Angiotensin II-induced JNK activation is mediated by NAD(P)H oxidase in isolated rat pancreatic islets

Angiotensin II (All), the active component of the renin angiotensin system (RAS), plays a vital role in the regulation of physiological processes of the cardiovascular system, but also has autocrine and paracrine actions in various tissues and organs. Many studies have shown the existence of RAS in the pancreas of humans and rodents. The aim of this study was to evaluate potential signaling pathways mediated by All in isolated pancreatic islets of rats. Phosphorylation of MAPKs (ERK1/2, JNK and p38MAPK), and the interaction between proteins JAK/STAT were evaluated. All increased JAK2/STAT1 (42%) and JAK2/STAT3 (100%) interaction without altering the total content of JAK2. Analyzing the activation of MAPKs (ERK1/2, JNK and p38MAPK) in isolated pancreatic islets from rats we observed that All rapidly (3 min) promoted a significant increase in the phosphorylation degree of these proteins after incubation with the hormone. Curiously JNK protein phosphorylation was inhibited by DPI, suggesting the involvement of NAD(P)H oxidase in the activation of protein. (C) 2012 Elsevier B.V. All rights reserved.

A stable liquid-liquid extraction system for clavulanic acid using polymer-based aqueous two-phase systems

The partitioning of Clavulanic Acid (CA) in a novel inexpensive and stable aqueous two-phase system (ATPS) composed by poly(ethylene glycol) (PEG) and sodium polyacrylate (NaPA) has been studied. The aqueous two-phase systems are formed by mixing both polymers with a salt (NaCl or Na2SO4) and an aqueous solution of CA. The stability of CA on the presence of both polymers was investigated and it was observed that these polymers do not degrade the biomolecule. The effect of PEG-molecular size, polymer concentrations on the commercial CA partitioning has been studied, at 25 degrees C. The data showed that commercial CA was preferentially partitioned for the PEG-rich phase with a partition coefficient (K-CA) between 1 and 12 in the PEG/NaPA aqueous two phase systems supplemented with NaCl and Na2SO4. The partition to the PEG phase was increased in the systems with high polymer concentrations. Furthermore, Na2SO4 caused higher CA preference for the PEG-phase than NaCl. The systems having a composition with 10 wt.% of PEG4000, 20 wt.% of NaPA8000 and 6 wt.% of Na2SO4 were selected as the optimal ones in terms of recovery of CA from fermented broth of Streptomyces clavuligerus. The partitioning results (K-CA = 9.15 +/- 1.06) are competitive with commercial extraction methods of CA (K-CA = 11.91 +/- 2.08) which emphasizes that the system PEG/NaPA/Na2SO4 can be used as a new process to CA purification/concentration from fermented broth. (C) 2012 Elsevier B.V. All rights reserved.

An in vitro study showing the three-dimensional microenvironment influence over the behavior of head and neck squamous cell carcinoma

Objectives: The Head and Neck Squamous Cell Carcinoma (HNSCC) ranks sixth worldwide. The mechanisms of growth, invasion and metastasis of this pathology are extensively studied and generally related to specific variations in signaling pathways like the PI3K-Akt; however most of these competent studies have been performed bidimensionally, which may hide important questions. This study sought to analyze the influence of the microenvironment upon the behavior of HNSCC. Study Design: The status of pAkt, NF-kappa B and Cyclin D1 proteins was accessed through immunofluorescence and western blot methods in HNSCC cell lines originating from tongue, pharynx and metastatic lymph node when submitted to a three-dimensional culture model utilizing a matrix system. A bidimensional culture model (monolayer) was used as control. Results: The HNSCC cell lines cultured three-dimensionally exhibited a growth pattern characterized by small isolated islands, different from the control group. When the three-dimensional model was applied, two of the studied cell lines showed the same expression pattern as the bidimensional model regarding nuclear or cytoplasmatic localization, as well as reduction of all protein levels; however, the cell line originated from tongue, which specially has the epidermal growth factor receptor constitutively activated, demonstrated nuclear translocation of pAkt and also an increase in the levels of Cyclin D1. Conclusions: The results suggest the influence of the microenvironment upon the behavior of HNSCC cells due to the changed expression of proteins related to tumor growth and cellular invasion. Furthermore, intrinsically genetic conditions also played important roles over the cells, despite the culture model employed.

Photobiological effect of low-level laser irradiation in bovine embryo production system

The objectives of this study were to evaluate the effect of low-level laser irradiation (LLLI) on bovine oocyte and granulosa cells metabolism during in vitro maturation (IVM) and further embryo development. Cumulus-oocytes complexes (COCs) were subjected (experimental group) or not (control group) to irradiation with LLLI in a 633-nm wavelength and 1 J/cm2 fluency. The COCs were evaluated after 30 min, 8, 16, and 24 h of IVM. Cumulus cells were evaluated for cell cycle status, mitochondrial activity, and viability (flow cytometry). Oocytes were assessed for meiotic progression status (nuclear staining), cell cycle genes content [real-time polymerase chain reaction (PCR)], and signal transduction status (western blot). The COCs were also in vitro fertilized, and the cleavage and blastocyst rates were assessed. Comparisons among groups were statistically performed with 5% significance level. For cumulus cells, a significant increase in mitochondrial membrane potential and the number of cells progressing through the cycle could be observed. Significant increases on cyclin B and cyclin-dependent kinase (CDK4) levels were also observed. Concerning the oocytes, a significantly higher amount of total mitogen-activated protein kinase was found after 8 h of irradiation, followed by a decrease in all cell cycle genes transcripts, exception made for the CDK4. However, no differences were observed in meiotic progression or embryo production. In conclusion, LLLI is an efficient tool to modulate the granulosa cells and oocyte metabolism

