Molecular mechanisms and effects of a rasgap-derived peptide on metastatic progression

Cancer is the second leading cause of mortality worldwide. Cancer progression leads to metastasis formation, which accounts for more than ninety percent of cancer-related death. Metastases are more difficult to be surgically removed because of their invasive behavior and shape. In addition, during their transformation journey, they become more and more resistant to anticancer drugs. Significant improvements have been achieved in therapy against cancer in recent years but targeting the metastatic cascade remains the Achilles heel of the cure against cancer. A First step in the metastatic process is the escape of cancer cells from the primary tumor site. This involves an increase in cell motility and the concomitant ability to clear a path through the extracellular matrix. From a therapeutic point of view, inhibition of cell migration is a logical approach to develop anti-metastatic drugs. Our lab previously developed a cell permeable peptide derived from a caspase-3-generaied fragment of the RasGAP protein called TAT-RasGAP317-326. This peptide efficiently and specifically sensitizes cancer cells to chemotherapy- and radiotherapy-induced ceil death, which allows decreasing the anticancer drug doses and eventually their associated side- effects. In the present study we discovered that TAT-RasGAP317.326 also increases cell adhesion which was associated with inhibition of cell migration and invasion into the extracellular matrix. The ability of TAT-RasGAP317.326 to increase ceil adhesion involves the dramatic depolymerization of actin cytoskekton together with redistribution of focal adhesions. We found that the inhibitory effects on migration were mediated by a RhoGAP tumor and metastasis suppressor cailed DLC1 (Deleted in Liver Cancer 1). Moreover. DEC 1 was found to be a direct RasGAP-interacting protein and this interaction requires the RasGAP tryptophan 317 residue, the very first RasGAP residue of TAT-RasGAP317.326. We then evaluated the roie of RasGAP fragments in the in vivo metastatic cascade. We found that breast cancer cells overexpressing the parental RasGAP fragment, to which the TAT-RasGAP317.326 peptide belongs, have a markedly decreased ability to form lung metastases. Unfortunately, we were not able to recapitulate these an ti-metastatic effects when TAT-RasGAP317.326 was injected. However, we later understood that this was due to the fact that TAT-RasGAP317.326 was not properly delivered to the primary tumors. Further work, aimed at better understanding of how TAT-RasGAP317.326 functions, revealed that the ten amino acid TAT-RasGAP317.326 peptide could, be narrowed down to a three amino acid TAT-RasGAP317.329 peptide while keeping its sensitizer activity. In parallel, investigations on the RasGAP-DLCl binding indicated that the arginine linger of the DLC1 GAP domain is required for this interaction, which suggests that TAT-RasGAP317.326 modulates the GAP activity of DLC1. Additional work should be performed to fully elucidate its mechanism of action and render TAT-RasGAP317.326 usable as a tool to fight cancer on two fronts, by improving chemotherapy and preventing metastatic progression. - Le cancer est la deuxième cause de mortalité dans le monde. La formation de métastases est la dernière étape de la progression cancéreuse et représente plus du nonante pour cent des morts induites par le cancer. De par leur morphologie et comportement invasifs, ii est difficile d'avoir recours à la chirurgie pour exciser des métastases. De plus, les cellules cancéreuses en progression deviennent souvent de plus en plus résistantes aux drogues anticancéreuses. Ces dernières années, des avancements significatifs ont contribué à l'amélioration de la lutte contre le cancer. Néanmoins, pouvoir cibler spécifiquement la cascade métastatique demeure cependant le talon d'Achille des thérapies anticancéreuses. Une première étape dans ie processus métastatique est l'évasion des cellules cancéreuses du site de la tumeur primaire. Ceci requiert une augmentation de la motiliié cellulaire couplée à la capacité de se frayer un chemin au sein de la matrice extracelluiaire. D'un point de vue thérapeutique, inhiber la migration cellulaire est une approche attrayante. Notre laboratoire a développé un peptide, nommé TAT-RasGAP317.326 dérivé d'un fragment qui est lui-même le résultat du clivage de la protéine RasGAP par la caspase-3. Ce peptide est capable de pénétrer les cellules cancéreuses et de les sensibiliser spécifiquement à la mort induite par la radiothérapie et la chimiothérapie. La finalité des effets de ce peptide est de pouvoir diminuer les doses des traitements anti-cancéreux et donc des effets secondaires qu'ils engendrent. Dans cette étude, nous avons découvert que TAT-RasGAP317.326 augmente l'adhésion des cellules et inhibe la migration cellulaire ainsi que l'invasion des cellules à travers une matrice extracellulaire. La capacité de TAT-RasGAP317.326 à induire l'adhésion repose sur ia dépolymérisation du cytosquelette d'actine associée à une redistribution des points d'ancrage cellulaire. Nous avons découvert que l'inhibition de ia migration par TAT-RasGAP317.326 nécessitait la présence d'un suppresseur de tumeur et de métastases appelé DLC1 (Deleted in Liver Cancer l), qui par ailleurs s'avère aussi être une protéine RhoGAP. De plus, nous avons aussi trouvé que DLC1 était un partenaire d'interaction de RasGAP et que cette interaction s'effectuait via l'acide aminé tryptophane 317 de RasGAP. qui s'avère être le premier acide aminé du peptide TAT-RasGAP317.326. Nous avons ensuite évalué le rôle joué par certains fragments de RasGAP dans le processus de métastatisation. Dans ce contexte, des cellules de cancer du sein qui sur-expriment un fragment de RasGAP contenant la séquence TAT-RasGAP317.326 ont vu leur potentiel métastatique diminuer drastiquerment. Malheureusement, aucun effet anti-métastatique n'a été obtenu après injection de TAT-RasGAP317.326 dans les souris. Cependant, nous avons réalisé rétrospectivement que TAT-RasGAP317.326 n'était pas correctement délivré à la tumeur primaire, ce qui nous empêche de tirer des conclusions sur le rôle anti-métastatique de ce peptide. La suite de cette étude visant à mieux comprendre comment TAT-RasGAP317.326 agit, a mené à la découverte que les dix acides aminés de TAT-RasGAP317.326 pouvaient être réduits à trois acides aminés, TAT-RasGAP317.329, tout en gardant l'effet sensibilisateur à la chimiothérapie. En visant à élucider le mode d'interaction entre RasGAP et DLC1, nous avons découvert qu'un acide aminé nécessaire à l'activité GAP de DLC1 était requis pour lier RasGAP, ce qui laisse présager que TAT-RasGAp317.32c, module i'activité GAP de DLC1. Des travaux supplémentaires doivent encore être effectués pour complètement élucider les mécanismes d'action de TAT-RasGAP317.326 et afin de pouvoir l'utiliser comme un outil pour combattre le cancer sur deux fronts, en améliorant les chimiothérapies et en inhibant la formation de métastases.

Cumulative risk factors for adolescent alcohol misuse and its perceived consequences among 16 to 20 year old adolescents in Switzerland

Rapport de synthèse : OBJECTIF: évaluer l'impact cumulatif des facteurs individuels et environnementaux associés au mésusage d'alcool chez les adolescents et leurs corrélations avec ses conséquences perçues. METHODE : enquête scolaire transversale d'un échantillon représentatif de la population nationale, incluant 7548 apprentis et élèves ayant terminé l'école obligatoire âgés de 16 à 20 ans, en Suisse, en 2002. Le mésusage de l'alcool est fondé sur les réponses aux questions portant sur la fréquence 1) de sa consommation, 2) des épisodes d'ivresse et 3) de la conduite d'un véhicule sous son emprise. RÉSULTATS : quinze facteurs de risque significatifs ont été identifiés pour les adolescents des deux sexes. Un score individuel de facteurs de risques cumulés a été calculé en les additionnant. L'association entre ce score et la probabilité d'être engagé dans le mésusage d'alcool s'est révélée hautement significative et dose dépendante (p<0.001). Une proportion importante des adolescents rapporte des conséquences subjectives néfastes liées à leur consommation d'alcool. Il existe une corrélation linéaire (p<0.001) entre le score de facteurs de risque et la proportion d'adolescents rapportant des problèmes liés à la consommation d'alcool tels que mauvaises performances scolaires, comportements à risque, problèmes relationnels et comportements sexuels à risques. CONCLUSION : les facteurs de risque du mésusage d'alcool chez les adolescents sont cumulatifs et peuvent être synthétisés par un score individuel corrélé à la tendance à ce mésusage. La relation linéaire de ce score avec des problèmes subjectifs consécutifs à ce mésusage est un indicateur supplémentaire de sa validité.

