à travers un tel contexte d’enseignement. Il demeure que plusieurs conceptions alternatives, carences dans les connaissances antérieures de base et erreurs de raisonnement ont été mises en lumière par cette recherche. Ces problèmes dans l’apprentissage mènent les étudiants collégiaux à faire des prédictions incorrectes du comportement de la matière, ou à expliquer ce comportement de façon incorrecte. Au regard de ces résultats, une réflexion sur l’enseignement de la chimie au niveau collégial, qui pourrait faire une plus grande place à la réflexion conceptuelle et à l’utilisation du raisonnement pour la prédiction et l’explication des phénomènes étudiés, serait pertinente à tenir.

Régulation du métabolisme des ARNm par les voies de signalisation MAPK et mTOR

Il est à ce jour bien établi que la régulation de l’expression génique dépend en grande partie des évènements post-transcriptionnels et que la traduction des ARNm tient un rôle de premier plan dans ces processus. Elle est particulièrement importante pour définir le protéome, maintenir l’homéostasie et contrôler la croissance et la prolifération cellulaire. De nombreuses pathologies humaines telles que le cancer découlent de dérèglements de la synthèse protéique. Ceci souligne l’importance d’une meilleure compréhension des mécanismes moléculaires contribuant au contrôle de la traduction des ARNm. Le facteur d’initiation eIF4E est essentiel à la traduction et son activité est régulée par ses partenaires protéiques dont font partie les protéines 4E-BP et 4E-T. Les voies de signalisation PI3K/mTOR et MAPK qui sont fortement impliquées dans l’étiologie du cancer, contrôlent la traduction en modulant l’activité d’eIF4E via l’inhibition des protéines 4E-BP et la localisation de 4E-T. Afin d’améliorer notre compréhension des mécanismes régulant la traduction des ARNm, nous avons utilisé plusieurs approches. Tout d’abord, nous avons caractérisé les mécanismes par lesquels le complexe mTORC1 est activé en réponse aux facteurs de croissance et avons déterminé que la kinase RSK, en aval de la voie Ras/ERK, contrôle directement l’activité de mTORC1 en phosphorylant Raptor, la sous-unité régulatrice du complexe mTORC1. Par ailleurs, nous nous sommes intéressés au rôle joué par mTORC1 dans l’initiation de la traduction. Pour cela, nous avons réalisé un criblage protéomique dans le but d’identifier de nouveaux facteurs sous le contrôle de mTORC1 qui participent activement à la traduction. Ces travaux ont ainsi permis l’identification de la protéine de liaison à l’ARN LARP1 comme effecteur majeur de la traduction des ARNm et de la croissance cellulaire en aval de mTORC1. Finalement, notre étude de l’effet du stress oxydant dans la répression de la traduction nous a permis de montrer que la kinase JNK contrôle la localisation du répresseur 4E-T au sein des P-bodies, qui sont des granules cytoplasmiques concentrant des ARNm non traduits et des facteurs de la dégradation des ARNm. Nos travaux ont donc abouti à la découverte de mécanismes moléculaires cruciaux impliqués dans la régulation de la traduction des ARNm et de la synthèse protéique. Ces derniers étant largement impliqués dans la prolifération cellulaire et la croissance tumorale, nos recherches ouvrent sur un champ d’investigation plus large pour le développement de nouvelles molécules anti-cancéreuses.

A robust algorithm for segmenting fluorescence images and its application to single-molecule counting

La microscopie par fluorescence de cellules vivantes produit de grandes quantités de données. Ces données sont composées d’une grande diversité au niveau de la forme des objets d’intérêts et possèdent un ratio signaux/bruit très bas. Pour concevoir un pipeline d’algorithmes efficaces en traitement d’image de microscopie par fluorescence, il est important d’avoir une segmentation robuste et fiable étant donné que celle-ci constitue l’étape initiale du traitement d’image. Dans ce mémoire, je présente MinSeg, un algorithme de segmentation d’image de microscopie par fluorescence qui fait peu d’assomptions sur l’image et utilise des propriétés statistiques pour distinguer le signal par rapport au bruit. MinSeg ne fait pas d’assomption sur la taille ou la forme des objets contenus dans l’image. Par ce fait, il est donc applicable sur une grande variété d’images. Je présente aussi une suite d’algorithmes pour la quantification de petits complexes dans des expériences de microscopie par fluorescence de molécules simples utilisant l’algorithme de segmentation MinSeg. Cette suite d’algorithmes a été utilisée pour la quantification d’une protéine nommée CENP-A qui est une variante de l’histone H3. Par cette technique, nous avons trouvé que CENP-A est principalement présente sous forme de dimère.