Zinco, invecchiamento e sistema immunitario: effetti sull'apoptosi e sulla proliferazione dei linfociti

Immunosenescence is characterized by a complex remodelling of the immune system, mainly driven by lifelong antigenic burden. Cells of the immune system are constantly exposed to a variety of stressors capable of inducing apoptosis, including antigens and reactive oxygen species continuously produced during immune response and metabolic pathways. The overall homeostasis of the immune system is based on the balance between antigenic load, oxidative stress, and apoptotic processes on one side, and the regenerative potential and renewal of the immune system on the other. Zinc is an essential trace element playing a central role on the immune function, being involved in many cellular processes, such as cell death and proliferation, as cofactor of enzymes, nuclear factors and hormones. In this context, the age associated changes in the immune system may be in part due to zinc deficiency, often observed in aged subjects and able to induce impairment of several immune functions. Thus, the aim of this work was to investigate the role of zinc in two essential events for immunity during aging, i.e. apoptosis and cell proliferation. Spontaneous and oxidative stress-induced apoptosis were evaluated by flow cytometry in presence of a physiological concentration of zinc in vitro on peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) obtained from healthy subjects of different age: a group of young subjects, a group of old subjects and a group of nonagenarians. In addition, cell cycle phases were analyzed by flow cytometry in PBMCs, obtained from the subjects of the same groups in presence of different concentration of zinc. We also analyzed the influence of zinc in these processes in relation to p53 codon 72 polymorphism, known to affect apoptosis and cell cycle in age-dependent manner. Zinc significantly reduces spontaneous apoptosis in all age-groups; while it significantly increases oxidative stress-induced late apoptosis/necrosis in old and nonagenarians subjects. Some factors involved in the apoptotic pathway were studied and a zinc effect on mitochondrial membrane depolarization, cytochrome C release, caspase-3 activation, PARP cleavage and Bcl-2 expression was found. In conclusion, zinc inhibits spontaneous apoptosis in PBMCs contrasting the harmful effects due to the cellular culture conditions. On the other hand, zinc is able to increase toxicity and induce cell death in PBMCs from aged subjects when cells are exposed to stressing agents that compromise antioxidant cellular systems. Concerning the relationship between the susceptibility to apoptosis and p53 codon 72 genotype, zinc seems to affect apoptosis only in PBMCs from Pro- people suggesting a role of this ion in strengthening the mechanism responsible of the higher propensity of Pro- towards apoptosis. Regarding cell cycle, high doses of zinc could have a role in the progression of cells from G1 to S phase and from S to G2/M phase. These effect seems depend on the age of the donor but seems to be unrelated to p53 codon 72 genotype. In order to investigate the effect of an in vivo zinc supplementation on apoptosis and cell cycle, PBMCs from a group of aged subjects were studied before and after six weeks of oral zinc supplementation. Zinc supplementation reduces spontaneous apoptosis and it strongly reduces oxidative stress-induced apoptosis. On the contrary, no effect of zinc was observed on cell cycle. Therefore, it’s clear that in vitro and in vivo zinc supplementation have different effects on apoptosis and cell cycle in PBMCs from aged subjects. Further experiments and clinical trials are necessary to clarify the real effect of an in vivo zinc supplementation because this preliminary data could encourage the of this element in all that disease with oxidative stress pathogenesis. Moreover, the expression of metallothioneins (MTs), proteins well known for their zinc-binding ability and involved in many cellular processes, i.e. apoptosis, metal ions detoxification, oxidative stress, differentiation, was evaluated in total lymphocytes, in CD4+ and in CD8+ T lymphocytes from young and old healthy subjects in presence of different concentration of zinc in vitro. Literature data reported that during ageing the levels of these proteins increase and concomitantly they lose the ability to release zinc. This fact induce a down-regulation of many biological functions related to zinc, such as metabolism, gene expression and signal transduction. Therefore, these proteins may turn from protective in young-adult age to harmful agents for the immune function in ageing following the concept that several genes/proteins that increase fitness early in life may have negative effects later in life: named “Antagonistic Pleyotropy Theory of Ageing”. Data obtained in this work indicate an higher and faster expression of MTs with lower doses of zinc in total lymphocytes, in CD4+ and in CD8+ T lymphocytes from old subjects supporting the antagonistic pleiotropic role of these proteins.