Molecular analysis of non-melanoma skin cancer

SUMMARY:Cylindroma, trichoepithelioma and spiradenoma are benign tumors of hair follicle. They are caused by mutations and loss of heterozygosity in the CYLD gene. CYLD is a ubiquitously expressed, but the tumors are restricted to skin, suggesting that the tumorigenesis is influenced by skin-specific regulators and probably by mutations in other genes. The objectives of the thesis were to analyze the molecular mechanisms leading to the aforementioned tumors. In the first project, we have identified five new mutations in CYLD gene in tive families affected with different combinations of these skin appendage tumors. F our of these mutations caused the introduction of a premature stop codon in CYLD protein sequence, but one was a missense mutation changing aspartic acid 681 into glycine (D68lG), in patients exhibiting multiple trichoepitheliomas. CYLD is a deubiquitinase which can downregulate NF-κB and INK pathways through the deubiquitination of TRAF2, for example. We showed that the CYLD-D681G mutant was unable to remove polyubiquitin chains from TRAF2. We also proved that CYLD-D68lG could not inhibit TRAP 2- or TNFα- mediated NF-κB or INK activations in 293T cells. These results underlined the importance of the D68l residue for the enzymatic activity of CYLD. TRAP-interacting protein (TRIP), which is a E3-Ubiquitin ligase, is a partner of CYLD. In the second project of the thesis, we studied the function of TRIP in the epidermis. We found that TRIP was a nucleolar protein in cultured human primary keratinocytes (HEK) and HeLa cells, and was detected in the midbody of HeLa cells. Moreover, TRIP expression was shown to be downregulated through a PKC-dependent mechanism before induction of keratinocyte differentiation. We also proved that TRIP was upregulated in basal cell carcinomas. Furthermore, TRIP was found to be important for keratinocyte survival and proliferation through the regulation of the Gl/S transition. Our results suggest that TRIP may be involved in keratinocyte tumorigenesis.RÉSUMÉ :Les cylindromes, trichoépithéliomes et spiradénomes sont des tumeurs bénignes du follicule pileux causées par des mutations et une perte d'hétérozygotie du gène CYLD. CYLD est ubiquitaire mais les tumeurs sont limitées à la peau, suggérant que la tumorigénèse est influencée par des protéines spécifiques de la peau et par des mutations dans d'autres gènes. Les objectifs de la thèse étaient d'2malyser les mécanismes moléculaires aboutissant à la formation de ces tumeurs. Dans le premier projet, cinq nouvelles mutations du gène CYLD ont été identifiées chez cinq familles présentant différentes combinaisons des tumeurs citées ci- dessus. Quatre de ces mutations causaient I' introduction d'un codon stop prématuré dans la séquence protéique, mais une était une mutation «misser1se» changeant l'aspartate 681 en résidu glycine (D68lG) chez des patients présentant des trichoépithéliomes multiples. CYLD est une déubiquitinase qui inhibe les voies de signalisation de NF-κB et JNK, en déubiquitinant notamment TRAF2. Nous avons montré que la protéine mutante CYLD- D68lG ne pouvait pas cliver la chaîne de poly-ubiquitines liée à TRAF2. CYLD-D68lG était aussi incapable d'inhiber l'activation de NF-κB ou de JNK induite par TRAF2 ou TNF-o dans les cellules 293T. Ces résultats ont donc souligné l'impo1tance du résidu D68l pour l'activité de CYLD. «TRAF-interacting protein (TRIP)», qui est une «E3-ubiquitin-ligase», est un partenaire de CYLD. Dans le second proj et de la thèse, nous avons étudié la fonction de TRIP dans l'épidenne. Nous avons montrépque TRIP était nucléolaire dans les cellules HeLa et les kératinocytes primaires humains en culture et était détectée dans le «midbody» des cellules HeLa. Nous avons prouvé que l'ARNm de TRIP était diminué avant l'induction de la différentiation des kératinocytes, par un mécanisme dépendent de la protéine kinase C, tandis qu'il était augmenté dans les carcinomes baso-cellulaires. Nous avons aussi montré que TRIP influençait la prolifération et la survie des kératinocytes en régulant la transition G1/S, Nos résultats suggèrent que TRIP est peut-être impliquée dans la tumorigénèse des kératinocytes. 7

