La réponse au Farnésol de Candida albicans : production de biofilms et Parenté génétique

C. albicans est une levure pathogène opportuniste. Elle est un agent causal fréquent des infections muco-cutanées. C. albicans peut alterner entre la forme blastospore et mycélium. Cette dernière forme est impliquée dans la formation des biofilms. Le dimorphisme de C. albicans est contrôlé en partie par le phénomène de perception du quorum (quorum sensing) qui en autre, est associé à la molécule farnésol, produit par cette levure. La présence de cette molécule, inhibe la formation d’hyphe par C. albicans et par conséquent limite la formation de biofilms. Certaines souches ne répondent pas au farnésol et nous avons vérifié les hypothèses que : 1) la proportion des Non-Répondeurs (NR) au farnésol est similaire entre les souches de provenance orale et vaginale; 2) la capacité de formation de biofilm varie d’une souche à une autre mais les Non-Répondeurs en produisent en plus grande quantité; 3) la technique RAPD-PCR permettra de regrouper les souches de cette levure suivant leur provenance, leur capacité de formation de biofilm et leur aptitude à répondre au farnésol. La découverte d’une souche vaginale Non-Répondeur nous permet de croire que la proportion de ces souches est similaire entre les deux types de provenance. Les souches caractérisées Non-Répondeurs produisent 30 % plus de biofilm que les Répondeurs en absence de farnésol exogène dans le milieu. En présence de farnésol exogène, les Non-Répondeurs produisent 70 % plus de biomasse que les Répondeurs. De plus, la technique RAPD ne nous a pas permis de classer nos souches d’après les caractéristiques proposées. En conclusion, les souches orales de C. albicans semblent produire en moyenne plus de biomasse que les souches vaginales. Aussi, les NR semblent moins affectés par la présence du farnésol, ce qui pourrait causer la présence de biofilms tenaces. Les amorces utilisées pour la technique RAPD n’ont pas été efficace à la classification des souches dépendamment de leur provenance, de leur capacité à former un biofilm et à répondre au farnésol. Mots clés : Candida albicans, biofilm, perception du quorum (quorum sensing), farnésol, Non-Répondeur

Analyse de la réponse macrophagique au Candida albicans chez la souris transgénique exprimant le génome du VIH-1

La candidose oro-pharyngée (COP) est l’infection opportuniste la plus répandue chez les patients infectés au VIH-1. Un modèle de COP chez la souris transgénique (Tg) exprimant une partie du génome du VIH-1 (CD4C/HIVMutA) est maintenant disponible. Grâce à ce modèle, il est possible d’étudier les perturbations quantitatives et fonctionnelles des macrophages exprimant les gènes nef, rev et env du VIH-1 dans le contexte d’une COP. Cette étude démontre que la présence du transgène n’influence pas le pourcentage des macrophages dans la muqueuse buccale et le petit intestin, malgré le fait que la charge buccale de C. albicans soit significativement plus élevée chez les souris Tg. Cependant, l’expression du transgène cause une diminution de la production de H2O2 par les macrophages, ainsi que l’augmentation de la production de la cytokine proinflammatoire IL-6 et de la chimiokine MCP-1.

Caractérisation génétique, phénotypique et formation de biofilm des souches de Candida albicans répondant ou non au farnésol

Candida albicans, le pathogène opportuniste le plus commun, peut subir des transitions morphologiques entre la forme levure et la forme hyphe, jouant un rôle dans la formation de biofilm. Le farnésol, un lipide endogène produit par C. albicans, est une molécule de quorum sensing qui inhibe cette transition morphologique. Certaines souches ne répondent pas au farnésol et nous avons vérifié les hypothèses que : 1) l’isolat clinique SC5314, la souche la mieux caractérisée, est un répondeur au farnésol; 2) la germination, la croissance et la formation de biofilm des non répondeurs diffèrent des répondeurs; 3) l’absence de la réponse au farnésol se manifeste en dehors de conditions de culture précises; 4) le farnésol agit via un récepteur nucléaire qui présente des altérations chez les non répondeurs; 5) la différence de la réponse au farnésol entre les souches s’explique par des variations au niveau transcriptionnel de certains gènes (CHK1, HST7, CPH1, GAP1, RAM2 et DPP3). Les non répondeurs produisent un plus grand nombre d’hyphes, forment 60% plus de biofilm et croissent 50% moins vite que les répondeurs. La souche SC5314 se comporte comme un répondeur. L’absence de la réponse au farnésol se manifeste indépendamment des conditions de culture. Cependant, elle ne s’explique pas par une différence dans le niveau d’expression des gènes proposés, excepté pour DPP3 qui est surexprimé chez le non répondeur ATTC® 36802, suggérant ainsi une surproduction de farnésol chez cette souche. De plus, si le farnésol agit via un récepteur nucléaire, il sera d’un type non décrit précédemment.

