Hsp70 and the Cochaperone StiA (Hop) Orchestrate Hsp90-Mediated Caspofungin Tolerance in Aspergillus fumigatus.

Aspergillus fumigatus is the primary etiologic agent of invasive aspergillosis (IA), a major cause of death among immunosuppressed patients. Echinocandins (e.g., caspofungin) are increasingly used as second-line therapy for IA, but their activity is only fungistatic. Heat shock protein 90 (Hsp90) was previously shown to trigger tolerance to caspofungin and the paradoxical effect (i.e., decreased efficacy of caspofungin at higher concentrations). Here, we demonstrate the key role of another molecular chaperone, Hsp70, in governing the stress response to caspofungin via Hsp90 and their cochaperone Hop/Sti1 (StiA in A. fumigatus). Mutation of the StiA-interacting domain of Hsp70 (C-terminal EELD motif) impaired thermal adaptation and caspofungin tolerance with loss of the caspofungin paradoxical effect. Impaired Hsp90 function and increased susceptibility to caspofungin were also observed following pharmacologic inhibition of the C-terminal domain of Hsp70 by pifithrin-μ or after stiA deletion, further supporting the links among Hsp70, StiA, and Hsp90 in governing caspofungin tolerance. StiA was not required for the physical interaction between Hsp70 and Hsp90 but had distinct roles in the regulation of their function in caspofungin and heat stress responses. In conclusion, this study deciphering the physical and functional interactions of the Hsp70-StiA-Hsp90 complex provided new insights into the mechanisms of tolerance to caspofungin in A. fumigatus and revealed a key C-terminal motif of Hsp70, which can be targeted by specific inhibitors, such as pifithrin-μ, to enhance the antifungal activity of caspofungin against A. fumigatus.

Molecular basis and regulation of insect pathogenicity in plant-beneficial pseudomonads

Les bactéries du genre Pseudomonas ont la capacité étonnante de s'adapter à différents habitats et d'y survivre, ce qui leur a permis de conquérir un large éventail de niches écologiques et d'interagir avec différents organismes hôte. Les espèces du groupe Pseudomonas fluorescens peuvent être facilement isolées de la rhizosphère et sont communément connues comme des Pseudomonas bénéfiques pour les plantes. Elles sont capables d'induire la résistance systémique des plantes, d'induire leur croissance et de contrer des phytopathogènes du sol. Un sous-groupe de ces Pseudomonas a de plus développé la capacité d'infecter et de tuer certaines espèces d'insectes. Approfondir les connaissances sur l'interaction de ces bactéries avec les insectes pourraient conduire au développement de nouveaux biopesticides pour la protection des cultures. Le but de cette thèse est donc de mieux comprendre la base moléculaire, l'évolution et la régulation de la pathogénicité des Pseudomonas plante-bénéfiques envers les insectes. Plus spécifiquement, ce travail a été orienté sur l'étude de la production de la toxine insecticide appelée Fit et sur l'indentification d'autres facteurs de virulence participant à la toxicité de la bactérie envers les insectes. Dans la première partie de ce travail, la régulation de la production de la toxine Fit a été évaluée par microscopie à épifluorescence en utilisant des souches rapportrices de Pseudomonas protegens CHA0 qui expriment la toxine insecticide fusionnée à une protéine fluorescente rouge, au site natif du gène de la toxine. Celle-ci a été détectée uniquement dans l'hémolymphe des insectes et pas sur les racines des plantes, ni dans les milieux de laboratoire standards, indiquant une production dépendante de l'hôte. L'activation de la production de la toxine est contrôlée par trois protéines régulatrices dont l'histidine kinase FitF, essentielle pour un contrôle précis de l'expression et possédant un domaine "senseur" similaire à celui de la kinase DctB qui régule l'absorption de carbone chez les Protéobactéries. Il est donc probable que, durant l'évolution de FitF, un réarrangement de ce domaine "senseur" largement répandu ait contribué à une production hôte-spécifique de la toxine. Les résultats de cette étude suggèrent aussi que l'expression de la toxine Fit est plutôt réprimée en présence de composés dérivés des plantes qu'induite par la perception d'un signal d'insecte spécifique. Dans la deuxième partie de ce travail, des souches mutantes ciblant des facteurs de virulence importants identifiés dans des pathogènes connus ont été générées, dans le but d'identifier ceux avec une virulence envers les insectes atténuée. Les résultats ont suggéré que l'antigène O du lipopolysaccharide (LPS) et le système régulateur à deux composantes PhoP/PhoQ contribuent significativement à la virulence de P. protegens CHA0. La base génétique de la biosynthèse de l'antigène O dans les Pseudomonas plante-bénéfiques et avec une activité insecticide a été élucidée et a révélé des différences considérables entre les lignées suite à des pertes de gènes ou des acquisitions de gènes par transfert horizontal durant l'évolution de certaines souches. Les chaînes latérales du LPS ont été montrées comme vitales pour une infection des insectes réussie par la souche CHA0, après ingestion ou injection. Les Pseudomonas plante-bénéfiques, avec une activité insecticide sont naturellement résistants à la polymyxine B, un peptide antimicrobien modèle. La protection contre ce composé antimicrobien particulier dépend de la présence de l'antigène O et de la modification du lipide A, une partie du LPS, avec du 4-aminoarabinose. Comme les peptides antimicrobiens cationiques jouent un rôle important dans le système immunitaire des insectes, l'antigène O pourrait être important chez les Pseudomonas insecticides pour surmonter les mécanismes de défense de l'hôte. Le système PhoP/PhoQ, connu pour contrôler les modifications du lipide A chez plusieurs bactéries pathogènes, a été identifié chez Pseudomonas chlororaphis PCL1391 et P. protegens CHA0. Pour l'instant, il n'y a pas d'évidence que des modifications du lipide A contribuent à la pathogénicité de cette bactérie envers les insectes. Cependant, le senseur-kinase PhoQ est requis pour une virulence optimale de la souche CHA0, ce qui suggère qu'il régule aussi l'expression des facteurs de virulence de cette bactérie. Les découvertes de cette thèse démontrent que certains Pseudomonas associés aux plantes sont de véritables pathogènes d'insectes et donnent quelques indices sur l'évolution de ces microbes pour survivre dans l'insecte-hôte et éventuellement le tuer. Les résultats suggèrent également qu'une recherche plus approfondie est nécessaire pour comprendre comment ces bactéries sont capables de contourner ou surmonter la réponse immunitaire de l'hôte et de briser les barrières physiques pour envahir l'insecte lors d'une infection orale. Pour cela, les futures études ne devraient pas uniquement se concentrer sur le côté bactérien de l'interaction hôte-microbe, mais aussi étudier l'infection du point de vue de l'hôte. Les connaissances gagnées sur la pathogénicité envers les insectes des Pseudomonas plante-bénéfiques donnent un espoir pour une future application en agriculture, pour protéger les plantes, non seulement contre les maladies, mais aussi contre les insectes ravageurs. -- Pseudomonas bacteria have the astonishing ability to survive within and adapt to different habitats, which has allowed them to conquer a wide range of ecological niches and to interact with different host organisms. Species of the Pseudomonas fluorescens group can readily be isolated from plant roots and are commonly known as plant-beneficial pseudomonads. They are capable of promoting plant growth, inducing systemic resistance in the plant host and antagonizing soil-borne phytopathogens. A defined subgroup of these pseudomonads evolved in addition the ability to infect and kill certain insect species. Profound knowledge about the interaction of these particular bacteria with insects could lead to the development of novel biopesticides for crop protection. This thesis thus aimed at a better understanding of the molecular basis, evolution and regulation of insect pathogenicity in plant-beneficial pseudomonads. More specifically, it was outlined to investigate the production of an insecticidal toxin termed Fit and to identify additional factors contributing to the entomopathogenicity of the bacteria. In the first part of this work, the regulation of Fit toxin production was probed by epifluorescence microscopy using reporter strains of Pseudomonas protegens CHAO that express a fusion between the insecticidal toxin and a red fluorescent protein in place of the native toxin gene. The bacterium was found to express its insecticidal toxin only in insect hemolymph but not on plant roots or in common laboratory media. The host-dependent activation of Fit toxin production is controlled by three local regulatory proteins. The histidine kinase of this regulatory system, FitF, is essential for the tight control of toxin expression and shares a sensing domain with DctB, a sensor kinase regulating carbon uptake in Proteobacteria. It is therefore likely that shuffling of a ubiquitous sensor domain during the evolution of FitF contributed to host- specific production of the Fit toxin. Findings of this study additionally suggest that host-specific expression of the Fit toxin is mainly achieved by repression in the presence of plant-derived compounds rather than by induction upon perceiving an insect-specific signal molecule. In the second part of this thesis, mutant strains were generated that lack factors previously shown to be important for virulence in prominent pathogens. A screening for attenuation in insect virulence suggested that lipopolysaccharide (LPS) O-antigen and the PhoP-PhoQ two-component regulatory system significantly contribute to virulence of P. protegens CHAO. The genetic basis of O-antigen biosynthesis in plant-beneficial pseudomonads displaying insect pathogenicity was elucidated and revealed extensive differences between lineages due to reduction and horizontal acquisition of gene clusters during the evolution of several strains. Specific 0 side chains of LPS were found to be vital for strain CHAO to successfully infect insects by ingestion or upon injection. Insecticidal pseudomonads with plant-beneficial properties were observed to be naturally resistant to polymyxin B, a model antimicrobial peptide. Protection against this particular antimicrobial compound was dependent on the presence of O-antigen and modification of the lipid A portion of LPS with 4-aminoarabinose. Since cationic antimicrobial peptides play a major role in the immune system of insects, O-antigenic polysaccharides could be important for insecticidal pseudomonads to overcome host defense mechanisms. The PhoP-PhoQ system, which is well-known to control lipid A modifications in several pathogenic bacteria, was identified in Pseudomonas chlororaphis PCL1391 and P. protegens CHAO. No evidence was found so far that lipid A modifications contribute to insect pathogenicity in this bacterium. However, the sensor kinase PhoQ was required for full virulence of strain CHAO suggesting that it additionally regulates the expression of virulence factors in this bacterium. The findings of this thesis demonstrate that certain plant-associated pseudomonads are true insect pathogens and give some insights into how these microbes evolved to survive within and eventually kill the insect host. Results however also point out that more in-depth research is needed to know how exactly these fascinating bacteria manage to bypass or overcome host immune responses and to breach physical barriers to invade insects upon oral infection. To achieve this, future studies should not only focus on the bacterial side of the microbe-host interactions but also investigate the infection from a host-oriented view. The knowledge gained about the entomopathogenicity of plant-beneficial pseudomonads gives hope for their future application in agriculture to protect plants not only against plant diseases but also against insect pests.

