Entstehung und Dynamik des Keratinfilament-Netzwerks

Das zytoplasmatische Zytoskelett besteht aus drei Filamentsystemen, die aus Aktin, Tubulin und Intermediärfilamentproteinen aufgebaut sind und dreidimensionale Netzwerke ausbilden. Das Intermediärfilamentsystem, dem vor allem mechanische Stabilisierungsfunktionen zugesprochen werden, unterscheidet sich von den anderen durch seine Fähigkeit, spontan aus seinen Polypeptiduntereinheiten ohne weitere Kofaktoren zu polymerisieren und durch seinen unpolaren Aufbau. Es ist bis heute unbekannt, wie Intermediärfilamentnetzwerke in vivo moduliert werden und wie ihre Anordnung in den Kontext des Gesamtzytoskeletts koordiniert wird. Am Beispiel der epithelialen Intermediärfilamentproteine, den Keratinen, sollte daher untersucht werden, wie und wo neue Intermediärfilamente entstehen, welche Bedeutung den anderen Filamentsystemen bei dem Netzwerkaufbau und –Turn-Over zukommen und wie die Netzwerkbildung gesteuert wird. Zur Beantwortung dieser Fragestellungen wurden Zellklone hergestellt, die fluoreszierende Keratine synthetisieren. In der Zelllinie SK8/18-2, deren gesamtes Netzwerk aus derartigen Chimären aufgebaut ist, konnten anhand von mikroskopischen Zeitrafferaufnahmen der Fluoreszenzmuster Keratinfilamentvorläufer (KFP) identifiziert und deren Dynamik direkt in lebenden Zellen verfolgt werden. Es konnte gezeigt werden, dass die KFP in einem Plasmamembran-nahen Bereich entstehen, in dem sie zuerst als punktförmige Partikel detektiert werden. Nach einer initialen, sphäroidalen Wachstumsphase elongieren die Partikel zu kleinen Filamentstückchen. Diese können miteinander fusionieren und werden über ihre Enden in das periphere Netzwerk integriert. Der Wachstumsprozess ist gekoppelt an eine kontinuierliche, langsame Bewegung in Richtung auf das Zellzentrum. Diese Motilität sistiert vollständig nach pharmakologisch induziertem Abbau der Aktinfilamente. In Zeitraffer-aufnahmen kann jedoch in derartig behandelten Zellen ein wesentlich schnellerer Transport, der in verschiedene Richtungen verläuft und durch lange Ruhephasen unterbrochen wird, beobachtet werden. Dieser Modus, der gelegentlich auch in unbehandelten Zellen gefunden wurde, ist abhängig von intakten Mikrotubuli. Erst durch Zerstörung der Aktinfilamente und der Mikrotubuli erlischt die Motilität der KFPs vollständig. Bei der Suche nach Regulatoren der Keratinnetzwerkbildung wurde die p38 MAPK als zentraler Faktor identifiziert. Erstmals konnte eine direkte räumliche und zeitliche Korrelation zwischen einer spezifischen Enzymaktivität durch Nachweis der phosphorylierten p38 MAPK, der daraus folgenden Phosphorylierung eines Keratins, hier Serin 73 des Keratin 8, und der daraus resultierenden Veränderung des Netzwerkaufbaus, d. h. der Ausbildung von Keratingranula, nachgewiesen werden. Diese koordinierten Veränderungen wurden in unterschiedlichen Stresssituationen in verschiedenen Zellsystemen und in Zellen mit mutierten Keratinen beobachtet. Genetische (shRNA) und pharmakologische Manipulationen der p38 MAPK-Aktivität deuten auf einen engen kausalen Zusammenhang hin.

Surface-plasmon optical and electrochemical characterization of biofunctional surface architectures

The development and characterization of biomolecule sensor formats based on the optical technique Surface Plasmon Resonance (SPR) Spectroscopy and electrochemical methods were investigated. The study can be divided into two parts of different scope. In the first part new novel detection schemes for labeled targets were developed on the basis of the investigations in Surface-plamon Field Enhanced Spectroscopy (SPFS). The first one is SPR fluorescence imaging formats, Surface-plamon Field Enhanced Fluorescence Microscopy (SPFM). Patterned self assembled monolayers (SAMs) were prepared and used to direct the spatial distribution of biomolecules immobilized on surfaces. Here the patterned monolayers would serve as molecular templates to secure different biomolecules to known locations on a surface. The binding processed of labeled target biomolecules from solution to sensor surface were visually and kinetically recorded by the fluorescence microscope, in which fluorescence was excited by the evanescent field of propagating plasmon surface polaritons. The second format which also originates from SPFS technique, Surface-plamon Field Enhanced Fluorescence Spectrometry (SPFSm), concerns the coupling of a fluorometry to normal SPR setup. A spectrograph mounted in place of photomultiplier or microscope can provide the information of fluorescence spectrum as well as fluorescence intensity. This study also firstly demonstrated the analytical combination of surface plasmon enhanced fluorescence detection with analyte tagged by semiconducting nano- crystals (QDs). Electrochemically addressable fabrication of DNA biosensor arrays in aqueous environment was also developed. An electrochemical method was introduced for the directed in-situ assembly of various specific oligonucleotide catcher probes onto different sensing elements of a multi-electrode array in the aqueous environment of a flow cell. Surface plasmon microscopy (SPM) is utilized for the on-line recording of the various functionalization steps. Hybridization reactions between targets from solution to the different surface-bound complementary probes are monitored by surface-plasmon field-enhanced fluorescence microscopy (SPFM) using targets that are either labeled with organic dyes or with semiconducting quantum dots for color-multiplexing. This study provides a new approach for the fabrication of (small) DNA arrays and the recording and quantitative evaluation of parallel hybridization reactions. In the second part of this work, the ideas of combining the SP optical and electrochemical characterization were extended to tethered bilayer lipid membrane (tBLM) format. Tethered bilayer lipid membranes provide a versatile model platform for the study of many membrane related processes. The thiolipids were firstly self-assembled on ultraflat gold substrates. Fusion of the monolayers with small unilamellar vesicles (SUVs) formed the distal layer and the membranes thus obtained have the sealing properties comparable to those of natural membranes. The fusion could be monitored optically by SPR as an increase in reflectivity (thickness) upon formation of the outer leaflet of the bilayer. With EIS, a drop in capacitance and a steady increase in resistance could be observed leading to a tightly sealing membrane with low leakage currents. The assembly of tBLMs and the subsequent incorporation of membrane proteins were investigated with respect to their potential use as a biosensing system. In the case of valinomycin the potassium transport mediated by the ion carrier could be shown by a decrease in resistance upon increasing potassium concentration. Potential mediation of membrane pores could be shown for the ion channel forming peptide alamethicin (Alm). It was shown that at high positive dc bias (cis negative) Alm channels stay at relatively low conductance levels and show higher permeability to potassium than to tetramethylammonium. The addition of inhibitor amiloride can partially block the Alm channels and results in increase of membrane resistance. tBLMs are robust and versatile model membrane architectures that can mimic certain properties of biological membranes. tBLMs with incorporated lipopolysaccharide (LPS) and lipid A mimicking bacteria membranes were used to probe the interactions of antibodies against LPS and to investigate the binding and incorporation of the small antimicrobial peptide V4. The influence of membrane composition and charge on the behavior of V4 was also probed. This study displays the possibility of using tBLM platform to record and valuate the efficiency or potency of numerous synthesized antimicrobial peptides as potential drug candidates.