Effect of fatty acids on hyphal growth in the pathogenic yeast Candida albicans

Candida albicans est une levure pathogène qui, à l’état commensal, colonise les muqueuses de la cavité orale et du tractus gastro-intestinal. De nature opportuniste, C. albicans cause de nombreuses infections, allant des candidoses superficielles (muguet buccal, vulvo-vaginite) aux candidoses systémiques sévères. C. albicans a la capacité de se développer sous diverses morphologies, telles que les formes levures, pseudohyphes et hyphes. Des stimuli environnementaux mimant les conditions retrouvées chez l’hôte (température de 37°C, pH neutre, présence de sérum) induisent la transition levure-à-hyphe (i.e. morphogenèse ou filamentation). Cette transition morphologique contribue à la pathogénicité de C. albicans, du fait que des souches présentant un défaut de filamentation sont avirulentes. Non seulement la morphogenèse est un facteur de virulence, mais elle constituerait aussi une cible pour le développement d’antifongiques. En effet, il a déjà été démontré que l’inhibition de la transition levure-à-hyphe atténuait la virulence de C. albicans lors d’infections systémiques. Par ailleurs, des études ont démontré que de nombreuses molécules pouvaient moduler la morphogenèse. Parmi ces molécules, certains acides gras, dont l’acide linoléique conjugué (CLA), inhibent la formation d’hyphes. Ainsi, le CLA posséderait des propriétés thérapeutiques, du fait qu’il interfère avec un déterminant de pathogénicité de C. albicans. Par contre, avant d’évaluer son potentiel thérapeutique dans un contexte clinique, il est essentiel d’étudier son mode d’action. Ce projet vise à caractériser l’activité anti-filamentation des acides gras et du CLA et à déterminer le mécanisme par lequel ces molécules inhibent la morphogenèse chez C. albicans. Des analyses transcriptomiques globales ont été effectuées afin d’obtenir le profil transcriptionnel de la réponse de C. albicans au CLA. L’acide gras a entraîné une baisse des niveaux d’expression de gènes encodant des protéines hyphes-spécifiques et des régulateurs de morphogenèse, dont RAS1. Ce gène code pour la GTPase Ras1p, une protéine membranaire de signalisation qui joue un rôle important dans la transition levure-à-hyphe. Des analyses de PCR quantitatif ont confirmé que le CLA inhibait l’induction de RAS1. De plus, le CLA a non seulement causé une baisse des niveaux cellulaires de Ras1p, mais a aussi entraîné sa délocalisation de la membrane plasmique. En affectant les niveaux et la localisation cellulaire de Ras1p, le CLA nuit à l’activation de la voie de signalisation Ras1p-dépendante, inhibant ainsi la morphogenèse. Il est possible que le CLA altère la structure de la membrane plasmique et affecte indirectement la localisation membranaire de Ras1p. Ces travaux ont permis de mettre en évidence le mode d’action du CLA. Le potentiel thérapeutique du CLA pourrait maintenant être évalué dans un contexte d’infection, permettant ainsi de vérifier qu’une telle approche constitue véritablement une stratégie pour le traitement des candidoses.