Mutations in the heat-shock protein A9 (HSPA9) gene cause the EVEN-PLUS syndrome of congenital malformations and skeletal dysplasia.

We and others have reported mutations in LONP1, a gene coding for a mitochondrial chaperone and protease, as the cause of the human CODAS (cerebral, ocular, dental, auricular and skeletal) syndrome (MIM 600373). Here, we delineate a similar but distinct condition that shares the epiphyseal, vertebral and ocular changes of CODAS but also included severe microtia, nasal hypoplasia, and other malformations, and for which we propose the name of EVEN-PLUS syndrome for epiphyseal, vertebral, ear, nose, plus associated findings. In three individuals from two families, no mutation in LONP1 was found; instead, we found biallelic mutations in HSPA9, the gene that codes for mHSP70/mortalin, another highly conserved mitochondrial chaperone protein essential in mitochondrial protein import, folding, and degradation. The functional relationship between LONP1 and HSPA9 in mitochondrial protein chaperoning and the overlapping phenotypes of CODAS and EVEN-PLUS delineate a family of "mitochondrial chaperonopathies" and point to an unexplored role of mitochondrial chaperones in human embryonic morphogenesis.

Hépatite C: épidémiologie, histoire naturelle et diagnostic [Hepatitis C: epidemiology natural course and diagnosis].

L'infection par le virus de l'hépatite C (HCV) représente une des causes les plus fréquentes d'hépatite chronique, de cirrhose et de carcinome hépatocellulaire au niveau mondial. D'énormes progrès ont été réalisés durant ces 25 dernières années depuis la découverte du HCV, notamment dans la compréhension de la virologie moléculaire, de la pathogenèse et de l'histoire naturelle ainsi que dans la prévention, le diagnostic et le traitement de l'hépatite C. Ces avancées seront résumées dans cet article et discutées à la lumière de nouveaux défis. Hepatitis C virus (HCV) infection represents a major cause of chronic hepatitis, liver cirrhosis and hepatocellular carcinoma worldwide. Great progress in the understanding of the molecular virology, pathogenesis and natural course as well as the prevention, diagnosis and treatment of hepatitis C have been made in over the last 25 years since the discovery of HCV. Here, we review recent advances and discuss them in the light of new challenges.

Tabagisme et système digestif: une relation complexe. Partie 1: Maladies inflammatoires chroniques de l'intestin et consommation de tabac [Smoking and digestive tract: a complex relationship. Part 1: Inflammatory bowel disease and cigarette smoking].

La méconnaissance des maladies rares, définies par une prévalence inférieure à 1/2000, a été à l'origine de situations parfois très invalidantes pour les patients. Les développements de ces dernières années, tant sur le plan de la clinique que de la biologie moléculaire et de la génétique, permettent de jeter un regard neuf sur ces pathologies et d'aborder leur prise en charge en se basant sur une approche multidisciplinaire. L'angiologie n'y fait pas exception et la collaboration entre l'angiologue et les autres spécialistes concernés est essentielle pour une démarche évolutive visant à optimaliser la prise en charge de ces pathologies Little is known about the effects of smoking on inflammatory bowel diseases (IBD). However the co-occurrence of smoking and IBD often happens in ambulatory care. Smokers have a doubled risk of developing a Crohn's disease with a more active disease course. After quitting, a decrease in risk can be observed after only one year. An inverse relationship is found between smoking and ulcerative colitis. Smoking seems protective for the development of the disease and its course is less active among smokers. Smoking cessation transitorily increases the risk of developing ulcerative colitis. Nevertheless, continuing smoking cannot be justified among those patients given the risks of long-term extra-digestive effects. It is thus important to counsel all smokers with an IBD to quit smoking.

