Implication des canaux K+ dans les processus de réparation de l’épithélium respiratoire sain et fibrose kystique

La pathologie de la fibrose kystique (FK) est causée par des mutations du gène codant pour le canal Cl- CFTR. Au niveau respiratoire, cette dysfonction du transport transépithélial de Cl- occasionne une altération de la composition et du volume du liquide de surface des voies aériennes. Une accumulation de mucus déshydraté favorise alors la colonisation bactérienne et une réponse inflammatoire chronique, entraînant des lésions épithéliales sévères au niveau des voies aériennes et des alvéoles pouvant culminer en défaillance respiratoire. Le principal objectif de mon projet de maîtrise était d’étudier les processus de réparation de l’épithélium alvéolaire sain, l’épithélium bronchique sain et FK à l’aide d’un modèle in vitro de plaies mécaniques. Nos résultats démontrent la présence d’une boucle autocrine EGF/EGFR contrôlant les processus de migration cellulaire et de réparation des lésions mécaniques. D’autre part, nos expériences montrent que l’EGF stimule l’activité et l’expression des canaux K+ KATP, KvLQT1 et KCa3.1 des cellules épithéliales respiratoires. L’activation de ces canaux est cruciale pour les processus de réparation puisque la majeure partie de la réparation stimulée à l’EGF est abolie en présence d’inhibiteurs de ces canaux. Nous avons également observé que les cellules FK présentent un délai de réparation, probablement causé par un défaut de la réponse EGF/EGFR et une activité/expression réduite des canaux K+. Nos résultats permettent de mieux comprendre les mécanismes de régulation des processus de réparation de l’épithélium sain et FK. De plus, ils ouvrent de nouvelles options thérapeutiques visant à promouvoir, à l’aide d’activateurs de canaux K+ et de facteurs de croissance, la régénération de l’épithélium respiratoire chez les patients atteints de FK.

Virus-Host Interaction during Therapy against Hepatitis C Virus

Le virus de l’hépatite C (VHC) est un problème mondial. La majorité des personnes infectées (70-85%) développent une infection chronique qui cause des complications hépatiques. Le seul régime thérapeutique approuvé pour le VHC est l'interféron alpha (IFN-α). Ce traitement a un taux de réussite de 50-80% selon le génotype de virus et le moment de l'initiation de la thérapie. Les facteurs régissant la réponse au traitement ne sont pas bien définis. Des études antérieures ont suggéré un rôle potentiel de la réponse immunitaire de l'hôte au succès de la thérapie, toutefois, ces résultats sont controversés. Nous avons émis l'hypothèse que la réponse immunitaire de l’hôte sera plus efficace chez les patients qui commencent la thérapie tôt pendant la phase aiguë de l'infection. En revanche, la réponse immunitaire sera épuisée lorsque le traitement est initié pendant la phase chronique. L'objectif principal de ce mémoire est d’étudier les facteurs immunologiques qui régissent la réponse à la thérapie, et de déterminer si la contribution de la réponse immunitaire de l'hôte peut être influencée par la période de l'infection. Nos résultats démontrent l'efficacité de la restauration de la réponse immunitaire spécifique au VHC lorsque la thérapie par l'interféron est initiée tôt. Ceci est démontré par le sauvetage des cellules T efficaces spécifiques au VHC efficace similaires à celles observées chez les individus qui ont résolu spontanément, suggérant ainsi qu'elles jouent un rôle actif dans la réponse au traitement. Toutefois, cette réponse n'a pas été restaurée chez les patients traités au cours de la phase chronique. Ces résultats ont des implications importantes dans la compréhension des mécanismes sous-jacents à la réponse aux traitements actuels et au développement des nouvelles thérapies.