Contribution de la déficience en lipoprotéine lipase (LPL) au profil cardiométabolique lié à l'adiponectine chez les femmes

La déficience partielle en lipoprotéine lipase (LPLD) est associée à une augmentation du risque cardiométabolique chez les hommes et les femmes. L’adiponectine, le syndrome métabolique et la ménopause sont des modulateurs importants de ce risque. L’objectif de cette étude était d’évaluer la contribution de l’adiponectine au profil de risque cardiométabolique de femmes porteuses de variants dans le gène LPL connus pour être associés avec la LPLD. L'échantillon étudié comprenait 568 femmes d'origine canadienne-française, dont 127 avec une LPLD et 441 non LPLD (contrôles). L'influence de l'adiponectine sur le risque associé à la LPLD a été évaluée en utilisant des analyses de régression multiples prenant en compte l’influence du statut ménopausique, des variables anthropométriques, du bilan lipidique, de la glycémie à jeun et du tabagisme. Les résultats montrent que les niveaux d'adiponectine étaient significativement plus faibles dans les groupes LPLD. La contribution des valeurs faibles d’adiponectine au profil de risque cardiométabolique des sujets LPLD était indépendante du statut ménopausique et de toutes les autres covariables étudiées. Cela suggère que l'adiponectine contribue au profil de risque cardiométabolique chez les femmes porteuses d’une mutation connue pour être associée avec la LPLD.

Développement de nouvelles formulations d’antifongiques et évaluation de l’activité sur Candida spp. et Aspergillus spp.

Les travaux effectués dans le cadre de cette thèse de doctorat avaient pour but de mettre au point des nouvelles formulations d’antifongiques sous forme de nanoparticules polymériques (NP) en vue d’améliorer l’efficacité et la spécificité des traitements antifongiques sur des souches sensibles ou résistantes de Candida spp, d’Aspergillus spp et des souches de Candida albicans formant du biofilm. Dans la première partie de ce travail, nous avons synthétisé et caractérisé un polymère à base de polyester-co-polyéther branché avec du poly(éthylène glycol) (PEG-g-PLA). En plus d’être original et innovant, ce co-polymère a l’avantage d’être non-toxique et de posséder des caractéristiques de libération prolongée. Trois antifongiques couramment utilisés en clinique et présentant une biodisponibilité non optimale ont été choisis, soient deux azolés, le voriconazole (VRZ) et l’itraconazole (ITZ) et un polyène, l’amphotéricine B (AMB). Ces principes actifs (PA), en plus des problèmes d’administration, présentent aussi d’importants problèmes de toxicité. Des NP polymériques encapsulant ces PA ont été préparées par une technique d’émulsion huile-dans-l’eau (H/E) suivie d’évaporation de solvant. Une fois fabriquées, les NP ont été caractérisées et des particules de d’environ 200 nm de diamètre ont été obtenues. Les NP ont été conçues pour avoir une structure coeur/couronne avec un coeur constitué de polymère hydrophobe (PLA) et une couronne hydrophile de PEG. Une faible efficacité de chargement (1,3% m/m) a été obtenue pour la formulation VRZ encapsulé dans des NP (NP/VRZ). Toutefois, la formulation AMB encapsulée dans des NP (NP/AMB) a montré des taux de chargement satisfaisants (25,3% m/m). En effet, le caractère hydrophobe du PLA a assuré une bonne affinité avec les PA hydrophobes, particulièrement l’AMB qui est le plus hydrophobe des agents sélectionnés. Les études de libération contrôlée ont montré un relargage des PA sur plusieurs jours. La formulation NP/AMB a été testée sur un impacteur en cascade, un modèle in vitro de poumon et a permis de démontrer le potentiel de cette formulation à être administrée efficacement par voie pulmonaire. En effet, les résultats sur l’impacteur en cascade ont montré que la majorité de la formulation s’est retrouvée à l’étage de collecte correspondant au niveau bronchique, endroit où se situent majoritairement les infections fongiques pulmonaires. Dans la deuxième partie de ces travaux, nous avons testé les nouvelles formulations d’antifongiques sur des souches planctoniques de Candida spp., d’Aspergillus spp. et des souches de Candida albicans formant du biofilm selon les procédures standardisées du National Committee for Clinical Laboratory Standards (NCCLS). Les souches choisies ont démontré des résistances aux azolés et aux polyènes. Les études d’efficacité in vitro ont permis de prouver hors de tout doute que les nouvelles formulations offrent une efficacité nettement améliorée comparée à l’agent antifongique libre. Pour mettre en lumière si l’amélioration de l’efficacité antifongique était due à une internalisation des NP, nous avons évalué le comportement des NP avec les cellules de champignons. Nous avons procédé à des études qualitatives de microscopie de fluorescence sur des NP marquées avec de la rhodamine (Rh). Tel qu’attendu, les NP ont montré une localisation intracellulaire. Pour exclure la possibilité d’une simple adhésion des NP à la surface des levures, nous avons aussi confirmé leur internalisation en microscopie confocale de fluorescence. Il est important de noter que peu d’études à ce jour ont mis l’accent sur l’élaboration de nouvelles formulations d’antifongiques à base de polymères non toxiques destinées aux traitements des mycoses, donnant ainsi une grande valeur et originalité aux travaux effectués dans cette thèse. Les résultats probants obtenus ouvrent la voie vers une nouvelle approche pour contourner les problèmes de résistances fongiques, un problème de plus en plus important dans le domaine de l’infectiologie.