Sleep in vitro : Erk pathway regulates sleep duration and sleep related genes

To date, for most biological and physiological phenomena, the scientific community has reach a consensus on their related function, except for sleep, which has an undetermined, albeit mystery, function. To further our understanding of sleep function(s), we first focused on the level of complexity at which sleep-like phenomenon can be observed. This lead to the development of an in vitro model. The second approach was to understand the molecular and cellular pathways regulating sleep and wakefulness, using both our in vitro and in vivo models. The third approach (ongoing) is to look across evolution when sleep or wakefulness appears. (1) To address the question as to whether sleep is a cellular property and how this is linked to the entire brain functioning, we developed a model of sleep in vitro by using dissociated primary cortical cultures. We aimed at simulating the major characteristics of sleep and wakefulness in vitro. We have shown that mature cortical cultures display a spontaneous electrical activity similar to sleep. When these cultures are stimulated by waking neurotransmitters, they show a tonic firing activity, similar to wakefulness, but return spontaneously to the "sleep-like" state 24h after stimulation. We have also shown that transcriptional, electrophysiological, and metabolic correlates of sleep and wakefulness can be reliably detected in dissociated cortical cultures. (2) To further understand at which molecular and cellular levels changes between sleep and wakefulness occur, we have used a pharmacological and systematic gene transcription approach in vitro and discovered a major role played by the Erk pathway. Indeed, pharmacological inhibition of this pathway in living animals decreased sleep by 2 hours per day and consolidated both sleep and wakefulness by reducing their fragmentation. (3) Finally, we tried to evaluate the presence of sleep in one of the most primitive species with a neural network. We set up Hydra as a model organism. We hypothesized that sleep as a cellular (neuronal) property may occur with the appearance of the most primitive nervous system. We were able to show that Hydra have periodic rest phases amounting to up to 5 hours per day. In conclusion, our work established an in vitro model to study sleep, discovered one of the major signaling pathways regulating vigilance states, and strongly suggests that sleep is a cellular property highly conserved at the molecular level during evolution. -- Jusqu'à ce jour, la communauté scientifique s'est mise d'accord sur la fonction d'une majorité des processus physiologiques, excepté pour le sommeil. En effet, la fonction du sommeil reste un mystère, et aucun consensus n'est atteint le concernant. Pour mieux comprendre la ou les fonctions du sommeil, (1) nous nous sommes d'abord concentré sur le niveau de complexité auquel un état ressemblant au sommeil peut être observé. Nous avons ainsi développé un modèle du sommeil in vitro, (2) nous avons disséqué les mécanismes moléculaires et cellulaires qui pourraient réguler le sommeil, (3) nous avons cherché à savoir si un état de sommeil peut être trouvé dans l'hydre, l'animal le plus primitif avec un système nerveux. (1) Pour répondre à la question de savoir à quel niveau de complexité apparaît un état de sommeil ou d'éveil, nous avons développé un modèle du sommeil, en utilisant des cellules dissociées de cortex. Nous avons essayé de reproduire les corrélats du sommeil et de l'éveil in vitro. Pour ce faire, nous avons développé des cultures qui montrent les signes électrophysiologiques du sommeil, puis quand stimulées chimiquement passent à un état proche de l'éveil et retournent dans un état de sommeil 24 heures après la stimulation. Notre modèle n'est pas parfait, mais nous avons montré que nous pouvions obtenir les corrélats électrophysiologiques, transcriptionnels et métaboliques du sommeil dans des cellules corticales dissociées. (2) Pour mieux comprendre ce qui se passe au niveau moléculaire et cellulaire durant les différents états de vigilance, nous avons utilisé ce modèle in vitro pour disséquer les différentes voies de signalisation moléculaire. Nous avons donc bloqué pharmacologiquement les voies majeures. Nous avons mis en évidence la voie Erkl/2 qui joue un rôle majeur dans la régulation du sommeil et dans la transcription des gènes qui corrèlent avec le cycle veille-sommeil. En effet, l'inhibition pharmacologique de cette voie chez la souris diminue de 2 heures la quantité du sommeil journalier et consolide l'éveil et le sommeil en diminuant leur fragmentation. (3) Finalement, nous avons cherché la présence du sommeil chez l'Hydre. Pour cela, nous avons étudié le comportement de l'Hydre pendant 24-48h et montrons que des périodes d'inactivité, semblable au sommeil, sont présentes dans cette espèce primitive. L'ensemble de ces travaux indique que le sommeil est une propriété cellulaire, présent chez tout animal avec un système nerveux et régulé par une voie de signalisation phylogénétiquement conservée.

Identification of novel factors during the establishment of the Casparian strip in the endodermis