The role of DcR3 in systemic lupus erythematosus and islet β-Cell viability and function

Le récepteur DcR3 (Decoy receptor 3) est un membre de la famille des récepteurs aux facteurs de nécrose tumorale (TNF). Il est fortement exprimé dans les tissus humains normaux ainsi que les tumeurs malignes. DcR3 est un récepteur pour trois ligands de la famille du TNF tels que FasL, LIGHT et TL1A. Étant une protéine soluble donc dépourvue de la portion transmembranaire et intracytoplasmique, le récepteur DcR3 est incapable d’effectuer une transduction de signal intracellulaire à la suite de son interaction avec ses ligands. De ce fait, DcR3 joue un rôle de compétiteur pour ces derniers, afin d’inhiber la signalisation via leurs récepteurs fonctionnels tels que Fas, HVEM/LTbetaR et DR3. Lors de nos précédentes études, nous avons pu démontrer, que DcR3 pouvaist moduler la fonction des cellules immunitaires, et aussi protéger la viabilité des îlots de Langerhans. À la suite de ces résultats, nous avons généré des souris DcR3 transgéniques (Tg) en utilisant le promoteur du gène β-actine humaine afin d’étudier plus amplement la fonction de ce récepteur. Les souris Tg DcR3 ont finalement développé le syndrome lupus-like (SLE) seulement après l’âge de 6 mois. Ces souris présentent une variété d'auto-anticorps comprenant des anticorps anti-noyaux et anti-ADN. Elles ont également manifesté des lésions rénales, cutanées, hépatiques et hématopoïétiques. Contrairement aux modèles de lupus murin lpr et gld, les souris DcR3 sont plus proche du SLE humain en terme de réponse immunitaire de type Th2 et de production d'anticorps d'anti-Sm. En péus, nous avons constaté que les cellules hématopoïétiques produisant DcR3 sont suffisantes pour causer ces pathologies. DcR3 peut agir en perturbant l’homéostasie des cellules T pour interférer avec la tolérance périphérique, et ainsi induire l'autoimmunité. Chez l'humain, nous avons détecté dans le sérum de patients SLE des niveaux élevés de la protéine DcR3. Chez certains patients, comme chez la souris, ces niveaux sont liés directement aux titres élevés d’IgE. Par conséquent, DcR3 peut représenter un facteur pathogénique important du SLE humain. L’étude des souris Tg DcR3, nous a permis aussi d’élucider le mécanisme de protection des îlots de Langerhans. Le blocage de la signalisation des ligands LIGHT et TL1A par DcR3 est impliqué dans une telle protection. D'ailleurs, nous avons identifié par ARN microarray quelques molécules en aval de cette interaction, qui peuvent jouer un rôle dans le mécanisme d’action. Nous avons par la suite confirmé que Adcyap1 et Bank1 joue un rôle critique dans la protection des îlots de Langerhans médiée par DcR3. Notre étude a ainsi élucidé le lien qui existe entre la signalisation apoptotique médiée par Fas/FasL et la pathogénèse du SLE humain. Donc, malgré l’absence de mutations génétiques sur Fas et FasL dans le cas de cette pathologie, DcR3 est capable de beoquer cette signalisation et provoquer le SLE chez l’humain. Ainsi, DcR3 peut simultanément interférer avec la signalisation des ligands LIGHT et TL1A et causer un phénotype plus complexe que les phénotypes résultant de la mutation de Fas ou de FasL chez certains patients. DcR3 peut également être utilisé comme paramètre diagnostique potentiel pour le SLE. Les découvertes du mécanisme de protection des îlots de Langerhans par DcR3 ouvrent la porte vers de nouveaux horizons afin d'explorer de nouvelles cibles thérapeutiques pour protéger la greffe d'îlots.