Analyse des altérations de l'immunité T-dépendante à l'égard de Candida albicans chez la souris transgénique exprimant le génome du VIH-1

La candidose oro-pharyngée (COP) est l’infection fongique opportuniste la plus commune chez les individus infectés par le VIH-1. La production des cytokines Il-17 et Il-22 par les lymphocytes Th17 est importante lors de la résolution de la COP, puisque ces cytokines induisent la production de peptides antifongiques et le recrutement des neutrophiles polymorphonucléaires. Toutefois, les lymphocytes Th17 sont préférentiellement déplétés chez les individus infectés par le VIH-1. Le modèle de COP chez la souris transgénique (Tg) CD4C/HIVMutA, exprimant les gènes nef, env et rev du VIH-1, permettra de déterminer si des altérations quantitatives et/ou fonctionnelles des sous-populations de lymphocytes T CD4+ causent la sensibilité à la candidose. Les sous-populations Th1, Th2, Th1Th17, Th17 et Treg, ainsi que leurs précurseurs, les lymphocytes T CD4+ naïfs, sont sévèrement déplétées dans les ganglions cervicaux de la souris Tg. Cependant, les lymphocytes T CD4+ naïfs conservent la capacité à se différencier in vitro en présence de cytokines polarisantes et à produire les cytokines typiques des diverses sous-populations. De plus, les cytokines requises pour la polarisation des lymphocytes T CD4+ naïfs n’étaient pas réduites dans les ganglions cervicaux des souris Tg, 7 jours après le début de l’infection. Les gènes S100a8, Ccl20, Il17 et Il22 étaient surexprimés en réponse à la COP chez la souris non-Tg, mais pas chez la souris Tg. Le traitement de souris Tg infectées à l’aide de la combinaison des cytokines Il-17 et Il-22 réduit significativement la charge fongique buccale de C. albicans et le nombre d’hyphes dans l’épithélium de la langue et restaure la capacité à surexprimer des gènes S100a8, Ccl20 et Il22. Ces résultats démontrent que la perturbation de l’induction de l’immunité innée par l’Il-17 et l’Il-22 augmente la susceptibilité à la COP chez la souris Tg.

Process Optimization for Mass Production of Marine Yeast Candida sp. S 27 and its Nutritional Characterization

The main source of protein for human and animal consumption is from the agricultural sector, where the production is vulnerable to diseases, fluctuations in climatic conditions and deteriorating hydrological conditions due to water pollution. Therefore Single Cell Protein (SCP) production has evolved as an excellent alternative. Among all sources of microbial protein, yeast has attained global acceptability and has been preferred for SCP production. The screening and evaluation of nutritional and other culture variables of microorganisms are very important in the development of a bioprocess for SCP production. The application of statistical experimental design in bioprocess development can result in improved product yields, reduced process variability, closer confirmation of the output response to target requirements and reduced development time and overall cost.The present work was undertaken to develop a bioprocess technology for the mass production of a marine yeast, Candida sp.S27. Yeasts isolated from the offshore waters of the South west coast of India and maintained in the Microbiology Laboratory were subjected to various tests for the selection of a potent strain for biomass production. The selected marine yeast was identified based on ITS sequencing. Biochemical/nutritional characterization of Candida sp.S27 was carried out. Using Response Surface Methodology (RSM) the process parameters (pH, temperature and salinity) were optimized. For mass production of yeast biomass, a chemically defined medium (Barnett and Ingram, 1955) and a crude medium (Molasses-Yeast extract) were optimized using RSM. Scale up of biomass production was done in a Bench top Fermenter using these two optimized media. Comparative efficacy of the defined and crude media were estimated besides nutritional evaluation of the biomass developed using these two optimized media.