Isolation and identification of molecular partners of the proteins encoded by the Drosophila tumor suppressor gene lethal(2)tumorous imaginal discs

Ziel dieser Arbeit war es, die funktionelle Bedeutung des Drosophila melanogaster tumor suppressor Gens lethal(2)tumorous imaginal discs (l(2)tid) durch die Identifikation von molekularen Partnern der vom Gen kodierten Proteine zu etablieren. Mit dem Screening einer Expressionsbibliothek mittels des Hefe-Di-Hybrid-Systems wurde das Protein Patched (Ptc) als ein neues Tid-bindendes Protein identifiziert. Ptc ist ein Zentralregulator der Hedhehog-Signalkette. Diese ist in der Entwicklung konserviert und in manchen humanen Krebsarten verwickelt. Die Tid/Ptc-Interaktion wurde mittels unabhängigen biochemischen Methoden wie dem GST-pulldown-Test oder der Immunopräzipitation überprüft. Außerdem ergaben funktionelle Studien in tumorosen Imaginalscheiben einen möglichen inhibitorischen Effekt von Tid über die Hh Signaltransduktion.Im letzten Teil dieser Arbeit wurde die Interaktion zwischen Tid und dem E-APC-Protein (Adenomatous polyposis coli) bewiesen. Polakis und seine Gruppe zeigten durch Studien mit dem Hefe-Di-Hybrid-System und in vitro, dass das hTid mit dem APC-Protein interagiert. Um dies auch auf Drosophila-Ebene zu überprüfen, wurden Immunopräzipitation-Studien mit den Drosophila-Gegenstücken durchgeführt. Diese Studien zeigen zum ersten Mal eine direkte Interaktion beider Proteine in vivo.

Konditionale Expression von HER-2, H-Ras oder BXB-Raf1 in einem Maustumormodell

Es ist bekannt, dass die Überexpression eines einzigen Onkogens im Tumorgewebe einen maligneren Phänotyp zur Folge haben kann. Ein Beispiel hierfür ist die Rezeptortyrosinkinase HER-2. Besonders in Mamma- und Ovarialkarzinomen tritt häufig eine HER-2 Überexpression auf, die mit einer schlechteren Prognose für die Patientinnen einhergeht. Die HER-2 blockierende Therapie mit Trastuzumab (Herceptin®) konnte zu einer signifikanten Verbesserung der Überlebenszeit bei Patientinnen mit metastasierendem Mammakarzinom führen. Es ist deshalb von großem Interesse herauszufinden, ob ein Tumor durch gezielte Blockade eines bestimmten Onkogens sein tumorigenes Potential verlieren kann, und dadurch das Tumorwachstum zumindest zeitweise unterbunden wird. Die Frage ist also, ob ein Tumor reversibel sein kann, wenn die Expression seiner Onkogene blockiert wird. Frühere Arbeiten meiner Arbeitsgruppe haben gezeigt, dass Tumore, die konditional humanes HER-2 exprimierten, nach Ausschalten von HER-2 tatsächlich in Remission gingen, d.h. reversibel waren. Tumorgrößenabhängig konnte sogar eine vollständige Tumorremission beobachtet werden. Die vorliegende Arbeit soll nun helfen, die beobachtete Remission nach Ausschalten von HER-2 besser verstehen zu können. Von Interesse sind dabei vor allem die molekularen Mechanismen, die in dem Tumor nach Ausschalten der HER-2 Expression ablaufen. Die konditionale Expression von HER-2 wurde mit Hilfe des TET-OFF Systems in NIH3T3 Mausfibroblasten erreicht. Mit dieser Technik wurde ein Maustumormodell etabliert, das ermöglichte, die Veränderungen in den Tumoren nach Ausschalten von HER-2 zu untersuchen. Ein besonderes Augenmerk wurde dabei auf zwei der durch HER-2 vermittelten Signalwege gerichtet, den Ras-MAP Kinase Signalweg und die Aktivierung von Akt über die Phosphoinositol-3 Kinase. Beide wurden nach Ausschalten der HER-2 Expression deaktiviert. Um herausfinden zu können, welcher der beiden Wege eine wichtigere Rolle bei der Tumorremission spielt, wurden in der vorliegenden Arbeit zwei weitere Maustumormodelle zur konditionalen Expression von humanem H-Ras bzw. einer Form des humanen c-Raf-1 (BXB-Raf1) etabliert. Die Modelle funktionierten auf dieselbe Weise wie das HER-2 Maustumormodell und es wurden auch dieselben Faktoren untersucht. Ras und Raf sind Mitglieder des Ras-MAP Kinase Signalweges. Raf ist aber im Gegensatz zu HER-2 und Ras nicht in der Lage, Akt zu aktivieren. Durch Vergleich der Ergebnisse der drei Maustumormodelle war es deshalb möglich zu differenzieren, ob Einflüsse auf die Tumorentwicklung über denn Ras-MAP Kinase oder den PI3K/Akt Signalweg vermittelt wurden. Auch Ausschalten von H-Ras oder BXB-Raf1 führte zu einer raschen Tumorremission. Damit wurde erneut die Frage nach der Reversibilität eines Tumors beantwortet. Ob die Remission auf einer Induktion von Apoptose beruhte, konnte nicht endgültig geklärt werden, da es zwar nach Ausschalten von HER-2 zu einer Erhöhung der Apoptoserate kam, nicht jedoch nach Ausschalten von H-Ras oder BXB-Raf1. Aufgrund der vorhandenen Ergebnisse wird vermutet, dass es zu einer Störung des Gleichgewichtes zwischen proliferationsfördernden und apoptotischen Faktoren nach Ausschalten der Onkogene kam. Die in den Tumoren vorhandene Spontanapoptose könnte dann ausreichen, den Prozess der Tumorremission auszulösen. Die Untersuchungen haben gezeigt, dass ERK bzw. der Ras-MAP Kinase Signalweg die bedeutendere Rolle bei der Tumorremission spielte. Zum einen wurde dies belegt durch die Beobachtung, dass die Tumorverläufe von HER-2 und BXB-Raf1 nahezu identisch waren. Zum anderen kam es in allen drei Modellen zu einer Dephosphorylierung von ERK, die der Tumorremission vorausging. Akt schien dagegen keine Rolle zu spielen, da das Ausschalten der HER-2, H-Ras oder BXB-Raf1 Expression zu keiner einheitlichen Veränderung des Posphorylierungsgrades von Akt führte. Demnach ist die Blockade des Ras-MAP Kinase Signalweges, der hauptsächlich proliferationsfördernde Eigenschaften besitzt, wichtiger für die Tumorremission als die Blockade des PI3K/Akt Signalweges, der hauptsächlich anti-apoptotische Eigenschaften vermittelt.