Globin Gene Expression: Role of Transcription Factors

La dérégulation de l'expression génétique est une base pathophysiologique de plusieurs maladies. On a utilisé le locus du gène β-globine humain comme modèle pour élucider le mécanisme de régulation de la transcription génétique et évaluer son expression génétique durant l'érythropoïèse. La famille des protéines 'E' est composée de facteurs de transcription qui possèdent plusieurs sites de liaison au sein de locus du gène β-globine, suggérant leur rôle potentiel dans la régulation de l’expression de ces gènes. Nous avons montré que les facteurs HEB, E2A et ETO2 interagissent d’une manière significative avec la région contrôle du Locus (LCR) et avec les promoteurs des gènes de la famille β-globine. Le recrutement de ces facteurs au locus est modifié lors de l'érythropoïèse dans les cellules souches hematopoitiques et les cellules erythroides de souris transgéniques pour le locus de la β-globine humain, ainsi que dans les cellules progénitrices hématopoïétiques humaines. De plus par cette étude, nous démontrons pour la première fois que le gène β-globine humain est dans une chromatine active et qu’il interagit avec des facteurs de transcriptions de type suppresseurs dans les cellules progénitrices lymphoïdes (voie de différentiation alternative). Cette étude a aussi été faite dans des souris ayant une génétique mutante caractérisée par l'absence des facteurs de transcription E2A ou HEB.

Impact du genre et du modèle sur les mécanismes d’épileptogénèse dans le cerveau immature

Les modèles kainate et pentylènetétrazole représentent deux modèles d’épilepsie du lobe temporal dont les conséquences à long terme sont différentes. Le premier est un modèle classique d’épileptogénèse avec crises récurrentes spontanées tandis que le second se limite aux crises aigües. Nous avons d’abord caractérisé les différents changements survenant dans les circuits excitateurs et inhibiteurs de l’hippocampe adulte de rats ayant subi des crises à l’âge immature. Ensuite, ayant observé dans le modèle fébrile une différence du pronostic lié au genre, nous avons voulu savoir si cette différence était aussi présente dans des modèles utilisant des neurotoxines. L’étude électrophysiologique a démontré que les rats KA et PTZ, mâles comme femelles, présentaient une hyperactivité des récepteurs NMDA au niveau des cellules pyramidales du CA1, CA3 et DG. Les modifications anatomiques sous-tendant cette hyperexcitabilité ont été étudiées et les résultats ont montré une perte sélective des interneurones GABAergiques contenant la parvalbumine dans les couches O/A du CA1 des mâles KA et PTZ. Chez les femelles, seul le DG était légèrement affecté pour les PTZ tandis que les KA présentaient, en plus du DG, des pertes importantes au niveau de la couche O/A. Les évaluations cognitives ont démontré que seuls les rats PTZ accusaient un déficit spatial puisque les rats KA présentaient un apprentissage comparable aux rats normaux. Cependant, encore une fois, cette différence n’était présente que chez les mâles. Ainsi, nos résultats confirment qu’il y a des différences liées au genre dans les conséquences des convulsions lorsqu’elles surviennent chez l’animal immature.