New sensing platforms based on nanoscopic devices for probing protein-membrane interactions

A novel nanosized and addressable sensing platform based on membrane coated plasmonic particles for detection of protein adsorption using dark field scattering spectroscopy of single particles has been established. To this end, a detailed analysis of the deposition of gold nanorods on differently functionalized substrates is performed in relation to various factors (such as the pH, ionic strength, concentration of colloidal suspension, incubation time) in order to find the optimal conditions for obtaining a homogenous distribution of particles at the desired surface number density. The possibility of successfully draping lipid bilayers over the gold particles immobilized on glass substrates depends on the careful adjustment of parameters such as membrane curvature and adhesion properties and is demonstrated with complementary techniques such as phase imaging AFM, fluorescence microscopy (including FRAP) and single particle spectroscopy. The functionality and sensitivity of the proposed sensing platform is unequivocally certified by the resonance shifts of the plasmonic particles that were individually interrogated with single particle spectroscopy upon the adsorption of streptavidin to biotinylated lipid membranes. This new detection approach that employs particles as nanoscopic reporters for biomolecular interactions insures a highly localized sensitivity that offers the possibility to screen lateral inhomogeneities of native membranes. As an alternative to the 2D array of gold nanorods, short range ordered arrays of nanoholes in optically transparent gold films or regular arrays of truncated tetrahedron shaped particles are built by means of colloidal nanolithography on transparent substrates. Technical issues mainly related to the optimization of the mask deposition conditions are successfully addressed such that extended areas of homogenously nanostructured gold surfaces are achieved. Adsorption of the proteins annexin A1 and prothrombin on multicomponent lipid membranes as well as the hydrolytic activity of the phospholipase PLA2 were investigated with classical techniques such as AFM, ellipsometry and fluorescence microscopy. At first, the issues of lateral phase separation in membranes of various lipid compositions and the dependency of the domains configuration (sizes and shapes) on the membrane content are addressed. It is shown that the tendency for phase segregation of gel and fluid phase lipid mixtures is accentuated in the presence of divalent calcium ions for membranes containing anionic lipids as compared to neutral bilayers. Annexin A1 adsorbs preferentially and irreversibly on preformed phosphatidylserine (PS) enriched lipid domains but, dependent on the PS content of the bilayer, the protein itself may induce clustering of the anionic lipids into areas with high binding affinity. Corroborated evidence from AFM and fluorescence experiments confirm the hypothesis of a specifically increased hydrolytic activity of PLA2 on the highly curved regions of membranes due to a facilitated access of lipase to the cleavage sites of the lipids. The influence of the nanoscale gold surface topography on the adhesion of lipid vesicles is unambiguously demonstrated and this reveals, at least in part, an answer for the controversial question existent in the literature about the behavior of lipid vesicles interacting with bare gold substrates. The possibility of formation monolayers of lipid vesicles on chemically untreated gold substrates decorated with gold nanorods opens new perspectives for biosensing applications that involve the radiative decay engineering of the plasmonic particles.

Oligomerisation, localisation and interaction of the sensor histidine kinases DcuS and CitA in Escherichia coli