Multicellular organisms rely on specialized tissues that allow for the controlled exchange of matter with their surrounding. In order to function properly, these tissues need to establish a tight connection between the individual cells to prevent uncontrolled passive diffusion across the extracellular space. In animals, these connections are called tight and adherens junctions and are a critical feature of epithelia. These connections, however, rely on direct protein-protein interaction of plasma membrane proteins of adjacent cells. Such a mechanism is not possible in plants due to the cell wall, which encases the individual cells. In order to absorb nutrients, while simultaneously preventing uncontrolled diffusion between cells, land plants have evolved the root endodermis, which is functionally equivalent to animal epithelia. Its cells are surrounded by a precisely localized and aligned, ring-like lignin deposition, called the Casparian strip, and therefore tightly connected between each other. Very little was known about the development of the endodermis and the Casparian strip until recently. In the meantime, however, we have identified a family of endodermis- specific proteins, the CASPs, which recruits extracellular proteins the specific Casparian strip membrane domain (CSD) to locally synthesize lignin in the cell wall. Yet, we hardly knew any specifics on how the CSD is initially defined and how the critically important CASPs are being recruited to it. We therefore conducted a forward genetic screen on the localization of CASPI-GFP in order to identify novel mutants, which lack a defined CSD. We identified 48 mutants, which fell into 15 different complementation groups. While some of the isolated genes had previously been identified through different approaches, nine novel genes, which had never been implicated in CSD development and maintenance, were identified. One of them, LORD OF THE RINGS 2 (.LOTR2) is described to greater detail in this work. LOTR2 encodes for EX070A1, a protein of the evolutionary conserved exocyst complex. This complex has frequently been implicated in various secretory processes across kingdoms. In Arabidopsis, it transiently defines the positioning of CASPI-GFP. We have performed a detailed analysis of the dynamics of EX070A1 and CASPI-GFP, including studies with other markers and propose a mechanism, by which the cytosolic EX070A1 transiently defines a plasma membrane domain to recruit transmembrane proteins, which then recruit extracellular enzymes for localized cell wall modification. Considering the ubiquitous expression of EX070A1, we think that this mechanism is potentially of importance not only for the endodermis and the Casparian strip but also for many other tissues, in which the cell wall becomes locally modified. In fact, many other tissues with secondary cell wall modifications contain proteins very similar to the CASPs. It will be interesting to see to which degree this mechanism is employed in other tissues. As for the endodermis, we have now identified the first gene, which is not specific to the endodermis but shows endodermis-specific dynamics. This might give us a better insight on how the plant modulates this ubiquitously present factor in a cell- or tissue-type specific manner. Considering the knowledge, mutants and tools, which are available to us for investigating the endodermis, the Casparian strip, the exocyst complex and EX070A1 might be just the right experimental system to address these questions. -- Les organismes multicellulaires dépendent des tissues spécialisé pour l'échange contrôlé entre eux et leur environnement. Pour leur bon fonctionnement, les cellules de ces tissus ont besoin d'être très étroitement assemblés afin de prévenir la diffusion non-contrôlée à travers l'espace extracellulaire. Chez les animaux, ces connexions sont appelées jonctions serrées et jonctions adhérentes. Ces jonctions dépendent des interactions directes entre les protéines des cellules voisines. Ceci n'est pas possible chez les plantes à cause de la paroi cellulaire qui recouvre chaque cellule individuellement. Pour absorber les nutriments et en même temps empêcher la diffusion non-contrôlé entre cellules, les plantes ont évolué 1'endoderme dans la racine, qui est fonctionnellement équivalent aux épithéliums des animaux. Les cellules de l'endoderme sont ceinturées par une déposition de lignine très précisément localisées comme un anneau et alignées entre les cellules, et qui, donc, connecte étroitement les cellules avoisinante: Le cadre de Caspary. Peu était connu sur le développement de l'endoderme et le cadre de Caspaiy jusqu'à il y a quelques années. Récemment, pourtant, nous avons identifié une famille de protéines spécifiques à l'endoderme, les CASPs, qui définissent le domaine membranaire du cadre de Caspaiy (CSD). Les CASPs recrutent les protéines extracellulaires nécessaire à la synthèse du cadre de Caspary vers une région limité dans la paroi cellulaire. Pourtant, on connaît très peu les processus spécifiques concernant la définition initiale du CSD et comment les CASPs, qui ont une importance cruciale, sont recrutées vers ce domaine. Par conséquent nous avons mené un crible génétique sur la localisation du CASPI- GFP, qui sert comme marqueur pour le CSD. Notre but étant d'isoler de nouveaux mutants affectés dans l'établissement du CSD. Nous avons identifié 48 mutants, en 15 groupes de complémentation. Bien que certains des gènes isolés étaient déjà impliqué dans la formation du cadre de Caspary, neuf nouveaux gènes n'ayant jamais été impliqués dans le développement ou la maintenance du CSD ont pu être identifiés. Un de ces gènes, LORD OF THE RINGS2 (LOTR2) sera décrit plus en détail dans cette étude. LOTR2 code pour EX070A1, qui est une protéine, du complexe exocyste. Ce complexe de protéines a très bien été conservé au cours de l'évolution. Il était souvent impliqué dans plusieurs processus de sécrétion dans toutes les branches de la vie. Chez Arabidopsis, EX070A1 définit la position du CSD d'une façon transitoire et recrute CASP1- GFP. Nous avons mené une analyse détaillée des dynamiques d'EX070Al et CASPI-GFP ainsi que, des études avec des autres mutants. Nous proposons un mécanisme, d'après lequel EX070A1, recruté du cytosol, définit un domaine dans la membrane plasmique pour localiser des protéines transmembranaires, ces dernières ensuite recruteront des enzymes extracellulaires pour la modification locale de la paroi cellulaire. Vu qu'EX070A1 est exprimé dans toute dans la plante, nous pensons que ce mécanisme est potentiellement important non seulement pour l'endoderme et le cadre de Caspary, mais aussi pour les autres tissus où la paroi cellulaire doit être localement modifiée. En effet, plusieurs autres tissus contiennent des protéines très similaires aux CASPs. Il serait intéressant de voir à quelle dégrée ce mécanisme est également utilisé dans ces tissues. En ce qui concerne l'endoderme, nous avons maintenant identifié le premier gène qui n'est pas exprimé spécifiquement dans l'endoderme, mais qui montre tout de même une dynamique caractéristique dans ce tissu. Il serait intéressant de voir comment la plante peut moduler ce facteur omniprésent d'une façon spécifique. Vu les connaissances, les mutants et les outils qu'on a maintenant à notre disposition, l'endoderme et son cadre de Caspary, le complexe exocyste et EX070A1 sont probablement des bons systèmes expérimentaux pour étudier ces questions. -- Identification des nouveaux facteurs pendant l'établissement du cadre de Caspary dans l'endoderme. Lothar Kalmbach, Département de Biologie Moléculaire Végétale (DBMV), Université de Lausanne. Comme tous les autres organismes multicellulaires, les plantes terrestres dépendent de tissus spécialisés pour l'échange contrôlé avec leur environnement. Ces tissus sont importants pour l'absorption des nutriments mais également pour éviter l'influx de composés toxiques. Chez les plantes, ce tissu se trouve dans la racine. C'est l'endoderme. Grâce au cadre de Caspary, qui permet une forte connexion entre les cellules au niveau de leur paroi, l'endoderme empêche les éléments toxiques d'entrer dans le système vasculaire. Depuis quelques années, nous comprenons de plus en plus la nature et la biosynthèse, ainsi que les protéines impliquées dans l'ancrage des enzymes à la membrane plasmique. Nous n'avons eu, par contre, aucune idée sur le mécanisme qui d'abord définit cet endroit dans la membrane plasmique. Nous avons mené un crible génétique sur la localisation de CASPI-GFP, une protéine, qui recrute les enzymes extracellulaires pour la synthèse du cadre de Caspary. Nous avons identifié plusieurs nouveaux gènes qui sont impliqués dans l'intégrité du cadre de Caspary. L'un de ces gènes est EX070A1, qui est un facteur ayant un rôle important lors de la sécrétion des protéines dans tous les organismes eukaryotes. Ces mutants sont gravement affectés au niveau du cadre de Caspary, mais surtout ils ne sont plus capables de localiser CASPI-GFP. Nous avons suivi la dynamique d'EX070Al et de CASP1-GFP en combinaison avec d'autres marqueurs. Nous avons pu montrer que l'accumulation d'EX070Al est spécifique pour l'endoderme et essentielle pour bien localiser CASPI-GFP et donc, le cadre de Caspary. Ces résultats nous aident à mieux comprendre le développement de l'endoderme mais peuvent potentiellement aussi être utilisés pour étudier les modifications de la paroi cellulaire dans d'autres cellules de la plante.