Mutations du gène HFE dans le cancer épithélial de l'ovaire

Le cancer épithélial de l’ovaire est le cancer gynécologique le plus agressif avec le plus haut taux de mortalité. La croissance des cellules cancéreuses de l’ovaire est limitée par les nutriments de l’environnement, le fer étant un des éléments indispensables à leur prolifération. L’hémochromatose héréditaire est une maladie associée à une accumulation corporelle de fer. Cette maladie est liée à deux mutations majeures du gène HFE soit H63D et C282Y. Étant donnée l’influence de la protéine HFE sur l’entrée du fer dans la cellule, des mutations du gène HFE pourraient être associées à une croissance rapide des cellules cancéreuses. Des études de génotypage du gène HFE effectuées chez 526 patientes avec cancer épithélial de l’ovaire, ont révélées une fréquence allélique de la mutation C282Y significativement plus élevées chez les patientes avec tumeur ovarienne comparativement aux patientes du groupe contrôle (5.9% versus 1.3%, p = 0.02). De plus, le taux de survie des patientes avec mutations C282Y et tumeur ovarienne de G3, après 2 ans, est faible (20%) lorsque comparé à celui des patientes sans mutations (60%, p = 0.005). Une analyse de régression multivariée de Cox a démontrée un risque relatif de 3.1, suggérant que les patientes avec mutations C282Y ont 3 fois plus de chance d’avoir une faible survie (p=0.001). Également, des études de corrélation ont démontrées que les niveaux de ferritine du sérum étaient plus élevés chez les patientes avec grade avancé du cancer épithélial de l’ovaire (r = 0.445 et p= 0.00001), suggérant que ce paramètre pourrait servir comme marqueur tumoral. Afin de comprendre ces résultats, nous avons tout d’abord étudiés l’influence des mutations HFE sur les cellules cancéreuses. Pour ce faire, la lignée du cancer de l’ovaire TOV-112D, homozygote pour la mutation C282Y, a été transfectée avec les vecteurs HFEwt et HFEC282Y. Bien qu’aucune différence significative n’ait été trouvée en termes de TfR totaux, des analyses par FACS ont démontrées un phénotype de déficience de fer pour les clones stables HFEwt. In vitro, la restauration de la protéine HFE, dans la lignée TOV-112D du cancer de l’ovaire, n’influence pas la croissance cellulaire. Ensuite, nous avons étudiés l’influence des niveaux de fer sur la progression tumorale. Une expérience in vivo préliminaire a démontré une tendance à un volume tumoral supérieur dans un modèle de souris de surcharge de fer,HfeRag1-/-. De plus, les souris HfeRag1-/-, injectées avec la lignée du cancer de l’ovaire TOV-21G, ont montrées des niveaux significativement plus faibles de fer sérique comparativement à leur contrôle (fer sérique 40±7μM versus 27±6μM, p = 0.001). En conclusion, des études supplémentaires sont nécessaires afin de comprendre davantage le rôle des mutations HFE sur la progression tumorale. Notamment, les niveaux élevés de fer pourraient rendre les cellules tumorales résistantes aux traitements ou encore, augmenter la toxicité et ainsi, contribuer à un mauvais prognostique.

Modulation de la voie de signalisation de Gαq par l’hyperglycémie : mécanisme moléculaire