The two-component system DcuSR of Escherichia coli regulates gene expression of anaerobic fumarate respiration and aerobic C4-dicarboxylate uptake. C4-dicarboxylates and citrate are perceived by the periplasmic domain of the membrane-integral sensor histidine kinase DcuS. The signal is transduced across the membrane by phosphorylation of DcuS and of the response regulator DcuR, resulting in activation of DcuR and transcription of the target genes.rnIn this work, the oligomerisation of full-length DcuS was studied in vivo and in vitro. DcuS was genetically fused to derivatives of the green fluorescent protein (GFP), enabling fluorescence resonance energy transfer (FRET) measurements to detect protein-protein interactions in vivo. FRET measurements were also performed with purified His6-DcuS after labelling with fluorescent dyes and reconstitution into liposomes to study oligomerisation of DcuS in vitro. In vitro and in vivo fluorescence resonance energy transfer showed the presence of oligomeric DcuS in the membrane, which was independent of the presence of effector. Chemical crosslinking experiments allowed clear-cut evaluation of the oligomeric state of DcuS. The results showed that detergent-solubilised His6-DcuS was mainly monomeric and demonstrated the presence of tetrameric DcuS in proteoliposomes and in bacterial membranes.rnThe sensor histidine kinase CitA is part of the two-component system CitAB of E. coli, which is structurally related to DcuSR. CitAB regulates gene expression of citrate fermentation in response to external citrate. The sensor kinases DcuS and CitA were fused with an enhanced variant of the yellow fluorescent protein (YFP) and expressed in E. coli under the control of an arabinose-inducible promoter. The subcellular localisation of DcuS-YFP and CitA-YFP within the cell membrane was studied by means of confocal laser fluorescence microscopy. Both fusion proteins were found to accumulate at the cell poles. The polar accumulation was slightly increased in the presence of the stimulus fumarate or citrate, respectively, but independent of the expression level of the fusion proteins. Cell fractionation demonstrated that polar accumulation was not related to inclusion bodies formation. The degree of polar localisation of DcuS-YFP was similar to that of the well-characterised methyl-accepting chemotaxis proteins (MCPs), but independent of their presence. To enable further investigations on the function of the polar localisation of DcuS under physiological conditions, the sensor kinase was genetically fused to the flavin-based fluorescent protein Bs2 which shows fluorescence under aerobic and anaerobic conditions. The resulting dcuS-bs2 gene fusion was inserted into the chromosome of various E. coli strains.rnFurthermore, a protein-protein interaction between the related sensor histidine kinases DcuS and CitA, regulating common metabolic pathways, was detected via expression studies under anaerobic conditions in the presence of citrate and by in vivo FRET measurements.

Structured antibody surfaces for bio-recognition and a label-free detection of bacteria

Antibody microarrays are of great research interest because of their potential application as biosensors for high-throughput protein and pathogen screening technologies. In this active area, there is still a need for novel structures and assemblies providing insight in binding interactions such as spherical and annulus-shaped protein structures, e.g. for the utilization of curved surfaces for the enhanced protein-protein interactions and detection of antigens. Therefore, the goal of the presented work was to establish a new technique for the label-free detection of bio-molecules and bacteria on topographically structured surfaces, suitable for antibody binding.rnIn the first part of the presented thesis, the fabrication of monolayers of inverse opals with 10 μm diameter and the immobilization of antibodies on their interior surface is described. For this purpose, several established methods for the linking of antibodies to glass, including Schiff bases, EDC/S-NHS chemistry and the biotin-streptavidin affinity system, were tested. The employed methods included immunofluorescence and image analysis by phase contrast microscopy. It could be shown that these methods were not successful in terms of antibody immobilization and adjacent bacteria binding. Hence, a method based on the application of an active-ester-silane was introduced. It showed promising results but also the need for further analysis. Especially the search for alternative antibodies addressing other antigens on the exterior of bacteria will be sought-after in the future.rnAs a consequence of the ability to control antibody-functionalized surfaces, a new technique employing colloidal templating to yield large scale (~cm2) 2D arrays of antibodies against E. coli K12, eGFP and human integrin αvβ3 on a versatile useful glass surface is presented. The antibodies were swept to reside around the templating microspheres during solution drying, and physisorbed on the glass. After removing the microspheres, the formation of annuli-shaped antibody structures was observed. The preserved antibody structure and functionality is shown by binding the specific antigens and secondary antibodies. The improved detection of specific bacteria from a crude solution compared to conventional “flat” antibody surfaces and the setting up of an integrin-binding platform for targeted recognition and surface interactions of eukaryotic cells is demonstrated. The structures were investigated by atomic force, confocal and fluorescence microscopy. Operational parameters like drying time, temperature, humidity and surfactants were optimized to obtain a stable antibody structure.

Near-field mediated enhancement effects on plasmonic nanostructures

In dieser Arbeit wird eine detaillierte Untersuchung und Charakterisierung der Zwei-Photonen-induzierten Fluoreszenzverstärkung von organischen Farbstoffen auf plasmonischen Nanostrukturen vorgestellt. Diese Fluoreszenzverstärkung ist insbesondere für hochaufgelöste Fluoreszenzmikroskopie und Einzelmolekülspektroskopie von großer Bedeutung. Durch die Zwei-Photonen-Anregung resultiert eine Begrenzung des Absorptionsprozesses auf das fokale Volumen. In Kombination mit dem elektrischen Nahfeld der Nanostrukturen als Anregungsquelle entsteht eine noch stärkere Verringerung des Anregungsvolumens auf eine Größe unterhalb der Beugungsgrenze. Dies erlaubt die selektive Messung ausgewählter Farbstoffe. Durch die Herstellung der Nanopartikel mittels Kolloidlithografie wird eine definierte, reproduzierbare Geometrie erhalten. Polymermultischichten dienen als Abstandshalter, um die Farbstoffe an einer exakten Distanz zum Metall zu positionieren. Durch die kovalente Anbindung des Farbstoffs an die oberste Schicht wird eine gleichmäßige Verteilung des Farbstoffs in geringer Konzentration erhalten. rnEs wird eine Verstärkung der Fluoreszenz um den Faktor 30 für Farbstoffe auf Goldellipsen detektiert, verglichen mit Farbstoffen außerhalb des Nahfelds. Sichelförmige Nanostrukturen erzeugen eine Verstärkung von 120. Dies belegt, dass das Ausmaß der Fluoreszenzverstärkung entscheidend von der Stärke des elektrischen Nahfelds der Nanostruktur abhängt. Auch das Material der Nanostruktur ist hierbei von Bedeutung. So erzeugen Silberellipsen eine 1,5-fach höhere Fluoreszenzverstärkung als identische Goldellipsen. Distanzabhängige Fluoreszenzmessungen zeigen, dass die Zwei-Photonen-angeregte Fluoreszenzverstärkung an strukturspezifischen Abständen zum Metall maximiert wird. Elliptische Strukturen zeigen ein Maximum bei einem Abstand von 8 nm zum Metall, wohingegen bei sichelförmigen Nanostrukturen die höchste Fluoreszenzintensität bei 12 nm gemessen wird. Bei kleineren Abständen unterliegt der Farbstoff einem starken Löschprozess, sogenanntes Quenching. Dieses konkurriert mit dem Verstärkungsprozess, wodurch es zu einer geringen Nettoverstärkung kommt. Hat die untersuchte Struktur Dimensionen größer als das Auflösungsvermögen des Mikroskops, ist eine direkte Visualisierung des elektrischen Nahfelds der Nanostruktur möglich. rnrnEin weiterer Fokus dieser Arbeit lag auf der Herstellung neuartiger Nanostrukturen durch kolloidlithografische Methoden. Gestapelte Dimere sichelförmiger Nanostrukturen mit exakter vertikaler Ausrichtung und einem Separationsabstand von etwa 10 nm wurden hergestellt. Die räumliche Nähe der beiden Strukturen führt zu einem Kopplungsprozess, der neue optische Resonanzen hervorruft. Diese können als Superpositionen der Plasmonenmoden der einzelnen Sicheln beschrieben werden. Ein Hybridisierungsmodell wird angewandt, um die spektralen Unterschiede zu erklären. Computersimulationen belegen die zugrunde liegende Theorie und erweitern das Modell um experimentell nicht aufgelöste Resonanzen. rnWeiterhin wird ein neuer Herstellungsprozess für sichelförmige Nanostrukturen vorgestellt, der eine präzise Formanpassung ermöglicht. Hierdurch kann die Lage der Plasmonenresonanz exakt justiert werden. Korrelationen der geometrischen Daten mit den Resonanzwellenlängen tragen zum grundlegenden Verständnis der Plasmonenresonanzen bei. Die vorgestellten Resultate wurden mittels Computersimulationen verifiziert. Der Fabrikationsprozess erlaubt die Herstellung von Dimeren sichelförmiger Nanostrukturen in einer Ebene. Durch die räumliche Nähe überlappen die elektrischen Nahfelder, wodurch es zu kopplungs-induzierten Shifts der Plasmonenresonanzen kommt. Der Unterschied zu theoretisch berechneten ungekoppelten Nanosicheln kann auch bei den gegenüberliegenden sichelförmigen Nanostrukturen mit Hilfe des Plasmonenhybridisierungsmodells erklärt werden.