Le lien entre consommation de psychotropes et délinquance : rapport de synthèse

4. Résumés 4.1. Consommation de psychotropes et délinquance dans une perspective comparative internationale 4.1.1. Titre original de la publication et indications bibliographiques : Ribeaud, Denis (2003). << Drug use and crime >>, In: Junger-Tas, J., I. Marshall & D. Ribeaud : Delinquency in an International Perspective : The International Self-Reported Delinquency Study (ISRD), 65-90. Monsey (NY) USA & The Hague, NL: Criminal Justice Press & Kugler Publications. 4.1.2. Résumé Il s'agit ici d'un chapitre dans une monographie portant sur des analyses comparatives menées avec les données de l'International Self-Reported Delinquency Study (ISRD). Le but primaire de cette étude était d'étudier différences et similarités entre différents pays occidentaux d'une part quant à la prévalence et à l'incidence de différents types de délinquance juvénile et d'autre part quant aux facteurs de risques et aux causes de cette délinquance. L'étude a été menée - selon le pays - soit sur la base d'interviews personnelles standardisées soit sur la base de questionnaires écrits et complétés en classe. En tout, l'échantillon analysé comprend 10'843 jeunes âgés entre 14 et 21 ans et provenant des pays Suivants: Belgique, Allemagne, Angleterre et Pays de Galles, Finlande, Italie, Pays-Bas, Irlande du Nord, Portugal, Espagne, Etats-Unis, Suisse. De plus amples informations sur la méthodologie de cette étude se trouvent au deuxième chapitre de l'ouvrage. Le chapitre portant sur la consommation de psychotropes ainsi que sur le lien entre consommation de psychotropes et délinquance traite les questions de recherche esquissées au chapitre précédent. Elles sont brièvement récapitulées ci-dessous ensemble avec les méthodes choisies pour les analyses correspondantes ainsi que les résultats qui en ont découlé. La première question - d'ordre méthodologique - porte sur l'appréciation de la validité externe des taux de prévalence trouvés dans l'échantillon ISRD. La validité externe a été établie en corrélant les taux de prévalence ISRD avec ceux trouvés dans cinq autres études présentant des taux méthodologiquement comparables. Les résultats suggèrent que la validité externe peut être caractérisée de satisfaisante pour autant que les comparaisons soient menées avec des séries de données de qualité - soit d'un niveau de standardisation - comparable à celle des données ISRD. La validité des données ayant été établie, nous avons ensuite comparé la prévalence de la consommation de cannabis et d'un groupe de substances dites « dures » (héroïne, cocaïne, LSD, amphétamines et autres produits stupéfiants de synthèse) entre les différents échantillons étudiés. Les résultats montrent tout d'abord des différences fort prononcées entre les différents pays et villes étudiés. Ensuite, on constate une corrélation prononcée entre les taux de consommation de cannabis et ceux d'autres stupéfiants. De manière générale, les pays anglophones présentent les taux de consommation les plus élevés. Les taux de consommation de « drogues dures » plus élevé dans ces pays s'expliquent pour une bonne partie du fait de la disponibilité dans ces pays de produits stupéfiants de synthèse encore largement inconnus à l'époque sur le continent. Nous avons ensuite étudié les différences de sexe par rapport à la consommation de psychotropes. Dans le groupe des 14 à 18 ans qui est typiquement celui avec les taux de délinquance les plus élevés, ces différences sont plus atténuées que pour d'autres types de délinquance juvénile. En comparant les différents échantillons l'on décèle à nouveau de grandes variations entre les pays étudiés : Contrairement aux autres échantillons, l'Angleterre, la Finlande, les Etats-Unis et l'Allemagne ne présentent quasiment pas de différences entre les sexes. Dans le groupe des 19 à 21 ans les différences entre les sexes sont nettement plus marquées. Nous avons tenté d'expliquer cette interaction entre âge et sexe avec une socialisation différentielle des sexes à l'usage de stupéfiants : Ainsi les filles seraient plutôt initiées à la consommation par des partenaires plus âgées, alors que les garçons apprendraient l'usage de stupéfiants plutôt par des pairs du même âge. L'analyse de l'âge d'initiation à la consommation des différentes substances présente des similarités frappantes entre les échantillons étudiés Plus une substances est proscrites et plus sa consommation est marginalisée, plus élevé est l'âge d'initiation. C'est ainsi que la consommation d'alcool débute en moyenne à 13,5 ans, celle de cannabis 15,0 et celle d'autres stupéfiants à 15,8 ans. Les âges d'initiation aux stupéfiants sont le plus bas aux Etats-Unis, suivi de l'Angleterre et des pays ibériques. De manière générale, nous avons pu déceler une forte corrélation négative entre l'âge d'initiation à la consommation d'une substance illicite et le taux de prévalence : Plus ce taux de consommation est élevé dans un pays donné, plus l'âge d'initiation est bas. Cela suggère que l'âge d'initiation est lié à la disponibilité d'une substance. Concernant le « chevauchement » entre la consommation de différentes substances, nous avons à nouveau constaté de grande similarités entre les différents échantillons : Presque tous les consommateurs de cannabis sont aussi consommateurs d'alcool, alors que l'inverse n'est pas le cas. Similairement, presque tous les consommateurs de « drogues dures » ont déjà fait usage de cannabis, [ors qu'inversement la majorité des consommateurs de cannabis n'a mais utilisé d'autres stupéfiants. En tenant compte que biographiquement la consommation d'alcool et de cannabis précède .11e d'autres stupéfiants, ces observations nous mènent à conclure que la consommation d'alcool et de cannabis est une condition quasiment nécessaire, mais non suffisante, à l'initiation à d'autres stupéfiants. Fous discuterons plus bas les différences du niveau de chevauchement âtre les échantillons. Nos analyses sur le lien entre consommation de psychotropes et délinquance montrent qu'il existe, dans tous les échantillons, une corrélation prononcée entre consommation de stupéfiants d'une part, et e délinquance violente et contre la propriété d'autre part. Afin 'élucider un éventuel ordre causal entre les délits contre la propriété et la consommation de stupéfiants, nous avons ensuite étudié la séquence e leurs âges d'initiation respectifs. Typiquement, la commission de délits contre la propriété précède la consommation de substances licites. Par contre, si on limite l'analyse à de sérieux délits contre la propriété, on trouvera que, typiquement, l'initiation à la consommation de stupéfiants précédera ce type de délinquance. Ceci pourrait donc indiquer que la commission de délits sérieux contre la propriété est une cause directe du besoin d'argent généré par une consommation de stupéfiants habituelle (délinquance « économico compulsive ») ou du moins indiquer une plus forte attache dans un milieu délinquant du fait de la consommation de substances illicites (stade du « renforcement mutuel »). Un des buts des analyses comparatives présentées dans ce chapitre était aussi de déceler un éventuel impact des différentes politiques en matière de stupéfiants sur les taux de consommation. De manière générale, aucun lien n'a pu être établi entre le niveau de répression de la consommation et les taux de consommation. En effet, les taux de consommation les plus élevés ainsi que les âges d'initiation les plus bas ont été décelés pour les Etats-Unis, soit un des pays occidentaux poursuivant probablement une des plus strictes politiques en matière de stupéfiants autant licites qu'illicites, en particulier en ce qui concerne les mineurs. D'autre part, la politique en matière de cannabis relativement libérale que poursuivent les Pays-Bas génère des taux de consommation correspondant à la moyenne occidentale. Cependant, les différents résultats trouvés pour les Pays-Bas indiquent que la politique de séparation du marché du cannabis de ceux d'autres stupéfiants poursuivie dans ce pays semble avoir atteint ses buts à différents niveaux. Alors que le taux de consommation de cannabis n'est pas plus élevé que dans la moyenne européenne, le taux de consommation d'autres stupéfiants se trouve être parmi les plus bas décelés dans les échantillons analysés, de même que le taux de « chevauchement » entre la consommation de cannabis et celle d'autres stupéfiants. Par ailleurs, il semble que cette politique de séparation a aussi un effet bénéfique sur l'âge d'initiation à la consommation d'autres stupéfiants puisque aux Pays-Bas cet âge se trouve être parmi les plus élevés. Ces observations semblent donc indiquer qu'aux Pays-Bas la limite séparant la consommation de cannabis de celle d'autres stupéfiants semble plus « difficile » à franchir que dans d'autres pays. A l'autre extrême du spectre des politiques en matière de stupéfiants, on constate que la politique plus globalement répressive menée aux Etats-Unis est associée à un chevauchement beaucoup plus prononcé entre la consommation de cannabis et celle d'autres stupéfiants. En d'autres termes, il semble que plus une politique en matière de stupéfiants est indifféremment répressive, plus elle facilitera le passage de la consommation de cannabis à celle d'autres stupéfiants, sans pour autant diminuer le niveau global de consommation, alors qu'une politique tentant de séparer les différents marchés en se montrant plus tolérante envers certaines substances moins addictives limitera le taux de ceux passant à usage de substances plus nocives. Nous sommes bien évidemment conscients qu'il s'agit ici de considérations rudimentaires basées sur une comparaison des extrêmes. C'est pourquoi, dans le chapitre final de l'ouvrage, nous avons tenté d'indiquer quels efforts devraient être entrepris afin de mieux opérationnaliser les politiques nationales en matière de stupéfiants. En effet, ce n'est que sur la base de tels efforts de standardisation qu'une analyse comparative quantitative satisfaisant à des critères scientifiques plus rigoureux deviendrait possible et permettrait dès lors de mieux dégager l'impact des politiques mises en oeuvre. 4.1.3. Contribution personnelle à cette recherche Le projet ISRD a été conçu entre 1988 et 1990 par un groupe de chercheurs qui s'était initialement rencontré dans le cadre d'un atelier international de l'OTAN sur les méthodes avancées organisé par le prof. Malcolm W. Klein et le Centre de recherche et de documentation du Ministère de la Justice des Pays-Bas (WODC). Par la suite c'est ce -même ministère qui sous l'égide du Prof. Josine Junger-Tas s'est chargé de la coordination du projet. La récolte de données dans les différents pays s'est déroulée entre 1991 et 1992 sous la direction des groupes de recherches nationaux respectifs. Après la parution du premier volume sur cette recherche en 1994 (Junger-Tas et al., 1994) présentant les résultats individuellement au niveau de chaque pays, le WODC s'est chargé d'assembler les bases de données des différents échantillons en une seule base de donnée en vue des analyses comparatives. Faute de fonds, il fallu attendre une requête du Prof. Martin Killias auprès du FNRS pour reprendre les travaux. C'est dans le cadre du projet ainsi octroyé que j'ai réalisé entre septembre 1999 et juin 2002, ensemble avec les Prof. Josine Junger-Tas et Ineke Haen Marshall, ma recherche sur la base de données ISRO. La première tâche a consisté à achever les efforts de standardisation entamés par le WODC. Bien qu'<< invisibles >>, ce n'est que sur la base de ces fastidieux travaux que des analyses comparatives dignes de ce nom ont été rendues possible. De manière générale, les données ont été standardisées par rapport aux populations retenues dans l'échantillon, par rapport aux modalités des réponses - certains chercheurs avaient opté pour d'autres formats de réponses que leurs collègues - ainsi que par rapport à la codification des valeurs manquantes. Dans un deuxième temps, nous avons créé différents indicateurs de la délinquance juvénile (variables dépendantes) ainsi qu'une série de variables explicatives sur la base de recodifications et recombinaisons des variables originales. Ce n'est qu'après ces travaux préparatifs décrits en détail au chapitre 2 de l'ouvrage que les analyses proprement dites ont été effectuées. Ainsi, ma contribution à l'ouvrage en question a consisté à standardiser la base de données tel que nous l'avions reçue du WODC, ensuite à créer des variables en vue des analyses comparatives et finalement à effectuer tolites les analyses présentées dans l'ouvrage sauf celles du chapitre 7. Pour ce qui est des travaux de rédaction, j'y ai contribué comme auteur unique du chapitre 5, soit celui faisant partie de la présente thèse de doctorat, ainsi que comme co-auteur des chapitres 1, 2, 6 et 8. 4.2. Le lien « drogue-criminalité » dans la perspective de la théorie du contrôle de soi de Gottfredson et Hirschi 4.2.1. Titre original de la publication et indications bibliographiques Ribeaud, Denis & Eisner, Manuel (2006). « The "drug-crime link" from a self-control perspective: An empirical test in a Swiss youth sample », European Journal of Criminology, 3 (1), 33-68. 4.2.2. Résumé Cet article se propose d'explorer dans quelle mesure un déficit du contrôle de soi (« low self-control ») est propre à expliquer le lien empiriquement bien établi entre consommation de psychotropes et délinquance. Sur la base d'un échantillon représentatif de plus de 2'600 élèves de 9erne du canton de Zurich (cf. Eisner et al., 2000) nous nous proposons de réanalyser la dimensionalité de l'échelle du contrôle de soi développée par Grasmick et al. (1993) au moyen d'analyses factorielles confirmatoires. Ces analyses nous ont mené à un modèle factoriel de second ordre composé de cinq dimensions. Ce modèle suggère que tels que le réclament Gottfredson et Hirschi dans leur publication originale (1990) les traits de la personnalité « impulsivité », « goût du risque », « manque de tolérance aux frustrations >), « égocentrisme » ainsi que « préférence pour des activités physique » peuvent effectivement être conçus comme les éléments d'un unique trait sous-jacent de la personnalité, soit le « déficit de contrôle de soi ». Toutefois, en désaccord avec la théorie, nos analyses ont montré qu'une sixième caractéristique prétendument constituante du « déficit de contrôle de soi », soit une « préférence pour des tâches aisées », ne peut être empiriquement conçue comme telle. Le modèle de mesure du « déficit de contrôle de soi » ainsi établi est ensuite utilisé comme variable explicative de deux dimensions comportementales, soit la consommation de substances psychoactives d'une part et la délinquance générale d'autre part. Les résultats indiquent que le « déficit de contrôle de soi » est un prédicteur aussi puissant que stable des deux types de comportements à problème, ceci corroborant donc la théorie de Gottfredson et Hirschi. Toutefois, bien que le « déficit de contrôle de soi » explique une part substantielle de la corrélation entre les deux dimensions comportementales - soit le lien entre consommation de psychotropes et délinquance - il reste une corrélation résiduelle substantielle entre ces deux types de comportements. Diverses considérations théoriques nous ont mené à la conclusion que cette corrélation résiduelle est plus probablement attribuable à des facteurs dynamiques (« state dependent factors », Nagin et Paternoster, 2000) qu'a d'autres facteurs stables de la personnalité (concept de la « population heterogeneity », Nagin et Paternoster, 2000) Nous avons par ailleurs analysé dans quelle mesure chaque sous-dimension du « déficit de contrôle de soi » est apte à expliquer la consommation de substances psychoactives, la délinquance ainsi que le lien entre les deux. Ces analyses suggèrent qu'au niveau de la prédiction de ces deux types de comportements, le « déficit de contrôle de soi » pourrait être réduit à un construit bidimensionnel composé des traits de l'« impulsivité » et du « goût du risque ». L'article se conclut par une discussion des résultats trouvés dans le contexte de la recherche passée ainsi que du débat théorique en cours. En particulier, j'ai tenté de démontrer comment le modèle proposé par Brochu (1995) peut être conçu comme une tentative d'intégration des modèles théoriques centrés sur les différences stables dans la population (« population heterogeneity ») - parmi lesquels aussi la théorie du « déficit du contrôle de soi » et ceux s'intéressant plutôt aux facteurs dynamiques (« state dependence ») et comment ce modèle permet de réconcilier ces deux approches à priori contradictoires. 4.2.3. Contribution personnelle à cette recherche L'étude zurichoise à la base de cette contribution a été menée sous la direction du Prof. Manuel Eisner entre 1999 et 2000 et financée par la Département de l'éducation du Canton de Zurich. Le questionnaire ainsi que la méthodologie de l'étude à la base de l'étude ont été développés par l'Institut de recherche criminologique de Basse-Saxonie (KFN). Il convient cependant d'indiquer ici que c'est au Prof. Eisner que revient le mérite d'avoir ajouté l'échelle de Grasmick et al. au questionnaire. Ayant fait d'emblée partie de l'équipe de recherche, j'ai eu l'occasion de participer autant à l'adaptation du questionnaire qu'a la planification et la coordination de la récolte de données. En particulier, le domaine de l'échantillonnage m'a été entièrement confié. La saisie ainsi que la préparation des données ont été assurées par le KFN. Ma contribution à l'article en question comprend autant sa conception, la réalisation des analyses, ainsi que sa rédaction. La contribution de mon co-auteur, Manuel Eisner, a tout d'abord consisté en sa fonction de directeur de recherche de même que, dans la version finale soumise à l'European Journal of Criminology, dans la relecture critique de l'article et dans la co-rédaction des conclusions. 4.3. Effets à long terme des essais avec prescription d'héroïne sur la délinquance des consommateurs d'héroïne traités 4.3.1. Titre original de la publication et indications bibliographiques Ribeaud, Denis (2004). « Long-term impacts of the Swiss heroin prescription trials on crime of treated heroin users >), Journal of Drug Issues, 34 (1), 163-194. 4.3.2. Résumé Dans le cadre des projets suisses avec prescription d'héroïne (PROVE, 1994-1996) plus de 1'000 consommateurs d'héroïne gravement dépendants ont été enrôlés autant dans le programme de traitement que dans son évaluation scientifique. Alors que les effets à court et à moyen terme avaient été analysés en détail dans des études précédentes (cf. Killias et al., 1999; Uchtenhagen et al., 1999), peu de données étaient disponibles sur les effets du programme à plus long terme, les données sur les participants ayant interrompu le programme étant particulièrement rares. Afin de remplir partiellement cette lacune, en été 2000, les fichiers de police de tous les participants au programme - soit donc aussi de ceux qui l'avaient quitté entre-temps - ont été saisis auprès des onze corps de police recouvrant toutes les localités où un programme avec prescription d'opiacés avait été mis en place. Sur la base de ces données, notre article analyse les effets à long terme - soit sur une période de 48 mois après l'admission - du programme PROVE sur la délinquance et, dans une certaine mesure, sur les comportements addictifs des participants. Avant la présentation des résultats proprement dit, nous avançons quelques réflexions méthodologiques sur la validité des données de police comme indicateurs de l'évolution de l'implication délinquante, l'argument principal étant qu'il est peu probable que le déclin général observé soit lié à une diminution de la dénonciation de délits par la police puisque le déclin constaté pour les délits typiquement découverts et dénoncés par la police (p. ex. infractions contre la LStup) est presque identique à celui observé pour les délits typiquement dénoncés par la population générale et le commerce (p. ex. vols et cambriolages). Toutefois nous constatons que cette congruence n'est que partielle pour ce qui est de la période avant le début du traitement et tentons d'expliquer cette dissimilarité. Les résultats suggèrent que la prescription d'héroïne est à la source d'un déclin prononcé et stable de l'implication délinquante des personnes traitées. Un désistement similaire peut être observé pour une large gamme de délits et pour différentes sous-populations - par rapport à l'âge, au sexe, à la consommation d'autres substances et à la durée du traitement. Bien que la diminution la plus prononcée soit observée dans le groupe de ceux traités sans interruption, il semble toutefois que les effets du traitement persistent dans la période post-traitement. Il est en particulier intéressant de noter que les taux post-traitement pour possession d'héroïne se stabilisent à un niveau bas, ceci indiquant que la majorité de ceux ayant quitté le programme ne reprennent pas leur consommation d'héroïne. Comme le suggèrent certaines analyses complémentaires, il semble que cette stabilisation est en particulier due à la capacité du programme de rediriger la majorité des patients vers des traitements alternatifs une fois que ceux-ci ont quitté le programme. 4.3.3. Contribution personnelle à cette recherche L'article en question fait partie d'une recherche mandatée par l'Office fédéral de la santé publique (OFSP) en 1999. S'agissant d'une étude de suivi au premier mandat d'évaluation criminologique du programme PROVE par l'OFSP, sa méthodologie était prédéfinie d'emblée. L'équipe de recherche dirigée par le Prof. Martin Killias et constituée de Marcelo Aebi et de moi-même - ainsi que de quelques autres collaborateurs et étudiants chargés de la récolte proprement dite - a toutefois revu et amélioré le schéma de récolte développé lors de la première étude. J'ai ensuite participé à cette étude en tant que coordinateur de la récolte de données dans les corps de police suisses alémaniques impliqués (à l'exception de Bâle-Ville). La coordination de la saisie et la préparation des données ont été principalement assurées par Marcelo Aebi. Par la suite j'ai mené une première analyse de ces données qui a abouti à une première publication (Ribeaud Aebi, 2001). Certains résultats ont aussi été présentés dans le rapport de recherche correspondant (Killias et al., 2002). L'article présenté ici se distingue des publications susmentionnées par une réanalyse approfondie des données de police récoltées en 2000. J'en ai entièrement assuré la conception, les analyses ainsi que la rédaction. 4.4. La diminution de la délinquance dans le cadre des essais suisses avec prescription d'héroïne: Est-elle due à la réintégration sociale des personnes traitées ? 4.4.1. Titre original de la publication et indications bibliographiques Ribeaud, Denis (2005). « Gibt es einen Delinquenzrückgang durch soziale Reintegration im Rahmen der schweizerischen Heroin-verschreibungsversuche? >), Sucht, 51 (2), 76-87. 4.4.2. Résumé Le but de cet article est d'examiner si la diminution de la délinquance des personnes traitées dans le cadre des essais suisses avec prescription d'héroïne (PROVE) est accompagnée, au niveau de l'individu, d'une évolution complémentaire des indicateurs de la situation sociale et des comportements addictifs de ces personnes, ceci entre autre dans le but de vérifier si le désistement observé est attribuable à un processus de réintégration sociale. Afin de vérifier cette hypothèse générale, nous avons tout d'abord fusionné la base contenant les données des interviews de suivi sur les comportements délinquants avec celle portant sur le domaine des comportements addictifs et sur l'intégration sociale et économique des patients. En effet, avant cette recherche, ces deux bases de données n'avaient jamais été analysées conjointement au niveau individuel. Qui plus est, les résultats publiés sur ces deux domaines ne se basaient pas sur les mêmes échantillons, rendant donc les comparaisons entre les deux domaines quelque peu hasardeuses. C'est pourquoi nous avons, sur la base de ces données fusionnées, tout d'abord vérifié s'il s'en dégageait les mêmes lignes de développement que celles observées dans les publications originales, soit Killias et al. (2003) et Uchtenhagen et al. (1999). À une exception près qui concernait l'intégration professionnelle, nous avons pu reproduire les résultats originaux. Nous avons ensuite procédé à la vérification de l'hypothèse centrale en nous concentrant sur le groupe des patients ayant indiqué des activités délinquantes avant l'entrée dans le programme. L'analyse, techniquement basée sur des régressions logistiques bivariées, consistait à examiner, pour chaque indicateur de la situation sociale et des comportements addictifs, s'il y avait un parallélisme entre désistement et réintégration sociale ou comportements addictifs. Plus concrètement, il s'agissait d'examiner si, par exemple, ceux qui ne présentaient plus de délinquance pendant le traitement étaient surreprésentés dans le groupe de ceux qui avaient trouvé un emploi ou qui en avaient toujours eu un. Les résultats nous ont mené à une vue différenciée du phénomène de désistement, en ce sens que le retrait de la « scène de la drogue » ne peut être confondu avec une réintégration socio-économique : En effet, alors que la diminution de la délinquance va de pair avec un retrait de la « scène de la drogue » et des comportements addictifs correspondants, nous n'avons pas pu observer un parallélisme équivalent entre désistement et réintegration sociale telle qu'indiquée par des indicateurs comme l'emploi, la dépendance d'aides financières ou encore la situation de logement. Nos analyses nous mènent à la conclusion que la réduction de la délinquance s'explique essentiellement par le fait de la relâche de compulsions économiques engendrées par la prescription d'héroïne et non du fait d'une réintégration sociale. Des publications récentes sur l'évolution à long terme de la situation sociale des personnes traitées (cf. semblent d'ailleurs indiquer que, même après plusieurs années de traitement, l'intégration socio-économique des patients ne s'est guère améliorée. Ceci suggère que l'appui psychosocial offert aux patients et qui était censé assurer leur réintégration ne s'est montré guère efficace. Ces résultats sont aussi intéressant au niveau théorique : En effet, alors qu'ils corroborent le concept de délinquance « économico-compulsive », telle que décrit par Brochu (1995), ils sont en opposition autant avec la théorie du « contrôle de soi » de Gottfredson et Hirschi (1990), qui n'offre pas les instruments théoriques nécessaires à l'explication d'une pareil « implosion » de l'activité délinquante, qu'avec la théorie du contrôle social de Hirschi (1969) qui aurait laissé supposer que la diminution de la délinquance devrait aller de pair avec un renforcement des liens avec la société conventionnelle. 4.4.3. Contribution personnelle à cette recherche S'agissant d'une réanalayse de données récoltées entre 1994 et 1996, soit avant mon arrivée à l'IPSC, il est évident que je n'ai pas eu l'occasion de participer à la conception générale du projet PROVE, au développement des instruments, ainsi qu'a la récolte de données. Ma première tâche a consisté à assembler les données de suivi de l'évaluation criminologique, soit de l'étude menée à l'IPSC, avec celles de l'évaluation du développement psychosocial, soit l'étude menée à l'Institut Kir Suchtforschung (ISF). Comme pour l'étude ISRD, ces travaux préparatoires se sont avérés fort délicats et de longue haleine L'idée de recherche m'était venue en constatant que, d'une part, nous disposions de résultats acquis concernant l'effet bénéfique du programme PROVE sur la diminution de la délinquance des personnes traitées, ainsi que sur différents domaines de leurs situation sociale, et que d'autre part, peu de connaissances étaient acquises sur les mécanismes du processus de désistement. Disposant de données longitudinales prospectives pour les deux domaines comportementaux, ce ne fût plus qu'un petit pas que de conclure qu'une analyse de la coévolution au niveau individuel entre les comportements délinquants, d'une part, et certains indicateurs du domaine psychosocial, d'autre part, pourrait s'avérer utile pour la détection de tels mécanismes. C'est sur la base de cette réflexion et de ces travaux préparatoires que j'ai ensuite analysé les données et que j'ai présenté des premiers résultats au colloque de l'Association des criminologues de langue française (AICLF) en 2002. L'article finalement soumis auprès de « Sucht » se base sur un affinement de ces analyses initiales.