Impact of T cell receptor affinity on the molecular mechanisms modulating CD8 T cell signalling and function against NY-ESO-1 tumour antigen

It is well established that cytotoxic T lymphocytes play a pivotal role in the protection against intracellular pathogens and tumour cells. Such protective immune responses rely on the specific T cell receptor (TCR)-mediated recognition by CD8 T cells of small antigenic peptides presented in the context of class-I Major Histocompatibility Complex molecules (pMHCs) on the surface of infected or malignant cells. The strength (affinity/avidity) of this interaction is a major correlate of protection. Although tumour-reactive CD8 T cells can be observed in cancer patients, anti-tumour immune responses are often ineffective in controlling or eradicating the disease due to the relative low TCR affinity of these cells. To overcome this limitation, tumour-specific CD8 T cells can be genetically modified to express TCRs of improved binding strength against a defined tumour antigen before adoptive cell transfer into cancer patients. We previously generated a panel of TCRs specific for the cancer-testis antigen NY-ESO-l,57.165 with progressively increased affinities for the pMHC complex, thus providing us with a unique tool to investigate the causal link between the surface expression of such TCRs and T cell activation and function. We recently demonstrated that anti-tumour CD8 T cell reactivity could only be improved within physiological affinity limits, beyond which drastic functional declines were observed, suggesting the presence of multiple regulatory mechanisms limiting T cell activation and function in a TCR affinity-dependent manner. The overarching goal of this thesis was (i) to assess the precise impact of TCR affinity on T cell activation and signalling at the molecular level and (ii) to gain further insights on the mechanisms that regulate and delimitate maximal/optimized CD8 T cell activation and signalling. Specifically, by combining several technical approaches we characterized the activation status of proximal (i.e. CD3Ç, Lek, and ZAP-70) and distal (i.e. ERK1/2) signalling molecules along the TCR affinity gradient. Moreover, we assessed the extent of TCR downmodulation, a critical step for initial T cell activation. CD8 T cells engineered with the optimal TCR affinity variants showed increased activation levels of both proximal and distal signalling molecules when compared to the wild-type T cells. Our analyses also highlighted the "paradoxical" status of tumour-reactive CD8 T cells bearing very high TCR affinities, which retained strong proximal signalling capacity and TCR downmodulation, but were unable to propagate signalling distally (i.e. pERKl/2), resulting in impaired cell-mediated functions. Importantly, these very high affinity T cells displayed maximal levels of SHP-1 and SHP-2 phosphatases, two negative regulatory molecules, and this correlated with a partial pERKl/2 signalling recovery upon pharmacological SHP-l/SHP-2 inhibition. These findings revealed the putative presence of inhibitory regulators of the TCR signalling cascade acting very rapidly following tumour-specific stimulation. Moreover, the very high affinity T cells were only able to transiently express enhanced proximal signalling molecules, suggesting the presence of an additional level of regulation that operates through the activation of negative feedback loops over time, limiting the duration of the TCR-mediated signalling. Overall, the determination of TCR-pMHC binding parameters eliciting optimal CD8 T cell activation, signalling, and effector function while guaranteeing high antigen specificity, together with the identification of critical regulatory mechanisms acting proximally in the TCR signalling cascade, will directly contribute to optimize and support the development of future TCR-based adoptive T cell strategies for the treatment of malignant diseases. -- Les lymphocytes T CD8 cytotoxiques jouent un rôle prédominant dans la protection contre les pathogènes intracellulaires et les cellules tumorales. Ces réponses immunitaires dépendent de la spécificité avec laquelle les récepteurs T (TCR) des lymphocytes CD8 reconnaissent les peptides antigéniques présentés par les molécules du complexe Majeur de Histocompatibilité de classe I (pCMH) à la surface des cellules infectées ou malignes. La force (ou affinité/avidité) de l'interaction du TCR-pCMH est un corrélat majeur de protection. Les réponses immunitaires sont cependant souvent inefficaces et ne permettent pas de contrôler ou d'éliminer les cellules tumorales chez les patients atteint du cancer, et ce à cause de la relative faible reconnaissance des TCRs exprimés par les lymphocytes T CD8 envers les antigènes tumoraux. Afin de surmonter cette limitation, les cellules T anti-tumorales peuvent être génétiquement modifiées en les dotant de TCRs préalablement optimisés afin d'augmenter leur reconnaissance ou affinité contre les antigènes tumoraux, avant leur ré¬infusion dans le patient. Nous avons récemment généré des cellules T CD8 exprimant un panel de TCRs spécifiques pour l'antigène tumoral NY-ESO-l157.16J avec des affinités croissantes, permettant ainsi d'investiguer la causalité directe entre l'affinité du TCR-pCMH et la fonction des cellules T CD8. Nous avons démontré que la réactivité anti-tumorale pouvait être améliorée en augmentant l'affinité du TCR dans une intervalle physiologique, mais au delà duquel nous observons un important déclin fonctionnel. Ces résultats suggèrent la présence de mécanismes de régulation limitant l'activation des cellules T de manière dépendante de l'affinité du TCR. Le but de cette thèse a été (i) de définir l'impact précis de l'affinité du TCR sur l'activation et la signalisation des cellules T CD8 au niveau moléculaire et (ii) d'acquérir de nouvelles connaissances sur les mécanismes qui régulent et délimitent l'activation et la signalisation maximale des cellules T CD8 optimisées. Spécifiquement, en combinant plusieurs approches technologiques, nous avons caractérisé l'état d'activation de différentes protéines de la voie de signalisation proximale (CD3Ç, Lek et ZAP-70) et distale (ERK1/2) le long du gradient d'affinité du TCR, ainsi que l'internalisation du TCR, une étape clef dans l'activation initiale des cellules T. Les lymphocytes T CD8 exprimant des TCRs d'affinité optimale ont montré des niveaux d'activation augmentés des molécules proximales et distales par rapport aux cellules de type sauvage (wild-type). Nos analyses ont également mis en évidence un paradoxe chez les cellules T CD8 équipées avec des TCRs de très haute affinité. En effet, ces cellules anti-tumorales sont capables d'activer leurs circuits biochimiques au niveau proximal et d'internaliser efficacement leur TCR, mais ne parviennent pas à propager les signaux biochimiques dépendants du TCR jusqu'au niveau distal (via phospho-ERKl/2), avec pour conséquence une limitation de leur capacité fonctionnelle. Finalement, nous avons démontré que SHP-1 et SHP-2, deux phosphatases avec des propriétés régulatrices négatives, étaient majoritairement exprimées dans les cellules T CD8 de très hautes affinités. Une récupération partielle des niveaux d'activation de ERK1/2 a pu être observée après l'inhibition pharmacologique de ces phosphatases. Ces découvertes révèlent la présence de régulateurs moléculaires qui inhibent le complexe de signalisation du TCR très rapidement après la stimulation anti-tumorale. De plus, les cellules T de très hautes affinités ne sont capables d'activer les molécules de la cascade de signalisation proximale que de manière transitoire, suggérant ainsi un second niveau de régulation via l'activation de mécanismes de rétroaction prenant place progressivement au cours du temps et limitant la durée de la signalisation dépendante du TCR. En résumé, la détermination des paramètres impliqués dans l'interaction du TCR-pCMH permettant l'activation de voies de signalisation et des fonctions effectrices optimales ainsi que l'identification des mécanismes de régulation au niveau proximal de la cascade de signalisation du TCR contribuent directement à l'optimisation et au développement de stratégies anti-tumorales basées sur l'ingénierie des TCRs pour le traitement des maladies malignes.