Interaction entre le virus SRRP et Actinobacillus pleuropneumoniae dans un modèle d'infection en culture cellulaire

Le virus du syndrome reproducteur et respiratoire porcin (VSRRP) est un pathogène d’importance dans l’industrie porcine et est responsable d’importantes pertes économiques. Il n’existe pas d’antiviral efficace contre celui-ci. Il a récemment été mis en évidence que le surnageant de culture d’Actinobacillus pleuropneumoniae, l’agent étiologique de la pleuropneumonie porcine, possédait une activité antivirale in vitro contre le VSRRP dans la lignée cellulaire SJPL. Les objectifs de mon projet sont (i) d’étudier les mécanismes cellulaires menant à l’activité antivirale causée par le surnageant de culture d’A. pleuropneumoniae, et (ii) de caractériser les molécules actives présentes dans le surnageant de culture d’A. pleuropneumoniae. Dans un premier temps, des analyses de protéome ont été effectuées et ont permis d’observer que le surnageant de culture modulait la régulation du cycle cellulaire. Dans le but d’analyser le cycle cellulaire des cellules SJPL, la cytométrie en flux a été utilisée et a permis de démontrer que le surnageant de culture induisait un arrêt du cycle cellulaire en phase G2/M. Deux inhibiteurs de la phase G2/M ont alors été utilisé. Il s'est avéré que ces inhibiteurs avaient la capacité d’inhiber le VSRRP dans les cellules SJPL. Enfin, la spectrométrie de masse a été utilisée dans le but de caractériser les molécules actives présentes dans le surnageant de culture d’A. pleuropneumoniae et d’identifier deux molécules. Ce projet a permis de démontrer pour la première fois qu’A. pleuropneumoniae est capable de perturber le cycle cellulaire et que ce dernier était un élément important dans l’effet antiviral contre le VSRRP.

Study of nuclear receptor dynamics by BRET

Les récepteurs nucléaires (RN) sont des facteurs de transcription ligand dépendants qui contrôlent une grande variété de processus biologiques de la physiologie humaine, ce qui a fait d'eux des cibles pharmacologiques privilégiées pour de nombreuses maladies. L'un de ces récepteurs, le récepteur de l’œstrogène alpha (ERα), peut activer la prolifération cellulaire dans certaines sections de l'épithélium mammaire tandis qu’un autre, le récepteur de l'acide rétinoïque alpha (RARα), peut provoquer un arrêt de la croissance et la différenciation cellulaire. La signalisation de ces deux récepteurs peut être altérée dans le cancer du sein, contribuant à la tumorigénèse mammaire. L’activité d’ERα peut être bloquée par les anti-oestrogènes (AE) pour inhiber la prolifération des cellules tumorales mammaires. Par contre, l’activation des voies de RARα avec des rétinoïdes dans un contexte clinique a rencontré peu de succès. Ceci pourrait résulter du manque de spécificité des ligands testés pour RARα et/ou de leur activité seulement dans certains sous-types de tumeurs mammaires. Puisque les récepteurs nucléaires forment des homo- et hétéro-dimères, nous avons cherché à développer de nouveaux essais pharmacologiques pour étudier l'activité de complexes dimériques spécifiques, leur dynamique d’association et la structure quaternaire des récepteurs des œstrogènes. Nous décrivons ici une nouvelle technique FRET, surnommée BRET avec renforcement de fluorescence par transferts combinés (BRETFect), qui permet de détecter la formation de complexes de récepteurs nucléaires ternaires. Le BRETFect peut suivre l'activation des hétérodimères ERα-ERβ et met en évidence un mécanisme allostérique d'activation que chaque récepteur exerce sur son partenaire de dimérisation. L'utilisation de BRETFect en combinaison avec le PCA nous a permis d'observer la formation de multimères d’ERα fonctionnels dans des cellules vivantes pour la première fois. La formation de multimères est favorisée par les AE induisant la dégradation du récepteur des oestrogènes, ce qui pourrait contribuer à leurs propriétés spécifiques. Ces essais de BRET apportent une nette amélioration par rapport aux tests de vecteurs rapporteur luciférase classique, en fournissant des informations spécifiques aux récepteurs en temps réel sans aucune interférence par d'autres processus tels que la transcription et de la traduction. L'utilisation de ces tests nous a permis de caractériser les propriétés de modulation de l’activité des récepteurs nucléaires d’une nouvelle classe de molécules hybrides qui peuvent à la fois lier ERa ou RAR et inhiber les HDACs, conduisant au développement de nouvelles molécules prometteuses bifonctionnelles telles que la molécule hybride RAR-agoniste/HDACi TTNN-HA.