Isolierung und Charakterisierung der ER-residenten Aminopeptidase ERMP1 und Untersuchung ihrer Funktion in der Prozessierung MHC I restringierter CTL Epitope

Die effiziente Generierung von Peptid-Epitopen aus zelleigenen oder viralen Proteinen für die Präsentation auf „Major Histocompatibility Complex I“ (MHC I) Molekülen ist essentiell für die Aktivierung des adaptiven Immunsystems und die Effektorfunktion der CD8+ zytotoxischen T-Zellen (CTLs). CTLs erkennen diese Peptide in Kontext mit MHC I Molekülen über ihren spezifischen T-Zellrezeptor (TCR). Die Generierung dieser Epitope ist das Resultat eines komplexen proteolytischen Prozesses, der im Zytosol und im endoplasmatischen Retikulum (ER) stattfindet. Im Zytosol generiert das Proteasom N-terminal verlängerte Epitop-Vorläufer. Diese werden durch weitere zytosolische Proteasen abgebaut, es sei denn, sie werden durch den „transporter associated with antigen processing“ (TAP) in das ER transportiert. Dort werden sie durch Aminopeptidasen getrimmt, um den Bindungsvoraussetzungen der MHC I Moleküle zu genügen. Im murinen System ist die „ER aminopeptidase associated with antigen processing“ (ERAAP) die bislang einzige beschriebene Aminopeptidase, die dieses N-terminale Trimming von CTL Epitopen vermitteln kann. Das Profil der proteolytischen Aktivität in angereichertem murinen ER kann jedoch nicht allein durch die Aktivität von ERAAP erklärt werden, was auf die Anwesenheit weiterer Aminopeptidasen mit einer potentiellen Funktion in der Antigenprozessierung hinweist. In dieser Arbeit konnte die immunologisch bislang noch nicht beschriebene Aminopeptidase ERMP1 (endoplasmic reticulum metallopeptidase 1) im murinen ER identifiziert werden. Nach Aufreinigung muriner Mikrosomen und anschließender Anionenaustausch-Chromatographie wurden die gesammelten Fraktionen mit fluorogenen Substraten auf Aminopeptidase-Aktivität getestet. Durch massenspektrometrische Analyse konnten in den beobachteten Peaks die schon beschriebenen Aminopeptidasen ERAAP, die „insulin regulated aminopeptidase“ IRAP und die immunologisch bislang nicht beschriebene Aminopeptidase ERMP1 identifiziert werden. Durch Fluoreszenzmikroskopie konnte die intrazelluläre Lokalisation von ERMP1 im ER durch Kolokalisation mit TAP verifiziert werden. Wie viele Komponenten des MHC I Prozessierungsweges wird auch die Expression von ERMP1 durch IFN-γ stimuliert. Dies macht ERMP1 zu einer potentiellen zweiten trimmenden Aminopeptidase im murinen ER. Überexpression von ERMP1 hat einen allelspezifischen Einfluss auf die globale MHC I Präsentation auf der Zelloberfläche und durch Überexpression und shRNA vermitteltes gene silencing konnte außerdem ein epitopspezifischer Effekt nachgewiesen werden. Da N-terminales Trimming durch ERAAP mit der Evasion von Tumoren und veränderter Immundominanz assoziiert wird, ist die detaillierte Charakterisierung der Aminopeptidase ERMP1 ein wichtiger Schritt zum Verständnis der MHC I Antigen-Prozessierung und der Generierung von CTL Epitopen im ER.