The role of raptor in cell death

Selon les statistiques, les maladies cancéreuses sont en augmentation dans les pays en développement ainsi que dans les pays industrialisés. Ceci peut s'expliquer largement par les habitudes alimentaires, le tabagisme, les infections, le manque d'activité physique, la pollution et le stress, entre autres. Ainsi, l'Organisation Mondiale de la Santé (OMS) prévoit une augmentation de la fréquence des cancers avec 15 millions de nouveaux cas par an en 2020. La transformation d'une cellule normale en une cellule cancéreuse se déroule en plusieurs étapes avec, au niveau moléculaire, différentes mutations ciblant des protéines régulant la croissance cellulaire. Un des exemples de protéines qui participent au contrôle des voies cellulaires impliquées lors de la prolifération des cellules sont les complexes de protéines mTORCl et mTORC2 (« mammalian target of rapamycin complex 1 and 2 »). Ces complexes mTORCl et mTORC2 activent des processus anaboliques (la synthèse de protéines et de lipides, le métabolisme énergétique, entre autres) et inhibent en même temps des voies de catabolismes cellulaires (autophagie et synthèse de lysosomes). Ils sont souvent mutés dans de nombreux cas de cancers, c'est pourquoi ils sont la cible de nombreux traitements anti-cancéreux. Pour ces raisons, nous nous sommes intéressés aux mécanismes d'actions moléculaires des drogues qui ciblent les complexes mTORCl et mTORC2. Nous avons ainsi découvert qu'une molécule présente uniquement dans le complexe mTORCl, raptor, était clivée en un fragment plus petit lors du traitement de cellules cancéreuses avec des drogues. Des molécules activées durant la mort cellulaire programmée par apoptose, les caspases, se sont révélées responsables du clivage de raptor. Nous avons ensuite décrit de façon précise les sites de clivage de raptor par les caspases durant la mort cellulaire. Il s'est avéré que le clivage de raptor affaiblissait son interaction avec mTOR au sein du complexe mTORCl, ce qui participe à l'inactivation de mTORCl lors de traitements avec des molécules anti-cancéreuses. Ces résultats nous ont permis de mieux comprendre les mécanismes d'actions de différentes drogues anti-cancéreuses au niveau du complexe mTORCl, ce qui peut être utile pour la synthèse de nouvelles molécules ciblant mTORCl ainsi que pour lutter contre les mécanismes de résistance chimiothérapeutiques. -- La protéine « mammalian target of rapamycin » (mTOR) est une sérine/thréonine kinase qui est hautement conservée des protistes à l'être humain. Deux complexes mTOR existent : le complexe 1 mTOR (mTORCl) et le complexe 2 mTOR (mTORC2). Ils régulent positivement des processus anaboliques (synthèse de protéines et de lipides, le métabolisme énergétique, l'organisation du cytosquelette, la survie cellulaire) et négativement des voies cataboliques (autophagic, biogenèse de lysosomes). Les complexes mTORCl et mTORC2 sont sensibles aux signaux mitogéniques tels que les acides aminés, le glucose, les facteurs de croissance, l'état énergétique (ATP) et les niveaux d'oxygène et induisent des voies de croissance cellulaire essentielles. La voie cellulaire regulée par mTORCl peut être hyperactivée dans de nombreux cancers humains. Puisque plusieurs voies cellulaires convergent et régulent les complexes mTORCl et mTORC2, des mutations dans les kinases en amont peuvent mener à une dérégulation de l'activation de mTOR. Des stratégies thérapeutiques ont été développées pour cibler les complexes mTORCl et mTORC2, ainsi que les kinases en amont qui régulent mTOR. Plusieurs drogues ciblant mTORCl, telles que la rapamycine et la curcumine, affectent l'interaction entre mTOR et un composant spécifique de mTORCl, raptor. Dans cette étude, nous nous sommes intéressés aux mécanismes moléculaires des drogues qui ciblent mTORCl, ainsi que leur effet déstabilisant sur l'interaction entre mTOR et raptor dans des lignées cellulaires de lymphomes. Nous avons démontré que raptor était clivé en un fragment de lOOkDa après traitement avec la rapamycine, la curcumine, l'étoposide, la cisplatine, la staurosporine et le ligand Fas (FasL). Etant donné que ces drogues ont été décrites comme induisant I'apoptose, l'utilisation d'un inhibiteur de caspases (z- VAD-fmk) a révélé que le clivage de raptor, lors de la mort cellulaire, était dépendant des caspases. Des essais caspases in vitro ont permis d'identifier la caspase-6 (ainsi que probablement d'autres caspases) comme étant une protéase impliquée dans le clivage de raptor. La séquence protéique de raptor a montré potentiellement plusieurs sites de clivage de caspases aux extrémités amino-terminale et carboxy-terminale. La mutagénèse a permis d'identifier les sites de clivages de raptor par les caspases comme étant DEAD LTD (acides aminés 17-23) et DDADD (acides aminés 939¬943). De plus, le clivage de raptor corrèle avec l'inhibition de l'activité de mTORCl envers ces substrats (S6K et 4E-BP1). Nous avons aussi observé que le clivage de raptor affaiblissait l'interaction entre mTOR et raptor, ce qui indique que ce clivage est une étape critique dans l'inhibition de mTORCl durant I'apoptose. Pour terminer, la mutagénèse du site de clivage de raptor DDADD a montré une résistance à la mort cellulaire de cellules cancéreuses. Notre travail de recherche a révélé un nouveau mécanisme moléculaire qui module l'organisation et l'activité de mTORCl, ce qui peut être d'un grand intérêt pour les recherches dans le domaine de mTOR ainsi que pour la découverte de molécules ciblant mTORCl. -- The mammalian target of rapamycin (mTOR) is a serine/threonine protein kinase, which is highly conserved from yeast to humans. Two different mTOR complexes exist: the mTOR complex 1 (mTORCl) and the mTOR complex 2 (mTORC2). They positively regulate anabolic processes (protein and lipid synthesis, energy metabolism, cytoskeleton organization, cell survival) and negatively regulate catabolic pathways (autophagy, lysosome biogenesis). The mTORCl and mTORC2 respond to mitogenic stimuli such as amino acids, glucose, growth factors, energy levels (ATP) and oxygen levels and drive essential cellular growth pathways. The mTORCl pathway can be found hyperactivated in numerous human cancers. As various cellular pathways converge and regulate mTORCl and mTORC2, mutations in upstream protein kinases can lead to a deregulated mTOR activation. Different therapeutic strategies have been developped to target mTORCl, mTORC2, as well as upstream protein kinases regulating mTOR pathways. Various drugs targeting mTORCl, such as rapamycin and curcumin, affect the interaction between mTOR and a specific mTORCl component, raptor. In this study, we investigated the molecular mechanisms of drugs targeting mTORCl, as well as their destabilizing effect on the mTOR-raptor interaction in lymphoma cell lines. We demonstrated that raptor was processed into a lOOkDa fragment after treatment with rapamycin, curcumin, etoposide, cisplatin, staurosporine and FasL. As these drugs were reported to induce apoptosis, the use of a pan-caspase inhibitor (z-VAD-fmk) revealed that the cleavage of raptor under cell death was caspase-dependent. In vitro caspase assays were performed to identify caspases-6 (and probably other caspases) as an important cysteine protease implicated in the cleavage of raptor. Analysis of raptor protein sequence showed several putative caspase-specific cleavage sites at the N-terminal and the C-terminal ends. Mutagenesis studies allowed us to identify the DEADLTD (amino acids 17-23) and the DDADD (amino acids 939-943) as the caspase-dependent cleavage residues of raptor. Furthermore, the cleavage of raptor correlated with inhibition of mTORCl activity towards its specific targets (4E-BP1 and S6K). We also highlighted that raptor processing weakened the interaction between mTOR and raptor, indicating that raptor cleavage is a critical step in the mTORCl inhibition process during apoptosis. Finally, mutagenesis of raptor C-terminal cleavage site (DDADD) conferred resistance to the chemotherapeutic-mediated cell death cascade of cancer cell. Our research work highlighted a new molecular mechanism modulating mTORCl organization and activity, which can be of great interest in the mTOR field research and for designing drugs trageting mTORCl.