Rôle essentiel des cellules dendritiques dans l'immunité innée face a des streptocoques encapsulés

Streptococcus du Groupe B (GBS) et Streptococcus suis sont deux pathogènes encapsulés qui induisent des pathologies similaires dont la méningite et la septicémie chez les animaux et/ou les humains. Les sérotypes III et V du GBS et les sérotypes 2 et 14 du S. suis (utilisés dans cette étude) sont parmi les plus prévalents et/ou les plus virulents. La capsule polysaccharidique (CPS) définit le sérotype et est considérée comme un facteur de virulence essentiel pour les deux espèces bactériennes. Malgré que plusieurs études aient été réalisées au niveau des interactions entre ces streptocoques et les cellules de l’immunité innée, aucune information n’est disponible sur la régulation de la réponse immunitaire contre ces pathogènes par les cellules dendritiques (DCs) et leur interactions avec d’autres cellules, notamment les cellules ‘natural killer’ (NK). Dans cette étude, différentes approches (in vitro, ex vivo et in vivo) chez la souris ont été développées pour caractériser les interactions entre les DCs, les cellules NK et GBS ou S. suis. L’utilisation de mutants non encapsulés a permis d’évaluer l’importance de la CPS dans ces interactions. Les résultats in vitro avec les DCs infectées par GBS ou S. suis ont démontré que ces deux pathogènes interagissent différemment avec ces cellules. GBS est grandement internalisé par les DCs, et ce, via de multiples mécanismes impliquant notamment les radeaux lipidiques et la clathrine. Le mécanisme d’endocytose utilisé aurait un effet sur la capacité du GBS à survivre intracellulairement. Quant au S. suis, ce dernier est très faiblement internalisé et, si le cas, rapidement éliminé à l’intérieur des DCs. GBS et S. suis activent les DCs via différents récepteurs et favorisent la production de cytokines et chimiokines ainsi que l’augmentation de l’expression de molécules de co-stimulation. Cette activation permet la production d’interferon-gamma (IFN-y) par les cellules NK. Cependant, GBS semble plus efficient à activer les DCs, et par conséquent, les cellules NK que S. suis. La production d’IFN-y, en réponse à la stimulation bactérienne, est principalement assurée par un contact direct entre les DCs et les cellules NK et ne dépend qu’en partie de facteurs solubles. De plus, nos résultats in vivo ont démontré que ces deux streptocoques induisent rapidement la libération d'IFN-y par les cellules NK lors de la phase aiguë de l'infection. Ceci suggère que les interactions entre les DCs et les cellules NK pourraient jouer un rôle dans le développement d’une réponse immune T auxiliaire de type 1 (T ‘helper’ 1 en anglais; Th1). Cependant, la capacité de S. suis à activer la réponse immunitaire in vivo est également plus faible que celle observée pour GBS. En effet, les CPSs de GBS et de S. suis jouent des rôles différents dans cette réponse. La CPS de S. suis empêche une activation optimale des DCs et des cellules NK alors que c’est l’opposé pour la CPS de GBS, indépendamment du sérotype évalué. En résumé, cette étude adresse pour la première fois la contribution des DCs et des cellules NK dans la réponse immunitaire innée lors d’une infection à GBS ou à S. suis et, par extension, dans le développement d’une réponse Th1. Nos résultats renforcent davantage le rôle central des DCs dans le contrôle efficace des infections causées par des bactéries encapsulées.