Reactive rise in blood pressure upon cuff inflation : cuff inflation at the arm causes a greater rise in pressure than at the wrist in hypertensive patients

Résumé en français: Il est admis que l'inflation d'une manchette à pression au niveau du bras engendre une augmentation réactionnelle de la tension artérielle qui peut être le résultat d'une gêne lors de l'inflation et peut diminuer la précision de la mesure. Dans cette étude, nous comparons séquentiellement l'augmentation de la tension artérielle lorsque la manchette à pression est positionnée au niveau du bras et au niveau du poignet. Nous avons étudié un collectif de 34 participants normotendus et 34 patients hypertendus. Chacun d'eux était équipé de deux manchettes à pression, l'une au niveau du bras et l'autre au niveau du poignet. Nous avons randomisé l'ordre d'inflation des manchettes ainsi que la pression d'inflation maximale (180mmHg versus 240mmHg). Trois mesures étaient effectuées pour chaque pression d'inflation maximale, ceci au bras comme poignet, et leur séquence était également randomisée. En parallèle, un enregistrement continu de la tension artérielle avait lieu au niveau du majeur de la main opposée à l'aide d'un photoplethysmographe. Cette valeur était considérée comme la valeur de tension artérielle au repos. Pour les participants normotendus, aucune différence statistiquement significative n'a pu être mise en évidence en lien avec la position de la manchette à pression, ceci indépendamment de la pression d'inflation maximale. Variation de la pression systolique à 180 mmHg: 4.3+/-3.0 mmHg au bras et 3.7+/-2.9 mmHg au poignet (p=ns), à 240 mmHg: 5.5+/-3.9 au bras et 4.2+/-2.7 mmHg au poignet (p=0.052). En revanche, concernant les patients hypertendus, une augmentation significative de la tension artérielle a été mise en évidence entre le bras et le poignet. Ceci pour les valeurs de tension artérielle systolique et diastolique et quelle que soit la pression d'inflation maximale utilisée. Augmentation de la pression artérielle systolique 6.513.5 mmHg au bras et 3.812.1mmHg au poignet pour une pression d'inflation maximale de 180 mmHg (p<0.01) et respectivement 6.413.5 mmHg et 4.713.0 mmHg pour 240 mmHg (p=0.01). L'augmentation des valeurs de tension artérielle était indépendante de la valeur tensionnelle de base. Ces résultats montrent que les patients hypertendus réagissent significativement moins à l'inflation d'une manchette ä pression lorsque celle-ci est positionnée au niveau du poignet par rapport au bras, ceci indépendamment des valeurs de tension artérielle de base des patients. Nous pouvons donc suggérer que l'inflation d'une manchette à pression cause moins de désagrément lorsqu'elle est placée au niveau du poignet, notamment chez les patients hypertendus et qu'elle peut être une alternative à la mesure standard au niveau du bras.