Les complications vasculaires telles que l’augmentation de la contractilité et la prolifération cellulaire sont les complications les plus communes observées dans le diabète et l’hyperglycémie chronique est un facteur important dans ces processus. La voie de signalisation de Gαq joue un rôle important dans la régulation du tonus vasculaire et l’altération de celle-ci peut contribuer aux complications vasculaires observées dans les cas de diabète et d’hyperglycémie. Il a été observé que les taux et l’activité des protéines kinase C (PKC) et du diacylglycérol (DAG) sont augmentés dans ces conditions. Cependant, aucune étude n’a démontré l’implication de Gαq/11 et des PLCβ, molécules de signalisation en amont de PKC/DAG. Plusieurs études révèlent que l’augmentation des taux et de l’activité des PKC et du DAG induite par l’hyperglycémie dans des cellules du muscle lisse vasculaire (CMLV) est attribuée à l’augmentation du stress oxydatif. De plus, les niveaux de certains peptides vasoactifs, tels que l’angiotensine II et l’endothéline-1, augmentés dans les conditions de diabète/d’hyperglycémie, peuvent contribuer à l’augmentation du stress oxydatif observée. Le travail présenté dans cette thèse avait pour but d’examiner les effets de l’hyperglycémie sur les niveaux d’expression protéique de Gαq/11 et de ses molécules associées, ainsi que d’étudier le mécanisme moléculaire par lequel l’hyperglycémie module la voie de signalisation de Gαq dans les CMLV. Dans la première étude, nous avons examiné si l’hyperglycémie pouvait moduler l’expression des protéines Gαq, Gα11, PLCβ1 et PLCβ2. Le prétraitement des CMLV A10 avec 26 mM de glucose durant 72 heures augmente l’expression des protéines Gαq, Gα11, PLCβ-1 et PLCβ-2 en comparaison avec les CMLV témoins. Le traitement avec des antagonistes aux récepteurs AT1 de l’Ang II, et ETA/ETB de l’ET-1, atténue la hausse de Gαq, de Gα11, de PLCβ1 et de PLCβ2 induite par l’hyperglycémie. De plus, la formation d’IP3 stimulée par l’ET-1 était plus élevée dans les CMLV exposée à 26 mM de glucose. Le traitement des CMLV A10 avec l’Ang II et l’ET-1 augmente également les niveaux d’expression des protéines Gα q/11 et PLCβ. Cette augmentation de l’expression est restaurée au niveau des CMLV témoins par les antagonistes des récepteurs AT1, ETA et ETB. Ces résultats suggèrent que l’augmentation de l’expression des protéines Gαq/11 et PLCβ dans les CMLV induite par l’hyperglycémie est attribuée à l’activation des récepteurs AT1, ETA et ETB. Dans la seconde étude, nous avons examiné l’implication du stress oxydatif dans l’augmentation des niveaux d’expression des protéines Gαq/11 et PLCβ et de leur signalisation induite par l’hyperglycémie. Nous avons également déterminé le mécanisme responsable de l’augmentation du stress oxydatif induite par l’hyperglycémie. L’augmentation de l’expression des protéines Gαq/11 et PLCβ des CMLV A10 exposées à 26 mM de glucose est revenue au niveau basal après un traitement avec l’antioxydant diphenyleneiodonium (DPI), et la catalase, un chélateur du peroxyde d’hydrogène, mais pas par le 111Mn-tetralis(benzoic acid porphyrin) (MnTBAP) ni par l’acide urique, des chélateurs du peroxynitrite. De plus, l’augmentation de la formation d’IP3 stimulée par l’ET-1 dans les CMLV exposées à 26 mM de glucose est revenue au niveau basal après un traitement avec le DPI et la catalase. Ces résultats suggèrent que l’augmentation du stress oxydatif induite par l’hyperglycémie contribue à l’augmentation de l’expression des protéines Gαq/11 et les molécules associées à la voie de signalisation de Gq. De plus, l’augmentation de la production d’anion superoxyde (O2-), de l’activité de la NADPH oxydase et de l’expression des protéines p22(phox) et p47(phox) induite par l’hyperglycémie est revenue à un niveau basal après un traitement avec les antagonistes des récepteurs AT1, ETA et ETB. Ces résultats suggèrent que l’hyperglycémie augmente les niveaux endogènes de l’Ang II et de l’ET-1, ce qui augmente le stress oxydatif par la formation d’O2- et de H2O2 et peut contribuer à l’augmentation des niveaux de Gq/11α et de leurs molécules de signalisation. Puisqu’il a été observé que l’hyperglycémie transactive les récepteurs aux facteurs de croissance tels que le récepteur au facteur de croissance épidermique (EGF-R) et le récepteur au facteur de croissance dérivé des plaquettes (PDGF-R), nous avons entrepris d’examiner, dans la troisième étude, l’implication d’EGF-R et de PDGF-R dans l’augmentation des niveaux de Gαq/11, de PLCβ et de leur signalisation induite par l’hyperglycémie. L’augmentation des niveaux d’expression des protéines Gαq, Gα11, PLCβ-1 et PLCβ-2 induite par l’hyperglycémie est revenue au niveau basal après un traitement avec les inhibiteurs d’EGF-R (AG1478) et de PDGF-R (AG1295) et par l’inhibiteur de c-Src, PP2. L’augmentation de la phosphorylation d’EGF-R et de PDGF-R induite par l’hyperglycémie a été abolie par AG1478, AG1295 et PP2. De plus, l’augmentation des niveaux de Gαq/11, et de PLCβ induite par l’hyperglycémie est atténuée par l’inhibiteur des MAPK, le PD98059, et par l’inhibiteur d’AKT, le wortmannin. L’augmentation de la phosphorylation d’ERK et d’AKT était également atténuée par AG1478 et AG1295. Ces résultats suggèrent que la transactivation des récepteurs aux facteurs de croissance induite par c-Src peut contribuer à l’augmentation des niveaux de Gα q/11/PLC et de leur signalisation par la voie des MAPK/PI3K. En conclusion, les études présentées dans cette thèse indiquent que l’hyperglycémie augmente les niveaux de Gαq/11 et de PLCβ. Nous avons émis des évidences qui démontrent que l’augmentation endogène de l’Ang II et de l’ET-1 par l’hyperglycémie peut contribuer à l’augmentation de la production d’O2- et de H2O2 résultant ainsi en une augmentation du stress oxydatif qui pourrait être responsable de l’augmentation de Gαq/11/PLC et de leur signalisation dans les conditions d’hyperglycémie. Finalement, nous avons démontré que la transactivation des récepteurs aux facteurs de croissance induite par l’hyperglycémie peut être responsable de l’augmentation de Gαq/11/PLC et les molécules associées à la voie de signalisation de Gq dans les cas de diabète et d’hyperglycémie.