Lysosomaler Transport kationischer Aminosäuren durch Mitglieder der SLC7-Familie

Lysosomaler Transport kationischer Aminosäuren (KAS) stellt einen Rettungsweg in der Cystinose-Therapie dar. Ein solches Transportsystem wurde in humanen Hautfibroblasten beschrieben und mit System c benannt. Des Weiteren stellt lysosomales Arginin eine Substratquelle für die endotheliale NO-Synthase (eNOS) dar. Das von der eNOS gebildete NO ist ein wichtiges vasoprotektiv wirkendes Signalmolekül. Ziel war es daher, herauszufinden, ob Mitglieder der SLC7-Unterfamilie hCAT möglicherweise System c repräsentieren.rnIn dieser Arbeit konnte ich die lysosomale Lokalisation verschiedener endogener, sowie als EGFP-Fusionsproteine überexprimierter CAT-Isoformen nachweisen. Mittels Fluoreszenz-mikroskopie wurde festgestellt, dass die in U373MG-Zellen überexprimierten Fusionsproteine hCAT-1.EGFP sowie SLC7A14.EGFP mit dem lysosomalen Fluoreszenz-Farbstoff LysoTracker co-lokalisieren. Eine Lokalisation in Mitochondrien oder dem endoplasmatischem Retikulum konnte mit entsprechenden Fluoreszenz-Farbstoffen ausgeschlossen werden. Zusätzlich reicherten sich die überexprimierten Proteine hCAT-1.EGFP, hCAT-2B.EGFP und SLC7A14.EGFP in der lysosomalen Fraktion C aus U373MG-Zellen zusammen mit den lysosomalen Markern LAMP-1 und Cathepsin D an. Gleiches galt für den endogenen hCAT-1 in der lysosomalen Fraktion C aus EA.hy926- und U373MG-Zellen sowie für den SLC7A14 in den humanen Hautfibroblasten FCys5. Mit dem im Rahmen dieser Arbeit generierte Antikörper gegen natives SLC7A14 konnte erstmals die endogene Expression und Lokalisation von SLC7A14 in verschiedenen Zelltypen analysiert werden.rnObwohl eine Herunterregulation des hCAT-1 in EA.hy926-Endothelzellen nicht zu einer Reduktion der Versorgung der eNOS mit lysosomalem Arginin führte, ist eine Funktion von hCAT-1 im Lysosom wahrscheinlich. Sowohl die [3H]Arginin- als auch die [3H]Lysin-Aufnahme der Fraktion C aus U373MG-hCAT-1.EGFP war signifikant höher als in die Fraktion C aus EGFP-Kontrollzellen. Dies konnte ebenfalls für den hCAT-2B.EGFP gezeigt werden. Zusätzlich zeigten lysosomale Proben aus U373MG-hCAT-2B.EGFP-Zellen in der SSM-basierten Elektrophysiologie eine elektrogene Transportaktivität für Arginin. Das Protein SLC7A14.EGFP zeigte in keiner der beiden durchgeführten Transportstudien eine Aktivität. Dies war unerwartet, da die aus der Diplomarbeit stammende und im Rahmen dieser Dissertation erweiterte Charakterisierung der hCAT-2/A14_BK-Chimäre, die die „funktionelle Domäne“ des SLC7A14 im Rückgrat des hCAT-2 trug, zuvor den Verdacht erhärtet hatte, dass SLC7A14 ein lysosomal lokalisierter Transporter für KAS sein könnte. Diese Studien zeigten allerding erstmals, dass die „funktionelle Domäne“ der hCATs die pH-Abhängigkeit vermittelt und eine Rolle in der Substraterkennung spielt.rnZukünftig soll weiter versucht werden auch endogen eine Transportaktivität der hCATs für KAS im Lysosom nachzuweisen und das Substrat für das intrazellulär lokalisierte Waisen-Protein SLC7A14 zu finden. Eine mögliche Rolle könnte SLC7A14 als Transporter für Neurotransmitter spielen, da eine sehr prominente Expression im ZNS festgestellt wurde.rn

Functional dna nanostructures for in vitro biosensing in live cells

DNA is a fascinating biomolecule that is well known for its genetic role in living systems. The emerging area of DNA nanotechnology provides an alternative view that exploits unparallel self-assembly ability of DNA molecules for material use of DNA. Although many reports exist on the results of DNA self-assembling systems, still few of them focus on the in vitro study about the function of such DNA nanostructures in live cells. Due to this, there are still a limited research about the in vitro functionality of such designs. To address an aspect of this issue, we have designed, synthesized and characterized two multifunctional fluorescencent nanobiosensors by DNA self-assembling. Each structure was designed and implemented to be introduced in live cells in order to give information on their functioning in real-time. Computational tools were used in order to design a graphic model of two new DNA motifs and also to obtain the specific sequences to all the ssDNA molecules. By thermal self-assembly techniques we have successfully synthesized the structure and corroborate their formation by the PAGE technique. In addition, we have established the conditions to characterize their structural conformation change when they perform their sensor response. The sensing behavior was also accomplished by fluorescence spectroscopy techniques; FRET evaluation and fluorescence microscopy imaging. Providing the evidence about their adequate sensing performance outside and inside the cells detected in real-time. In a preliminary evaluation we have tried to show the in vitro functionality of our structures in different cancer cell lines with the ability to perform local sensing responses. Our findings suggest that DNA sensor nanostructures could serve as a platform to exploit further therapeutic achievements in live cells.