Femur fracture in preschool children : experience with flexible intramedullary nailing in 72 children

RESUME Fractures du fémur chez les enfants d'âge préscolaire. Expérience avec l'enclouage centromédullaire élastique stable chez 72 enfants Introduction L'immobilisation plâtrée est le traitement le plus fréquemment utilisé pour traiter les fractures du fémur chez les enfants d'âge préscolaire de moins de 6 ans. L'enclouage centromédullaire élastique stable (ECMES), qui a remplacé les immobilisations plâtrées chez les enfants d'âge scolaire, est une alternative qui n'a jamais été étudiée spécifiquement dans la tranche d'âge préscolaire. Matériel et Méthode Nous avons réalisé une étude rétrospective de tous les cas de fractures du fémur chez l'enfant de moins de 6 ans traitées par ECMES dans le service de chirurgie pédiatrique du Centre Hospitalier Universitaire Vaudois et de l'Hôpital de l'Enfance de Lausanne sur une période de 15 ans. Résultats Parmi les 210 fractures du fémur traitées par ECMES entre le 1.1.1988 et le 31.12.2003, 74 fractures du fémur ont été identifiées chez 73 enfants âgés de 1.5 à 5.9 ans. Ces fractures étaient sous-trochantériennes (n=5), diaphysaires (n=64, dont 5 ouvertes), ou métaphysaires discales (n=4). Le type de fracture était transverse (n=35, dont 2 ouvertes), oblique (n=28, dont 3 ouvertes) au spiroïde (n=11). Quatre fractures étaient comminutives. Le temps opératoire moyen était de 56,9 minutes (limites entre 20 et 155 min.) pour les enfants ne présentant pas d'autre pathologie chirurgicale. Le séjour hospitalier moyen était de 9.1 jours (limites entre 1 et 46 jours) pour tous les enfants n'ayant pas de pathologie associée. Chez les enfants sans lésion ou pathologie associée, la première mise en charge s'est effectuée en moyenne au 14,1 ème jour post-opératoire (limites entre 1 et 42ème jour) alors que la première mobilisation a eu lieu en moyenne dès le 2,7ème jour post-opératoire (limites entre le 1 et le 14ème jour). 64 enfants ont été suivis à long terme avec un recul moyen de. 36,8 mois (limites entre 4 et 124 mois). Nous avons relevés 6 enfants avec une inégalité de longueur de plus d'un centimètre, alors que nous n'avons jamais constaté de défaut de rotation. Durant le 11 premières années de l'étude, 9 enfants ont dû être réopérés pour raccourcissement secondaire de broches extériorisées ou douloureuses sous la peau. Aucun problème de broche n'a été observé après introduction d'une nouvelle pince à couper. 2 réductions de fracture se sont faites à foyer ouvert. Une infection localisée transitoire du point de ponction d'une broche a été notée, sans ostéite associée. Discussion L' ECMES chez le petit enfant est techniquement réalisable sans véritable limite inférieure d'âge. Il favorise la mobilisation et la charge précoces. Les complications sont avant tout en rapport avec la technique et peuvent être évitées. Les résultats sont au moins aussi bons et meilleurs sur certains points que ceux publiés en utilisant les immobilisations. En outre ce traitement évite une longue hospitalisation. Conclusions L'ECMES peut être appliqué aux enfants de moins de 6 ans avec les mêmes bénéfices que ceux observés pour les plus grands, sans en augmenter la morbidité. La limite inférieure d'âge reste à déterminer. Un suivi à long terme s'impose pour vérifier l'absence d'inégalité de longueur des membres inférieurs.

Missale romanum.

F. 1 Séquence et messe de la Fête-Dieu. F. 2 Calendrier romain, avec additions des Chartreux de Sainte-Croix de Jérusalem à Rome. F. 8-134 et 151v-197v Temporal : « Ordo missalis romane curie » : — Exultet (122v). F. 134v « Ordo missae. » F. 199-255v Sanctoral : Vig. s. André (199) ; — ste Catherine (255) ; — ste Claire (255v). F. 255v Commun des saints. F. 277v Messes votives. F. 290 Bénédiction de l'eau (incompl. de la fin).

Perspectives féministes en éducation

A entendre le discours ambiant d'aujourd'hui, tout serait résolu dans la question de l'éducation des filles et de l'égalité des sexes dans le domaine de l'éducation. A l'école, voilà plusieurs années que les filles ont en moyenne de meilleurs résultats scolaires que les garçons et qu'elles forment la majorité de la population estudiantine universitaire dans pratiquement toute l'Europe. En fait l'école n'est pas neutre et les institutions de formation continuent de prendre une part active, avec la famille et la culture, à la construction d'individus répondant aux rôles sexués traditionnels. Réfléchir aux pratiques qui permettraient de rendre l'éducation égalitaire reste donc un objectif à l'ordre du jour, d'autant plus que la formation scolaire et professionnelle constitue un pré-requis pour l'émancipation des femmes.

New human kallikrein 14: enzymatic characterization and inhibitors development.

RESUME DESTINE A UN LARGE PUBLIC En biologie, si une découverte permet de répondre à quelques questions, en général elle en engendre beaucoup d'autres. C'est ce qui s'est produit récemment dans le monde des kallicréines. De la famille des protéases, protéines ayant la faculté de couper plus ou moins spécifiquement d'autres protéines pour exercer un rôle biologique, la famille des kallicréines humaines n'était composée que de 3 membres lors du siècle dernier. Parmi eux, une kallicréine mondialement utilisée pour détecter le cancer de la prostate, le PSA. En 2000, un chercheur de l'hôpital universitaire Mont Sinaï à Toronto, le Professeur Eleftherios Diamandis, a découvert la présence de 12 nouveaux gènes appartenant à cette famille, situés sur le même chromosome que les 3 premières kallicréines. Cette découverte majeure a placé les spécialistes des kallicréines face à une montagne d'interrogations car les fonctions de ces nouvelles protéases étaient totalement inconnues. La kallicréine humaine 14 (hK14) présente un intérêt particulier, car elle se retrouve associée à différents cancers, notamment les carcinomes ovariens et mammaires. Cette association ne répond cependant pas à la fonction de cette protéase. L'objectif de ce travail de thèse était donc de découvrir, dans un premier temps, la spécificité de cette nouvelle kallicréine, c'est-à-dire le type de coupure qu'elle engendre au niveau des protéines qu'elle cible. Utilisant une technologie de pointe qui exploite la propriété des bactériophages à se répliquer dans les bactéries à l'infini, des dizaines de millions de combinaisons protéiques aléatoires ont été présentées à hK14, qui a pu sélectionner celles qui lui étaient favorables pour la coupure. Cette technique qualitative porte le nom de Phage Display Substrate. Une fois la sélection réalisée, il fallait transférer ces séquences coupées ou substrats dans un système permettant de donner une valeur quantitative à l'efficacité de coupure. Pour cela nous avons développé une technologie qui permet d'évaluer cette efficacité en utilisant des protéines fluorescentes de méduse, modifiées génétiquement, dont l'excitation de la première (CFP : cyan fluorescent protein) par la lumière à une certaine longue d'onde permet le transfert d'énergie à la seconde (YFP : yellow fluorescent protein), via un substrat qui les lie. Pour que ce transfert d'énergie se produise, il faut que les deux protéines fluorescentes soient proches, comme c'est le cas lorsqu'elles sont liées par un substrat. La coupure de ce lien provoque un changement de transfert d'énergie qui est quantifiable en utilisant un spectrofluoromètre. Cette technologie permet donc de suivre la réaction d'hydrolyse (coupure) des protéases. Afin de poursuivre certaines expériences permettant de mieux comprendre la fonction biologique d'hK14 ainsi que son éventuelle implication dans le cancer, nous avons développé des inhibiteurs spécifiques d'hK14. Les séquences qui on été le plus efficacement coupées par hK14 ont été utilisées pour transformer deux types d'inhibiteurs classiques, qui circulent dans notre sang, en inhibiteurs d'hK14 hautement efficaces et spécifiques. Selon les résultats obtenus in vitro, ils pourront être évalués in vivo en tant que traitement potentiel contre le cancer. RESUME Les protéases sont des enzymes impliquées dans des processus physiologiques mais aussi parfois pathologiques. La famille des kallicréines tissulaires humaines représente le plus grand groupe de protéases humaines, dont plusieurs pourraient participer au développement de certaines maladies. D'autre part, ces protéases sont apparues comme des marqueurs de pathogénicité potentiels, notamment dans les cas de cancers hormono-dépendants. La kallicréine humaine 14 a été récemment découverte et son implication dans quelques maladies, particulièrement dans le cas de tumeurs, semble probable. En effet, son expression génique est augmentée au niveau des tissus cancéreux de la prostate et du sein et son expression protéique s'est révélée plus élevée dans le sérum de patientes atteintes d'un cancer du sein ou des ovaires. Cependant, comme c'est le cas pour la plupart des kallicréines, sa fonction est encore inconnue. Afin de mieux connaître son rôle biologique et/ou pathologique, nous avons décidé de caractériser son activité enzymatique. Nous avons tout d'abord mis au point un système de substrats entièrement biologique permettant d'étudier in vitro l'activité des protéases. Ce système est basé sur le phénomène de FRET, à savoir le transfert d'énergie de résonance fluorescente qui intervient entre deux molécules fluorescentes voisines si le spectre d'émission de la protéine donneuse chevauche le spectre d'excitation de la protéine receveuse. Nous avons fusionné de manière covalente une protéine fluorescente bleue (CFP) et une jaune (YFP) en les liant avec diverses séquences. Par clivage de la séquence de liaison, une perte du transfert d'énergie peut être mesurée par un spectrofluoromètre. Cette technologie représente un moyen facile de suivre la réaction d'hydrolyse des protéases. Les conditions optimales de production de ces substrats CFP-YFP ont été déterminées, de même que les paramètres pouvant éventuellement influencer le FRET. Ce système possède une grande résistance à la protéolyse non spécifique et est applicable à un grand nombre de protéase. Contrairement aux substrats fluorogéniques, il permet d'étudier les acides aminés se trouvant des deux côtés du site de clivage. Ce système étant entièrement biologique, il est le reflet des interactions protéine-protéine et représente un outil biologique facile, bon marché et rapide pour caractériser les protéases. Dans un premier temps, hK14 a été mise en présence d' une banque de haute diversité de pentapeptides aléatoires présentée à la surface de phages afin d'identifier des substrats spécifiques. Ensuite, le système CFP-YFP a été employé pour trier les peptides sélectionnés afin d'identifier les séquences de substrats les plus sensibles et spécifiques pour hK14. Nous avons montré, qu'en plus de sa prévisible activité de type trypsine, hK14 possède aussi une très surprenante activité de type chymotrypsine. Les séquences les plus sensibles ont été choisies pour cribler la banque de donnée Swissprot, permettant ainsi l'identification de 6 substrats protéiques humains potentiels pour hK14. Trois d'entre eux, la laminine α-5, le collagène IV et la matriline-4, qui sont des composants de la matrice extracellulaire, ont démontré une grande susceptibilité à l'hydrolyse par hK14. De plus, la séparation éléctrophorétique a montré que la dégradation de la laminine α-5 et de la matriline-4 par hK14 devait se produire aux sites identifiés par la technologie du phage display. Pour terminer, nous avons transformé, par mutagenèse dirigée, deux serpines (inhibiteurs de protéases de type sérine) connues, AAT et ACT (alpha anti-trypsine et alpha anti-chymotrypsine), qui inhibent un vaste éventail d'enzymes humaines en inhibiteurs d'hK14 hautement efficaces et spécifiques. Ces inhibiteurs pourront être utilisés d'une part pour poursuivre certaines expériences permettant de mieux comprendre l'implication d'hK14 dans des voies physiologiques ou dans le cancer et d'autre part pour les évaluer in vivo en tant que traitement potentiel contre le cancer. SUMMARY Proteases consist of enzymes involved in physiological events, but also, in case of dysregulation, in pathogenicity. The human tissue kallikrein family represents the largest human protease cluster and includes several members that either could participate in the course of certain diseases or emerged as potential biological markers, especially in hormone dependent cancers. The human kallikrein 14 has been recently discovered and suggested implications in some disorders, particularly in tumors since its gene expression is up-regulated in prostate and breast cancer tissues and its protein expression increased in the serum of patients with breast and ovarian cancers. However, like most kallikreins, its function remains unknown. To better understand hK14 biological and/or pathological role, we decided to characterize its enzymatic activity. First of all, we developped a biological system suitable for in vitro study of protease activity. This system is based on the so-called FRET phenomenon, that is the Fluorescence Resonance Energy Transfer that occurs between two nearby fluorescent proteins if the emission spectrum of the donor overlaps the excitation spectrum of the acceptor. We fused covalently a cyan fluorescent protein (CFP) and a yellow fluorescent protein (YFP) with diverses sequences. Upon cleavage of the linker sequence by protease, the loss of energy transfer can be measured by a spectrofluorometer allowing an easy following of hydrolysis reaction. The optimal conditions to produce in bacterial system these CFP-YFP substrates were determined as well as the parameters that could eventually influence the FRET. This system demonstrated a high degree of resistance to non-specific proteolysis and applicability to various conditions corresponding to a great number of existing proteases. Other avantages are the possibility to study the amino acids located both sides of the cleavage site as well as the interest to work in a full biological system reflecting protein-protein interaction. A phage substrate library with exhaustive diversity was used prior to CFP-substrate-YFP system to isolate specific human kallikrein 14 substrates. After that the CFP-YFP system was used to sort peptides and identify highly sensitive and specific substrate sequences for hK14. We showed that besides its predictable trypsin-like activity, hK14 also possesses a surprising chymotrypsin-like activity. The screening of the Swissprot database was achieved with the most sensitive sequences and allowed the identification of 6 potential human protein substrates for hK14. Three of them, laminin α-5, collagen IV and matrilin-4, which are components of the extracellular matrix were incubated with hK14, by which they were efficiently hydrolyzed. Moreover, electrophoretic separation revealed that degradation of laminin α-5 and matrilin-4 by hK14 generated fragments with identical molecular size than the predicted N-terminal fragments that would result from hK14 specific cleavage, proving the value of phage display substrate to identify potential substrates. Finally, with site-directed mutagenesis, we transformed two well-known serpins (serine protease inhibitors), AAT and ACT (alpha anti-trypsin and alpha anti-chymotrypsin), which inhibit a vast spectrum of human enzymes into highly efficient and specific hK14 inhibitors. These inhibitors will be used to pursue experiments that could help understand hK14 implication in physiological pathways as well as in cancer biology and also to perform their in vivo evalution as potential cancer treatment.