Régulation des chaperons de la présentation antigénique par ubiquitination

La chaîne invariante forme un complexe nonamérique avec les molécules classiques du CMH de classe II. HLA-DM et HLA-DO, des molécules non-classiques de classe II, sont aussi impliquées dans la présentation des peptides antigéniques aux lymphocytes T. Ces molécules chaperones de la présentation antigénique modulent la capacité d’une cellule à présenter des antigènes par les moloécules classiques du CMH de classe II. La régulation transcriptionnelle des molécules chaperones, tout comme celle des autres molécules du CMH de classe II, est assurée par le transactivateur CIITA. La molécule HLA-DR peut être régulée négativement de manière post-traductionnelle par ubiquitination grâce à l’enzyme E3 ubiquitine ligase MARCH1. Celle-ci est induite par l’interleukine-10 dans les monocytes. L’objectif de ce projet était de déterminer si l’ubiquitination par MARCH1 peut aussi réguler l’expression des molécules chaperones de la présentation antigénique. Les expériences furent réalisées dans le contexte de co-transfections en cellules HEK293T. L’expression des molécules fut évaluée par immunomarquages et cytométrie de flux. Il a été montré que l’isoforme p33 de la chaîne invariante est régulé négativement en présence de MARCH1 à partir de la surface cellulaire, causant ainsi sa dégradation. Tel que démontré par l’utilisation d’un mutant dépourvu de queue cytoplasmique, cette dernière région n’est pas indispensable à ce phénomène. Une hypothèse est qu’une molécule non-identifiée, associée à Ii, serait ubiquitinée par MARCH1, l’entraînant dans sa régulation négative. Il fut déterminer que cette molécule n’était pas CXCR2, un récepteur pouvant être impliqué, avec la chaîne invariante et CD44, en tant que récepteur de MIF (Macrophage Inhibitory Factor). Il fut aussi montré que HLA-DO peut être ciblé par MARCH1 mais ceci ne semble pas être un phénomène dominant; l’expression des complexes DO/DM n’étant pas affectée bien qu’ils entrent en interaction avec MARCH1. L’expression de HLA-DM n’est pas affectée par MARCH1. Il n’a toutefois pas été déterminé hors de tout doute si MARCH1 peut modifier DM; des résultats obtenus avec une queue cytoplasmique de DM possédant une lysine laissant suggérer qu’il est possible que MARCH1 interagisse avec DM. Dans l’ensemble, les travaux démontrent que l’ubiquitination par MARCH1 joue un rôle dans la régulation post-transcriptionnelle de la chaîne invariante p33 mais pas HLA-DO et HLA-DM.