Detektion von Nickel- und Cobaltspezies in einzelnen lebenden Zellen mit hoher lateraler Auflösung

Übergangsmetallen wie Nickel und Cobalt kommt meist eine große Bedeutung als Cofaktor in Enzymen oder Metallkomplexen im Metabolismus von Lebewesen zu. Da eine sehr geringe Konzentration dieser Übergangsmetalle in einer Zelle für deren Funktionalität ausreicht, ist eine konstante Konzentration der Spurenelemente in einer Zelle angestrebt. Durch meist anthropogene Einflüsse sind Pflanzen und Menschen zunehmend hohen Konzentrationen von Übergangsmetallen ausgesetzt, die in Abhängigkeit von ihrer Spezies, der Konzentration und der Lokalisation unterschiedliche Toxizitäten aufweisen können. Die Speziation von Metallen wurde bisher mittels gängiger Analyseverfahren, wie der ICP-MS und ähnlicher Verfahren, anhand von bulk-Material durchgeführt. Durch die Entwicklung von optischen Sensoren für Metallionen war es möglich, diese Metalle auch in lebenden Zellen mittels Fluoreszenzmikroskopie zu lokalisieren. Ke und Kollegen (2006, 2007) nutzten einen solchen optischen Sensor - Newport Green DCF, um die Aufnahme von Nickel in humane A543 Lungenbronchialepithelzellen nach Inkubation mit dem wasserlöslichen NiCl2 (0,5 mM und 1 mM) sowie den wasserunlöslichen Verbindungen Ni3S2 (0,5 µg/cm2 und 1 µg/cm2) und NiS (2,5 µg/cm2) nachzuweisen und zu lokalisieren und konnten damit eine Akkumulation von Nickel im Zytoplasma und im Zellkern aufzeigen. Dabei war bei wasserlöslichen und wasserunlöslichen Nickelverbindungen Nickel nach 24 h im Zytoplasma und erst nach 48 h im Zellkern zu beobachten.rnrnDa Nickel und Cobalt keine detektierbare Eigenfluoreszenz unter den gegebenen Bedingungen zeigten, wurde für den optischen Nachweis von Nickel und Cobalt mit dem konfokalen Laser-Raster Mikroskop (CLSM) nach der Zugabe der verschiedenen wasserlöslichen und wasserunlöslichen Metallverbindungen NiCl2, NiSO4, Ni3S2 und CoCl2 in einzelnen lebenden humanen Gingiva-Fibroblasten, sowie in Pflanzenzellen in dieser Arbeit ebenfalls der optische Sensor Newport Green DCF genutzt. Korrespondierend zu den Ergebnissen früherer Arbeiten von Ke et al. (2006, 2007), in denen die Nickelaufnahme bei Konzentrationen von >0,5 mM NiCl2 bzw. >0,5 µg/cm2 Ni3S2 gezeigt wurde, wurde Nickel in Fibroblasten in Abhängigkeit von der Spezies mit steigender Metallkonzentration von 100 µM bis 500 µM nach 16 h im Zytoplasma und zunehmend nach 24 h bis 48 h im Zellkern detektiert. Bei der wasserunlöslichen Verbindung Ni3S2 war der Nachweis von Nickel im Zellkern bereits nach 16 h bis 24 h erfolgreich. Zusätzlich wurden weitere Strukturen wie das Endoplasmatische Retikulum, die Mitochondrien und die Nukleoli durch eine starke Fluoreszenz des optischen Sensors bei Colokalisationsexperimenten mit Organell-spezifischen Fluoreszenzfarbstoffen als target für die Nickelbindung vermutet. Die Lokalisation von Cobalt in den Fibroblasten entsprach weitgehend der Lokalisation von Nickel. Im Zellkern war die Cobaltlokalisation jedoch auf die Nukleoli beschränkt. Weiterführende Versuche an humanen Gingiva-Fibroblasten zeigten, dass die Aufnahme der Metalle in die Fibroblasten pH-Wert abhängig war. Niedrige pH-Werte im sauren pH-Bereich verringerten die Aufnahme der Metalle in die Zellen, wobei ein pH-Wert im basischen Bereich keinen bedeutenden Unterschied zum neutralen pH-Bereich aufwies. Im Vergleich zu den Fibroblasten war in Pflanzenzellen zu jedem Zeitpunkt, auch bei geringen Konzentrationen der Metallverbindungen sowie des optischen Sensors, Nickel und Cobalt in den Zellkernen detektierbar. Durch die Eigenschaft der Pflanzenzellen eine Vakuole zu besitzen, war Nickel und Cobalt hauptsächlich in den Vakuolen lokalisiert. Weitere Strukturen wie das Endoplasmatische Retikulum, die Mitochondrien oder auch die Zellwand kamen bei Pflanzenzellen als target in Frage.rnrnDie Fluoreszenz und Lokalisation der Metalle in den Fibroblasten waren unabhängig von der Spezies sehr ähnlich, sodass in den Zellen die Spezies anhand der fluoreszenzmikroskopischen Aufnahmen kaum unterschieden werden konnten. Lambda-Scans in verschiedenen regions of interest (ROI) wurden durchgeführt, um durch die Fluoreszenzspektren Hinweise auf eine charakteristische Beeinflussung der Bindungspartner von Nickel und Cobalt oder dieser Metalle selbst in den Zellen auf den optischen Sensor zu bekommen und diese dadurch identifizieren zu können. Das Ziel der parallelen Detektion bzw. Lokalisation und gleichzeitigen Speziation bestimmter Nickel- und Cobaltpezies in einzelnen lebenden Zellen konnte in dieser Arbeit durch den optischen Sensor Newport Green DCF nicht erreicht werden.

Signalerkennung und Signaltransduktion im DctA,DcuS-Sensor-Regulatorkomplex von Escherichia coli.