Biochemical characterization of recombinant human telomerase

Résumé Les télomères sont les structures ADN-protéines des extrémités des chromosomes des eucaryotes. L'ADN télomérique est constitué de courtes séquences répétitives. L'intégrité des télomères est essentielle pour protéger les extrémités des chromosomes contre les systèmes de dégradations et pour les distinguer des cassures de l'ADN double brin. Parce que la machinerie de la réplication de l'ADN n'est pas capable de répliquer l'extrémité des chromosomes, les télomères raccourcissent au fur et à mesure des cycles de réplication. Dès que les télomères atteignent une longueur critique, leur structure protectrice est perdue. Cela induit un signal de dommage de l'ADN et l'arrêt du cycle cellulaire. Pour contrebalancer le raccourcissement des télomères, les cellules qui s'auto régénèrent, dont les cellules de la moelle osseuse, les lymphocytes activés et 80-90% des cellules cancéreuses, expriment la télomérase. C'est une ribonucléoprotéine qui a la capacité de synthétiser des séquences télomériques par transcription inverse d'une courte séquence contenue dans sa propre sous-unité ARN avec laquelle elle est associée. La télomérase humaine est une enzyme processive au niveau de l'addition des nucléotides et aussi des répétitions télomériques. La télomérase de levure et la télomérase humaine sont toutes deux dimériques et il a été montré que la télomérase humaine recombinante contient deux ARN qui coopèrent pour fonctionner ainsi que deux sous-unités catalytiques. Cependant, il n'a pas encore été montré quel est le rôle de la dimérisation dans l'activité de la télomérase. Afin d'élucider ce rôle, nous avons exprimé, reconstitué et purifié la télomérase humaine dimérique recombinante. Et pour étudier l'effet d'ARN mutants sur l'activité de la télomérase, nous avons développé une méthode pour reconstituer et enrichir en hétérodimères de télomérase. Les hétérodimères contiennent une sous-unité ARN sauvage et une sous-unité ARN mutée au niveau de la séquence de la matrice. Sur l'ARN muté nous avons introduit une étiquette aptamer ARN-S1 puis nous avons purifié la télomérase via l'etiquette Si. Nous avons montré que la dimérisation est essentielle pour l'activité de la télomérase. Nos données indiquent que chaque télomérase du dimère allonge leur substrat, l'ADN télomérique, indépendamment l'une de l'autre à chaque cycle d'élongation mais que l'addition itérative de répétitions télomériques nécessite une coopération entre les deux télomérases du dimère. Nous proposons donc un modèle dans lequel les deux télomérases du dimères se lient et allongent deux substrats télomères et que pendant l'élongation processive les deux enzymes subissent un changement de conformation de manière coordonnée, ce changement va permettre le repositionnement des substrats pour d'autres cycles d'additions de répétitions télomériques. Dyskeratosis congenita est une maladie mortelle due majoritairement au disfonctionnement de la moelle osseuse. Dans la forme autosomale de la maladie, l'ARN de la télomérase contient des mutations. En utilisant notre système de reconstitution, nous avons montré que ces ARN mutés, qui ont perdu leur activité enzymatique dans le cas d'un homodimère de mutants, sont dominant négatifs quand ils sont présents dans les hétérodimères sauvage/mutant. Cet effet trans-dominant négatif pourrait contribuer à la progression de la maladie. Abstract Telomeres are protein-DNA structures at the ends of linear eukaryotic chromosomes. The telomeric DNA consists of tandemly repeated sequences. Telomeric integrity is essential to protect chromosomal ends from nucleolytic degradation and to prevent their recognition as DNA double strand breaks. Due to the inability of the conventional DNA replication machinery to replicate terminal DNA stretches, telomeres shorten with continuous rounds of DNA replication. As soon as telomeres reach a critical length, their protective structure is lost and the deprotected telomeres will induce a DNA damage response leading to cell cycle arrest. To counteract telomere shortening, self-renewing cells, including bone marrow cells, activated lymphocytes and 80-90% of cancer cells express the cellular reverse transcriptase telomerase, which has the capacity to synthesize telomeric repeats by reverse transcription of a short template sequence encoded by its stably associated RNA subunit. Human telomerase is a processive enzyme for nucleotide as well as repeat addition. Both yeast and human telomerase are dimeric enzymes and recombinant human telomerase has been shown to contain two functionally cooperating RNAs and most probably also two protein subunits. However, it has remained unclear how dimerization may contribute to telomerase activity. To study the role of dimerization, we expressed, reconstituted and purified recombinant human telomerase. We also developed a new method to reconstitute and enrich for telomerase heterodimers containing wild-type (wt) and mutant telomerase RNA subunits. To this end we introduced an S1-RNA-aptamer tag into telomerase RNA and purified telomerase reconstituted with a mixture of untagged and tagged RNA via the S1-tag. Using this experimental system, we introduced template mutations in the tagged RNA subunit and examined the effect of mutant RNAs on wt telomerase activity in wt/mutant heterodimers. We obtained evidence that dimerization is essential for telomerase activity. Our data indicate that the two subunits elongate telomere substrates independently of each other during single rounds of elongation, but that iterative addition of telomeric repeats requires cooperation between the two subunits. We suggest a model, in which dimeric telomerases bind and elongate two telomere substrates and that the two subunits undergo coordinated conformational changes during processive elongation that enable repositioning the substrates for subsequent rounds of repeat addition. Dyskeratosis congenita is a multisystemic disease with bone marrow failure as the major cause of death. The autosomal form of this disease was found to harbor mutations in the telomerase RNA. Using our reconstitution system, we tested whether mutant dyskeratosis telomerase RNAs behaved in a dominant negative manner. We observed that dyskeratosis telomerase RNA mutants, which lacked enzymatic activity were dominant negative, when present in wt/ mutant heterodimers. The transdominant negative effect of these mutants may contribute to disease progression.