Mechanisms of protein homeostasis in health, aging and disease.

When emerging from the ribosomes, new polypeptides need to fold properly, eventually translocate, and then assemble into stable, yet functionally flexible complexes. During their lifetime, native proteins are often exposed to stresses that can partially unfold and convert them into stably misfolded and aggregated species, which can in turn cause cellular damage and propagate to other cells. In animal cells, especially in aged neurons, toxic aggregates may accumulate, induce cell death and lead to tissue degeneration via different mechanisms, such as apoptosis as in Parkinson's and Alzheimer's diseases and aging in general. The main cellular mechanisms effectively controlling protein homeostasis in youth and healthy adulthood are: (1) the molecular chaperones, acting as aggregate unfolding and refolding enzymes, (2) the chaperone-gated proteases, acting as aggregate unfolding and degrading enzymes, (3) the aggresomes, acting as aggregate compacting machineries, and (4) the autophagosomes, acting as aggregate degrading organelles. For unclear reasons, these cellular defences become gradually incapacitated with age, leading to the onset of degenerative diseases. Understanding these mechanisms and the reasons for their incapacitation in late adulthood is key to the design of new therapies against the progression of aging, degenerative diseases and cancers.

Identification des dermatophytes en cultures sur la base de leurs critères macroscopiques et microscopiques

Contexte : Les dermatophytes sont des champignons filamenteux parasites spécialisés qui dégradent les tissus kératinisés. Ils sont responsables de la plupart des mycoses de la peau, du cuir chevelu et des cheveux, et des ongles. Le choix du traitement des dermatophytoses dépend des symptômes et du dermatophyte incriminé parmi une quinzaine d'espèces possibles. L'identification des dermatophytes se fait en général sur la base des caractères macroscopiques et microscopiques des cultures. L'identification est parfois difficile ou reste incertaine car il peut y avoir des variations d'un isolat à l'autre au sein d'une même espèce. Cependant, les espèces sont facilement identifiées sur la base de séquences d'ADN. En pratique, des séquences d'ADN ribosomique suffisamment polymorphes sont le plus souvent utilisées pour discriminer les espèces de dermatophytes. Des méthodes spécialisées et sophistiquées telles que les séquences d'ADN et la spectrométrie de masse sont de plus en plus proposées dans la littérature pour identifier les dermatophytes. Toutefois, ces méthodes ne peuvent pas être utilisées directement par un médecin dans un cabinet médical. C'est pourquoi des méthodes plus simples basées sur l'observation de caractères phénotypiques des champignons en culture ne devraient pas être abandonnées. Objectif : Etablir une clé d'identification dichotomique se basant sur des caractères macroscopiques et microscopiques permettant une identification fiable du dermatophyte par la culture. Des clés d'identification des espèces seront élaborées et testées pour leur validation en parallèle avec leur identification par des méthodes de Biologie Moléculaire. Créer un outil simple qui pourra être utilisé au laboratoire par des médecins ou des biologistes non spécialisés en mycologie pour identifier les dermatophytes sans avoir recours à une technologie sophistiquée. Méthodes : Inventaire des espèces isolées de 2001 à 2012 au laboratoire de dermatologie du CHUV. Inventaire des caractères phénotypiques permettant de caractériser chaque espèce. Création d'un système dichotomique sur la base des caractères phénotypiques pour séparer et identifier les espèces (clé d'identification des espèces). Résultats attendus : Les résultats attendus sont définis au niveau des objectifs. L'outil doit être accessible pour des personnes inexpérimentées qui pourront alors identifier les dermatophytes. Plus-value : Les dermatophytoses sont fréquemment diagnostiquées. Cet outil est destiné à tous les dermatologues installés et au personnel de laboratoire qui ne sont pas nécessairement spécialisés en la matière.