E. coli ist in der Lage unter aeroben sowie anaeroben Bedingungen C4-Dicarbonsäuren zur Energiekonservierung zu nutzen. Das DcuS/DcuR-Zweikomponentensystem detektiert diese und reguliert die Gene für den C4-Dicarboxylat-Transport und Metabolismus. Dabei hängt die Sensitivität der Sensorkinase DcuS für C4-Dicarbonsäuren von der Anwesenheit des aeroben Symporters DctA oder des anaeroben Antiporters DcuB ab. Diese bifunktionalen Transporter bilden mit DcuS über direkte Protein-Protein-Wechselwirkungen Sensoreinheiten. In dieser Arbeit wurden die Funktionen von DctA und DcuS im DctA/DcuS-Sensorkomplex analysiert. Mit DctA(S380D) wurde eine Variante des Transporters identifiziert, in der die regulatorische Eigenschaft von der katalytischen Funktion entkoppelt ist. Stämme von E. coli, die den DctA(S380D)/DcuS-Sensorkomplex enthielten, waren in der Lage C4-Dicarbonsäuren wahrzunehmen, obwohl die Transportfunktion von DctA inaktiviert war. Zudem wurden Unterschiede in den Substratspektren von DctA und DcuS festgestellt. Citrat, ein guter Effektor des DctA/DcuS-Sensorkomplexes, wurde durch DctA nicht gebunden oder transportiert. Anhand von Titrationsexperimenten mit variierenden DctA-Mengen wurde außerdem nachgewiesen, dass die Sensitivität von DcuS für seine Effektoren von der DctA-Konzentration abhängig ist. Es konnte gezeigt werden, dass DctA im DctA/DcuS-Sensorkomplex nicht an der Erkennung von C4-Dicarbonsäuren beteiligt ist. DcuS stellt die Signaleingangsstelle des Komplexes dar, während DctA durch seine Anwesenheit die Sensorkinase in eine funktionsbereite oder sensitive Form überführt, die auf Effektoren reagieren kann. Darüber hinaus wurde die Rolle der Transmembranhelices TM1 und TM2 von DcuS für die Funktion und Dimerisierung der Sensorkinase untersucht. Durch Sequenzanalysen wurden „SmallxxxSmall“-Motive, deren Relevanz als Dimerisierungsschnittstellen bereits in Transmembranhelices anderer Proteine nachgewiesen wurde, in TM1 sowie TM2 identifiziert. Die Homodimerisierung beider Transmembrandomänen wurde im GALLEX Two-Hybrid System nachgewiesen, wobei die TM2-TM2-Interaktion stärker war. Die Substitution G190A/G194A im SxxxGxxxG-Tandemmotiv von TM2 rief zudem einen deutlichen Funktionsverlust der Sensorkinase hervor. Dieser Aktivitätsverlust korrelierte mit Störungen der Homodimerisierung von TM2(G190A/G194A) sowie DcuS(G190A/G194A) bei bakteriellen Two-Hybrid Messungen im GALLEX- bzw. BACTH-System. Demzufolge agiert Transmembranhelix 2 mit seinem SxxxGxxxG-Sequenzmotiv als wesentliche Homodimerisierungsstelle in DcuS. Die Dimerisierung von DcuS ist essentiell für die Funktion der Histidinkinase. Zusätzlich wurde bei fluoreszenzmikroskopischen Studien durch Koexpression von DcuS bzw. DctA die zelluläre Kolokalisierung von DctA und DcuR mit DcuS sowie DauA mit DctA nachgewiesen. Die DctA/DcuS-Sensoreinheit kann demnach zum DauA/DctA/DcuS/DcuR-Komplex erweitert werden.

Non-aqueous dispersions of particles and their applications

In the current work, three studies about non-aqueous dispersions of particles were carried out by using an amphiphilic block copolymer poly(isoprene)-block-poly(methyl methacrylate) (PI-b-PMMA) as stabilizer:rn1. Dispersions of polyurethane and polyurea porous particles for polymer compositesrn2. Dispersions of PMMA and PU particles with PDI dye for study of Single Molecule Spectroscopy Detectionrn3. Dispersions of graphene nanosheets for polymer compositesrnrnIn the first study, highly porous polyurethane and polyurea particles were prepared in a non-aqueous emulsion. The preparation of porous particles consisted of two parts: At first, a system was developed where the emulsion had high stability for the polymerization among diisocyanate, diol and water. In the second part, porous particles were prepared by using two methods fission/fusion and combination by which highly porous particles were obtained. In this study, the applications of porous particles were also investigated where polyurethane particles were tested as filling material for polymer composites and as catalyst carrier for polyethylene polymerization. rnrnIn the second study, PMMA and PU particles from one non-aqueous emulsion were investigated via single molecule fluorescence detection. At first the particles were loaded with PDI dye, which were detected by fluorescence microscopy. The distribution and orientation of the PDI molecules in the particles were successfully observed by Single Molecule Fluorescence Detection. The molecules were homogenously distributed inside of the particles. In addition they had random orientation, meaning that no aggregations of dye molecules were formed. With the results, it could be supposed that the polymer chains were also homogenously distributed in the particles, and that the conformation was relatively flexible. rnrnIn the third part of the study, graphene nanosheets with high surface area were dispersed in an organic solvent with low boiling point and low toxicity, THF, stabilized with a block copolymer PI-b-PMMA. The dispersion was used to prepare polymer composites. It was shown that the modified graphene nanosheets had good compatibility with the PS and PMMA matrices. rn

Etablierung transgener BY-2-Zelllinien zur In-vivo-Lokalisierung pflanzlicher Cytoskelettproteine