Lipase production by marine fungus Aspergillus Awamori Nagazawa

The present study indicate the scope for the utilization of the marine fungus Aspergillus awamori Nagazawa BTMFW 032 for extracellular lipase production employing submerged fermentation. To the best of our knowledge this is the first report on lipase production by a marine fungus employing statistical modeling towards industrial production. The characterization of purified lipase produced by A. awamori showed stability in organic solvents, oxidizing agent and reducing agents, I,3-regiospecificity and hydrolytic activity. These properties make this lipase an ideal candidate for biocatalysis in organic media for the production of novel compounds such as biodiesel and sugar fatty esters. 91.4 % reduction in oil and grease content in ayurvedic oil by the treatment of A. awamori lipase indicates that there is a scope for this enzyme in the treatment of oil effluents and bioremediation. There is ample scope for further research on the biochemistry of the enzyme, structure elucidation and enzyme engineering towards a wide range of further applications, besides enriching scientific knowledge on marine enzymes.

A marine candida sake as source of immunostimulants to fenneropenaeus indicus

Aquaculture has developed rapidly over the last three decades to become an important activity worldwide.The Food and Agricultural Organization (FAO) of the UN acknowledge that global fishery output must be increased by at least 50% to offset projected shortfalls in dietary protein by 2030.LAquaculture has developed rapidly over the last three decades and has become an importat industry as today’s demand for fish exceeds the natural supply.lmmunostimulants are chemical compounds that activate the immune system of animals and render them more resistant to infections by viruses, bacteria, fungi, and parasites. lmmunostimulants have been obtained from diverse natural sources where, microbial cell wall acts as the main source.The salient findings of the study are summariseSeven marine yeasts were screened for growth promoting and immunostimulant property in F. indicus. Candida sake S165 was found to be best in terms of its support for growth and protection against white spot virus infection.The study revealed that marine yeast Candida sake can be effectively used as potential source of immunostimulants for application in penaeid prawns culture systems. The study emphasise the fact that the dose and frequency of application of immunostimulants are to be standardised and validated before commercialisation to achieve optimum stimulation of the immune system and to avoid immune fatigue die to verdose.Marine yeast (whole cell) was found to support better immunostimulation compared to its cell wall component B-1,3-glucan. This study shows that administration of marine yeast (whole cell) or B-1,3-glucan as immunostimulants in aquaculture would definitely help in protection of the stock to a few more days even though total protection is not being imparted. This partial protection itself would be highly helpful to the farming industry so that they can get sufficient time to plan for a safe harvest and save the crop from cent percent mortality.

"Alkaline Lipase Production by Marine Bacillus smithii BTMS 11"

Considering the potential of marine environment present study was designed for the screening and isolation of a potential salt tolerant. alkaline and thennotolerant lipase producing bacteria from the costal belts of South India and consequent development of ideal bioprocess for industrial production, purification characterisation and evaluation of the potential of the lipase enzyme for various industrial applications 1. Screening and isolation of a potential lipase producing bacteria. 2. Optimization of various physicochemical factors in Submerged fennentation for the production of alkaline lipase 3. Purification ofthe lipase enzyme 4. Characterisation of the enzyme 5. Evaluation of the enzyme for various industrial applications

Immunostimulatory effect of a marine yeast Candida sake S165 in Fenneropenaeus indicus

The efficacy of a marine yeast Candida sake as source of immunostimulant to Indian white shrimp Fenneropenaeus indicus was estimated. Biomass of C. sake was prepared using malt extract agar and incorporated at graded levels into a standard diet to prepare yeast diets of varying biomass concentrations (1%, 10% and 20%). F. indicus were fed on these diets for a period of 28 days and challenged orally with white spot syndrome virus (WSSV) and immune parameters such as total haemocyte count, phenoloxidase and nitroblue tetrazolium reduction (NBT) were determined. Ten per cent C. sake in the diet was found to support an optimum immune response in the animals in general and their enhancement could be observed on the second and third day following challenge with the virus. The study has demonstrated that marine yeast C. sake at 10% in diet (w/w) may be used as an effective source of immunostimulants in F. indicus

Lipase from marine Aspergillus awamori BTMFW032: Production, partial purification and application in oil effluent treatment