The processing limits the presentation of the melanoma-associated antigen Melan-A in vitro and in vivo

SUMMARY Both proteasomes and additional proteases play an essential role in the generation of most antigenic peptides presented by MHC class I molecules. Therefore, it is of major importance to characterize the mechanisms leading to the production of correct antigenic peptides to improve the design of vaccines. As a model determinant we used the melanoma-associated protein Melan-A, which contains the immunodominant CTL-epitope Melan-A26/27-35/HLA-A*0201 and against which a high frequency of T lymphocytes has been detected in many melanoma patients. In a first part, we have studied the effects of antigen processing on the induction of a specific T cell response in vivo. Our results have shown that the immunoproteasome, expressed in most cells after exposure to Interferon-γ (IFN-γ) and constitutively in some specialized cells such as dendritic cells, does not efficiently process the HLA¬A2-restricted peptide Melan-A26-35. We have produced recombinant lentiviral vectors (rec. 1v) and vaccinia virus (rec. vv) encoding either preprocessed Melan-A26-35(A27L) peptide or full-length Melan-A(A27L). The immunization of HLA-A2/Kb mice with thoses viruses indicates that immunoproteasomes negatively affect the induction of anti-Melan-A T cell responses in animals immunized with vectors coding for the full- length protein. This negative effect was abrogated in HLA-A2/Kb LMP2-/- mice, lacking the immunoproteasomes. Therefore, we can conclude that the expression of immunoproteasomes limits the induction of the anti-Melan-A T cell response. In a second part, we show that the in vitro degradation of a Melan-A26/27-35 precursor by the proteasomes produces both the final antigenic peptide and N-terminally extended intermediates. When human melanoma cells expressing the corresponding fragments were exposed to specific CTL, those expressing the minimal antigenic sequence were recognized more efficiently than those expressing the N-terminally extended intermediates. We demonstrated that the N-terminally extended intermediates were inefficiently trimmed by cytosolic proteases. These results imply that both proteasomes and post-proteasomal peptidases influence the availability of antigenic peptides and that the efficiency of presentation may be affected by conditions that alter the ratio between fully and partially processed proteasomal products. RESUME Le protéasome ainsi que d'autres protéases jouent un rôle essentiel dans l'apprêtement de la plupart des peptides antigéniques présentés par les molécules de MHC classe I. Il est donc particulièrement important de connaître les mécanismes menant à la production du peptide antigénique correct afin de pouvoir mieux définir de futurs vaccins. Nous avons utilisé la protéine associée au mélanome, Melan-A, contenant un épitope immunodominant Melan-A26/27-35/HLA-A*0201 contre lequel une fréquence élevée de lymphocytes T a été detectée dans plusieurs patients atteints de mélanome. Dans une première partie, nous avons étudié les effets de l'apprêtement du peptide antigéniques Melan-A26-35 sur l'induction de cellules T spécifiques dans la souris. Nos résultats ont démontré que l'immunoprotéasome, exprimé dans la plupart des cellules après exposition à de l'IFN-γ et exprimé constitutivement dans certaines cellules spécialisées, telles les cellules dendritiques, n'apprête pas efficacement le peptide antigénique Melan-A26-35 restreint par HLA-A2 in vitro. Nous avons produit des vecteurs lentiviraux recombinants ainsi que des virus vaccinia codant pour le peptide antigénique Melan-A26-35(A27L) et pour la protéine entière Melan-A(A27L). L'immunisation de souris HLA-A2/Kb avec ces virus démontre que l'immunoprotéasome affecte négativement l'induction d'une réponse T contre Melan¬-A dans les souris immunisées avec des virus contenant la séquence de la protéine entière. Cet effet négatif est complètement aboli dans les souris HLA-A2/Kb LMP2-/- qui n'expriment pas l'immunoprotéasome. Deuxièmement, nous avons demontré que la dégradation d'un peptide précurseur contenant Melan-A26/27-35 par le protéasome produit à la fois le peptide antigénique ainsi que des peptides rallongés à leurs extrémités N-terminales. Lorsque ces fragments sont exprimés dans des cellules humaines et exposés à des cellules T cytotoxiques (CTL), celles qui expriment le peptide antigénique final sont reconnus plus efficacement que celles exprimant les peptides rallongés en N-terminus. Nous avons démontré que les peptides rallongés en N-terminus ne sont pas apprêtés efficacement par les peptidases du cytosol. L'inefficacité de l'apprêtement des peptides rallongés dans le cytosol offre un certain avantage pour les peptides directement produits par le protéasome. Ces résultats impliquent donc que le protéasome ainsi que les peptidases post-proteasomales influencent l'accessibilité des peptides antigéniques.

Pyochelin-mediated signalling in Pseudomonas aeruginosa

SUMMARY: Iron is an essential element for nearly all organisms but it is poorly available in most environments and not sufficient to support microbial growth. Bacteria have evolved a range of strategies to acquire this important metal, the most common of these being siderophore-mediated iron uptake. Siderophores are high-affinity iron chelators which are released to the extracellular environment where they complex iron and deliver it to the bacterial cell, via specific uptake systems. The Gram-negative bacterium Pseudomonas aeruginosa produces two siderophores, pyoverdine and pyochelin, which both contribute to the virulence of this opportunistic human pathogen. The genes responsible for pyochelin-mediated iron uptake are grouped in the P. aeruginosa chromosome. The pyochelin biosynthetic genes are organized in two divergent operons, pchDCBA and pchEFGHI, which flank the regulatory gene pchR. The fptA gene, encoding the ferric pyochelin outer membrane receptor, occurs immediately downstream of the pchEFGHI genes. The biosynthesis of the siderophore and its receptor is subjected to dual regulation enabling P. aeruginosa to respond not only to the intracellular iron level but also to the presence of the siderophore in the extracellular environment. Negative regulation is mediated by the widespread Fur protein which employs ferrous iron as a corepressor and binds to a consensus sequence in the promoter region of iron-regulated genes. Positive regulation occurs during iron starvation and requires the AraC-type transcriptional regulator PchR. This regulator, together with pyochelin, induces the expression of pyochelin biosynthesis and uptake genes via a mechanism which was partly unraveled during this thesis. A 32-bp conserved sequence element (PchR-box) was identified in promoter regions of pyochelin-controlled genes. The PchR-box in the pchR-pchDCBA intergenic region was found to be essential for the induction of the pchDCBA operon and for the repression of the divergently transcribed pchR gene. PchR was purified as a fusion with maltose-binding protein (MBP). Mobility shift assays demonstrated specific binding of MBP-PchR to the PchR-box in the presence, but not in the absence of pyochelin. PchR-box mutations which interfered with pyochelin-dependent regulation in vivo, also affected pyochelin-dependent PchR-box recognition in vitro. These results show that pyochelin is the intracellular effector required for PchR-mediated regulation. The fact that extracellular pyochelin triggers this regulation implies that the siderophore can enter the cytoplasm. This conclusion was corroborated by analysing the importance of known and putative pyochelin uptake genes for pyochelin-dependent gene regulation. The pyochelin receptor gene fptA is followed by three genes, fptB, fptC, and fptX, which were shown here to be co-transcribed with fPtA. While fPtX encodes an inner membrane pen-I-lease, the functions of FptB and FptC are currently unknown. FptA and FptX, which are both required for pyochelin-mediated iron uptake, were found to be also needed for pyochelin-dependent gene regulation. FptB and FptC however, were not required and their role, if any, in the uptake of the PchR effector pyochelin remains elusive. RESUME Le fer est un élément essentiel pour la quasi-totalité des organismes, mais dans la plupart des environnements, il est difficilement accessible et insuffisant à la croissance microbienne. Les bactéries ont développé de multiples stratégies pour acquérir ce précieux métal, la plus commune étant l'acquisition au moyen de sidérophores. Les sidérophores sont des petites molécules dotées d'une forte affinité pour le fer qui, une fois relâchées dans l'environnement extracellulaire, vont complexer le fer et le délivrer à la cellule bactérienne par l'intermédiaire de systèmes d'acquisition spécifiques. La bactérie Gram-négative Pseudomonas aeruginosa produit deux sidérophores, la pyoverdine et la pyochéline, qui contribuent également à la virulence de ce pathogène opportuniste. Les gènes impliqués dans l'acquisition du fer à l'aide de la pyochéline sont regroupés sur t. le chromosome de P. aeruginosa. Les gènes de biosynthèse de la pyochéline sont organisés en deux opérons divergents, pchDCBA et pchEFGHI, qui flanquent le gène régulateur pchR. Le gène fptA, codant pour le récepteur de la pyochéline dans la membrane externe, est situé immédiatement en aval des gènes pchEFGHL La biosynthèse du sidérophore et de son récepteur est soumise à une double régulation permettant à P. aeruginosa de réagir non seulement à la quantité de fer intracellulaire, mais également à la présence du sidérophore dans le milieu extracellulaire. La répression se fait par l'intermédiaire de la protéine Fur, qui nécessite le fer ferreux comme co-répresseur et se lie à une séquence consensus dans la région promotrice des gènes régulés par le fer. L'induction se produit lorsque le fer est limitant, et requiert PchR, un régulateur transcriptionnel de la famille AraC. En présence de pyochéline, ce régulateur induit l'expression des gènes de biosynthèse et du récepteur de la pyochéline par l'intermédiaire d'un mécanisme partiellement résolu dans ce travail. Une séquence conservée (PchR-box) a été identifiée dans la région promotrice des gènes régulés par la pyochéline. La PchR-box située dans la région intergénique pchR-pchDCBA s'est révélée être importante pour l'induction de l'opéron pchDCBA et la répression du gène divergent pchR. PchR a été purifiée en tant que protéine de fusion avec une protéine liant le maltose (MBP). Des expériences de gel retard ont démontré la liaison spécifique de la protéine MBP-PchR sur la PchR-box en présence, mais non en absence de pyochéline. Les mutations de la PchR-box qui ont affecté la régulation pyochéline-dépendante in vivo, ont également eu un effet sur la liaison de la protéine in vitro. Ces résultats démontrent que la pyochéline est l'effecteur intracellulaire nécessaire à la régulation par PchR. Le fait que la pyochéline extracellulaire soit capable d'activer cette régulation implique que le sidérophore entre dans le cytoplasme. Cette conclusion a été corroborée par l'évaluation du rôle des gènes connus ou putatifs de l'incorporation du fer via la pyochéline sur la régulation pyochéline-dépendente. Le gène fPtA, codant pour le récepteur de la pyochéline, est suivi de trois gènes, fptB,fptC, et fptX, co-transcrits avec,ffitA. Si sffitX code pour une perméase de la membrane interne, la fonction de FptB et FptC reste obscure. FptA et FptX, nécessaires à l'acquisition du fer par l'intermédiaire de la pyochéline, se sont également révélés être requis pour la régulation pyochéline-dépendante des gènes pchDCBA, pchEFGHI et fptABCX. FptB et FptC n'ont quant à eux vraisemblablement pas de rôle majeur à jouer, si ce n'est aucun, dans l'incorporation de la pyochéline.