Bei den Pflanzen sind viele Fragen bezüglich der Organisation und Regulation des bei der Zellteilung und differenzierung wichtigen Auf-, Ab- und Umbaus des Mikrotubuli-Netzwerkes noch immer offen, insbesondere was die Rolle des γ-Tubulins betrifft. Ziel der vorliegenden Arbeit war die Etablierung von BY-2 Modell-Zelllinien (Nicotiana), die verschiedene mit fluoreszierenden Proteinen (FP) markierte Elemente des Cytoskeletts exprimieren, um eine fluoreszenzmikroskopische Detektion in vivo zu ermöglichen.rnAls Grundlage für alle weiteren Versuche wurde eine zuverlässige Methode zur A. tumefaciens vermittelten stabilen Transfektion von BY-2 Zellen erarbeitet. Für die Expression von FP-markierten Cytoskelettproteinen, wurden entsprechende Fusionskonstrukte kloniert und via A. tumefaciens in BY-2 Zellen transferiert. So gelang zunächst die Herstellung transgener Zelllinien, die GFP-markiertes α- bzw. γ-Tubulin exprimierten. Diese sollten später als Basis für die Untersuchung des dynamischen Mikrotubuli-Netzwerkes bzw. dessen Regulation dienen. In beiden Zelllinien standen die Konstrukte zunächst unter Kontrolle eines doppelten 35S-Promotors, was zu einer starken, konstitutiven Expression der Transgene führte. Fluoreszenzmikroskopisch konnten Strukturen, an deren Aufbau Mikrotubuli beteiligt sind, detektiert werden. Aufgrund einer starken Hintergrundfluoreszenz, vermutlich bedingt durch die konstitutive Überexpression, war die Darstellung feinerer Bereiche, wie sie im Cytoskelett häufig auftreten, jedoch äußerst schwierig. Deshalb wurde eine schwächere bzw. adäquate Expressionsrate angestrebt. rnPhysiologische Expressionsraten sollten vor allem durch den endogenen γ-Tubulin-Promotor ermöglicht werden. Da die entsprechende Sequenz noch unbekannt war, wurde sie zunächst bestimmt und in ein passendes Konstrukt integriert. Fluoreszenzmikroskopische Untersuchungen der resultierenden Zelllinie ließen auf eine stark reduzierte Expressionsrate schließen. Tatsächlich war die Detektion von Cytoskelettstrukturen, wenn überhaupt, erst bei deutlich längeren Belichtungszeiten möglich. Bedingt durch die langen Belichtungszeiten wurde die Dokumentation durch eine latente pflanzentypische Autofluoreszenz der Zellen erschwert. Auch wenn hier keine detailreicheren Aufnahmen der Cytoskelettstrukturen möglich waren, ist die Zellkultur für weiterführende Untersuchungen, z.B. in Studien bezüglich des zeitlichen Expressionsmusters des γ-Tubulins, potentiell geeignet. Der Einsatz eines sensibleren Mikroskopsystems ist allerdings erforderlich. rnUm klären zu können, inwieweit γ-Tubulin mit den Mikrotubuli co-lokalisiert, wurden Zelllinien benötigt, bei denen die entsprechenden Elemente unterschiedlich markiert waren. Zu diesem Zweck wurde der Einsatz von RFP-markiertem Tubulin getestet. Eine deutliche Überexpression von RFP alleine war möglich. Trotz mehrfacher Wiederholung der Versuche war aber keine Expression von RFP-markiertem α-Tubulin in BY-2 Zellen zur Visualisierung der Mikrotubuli detektierbar. Die DNA-Sequenzen waren im Genom nachweisbar, eine Transkription jedoch nicht. Möglicherweise spielten hier gene silencing Effekte eine Rolle. Das verwendete RFP (TagRFP) und GFP stammten aus unterschiedlichen Organismen, aus einer Seeanemone bzw. einer Qualle. Eine Lösung könnte der Austausch des TagRFP durch ein Quallen-Derivat, das in einer von grün unterscheidbaren Farbe fluoresziert, bringen. Da bereits BY-2 Zelllinien vorliegen, die GFP-markiertes α- bzw. γ-Tubulin exprimieren, sollte es, nach Klonieren eines entsprechenden Konstruktes, zeitnah möglich sein, eine doppelt transfizierte Zelllinie herzustellen.

Development of a fluorescent-based single liposome assay for studying calcium transporter LMCA1

The morphological and functional unit of all the living organisms is the cell. The transmembrane proteins, localized in the plasma membrane of cells, play a key role in the survival of the cells themselves. These proteins perform a variety of different tasks, for example the control of the homeostasis. In order to control the homeostasis, these proteins have to regulate the concentration of chemical elements, like ions, inside and outside the cell. These regulations are fundamental for the survival of the cell and to understand them we need to understand how transmembrane proteins work. Two of the most important categories of transmembrane proteins are ion channels and transporter proteins. The ion channels have been depth studied at the single molecule level since late 1970s with the development of patch-clamp technique. It is not possible to apply this technique to study the transporter proteins so a new technique is under development in order to investigate the behavior of transporter proteins at the single molecule level. This thesis describes the development of a nanoscale single liposome assay for functional studies of transporter proteins based on quantitative fluorescence microscopy in a highly-parallel manner and in real time. The transporter of interest is the prokaryotic transporter Listeria Monocytogenes Ca2+-ATPase1 (LMCA1), a structural analogue of the eukaryotic calcium pumps SERCA and PMCA. This technique will allow the characterization of LMCA1 functionality at the single molecule level. Three systematically characterized fluorescent sensors were tested at the single liposome scale in order to investigate if their properties are suitable to study the function of the transporter of interest. Further studies will be needed in order to characterize the selected calcium sensor and pH sensor both implemented together in single liposomes and in presence of the reconstituted protein LMCA1.

The presence of iodinated contrast agents amplifies DNA radiation damage in computed tomography

The purpose of this study was to determine the influence of iodinated contrast agents on the formation of DNA double-strand breaks in vitro in lymphocytes and to verify these results in patients undergoing diagnostic computed tomography examinations. Blood samples were irradiated in vitro in the presence of iodinated X-ray contrast agent. Controls were irradiated without contrast agent. Fourteen patients were investigated using contrast-enhanced computed tomography (CT), and 14 other patients with unenhanced CT. Blood samples were taken prior to and 5 min and 1, 2 and 24 h after the CT examination. In these blood samples the average number of γH2Ax-foci per lymphocyte was enumerated by fluorescence microscopy. Statistical differences between foci numbers developed in the presence and absence of contrast agent were tested using an independent sample t-test. In vitro foci numbers after irradiation were significantly higher when contrast agent was present during irradiation. In vivo, γH2Ax-foci levels were 58% higher in patients undergoing contrast-enhanced CT compared with those undergoing unenhanced CT. In the presence of iodinated contrast agents DNA, damage is increased and the radiation dose is not the only factor affecting the amount of DNA damage. Individual patient characteristics and biological dosimetry applications, e.g. the analysis of γH2Ax-foci, have to be considered.