Études sur le rôle d’IL-18 dans l’immunopathogénèse du SIDA

Le virus de l’immunodéficience humaine ou VIH est l’agent qui cause le SIDA. Le VIH donne lieu à une dérégulation dans la production de certaines cytokines qui ont un rôle immunologique très important chez les patients infectés. L’IL-18, autrement nommé facteur inducteur d’IFN-γ, est une cytokine pro-inflammatoire qui affecte le système immunitaire de façon importante. Son activité est régulée par l’"IL-18 Binding Protein" (IL-18BP), une autre cytokine qui se lie avec l’IL-18 et inhibe son activité biologique. Des études ultérieures ont montré des niveaux élevés d’Il-18 chez les patients infectés par le VIH par rapport aux personnes saines. Cependant, aucune étude n’a été réalisée concernant la production d’IL-18BP chez ces patients. Due à sa relevance dans la régulation de l’IL-18, nous avons étudié l’effet de l’infection par le VIH sur l’équilibre entre ces deux facteurs et l’impact de cet équilibre sur l’homéostasie des cellules NK. Nous avons mesuré les taux de l’IL-18 et de l’IL-18BP circulantes dans les sérums des patients infectés par le VIH en les comparants avec le même nombre de personnes saines et séronégatives. Nous avons aussi déterminé le nombre total des différents sous-types de cellules NK et analysé l’activité des cellules NK (Natural Killer). Finalement nous avons cherché à déterminer si l’IL-18 pouvait induire l’apoptose des cellules NK en activant l’expression de Fas ligand. Nos résultats nous démontrent que les patients infectés par le VIH ont trois fois plus d’IL-18 que les donneurs sains. Cependant les niveaux d’IL-18BP sont plus bas chez les patients infectés comparés aux donneurs sains. Alors, le ratio IL-18/IL-18BP est augmenté chez les patients infectés, ce qui entraîne une grande quantité d’IL-18 libre et biologiquement active circulante dans leur organisme. Nos études démontrent que chez ces patients, les concentrations d’IL-18 sont en corrélation négative avec l’activité cytotoxique de leurs cellules NK. Nos études in vitro démontrent que le traitement des cellules NK par l’IL-18 induit de façon fratricide leur apoptose en augmentant l’expression de Fas ligand. Finalement, cette production non coordonnée de ces deux facteurs pourrait contribuer à une immunopathologie induite par l’IL-18 en entraînant une apoptose fratricide des cellules NK qui possèdent un rôle important dans la réponse antivirale. Le dérèglement de l’homéostasie des cellules NK pourrait donc contribuer à la pathogenèse induite par le VIH.

Étiopathogenèse de la scoliose idiopathique de l'adolescent : implication de la mélatonine et de l'ostéopontine