Molecular analysis of NOTCH2 in patients with primary open-angle glaucoma

Le glaucome est la seconde cause de cécité dans le monde après la cataracte et est caractérisé par la perte progressive de cellules ganglionnaires de la rétine allant vers la dégénérescence du nerf optique. On distingue deux formes de glaucome; le glaucome à angle fermé et le glaucome à angle ouvert. L'hérédité du glaucome est souvent sporadique, parfois autosomique dominante. Une pression intraoculaire de plus de 21 mmHg représente un facteur de risque important pour son développement. Actuellement, la mutation la plus fréquente, observée dans 5% des cas de glaucome héréditaire, est retrouvée dans le gène MYOC (trabecular meshwork inducible glucocorticoide response). À ce jour, les causes et mécanismes moléculaires sous-jacent ne sont que partiellement compris. Récemment, il a été démontré qu'une souris transgénique exprimant le gène Notch2 dans luvée, développait un glaucome. Pour cette raison, nous avons analysé le gène NOTCH2 chez l'homme afin de déterminer s'il était impliqué. NOTCH2 est composé de 34 exons sur le chromosome 1 et code une protéine transmembranaire essentielle à la prolifération, l'apoptose, la différenciation cellulaire et le destin cellulaires. L'expression du gène est localisée dans le segment antérieur de l'oeil, le segment externe du corps ciliaire et le trabéculum. Les fonctions principales de ces deux tissus sont la production et le drainage de l'humeur aqueuse. Pour mémoire, une perturbation du flux peut générer une augmentation de la pression intraoculaire. Le but de cette étude était de rechercher d'éventuelles mutations du gène NOTCH2 chez des patients souffrant de glaucome. 130 patients ont été vu à l'hôpital ophtalmique Jules- Gonin et un échantillon d'ADN a été récolté afin d'identifier l'origine moléculaire de leur pathologie. L'analyse moléculaire s'est fait étape par étape. Premièrement, j'ai séquencé l'exon 3 du gène MYOC. Deuxièment, la Chromatographie en phase liquide à haute performance a été utilisée pour l'analyse des 34 exons du gène NOTCH2. Troisièment, tous les exons présentant une courbe suspecte au chromatogramme ont été séquencés selon la méthode de Sanger. Dans la première partie de l'étude, j'ai analysé l'exon 3 du gène MYOC afin de déterminer les éventuels porteurs d'une mutation dominante. Aucune mutation pathogénique n'a été mis en évidence mais 4 patients sur les 130 étaient porteurs d'un variant connu et fréquent. Dans la deuxième partie de mon étude, j'ai analysé les 34 exons du gène NOTCH2, qui n'ont révélé aucune mutation. Bien que les méthodes utilisées dans cette étude montrent quelques limitations, il est peu probable que des mutations dans les régions codantes de NOTCH2 soient un facteur de risque important dans le glaucome primaire à angle ouvert.

Functional EF-hands in neuronal calcium sensor GCAP2 determine its phosphorylation state and subcellular distribution in vivo, and are essential for photoreceptor cell integrity

The neuronal calcium sensor proteins GCAPs (guanylate cyclase activating proteins) switch between Ca2+-free and Ca2+-bound conformational states and confer calcium sensitivity to guanylate cyclase at retinal photoreceptor cells. They play a fundamental role in light adaptation by coupling the rate of cGMP synthesis to the intracellular concentration of calcium. Mutations in GCAPs lead to blindness. The importance of functional EF-hands in GCAP1 for photoreceptor cell integrity has been well established. Mutations in GCAP1 that diminish its Ca2+ binding affinity lead to cell damage by causing unabated cGMP synthesis and accumulation of toxic levels of free cGMP and Ca2+. We here investigate the relevance of GCAP2 functional EF-hands for photoreceptor cell integrity. By characterizing transgenic mice expressing a mutant form of GCAP2 with all EF-hands inactivated (EF(-)GCAP2), we show that GCAP2 locked in its Ca2+-free conformation leads to a rapid retinal degeneration that is not due to unabated cGMP synthesis. We unveil that when locked in its Ca2+-free conformation in vivo, GCAP2 is phosphorylated at Ser201 and results in phospho-dependent binding to the chaperone 14-3-3 and retention at the inner segment and proximal cell compartments. Accumulation of phosphorylated EF(-)GCAP2 at the inner segment results in severe toxicity. We show that in wildtype mice under physiological conditions, 50% of GCAP2 is phosphorylated correlating with the 50% of the protein being retained at the inner segment. Raising mice under constant light exposure, however, drastically increases the retention of GCAP2 in its Ca2+-free form at the inner segment. This study identifies a new mechanism governing GCAP2 subcellular distribution in vivo, closely related to disease. It also identifies a pathway by which a sustained reduction in intracellular free Ca2+ could result in photoreceptor damage, relevant for light damage and for those genetic disorders resulting in 'equivalent-light'' scenarios.

Choosing the target loci : heat shock factors HSF1 and HSF2 as regulators of cell stress and development

Heat shock factors (HSFs) are an evolutionarily well conserved family of transcription factors that coordinate stress-induced gene expression and direct versatile physiological processes in eukaryote organisms. The essentiality of HSFs for cellular homeostasis has been well demonstrated, mainly through HSF1-induced transcription of heat shock protein (HSP) genes. HSFs are important regulators of many fundamental processes such as gametogenesis, metabolic control and aging, and are involved in pathological conditions including cancer progression and neurodegenerative diseases. In each of the HSF-mediated processes, however, the detailed mechanisms of HSF family members and their complete set of target genes have remained unknown. Recently, rapid advances in chromatin studies have enabled genome-wide characterization of protein binding sites in a high resolution and in an unbiased manner. In this PhD thesis, these novel methods that base on chromatin immunoprecipitation (ChIP) are utilized and the genome-wide target loci for HSF1 and HSF2 are identified in cellular stress responses and in developmental processes. The thesis and its original publications characterize the individual and shared target genes of HSF1 and HSF2, describe HSF1 as a potent transactivator, and discover HSF2 as an epigenetic regulator that coordinates gene expression throughout the cell cycle progression. In male gametogenesis, novel physiological functions for HSF1 and HSF2 are revealed and HSFs are demonstrated to control the expression of X- and Y-chromosomal multicopy genes in a silenced chromatin environment. In stressed human cells, HSF1 and HSF2 are shown to coordinate the expression of a wide variety of genes including genes for chaperone machinery, ubiquitin, regulators of cell cycle progression and signaling. These results highlight the importance of cell type and cell cycle phase in transcriptional responses, reveal the myriad of processes that are adjusted in a stressed cell and describe novel mechanisms that maintain transcriptional memory in mitotic cell division.

Desmin: molecular interactions and putative functions of the muscle intermediate filament protein

Desmin is the intermediate filament (IF) protein occurring exclusively in muscle and endothelial cells. There are other IF proteins in muscle such as nestin, peripherin, and vimentin, besides the ubiquitous lamins, but they are not unique to muscle. Desmin was purified in 1977, the desmin gene was characterized in 1989, and knock-out animals were generated in 1996. Several isoforms have been described. Desmin IFs are present throughout smooth, cardiac and skeletal muscle cells, but can be more concentrated in some particular structures, such as dense bodies, around the nuclei, around the Z-line or in costameres. Desmin is up-regulated in muscle-derived cellular adaptations, including conductive fibers in the heart, electric organs, some myopathies, and experimental treatments with drugs that induce muscle degeneration, like phorbol esters. Many molecules have been reported to associate with desmin, such as other IF proteins (including members of the membrane dystroglycan complex), nebulin, the actin and tubulin binding protein plectin, the molecular motor dynein, the gene regulatory protein MyoD, DNA, the chaperone alphaB-crystallin, and proteases such as calpain and caspase. Desmin has an important medical role, since it is used as a marker of tumors' origin. More recently, several myopathies have been described, with accumulation of desmin deposits. Yet, after almost 30 years since its identification, the function of desmin is still unclear. Suggested functions include myofibrillogenesis, mechanical support for the muscle, mitochondrial localization, gene expression regulation, and intracellular signaling. This review focuses on the biochemical interactions of desmin, with a discussion of its putative functions.