Konditionale Modellsysteme zur Untersuchung der ERBB2-induzierten Tumorgenese

Konditionale Modellsysteme zur Untersuchung der ERBB2-induzierten Tumorgenese Die Rezeptor-Tyrosinkinase ERBB2 ist in einer Vielzahl epithelialer Tumore, wie Mamma- und Ovarialkarzinomen, überexprimiert. Diese erhöhte Expression korreliert mit aggressivem Tumorwachstum, verstärkter Metastasierung und schlechter Prognose für den Patienten. Zur genaueren Untersuchung molekularer Mechanismen, die zur Tumorentstehung infolge der ERBB2-Überexpression führen, wurden im Rahmen dieser Arbeit mit Hilfe des Tet-Systems induzierbare MCF-7 Zelllinien generiert. Diese exprimieren bei Gabe von Doxyzyklin ERBB2 bzw. die zum humanen ERBB2 homologe und durch Punktmutation onkogen aktivierte Rattenvariante NeuT. Nachdem die stringente Regulierbarkeit durch Doxyzyklin für die untersuchten Zellklone gezeigt werden konnte, stellte sich bei der Charakterisierung der Zelllinien heraus, dass die Induktion von ERBB2 erstaunlicherweise nicht zur Proliferation der Zellen, sondern zum Wachstumsarrest führt. Bei der Untersuchung verschiedener Zellzyklusregulatoren konnte dieser Zellzyklusarrest dem CDK-Inhibitor P21 zugeordnet werden, dessen Expression durch ERBB2 induziert wird. In P21-Antisense-Experimenten konnte nachgewiesen werden, dass P21 eine Schlüsselrolle beim ERBB2-induzierten Zellzyklusarrest spielt. Neben der Induktion von P21 und der daraus resultierenden Wachstumsinhibition zeigten die Zellen starke morphologische Veränderungen und waren positiv beim Nachweis der Seneszenz-assoziierten -Galaktosidase. Erstmals konnte gezeigt werden, dass die Induktion des Onkogens ERBB2 nicht zur Proliferation, sondern zur Aktivierung eines verfrühten Seneszenz-Programms führt, welches der Zelle Schutz gegen die Onkogeneinwirkung bietet. Bei der Untersuchung verschiedener Signaltransduktionskaskaden mit Inhibitormolekülen konnte die Aktivierung dieses Seneszenz-Programms der Stress-aktivierten Proteinkinase P38 zugeordnet werden. Zur Identifizierung von Genen, die für die ERBB2-induzierte Tumorgenese relevant sind, wurde die differenzielle Genexpression eines NeuT-Klons nach 8- bzw. 48-stündiger Induktion mit Doxyzyklin in einem cDNA-Array untersucht. Dabei zeigte sich eine besonders starke Induktion von Integrin 5 und Integrin 1, die zusammen den Fibronektinrezeptor bilden. Der funktionale Nachweis des Rezeptors in einem Adhäsionsassay demonstrierte ein stark erhöhtes Adhäsionsverhalten ERBB2-überexprimierender Zellen an Fibronektin. Bei der Untersuchung von Mamma-, Ovarial- und Endometriumkarzinomen konnte die Expression von ERBB2 mit der von Integrin 5 korreliert werden. Diese Ergebnisse machen Integrin 5 zu einem potenziellen neuen Tumormarker und Therapieziel in ERBB2-überexprimierenden Tumoren. Ein weiteres interessantes Gen, das sich im Array durch ERBB2 überexprimiert zeigte, war die Matrix-Metalloproteinase MMP-9. In einem Zymografieassay konnte die erhöhte Gelatinaseaktivität von MMP-9 in Dox-induzierten Zellen nachgewiesen werden. Der Einsatz verschiedener Signaltransduktionsinhibitoren ergab, dass auch die ERBB2-induzierte Expression von MMP-9 über die Aktivierung von P38 läuft. Bei der Suche nach weiteren MMPs, die für die ERBB2-induzierte Tumorgenese relevant sein könnten, wurde MMP-13 untersucht. Erstmals konnte gezeigt werden, dass diese Matrix-Metalloproteinase von ERBB2 induziert wird. Dieser interessante Befund wurde auch in einem anderen Zellmodell in NIH3T3 Mausfibroblasten verifiziert. Durch ihre Matrix-degradierenden Eigenschaften sind MMPs potente „Werkzeuge“ für Tumorzellen und stellen ein wichtiges Ziel zur Unterbindung der Invasion und Metastasierung dieser Zellen dar. Neben den Zellkulturarbeiten wurden im Rahmen dieser Dissertation transgene Responder-Mäuse generiert, die NeuT unter Kontrolle eines Tet-responsiven Promotors exprimieren. Von vier transgenen Gründerlinien zeigten zwei eine unerwünschte, basale NeuT-Expression, für die beiden anderen Linien konnte sowohl in MEF-Assays, als auch nach Kreuzung mit rtTA- bzw. tTA-Effektor-Mäusen eine Dox-abhängige Regulation des Transgens gezeigt werden. Die Tiere dieser Linien sollen in Zukunft mit Effektor-Mäusen gepaart werden, die den rtTA bzw. tTA spezifisch in für die ERBB2-Tumorgenese relevanten Geweben, wie Ovarial- oder Lungenepithelzellen, exprimieren. So können individuelle Tumormodelle für die verschiedenen epithelialen Tumore, bei denen die Überexpression von ERBB2 von Bedeutung ist, entwickelt und untersucht werden.