Integrating receptor interactions and dynamics and Interference with endocrine disruptors in the mechanisms of action of PPAR nuclear receptors

Abstract Peroxisome Proliferator-Activated Receptors (PPARs) form a family of three nuclear receptors regulating important cellular and metabolic functions. PPARs control gene expression by directly binding to target promoters as heterodimers with the Retinoid X Receptor (RXR), and their transcriptional activity is enhanced upon activation by natural or pharmacological ligands. The binding of PPAR/RXR heterodimers on target promoters allows the anchoring of a series of coactivators and corepressors involved in promoter remodeling and the recruitment of the transcription machinery. The transcriptional output finally depends on a complex interplay between (i) the respective expression levels of PPARs, RXRs and of other nuclear receptors competing for DNA binding and RXR recruitment, (ii) the availability and the nature of PPAR and RXR ligands, (iii) the expression levels and the nature of the different coactivators and corepressors and (iv) the sequence and the epigenetic status of the promoter. Understanding how all these factors and signals integrate and fine-tune transcription remains a challenge but is necessary to understand the specificity of the physiological functions regulated by PPARs. The work presented herein focuses on the molecular mechanisms of PPAR action and aims at understanding how the interactions and mobility of the receptor modulate transcription in the physiological context of a living cell: Such observations in vivo rely on the use of engineered fluorescent protein chimeras and require the development and the application of complementary imaging techniques such as Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP), Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) and Fluorescence Correlation Spectroscopy (FCS). Using such techniques, PPARs are shown to reside solely in the nucleus where they are constitutively associated with RXR but transcriptional activation by ligand binding -does not promote the formation of sub-nuclear structures as observed with other nuclear receptors. In addition, the engagement of unliganded PPARs in large complexes of cofactors in living cells provides a molecular basis for their ligand-independent activity. Ligand binding reduces receptor diffusion by promoting the recruitment of coactivators which further enlarge the size of PPAR complexes to acquire full transcriptional competence. Using these molecular approaches, we deciphered the molecular mechanisms through which phthalates, a class of pollutants from the plastic industry, interfere with PPARγ signaling. Mono-ethyl-hexyl-phthalate (MEHP) binding induces the recruitment of a specific subset of cofactors and translates into the expression of a specific subset of target genes, the transcriptional output being strongly conditioned by the differentiation status of the cell. This selective PPARγ modulation induces limited adipogenic effects in cellular models while exposure to phthalates in animal models leads to protective effects on glucose tolerance and diet-induced obesity. These results demonstrate that phthalates influence lipid and carbohydrate metabolism through complex mechanisms which most likely involve PPARγ but also probably PPARα and PPARß, Altogether, the molecular and physiological demonstration of the interference of pollutants with PPAR action outlines an important role of chemical exposure in metabolic regulations. Résumé Les PPARs (Peroxisome Proliferator-Activated Receptors) forment une famille de récepteurs nucléaires qui régulent des fonctions cellulaires et métaboliques importantes. Les PPARs contrôlent l'expression des gènes en se liant directement à leurs promoteurs sous forme d'hétérodimères avec les récepteurs RXR (Retinoid X Receptor), et leur activité transcriptionnelle est stimulée par la liaison de ligands naturels ou pharmacologiques. L'association des hétérodimères PPAR/RXR avec les promoteurs des gènes cibles permet le recrutement de coactivateurs et de corépresseurs qui vont permettre le remodelage de la chromatine et le recrutement de la machinerie transcriptionnelle. Les actions transcriptionnelles du récepteur dépendent toutefois d'interactions complexes qui sont régulées par (i) le niveau d'expression des PPARs, des RXRs et d'autres récepteurs nucléaires entrant en compétition pour la liaison à l'ADN et l'association avec RXR, (ii) la disponibilité et la nature de ligands de PPAR et de RXR, (iii) les niveaux d'expression et la nature des différents coactivateurs et corépresseurs et (iv) la séquence et le marquage épigénétique des promoteurs. La compréhension des mécanismes qui permettent d'intégrer ces aspects pour assurer une régulation fine de l'activité transcriptionnelle est un défi qu'il est nécessaire de relever pour comprendre la spécificité des fonctions physiologiques régulées par les PPARs. Ce travail concerne l'étude des mécanismes d'action moléculaire des PPARs et vise à mieux comprendre comment les interactions du récepteur avec d'autres protéines ainsi que la mobilité de ce dernier régulent son activité transcriptionnelle dans le contexte physiologique des cellules vivantes. De telles observations reposent sur l'emploi de protéines fusionnées à des protéines fluorescentes ainsi que sur le développement et l'utilisation de techniques d'imagerie complémentaires telles que le FRAP (Fluorescence Recovery After Photobleaching), le FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer) ou la FCS (Fluorescence Corrélation Spectroscopy). En appliquant ces méthodes, nous avons pu montrer que les PPARs résident toujours dans le noyau où ils sont associés de manière constitutive à RXR, mais que l'ajout de ligand n'induit pas la formation de structures sub-nucléaires comme cela a pu être décrit pour d'autres récepteurs nucléaires. De plus, les PPARs sont engagés dans de larges complexes protéiques de cofacteurs en absence de ligand, ce qui procure une explication moléculaire à leur activité ligand-indépendante. La liaison du ligand réduit la vitesse de diffusion du récepteur en induisant le recrutement de coactivateurs qui augmente encore plus la taille des complexes afin d'acquérir un potentiel d'activation maximal. En utilisant ces approches moléculaires, nous avons pu caractériser les mécanismes permettant aux phtalates, une classe de polluants provenant de l'industrie plastique, d'interférer avec PPARγ. La liaison du mono-ethyl-hexyl-phtalate (NERF) à PPARγ induit un recrutement sélectif de cofacteurs, se traduisant par l'induction spécifique d'un sous-ensemble de gènes qui varie en fonction du niveau de différentiation cellulaire. La modulation sélective de PPARγ par le MEHP provoque une adipogenèse modérée dans des modèles cellulaires alors que l'exposition de modèles animaux aux phtalates induit des effets bénéfiques sur la tolérance au glucose et sur le développement de l'obésité. Toutefois, les phtalates ont une action complexe sur le métabolisme glucido-lipidique en faisant intervenir PPARγ mais aussi probablement PPARα et PPARß. Cette démonstration moléculaire et physiologique de l'interférence des polluants avec les récepteurs nucléaires PPAR souligne un rôle important de l'exposition à de tels composés dans les régulations métaboliques.

Travail bilingue et intégré des savoirs disciplinaires et linguistiques: apprentissage dans l'enseignement bilingue au secondaire II

Trois constats majeurs sont à l'origine de notre étude. Premièrement, les processus d'acquisition mobilisés par l'enseignement bilingue ont fait l'objet de très peu de recherches, alors que les résultats issus de ce type d'enseignement ont été largement explorés et ont globalement reçu une évaluation positive. Deuxièmement, l'apprentissage de la langue seconde (L2) et le bénéfice qu'il peut tirer d'un enseignement bilingue reste l'objet privilégié pour la plupart des études, alors que les particularités et les enjeux de l'apprentissage des disciplines dites "non linguistiques" (DNL) (telles l'histoire, la physique ou les mathématiques) restent largement inexplorées. Troisièmement, l'intégration a été souvent étudiée au niveau du curriculum scolaire pour dégager les interrelations entre enseignement de la L2 et enseignement des DNL, mais l'intégration demandait encore à être décrit de manière détaillée en tant qu'incorporation de l'apprentissage des savoirs disciplinaires et linguistiques et en tant que travail intégré des savoirs linguistiques et disciplinaires.Notre analyse s'inscrit alors dans une triple perspective prenant en compte ces trois axes de recherche : une perspective interactionniste et située de l'apprentissage des langues permettant d'envisager les processus d'acquisition mobilisés par l'enseignement bilingue in situ ; une perspective bi-plurilingue qui invite à étudier les spécificités de l'enseignement bilingue et s'affilie à une didactique du plurilinguisme valorisant un travail bilingue et intégré en classe ; une perspective des DNL permettant de considérer les enjeux de l'enseignement bilingue pour l'apprentissage des DNL, et non seulement pour l'apprentissage de la L2, et de considérer le travail intégré des savoirs linguistiques et disciplinaires.Ainsi, notre étude vise la description des pratiques effectives en classe bilingue s'appuyant sur l'analyse d'un important corpus d'interactions enregistrées dans diverses classes du secondaire II, orientée vers une méthodologie à caractère ethnographique et basée sur une démarche empirique et descriptive, ainsi que sur les outils de l'analyse conversationnelle appliquée à l'apprentissage des L2.Dans ce contexte, notre travail repose sur l'hypothèse que l'enseignement bilingue profite non seulement à l'apprentissage des savoirs linguistiques, mais également à celui des savoirs disciplinaires, lorsqu'il se base sur un travail intégré de la dimension linguistique et disciplinaire de cet apprentissage, et qu'un travail dans les deux langues en présence contribue à une intégration forte des savoirs linguistiques et disciplinaires. Il vise alors l'examen de l'articulation entre travail disciplinaire et travail linguistique dans différentes DNL et activités, ainsi que l'élaboration bilingue des concepts disciplinaires.D'abord, nos analyses montrent deux manières d'aborder l'élaboration des concepts disciplinaires dans les classes bilingues observées, le mode unilingue et le mode bilingue, et mettent en lumière l'apport du mode bilingue ou travail bilingue à l'élaboration des savoirs disciplinaires. Puis, la description détaillée de séquences-types permet de dégager les fonctionnements spécifiques à un enseignement bilingue et intégré, ainsi que les degrés et les procédés d'intégration des savoirs linguistiques et disciplinaires dans l'apprentissage en classe bilingue.En résumé, nos observations montrent que le bénéfice de l'enseignement bilingue réside dans l'attention particulière portée aux enjeux linguistiques des DNL et dans le travail linguistique, lorsqu'il est orienté vers un but disciplinaire. Aussi, cette orientation s'affirme dans la dynamique entre travail sur la dimension disciplinaire et travail sur la dimension linguistique.