Marine fungus BTMFW032, isolated from seawater and identified as Aspergillus awamori, was observed to produce an extracellular lipase, which could reduce 92% fat and oil content in the effluent laden with oil. In this study, medium for lipase production under submerged fermentation was optimized statistically employing response surface method toward maximal enzyme production. Medium with soyabean meal- 0.77% (w/v); (NH4)2SO4-0.1 M; KH2PO4-0.05 M; rice bran oil-2% (v/v); CaCl2-0.05 M; PEG 6000-0.05% (w/v); NaCl-1% (w/v); inoculum-1% (v/v); pH 3.0; incubation temperature 35 8C and incubation period-five days were identified as optimal conditions for maximal lipase production. The time course experiment under optimized condition, after statistical modeling, indicated that enzyme production commenced after 36 hours of incubation and reached a maximum after 96 hours (495.0 U/ml), whereas maximal specific activity of enzyme was recorded at 108 hours (1164.63 U/mg protein). After optimization an overall 4.6- fold increase in lipase production was achieved. Partial purification by (NH4)2SO4 precipitation and ion exchange chromatography resulted in 33.7% final yield. The lipase was noted to have a molecular mass of 90 kDa and optimal activity at pH 7 and 40 8C. Results indicated the scope for potential application of this marine fungal lipase in bioremediation.

Detergent compatible alkaline lipase produced by marine Bacillus smithii BTMS 11

Bacillus smithii BTMS 11, isolated from marine sediment, produced alkaline and thermostable lipase. The enzyme was purified to homogeneity by ammonium sulfate precipitation and ion exchange chromatography which resulted in 0.51 % final yield and a 4.33 fold of purification. The purified enzyme was found to have a specific activity of 360 IU/mg protein. SDS-PAGE analyses, under non-reducing and reducing conditions, yielded a single band of 45 kDa indicating the single polypeptide nature of the enzyme and zymogram analysis using methylumbelliferyl butyrate as substrate confirmed the lipolytic activity of the protein band. The enzyme was found to have 50 C and pH 8.0 as optimum conditions for maximal activity. However, the enzyme was active over wide range of temperatures (30–80 C) and pH (7.0–10.0). Effect of a number of metal salts, solvents, surfactants, and other typical enzyme inhibitors on lipase activity was studied to determine the novel characteristics of the enzyme. More than 90 % of the enzyme activity was observed even after 3 h of incubation in the presence of commercial detergents Surf, Sunlight, Ariel, Henko, Tide and Ujala indicating the detergent compatibility of B. smithii lipase. The enzyme was also found to be efficient in stain removal from cotton cloths. Further it was observed that the enzyme could catalyse ester synthesis between fatty acids of varying carbon chain lengths and methanol with high preference for medium to long chain fatty acids showing 70 % of esterification. Results of the study indicated scope for application of this marine bacterial lipase in various industries

Marine yeast Candida MCCF 101 as feed supplement in aquaculture: nutritional quality, optimization of large scale production and evaluation of its protective effect on Koi carp from Aeromonas infection

Marine yeast have been regarded as safe and showing a beneficial impact on biotechnological process. It provides better nutritional and dietary values indicating their potential application as feed supplements in aquaculture. Brown et al. (1996) evaluated all the marine yeasts characterised with high protein content, carbohydrate, good amino acid composition and high levels of saturated fats. However, there is paucity of information on marine yeasts as feed supplements and no feed formulation has been found either in literature or in market supplemented with them. This statement supported by Zhenming et al. (2006) reported still a lack of feed composed of single cell protein (SCP) from marine yeasts with high content of protein and other nutrients. Recent research has shown that marine yeasts also have highly potential uses in food, feed, medical and biofuel industries as well as marine biotechnology (Chi et al., 2009; 2010). Sajeevan et al. (2006; 2009a) and Sarlin and Philip (2011) demonstrates that the marine yeasts Candida sake served as a high quality, inexpensive nutrient source and it had proven immunostimulatory properties for cultured shrimps. This strain has been made part of the culture collection of National Centre for Aquatic Animal Health, Cochin University of Science and Technology as Candida MCCF 101. Over the years marine yeasts have been gaining increased attention in animal feed industry due to their nutritional value and immune boosting property.Therefore, the present study was undertaken, and focused on the nutritional quality, optimization of large scale production and evaluation of its protective effect on Koi carp from Aeromonas infection