Bedeutung und Regulation von Apolipoprotein J in atherosklerotischen Läsionen

Apolipoprotein J (ApoJ) ist ein heterodimeres sekretiertes Glycoprotein, welchem sowohl antiapoptotische als auch antiinflammatorische Eigenschaften zugeschrieben werden. Es wird unter vielen pathophysiologischen Zuständen verstärkt exprimiert. Dazu zählen viele Krankheiten wie z.B. Krebs, M. Alzheimer, Creuzfeldt Jakob und Atherosklerose. Die vorliegende Arbeit befasst sich zum Einen mit der Funktion von ApoJ bei Atherosklerose und zum Anderen mit der Regulation von ApoJ durch in atherosklerotischen Läsionen vorkommende Bestandteile. Für die Untersuchungen der Funktion von ApoJ bei der Atherosklerose wurde die „Mainzer Hypothese“ zugrunde gelegt, die davon ausgeht, dass enzymatisch verdautes LDL (high density lipoprotein) (E-LDL) ursächlich für die Entstehung von atherosklerotischen Läsionen ist. In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass ApoJ zwar an E-LDL bindet, nicht aber an natives LDL und dass durch diese Bindung die zytotoxische Wirkung von E-LDL auf glatte Muskelzellen der Ratte unterdrückt wird. Mittels Annexinfärbung und Caspase-Messung konnte gezeigt werden, dass ApoJ in diesem Fall eine antiapoptotische Funktion aufweist. Durch immunhistochemische Untersuchungen an humanen Gewebsschnitten aus frühen atherosklerotischen Läsionen konnte eine Kolokalisation von ApoJ und E-LDL nachgewiesen werden. Diese Ergebnisse unterstreichen die Mainzer Hypothese. Durch eine Behandlung von glatten Muskelzellen der Ratte mit den Lipoproteinen LDL/E-LDL und nekrotischen Zellen sollte die Regulation von ApoJ durch in atherosklerotischen Läsionen vorhandenen Stimuli untersucht werden. Frühere Arbeiten unserer Arbeitsgruppe konnten bereits zeigen, dass eine Behandlung mit nekrotischen Zellen zu einer vermehrten Expression der ApoJ-mRNA führt und dass diese Regulation in Korrelation mit der Expression von Toll-like Rezeptoren (TLR) der verschiedenen Zellen steht. In dieser Arbeit konnte RNA aus nekrotischen Zellen als ApoJ-induzierende Komponente identifiziert werden. Durch Inhibition der TLR3-Signalwege konnten erste Hinweise darüber gewonnen werden, über welche Signaltransduktionswege die ApoJ Regulation erfolgt. Eine Behandlung der Zellen mit E LDL und LDL hingegen führte zu einer Repression der ApoJ-Sekretion. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass in atherosklerotischen Läsionen sowohl ApoJ induzierende wie auch repremierende Stimuli vorhanden sind.

Identifizierung und Charakterisierung von Interaktionspartnern des synaptischen Vesikelproteins Synaptophysin

Die neuronale Signalübertragung beruht auf dem synaptischen Vesikelzyklus, der durch das koordinierte Zusammenspiel von circa 400 verschiedenen Proteinen reguliert wird. Eines der Hauptproteine des synaptischen Vesikels ist Synaptophysin (SYP), das zu den tetraspan vesicle membrane proteins (TVPs) gehört. Es wird vermutet, dass es zahlreiche Funktionen der Exo- und Endozytose moduliert, wenngleich die zugrunde liegenden molekularen Mechanismen bisher größtenteils unverstanden sind. Ziel der Arbeit war daher die Identifizierung von Interaktionspartnern von SYP, um zum Verständnis der vielen ungeklärten Prozesse im synaptischen Vesikelzyklus beizutragen. Mit dem Split-Ubiquitin Yeast Two-Hybrid System, das eine direkte in vivo Interaktion von Membranproteinen erlaubt, konnten in der vorliegenden Arbeit bekannte, aber auch neue SYP-Bindungspartner identifiziert werden. Ein bekannter Interaktionspartner war Synaptobrevin2 (SYB2), das zu den stärksten im Split-Ubiquitin Y2H System identifizierten Bindeproteinen zählt. Zu den neuen starken SYP-Interaktionspartnern gehören die TVPs Synaptogyrin3 (SYNGR3) und SCAMP1. Somit konnten erstmals heterophile Interaktionen zwischen den verschiedenen TVP-Genfamilien nachgewiesen werden, die für eine universelle Funktion der TVPs sprechen. Die Validierung der im Split-Ubiquitin Y2H System ermittelten Interaktionspartner wurde auf eine Auswahl von Proteinen beschränkt, die vermutlich am synaptischen Vesikelzyklus beteiligt sind. Dabei konnte eine immunhistologische Kolokalisierung von SYP mit SYB2, SYNGR3, SCAMP1, Stathmin-like3 (STMN3), Rho family GTPase2 (RND2), Phospholipid transfer protein, Vesicle transport through interaction with t-SNAREs 1B homolog, Arfaptin2 und Profilin1 in den Synapsen-reichen Schichten der Retina beobachtet werden. Die SYP/SYB2- und SYP/SYNGR3-Komplexe konnten zudem sowohl aus Synaptosomen-Lysat als auch aus cDNA-transfizierten Epithelzellen koimmunpräzipitiert werden, wohingegen dies für die anderen Interaktionspartner nicht gelang. Da Koimmunpräzipitation die Struktur der Proteine durch Solubilisierung mit Detergenzien beeinflusst, wurden die in der Hefe beobachteten Interaktionen noch mittels Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer überprüft, mit dem Proteinwechselwirkungen in der nativen Umgebung nachgewiesen werden können. Ein positives FRET-Signal konnte für SYP mit SYB2, SYP, SYNGR3, SCAMP1, STMN3, RND2 und Arfaptin2 detektiert werden, lediglich für SYP mit Phospholipase D4 (PLD4) gelang dieser Nachweis nicht. Ferner zeigten FRET-Analysen von Synaptophysin-Mutanten, dass der zytoplasmatische C-Terminus für die Interaktion mit zytoplasmatischen und membranassoziierten Proteinen benötigt wird. Durch in vivo FRET-Studien mit der SH2-Domäne der Src-Kinase, die an phosphorylierte Tyrosine bindet, konnte eine Tyrosin-Phosphorylierung des zytoplasmatischen C-Terminus von Synaptophysin und von Synaptogyrin3 detektiert werden. Viele der neu identifizierten Synaptophysin-Interaktionspartner sind im Lipid-Metabolismus involviert. Vermutlich rekrutiert der zytoplasmatische und durch Phosphorylierung modifizierbare C-Terminus diese Partner in spezifische Lipoproteindomänen, die an der Feinabstimmung der synaptischen Vesikelendo- und -exozytose beteiligt sind.

Molekulargenetische Untersuchungen zur Reblausresistenz bei der Unterlagsrebe Börner

Dass Pflanzen gegen phytopathogene Infektionen resistent sind, ist das Ergebnis von multip-len Abwehrreaktionen. Eine solche ist auch die Hypersensitivitätsreaktion (HR). Sie ist die Folge eines Befalls von Börner mit Rebläusen und zeigt sich an Blättern und Wurzeln der resistenten Unterlagsrebe in Form von lokalen Nekrosen. Die Erzeugung von neuen, trans-genen reblausresistenten Unterlagsreben verlangt präzise Kenntnisse über die Mechanismen der Reblausresistenz. Um Resistenzgene zu identifizieren, wurden im Rahmen dieser Arbeit differenzielle Genexpressionsanalysen eingesetzt. Diese waren die Microarray Analyse mit der Geniom one Technik und die real time (RT) -PCR. Sie erlaubten eine Gegenüberstellung der Genexpression in behandeltem Wurzelgewebe mit der Expression im Normalgewebe der Unterlagsrebe Börner. Als experimenteller Induktor der HR in Börner diente die Indol-3-Essigsäure (IES), ein Bestandteil des Reblausspeichels. Frühere Untersuchungen zur Reb-lausresistenz zeigten, dass bei einer Behandlung mit IAA an Wurzeln von Börner Nekrosen entstehen, nicht jedoch an Wurzeln von der reblaustoleranten Unterlagssorte SO4 oder dem reblausanfälligem Edelreis. Das war der Grund, SO4 und Riesling als Vergleichsobjekte zu Börner für diese Studie auszuwählen. So sollte die Bedeutung der Rolle von IES als Auslö-ser der Resistenzmechanismen in Börner erklärt werden. Insgesamt konnten deutliche Unter-schiede in den Reaktionen der drei Rebsorten auf die IES Behandlung aufgedeckt werden. Während in Börner eine hohe Anzahl an Genen und diese intensiv auf den IES Reiz reagiert, fallen die Gene bei SO4 und Riesling zahlenmäßig kaum ins Gewicht und die Reaktionen der beiden Sorten auf IES zudem eher schwach aus. In der Summe waren es 27 Gene, die für die Reblausresistenz in Börner verantwortlich sein könnten. So konnte eine IES bedingte Aktivierung von Genen beobachtet werden, die bei der Produktion von Phytoalexinen be-deutsam sind, wie z.B. die phenylalanine ammonia-lyase, die lipoxygenase und die stilbene synthase. Weiter ließ sich eine Regulation von allgemein Stress assoziierten Genen und von Zellwandproteinen und eine Induktion von Signalkomponenten, etwa des Transkriptionsfak-tors ethylene response factor, nachweisen. Eine deutliche Hochregulation von Au-xintransportern in den IES behandelten Börnerwurzeln gab zudem Anhaltspunkte auf sorten-spezifische Unterschiede in der zellulären Aufnahme und Abgabe der IES. Durch die Ausar-beitung des Zusammenspiels der durch IES regulierten Gene konnten in dieser Arbeit wert-volle Hinweise auf die Mechanismen der Reblausresistenz in Börner gewonnen werden.

On the development of novel cocaine-analogues for in vivo imaging of the dopamine transporter status

The present thesis is concerned with the development of novel cocaine-derived dopamine transporter ligands for the non-invasive exploration of the striatal and extra-striatal dopamine transporter (DAT) in living systems. The presynaptic dopamine transporter acquires an important function within the mediation of dopaminergic signal transduction. Its availability can serve as a measure for the overall integrity of the dopaminergic system. The DAT is upregulated in early Parkinson’s disease (PD), resulting in an increased availability of DAT-binding sites in the striatal DAT domains. Thereby, DAT imaging has become an important routine diagnostic tool for the early diagnosis of PD in patients, as well as for the differentiation of PD from symptomatically similar medical conditions. Furthermore, the dopaminergic system is involved in a variety of psychiatric diseases. In this regard, DAT-selective imaging agents may provide detailed insights into the scientific understanding of the biochemical background of both, the progress as well as the origins of the symptoms. DAT-imaging may also contribute to the determination of the dopaminergic therapeutic response for a given medication and thereby contribute to more convenient conditions for the patient. From an imaging point of view, the former demands a high availability of the radioactive probe to facilitate broad application of the modality, whereas the latter profits from short-lived probes, suitable for multi-injection studies. Therefore, labelling with longer-lived 18F-fluoride and in particular the generator nuclide 68Ga is worthwhile for clinical routine imaging. In contrast, the introduction of a 11C-label is a prerequisite for detailed scientific studies of neuronal interactions. The development of suitable DAT-ligands for medical imaging has often been complicated by the mixed binding profile of many compounds that that interact with the DAT. Other drawbacks have included high non-specific binding, extensive metabolism and slow accumulation in the DAT-rich brain areas. However, some recent examples have partially overcome the mentioned complications. Based on the structural speciality of these leads, novel ligand structures were designed and successfully synthesised in the present work. A structure activity relationship (SAR) study was conducted wherein the new structural modifications were examined for their influence on DAT-affinity and selectivity. Two of the compounds showed improvements in in vitro affinity for the DAT as well as selectivity versus the serotonin transporter (SERT) and norepinephrine transporter (NET). The main effort was focussed on the high-affinity candidate PR04.MZ, which was subsequently labelled with 18F and 11C in high yield. An initial pharmacological characterisation of PR04.MZ in rodents revealed highly specific binding to the target brain structures. As a result of low non-specific binding, the DAT-rich striatal area was clearly visualised by autoradiography and µPET. Furthermore, the radioactivity uptake into the DAT-rich brain regions was rapid and indicated fast binding equilibrium. No radioactive metabolite was found in the rat brain. [18F]PR04.MZ and [11C]PR04.MZ were compared in the primate brain and the plasma metabolism was studied. It was found that the ligands specifically visualise the DAT in high and low density in the primate brain. The activity uptake was rapid and quantitative evaluation by Logan graphical analysis and simplified reference tissue model was possible after a scanning time of 30 min. These results further reflect the good characteristics of PR04.MZ as a selective ligand of the neuronal DAT. To pursue 68Ga-labelling of the DAT, initial synthetic studies were performed as part of the present thesis. Thereby, a concept for the convenient preparation of novel bifunctional chelators (BFCs) was developed. Furthermore, the suitability of novel 1,4,7-triazacyclononane based N3S3-type BFCs for biomolecule-chelator conjugates of sufficient lipophilicity for the penetration of the blood-brain-barrier was elucidated.

A SMO inhibitor drug reduces the progenitor cell's maintenance in the Drosophila hematopoietic organ: a novel model to study Chronic Myelogenous Leukemia relapse

The chronic myeloid leukemia complexity and the difficulties of disease eradication have recently led to the development of drugs which, together with the inhibitors of TK, could eliminate leukemia stem cells preventing the occurrence of relapses in patients undergoing transplantation. The Hedgehog (Hh) signaling pathway positively regulates the self-renewal and the maintenance of leukemic stem cells and not, and this function is evolutionarily conserved. Using Drosophila as a model, we studied the efficacy of the SMO inhibitor drug that inhibit the human protein Smoothened (SMO). SMO is a crucial component in the signal transduction of Hh and its blockade in mammals leads to a reduction in the disease induction. Here we show that administration of the SMO inhibitor to animals has a specific effect directed against the Drosophila ortholog protein, causing loss of quiescence and hematopoietic precursors mobilization. The SMO inhibitor induces in L3 larvae the appearance of melanotic nodules generated as response by Drosophila immune system to the increase of its hemocytes. The same phenotype is induced even by the dsRNA:SMO specific expression in hematopoietic precursors of the lymph gland. The drug action is also confirmed at cellular level. The study of molecular markers has allowed us to demonstrate that SMO inhibitor leads to a reduction of the quiescent precursors and to an increase of the differentiated cells. Moreover administering the inhibitor to heterozygous for a null allele of Smo, we observe a significant increase in the phenotype penetrance compared to administration to wild type animals. This helps to confirm the specific effect of the drug itself. These data taken together indicate that the study of inhibitors of Smo in Drosophila can represent a useful way to dissect their action mechanism at the molecular-genetic level in order to collect information applicable to the studies of the disease in humans.

PAS c als signaltransduzierende Domäne des Sensorproteins DcuS von Escherichia coli

Bakterien besitzen membranintegrierte Sensoren für die Reaktion auf verändernde Umweltbedingungen.rnViele der Sensoren sind Zweikomponenten-Systeme bestehend aus einer Sensorhistidinkinase und einem Responseregulator der die zellulare Antwort auslöst. DcuS, der C4-Dicarboxylat-Sensor von DcuS ist eine membranintegrierte Histidin-Kinase. DcuS ist ein Multidomänen-Protein mit einer sensorischen periplasmatischen PASP (Per-Arnt-Sim) Domäne, zwei Transmembranhelices, eine cytoplasmatische PASC-Domäne und eine C-terminale Kinase-Domäne. PAS-Domänen sind ubiquitäre Signalmodule die in allen Reichen des Lebens zu finden sind. PAS-Domänen detektieren eine Vielfalt von Reizen wie Licht, Sauerstoff, Redoxpotential und verschiedene kleine Moleküle so wie die Modulation von Protein-Protein Interaktionen. PAS-Domänen sind strukturell homolog und besitzen eine charakteristische α/β-Faltung. Eine große Anzahl der sensorischen PAS-Domänen wurden identifiziert, aber viele der PAS-Domänen besitzen keinen apparenten Cofaktor und die Funktion ist unbekannt.rnEine Kombination aus gerichteter und ungerichteter Mutagenese, Protein-Protein-Interaktionsstudien und Festkörper-NMR (ssNMR) Experimente mit strukturellem Modelling wurde zur Untersuchung der Struktur und Funktion der cytoplasmatischen PAS-Domäne des membranintegrierten Sensors DcuS verwendet. Die Experimente zeigen, dass PASC eine wichtige Rolle in die Signaltransduktion von PASP zur C-terminalen Histidin-Kinase von DcuS spielt.rn

Signaltransduktion in der membranständigen Sensor-Histidinkinase DcuS von Escherichia coli

Escherichia coli kann unter aeroben und anaeroben Bedingungen mit C4-Dicarboxylaten wachsen, die Regulation des Stoffwechsels erfolgt durch das Zwei-Komponenten-System DcuSR. Die C4-Dicarboxylattransporter DctA (aerob) bzw. DcuB (anaerob) agieren als Co-Regulatoren und bilden gemeinsam mit der Sensor-Histidinkinase DcuS einen Sensorkomplex, in dem DcuS den Sensor darstellt und DctA bzw. DcuB diesen in seine rezeptive Form überführen. DcuS ist membranständig und verknüpft die Bindung von C4-Dicarboxylaten im Periplasma mit der Autophosphorylierung seiner Kinasedomäne im Cytoplasma. Dies stellt den Beginn einer Signalkaskade vom extrazellulären Reiz zum cytoplasmatischen Responseregulator DcuR dar.rnIn dieser Arbeit wurde die intramolekulare Signaltransduktion in DcuS und über die Membran untersucht. Der Fokus lag auf der Funktion der beiden Transmembranhelices TM1 und TM2 und der cytoplasmatischen PAS-Domäne, die die sensorische PASp- mit der effektorischen Kinasedomäne verbinden. Konformationsänderungen dieser Signalweiterleitung wurden durch Cysteinzugänglichkeitsstudien, oxidatives Cystein-Crosslinking und Mutageneseexperimente analysiert. rnTM2 wurde als der Überträger eines transmembranen Signals identifiziert, während TM1 als Membrananker fungiert. Der aktive Signalzustand von TM2 wird unabhängig von der Art der DcuS-Aktivierung (Effektorbindung, Deletion des Co-Regulators DctA oder PASc-ON-Mutationen) eingenommen. Der Signaltransduktion liegt eine Verschiebung von TM2 entlang ihrer Längsachse (Kolbenhub) in Richtung Periplasma zu Grunde. Cystein-Crosslinking offenbarte eine durchgehende Helix aus PASp-α6 und TM2, die im Dimer parallel mit ihrem Pendant verschoben wird. Die Amplitude des Kolbenhubs wurde anhand von Zugänglichkeitsveränderungen, der Lage verankernder Tryptophanreste, Strukturvergleichen und energetischen Berechnungen auf max. 4 - 6 Å festgelegt. Sie ist von der Effektorstärke abhängig und koppelt so die metabolische Bevorzugung einzelner Substrate an das Ausmaß des Kolbenhubs und der Genexpression. Für die cytoplasmatische PAS-Domäne wurde ein Zusammenhang zwischen lokaler Dimerisierung und Kontrolle der Sensorfunktion nachgewiesen. Schwächung der Dimerisierung führt zu einer Aktivierung der Sensorkinase. Es wurde eine hydrophobe Region identifiziert, deren strukturelle Integrität für diese Dimerisierung essentiell ist. Mit N248 wurde ein funktionell bedeutender Rest beschrieben, der auf Grund seiner Lage und seiner Eigenschaft mehrere Sekundärstrukturelemente zu verknüpfen, als Scharnier innerhalb der Domäne an der Umsetzung des Kolbenhubs in eine veränderte Quartärstruktur von PASc beteiligt sein könnte.