La scoliose idiopathique de l’adolescent (SIA) est une maladie dont la cause est encore inconnue, et qui génère des déformations complexes du rachis, du thorax et du bassin. La prévalence est de 4% dans la population adolescente au Québec. Cette pathologie affecte surtout les filles durant leur poussée de croissance pubertaire. Parmi plusieurs hypothèses émises, l’hypothèse neuroendocrinienne, impliquant une déficience en mélatonine comme agent étiologique de la SIA a suscité beaucoup d’intérêt. Cette hypothèse découle du fait que l’ablation de la glande pinéale chez le poulet produit une scoliose ressemblant sous plusieurs aspects à la pathologie humaine. La pertinence biologique de la mélatonine dans la scoliose est controversée, étant donné que la majorité des études chez l’homme n’ont pu mettre en évidence une diminution significative des niveaux de mélatonine circulante chez les patients scoliotiques. Nous avons démontré un dysfonctionnement dans la signalisation de la mélatonine au niveau des tissus musculo-squelettiques chez une série de patients atteints de SIA (Moreau & coll. 2004). Nous avons confirmé ce défaut chez un plus grand nombre de patients ainsi qu’en utilisant une nouvelle technologie (spectroscopie cellulaire diélectrique) n’ayant pas recours à un prétraitement des cellules donnant ainsi des résultats plus précis. Cette technique a montré la présence des mêmes groupes fonctionnels identifiés auparavant par la technique d’AMPc. Le dysfonctionnement de la signalisation de la mélatonine est dû à une phosphorylation accrue des protéines G inhibitrices. Ce défaut pourrait être causé par un déséquilibre de l’activité des kinases et phosphatases capables de réguler la phosphorylation des protéines Gi. Parmi ces kinases, PKCd a suscité initialement notre intérêt vu qu’elle peut phosphoryler les protéines Gi. Nous avons démontré que cette kinase interagit avec le récepteur de la mélatonine MT2 et que cette interaction varie selon le groupe fonctionnel auquel un patient SIA appartient. Par la suite nos travaux se sont dirigés vers la découverte d’effecteurs cellulaires régulés par la mélatonine et plus spécifiquement l’ostéopontine (OPN), compte tenu de son rôle présumé comme mécanorécepteur et dans certaines structures jouant un rôle dans la proprioception, le contrôle postural et la fonction vestibulaire. L’OPN a été identifiée initialement par sa surexpression au niveau protéique et de l’ARNm dans la musculature paraspinale uniquement chez les poulets scoliotiques. Nous avons également utilisé un autre modèle animal, la souris C57Bl/6 naturellement déficiente en mélatonine. Nous avons généré des souris bipèdes en amputant les membres antérieurs de souris OPN KO, des souris CD44 KO ainsi que des souris contrôles C57Bl/6. Nos résultats ont montré qu’aucune souris OPN KO (n=50) ou CD44 KO (n=60) ne développe la maladie, contrairement aux souris contrôles C57Bl/6 (n=50) dont 45% deviennent scoliotiques. Ces résultats nous ont poussés à investiguer le rôle de cette protéine dans l’étiopathogenèse de la maladie chez l’humain. Nos résultats ont montré une augmentation des niveaux circulants d’OPN chez les patients atteints de la SIA et que l’élevation en OPN corrélait avec la sévérité de la maladie. Nos études chez les enfants asymptomatiques nés de parents scoliotiques et qui sont plus à risque de développer la maladie ont aussi démontré des différences significatives au niveau des concentrations en OPN en comparaison avec les sujets sains. En effet, plusieurs enfants à risque présentaient des niveaux d’OPN supérieurs à 800ng/ml suggérant un plus grand risque de développer une scoliose indiquant aussi que l’augmentation des niveaux en OPN précède le début de la maladie.

Les gènes et protéines BSP chez la souris et l’humain : clonage, caractérisation, expression sous forme recombinante et étude des fonctions biologiques

L’infertilité affecte environ 15% des couples en âge de se reproduire. Dans près de la moitié des cas, des facteurs masculins sont à la base de l’infertilité, quoique les causes exactes demeurent souvent inconnues. Les spermatozoïdes de mammifères subissent une série d’étapes de maturation avant d’acquérir la capacité de féconder un ovocyte. Les premiers changements ont lieu à l’intérieur de l’épididyme, où les spermatozoïdes gagnent la capacité de se mouvoir ainsi que de reconnaître et d’interagir avec l’ovocyte. Suite à l’éjaculation, ils doivent subir une seconde série de modifications à l’intérieur du tractus génital femelle, nommée capacitation. Nous avons préalablement démontré que chez le bovin, la famille de protéines BSP (Binder of SPerm) est essentielle à la capacitation. Des homologues des BSP ont aussi été isolés du fluide séminal de porc, de bouc, de bélier, de bison et d’étalon. Malgré la détection d’antigènes apparentés aux BSP dans le fluide séminal de souris et d’humain, les homologues des BSP n’ont jamais été caractérisés chez ces espèces. Nous avons émis l’hypothèse que des homologues des BSP seraient exprimés chez la souris et l’humain et joueraient un rôle dans la maturation des spermatozoïdes. Nous avons démontré que des séquences homologues aux BSP sont présentes dans les génomes murin et humain. Le génome murin contient trois séquences; Bsph1, Bsph2a et Bsph2b, tandis qu’une seule séquence (BSPH1) a été identifée chez l’humain. Les séquences d’ADNc de Bsph1, Bsph2a et BSPH1 ont été clonées, tandis que Bsph2b serait probablement un pseudogène. Les trois gènes sont exprimés uniquement dans l’épididyme et font partie d’une sous-famille distincte à l’intérieur de la famille des BSP. Chez les ongulés, les BSP sont exprimées par les vésicules séminales, sont ajoutées aux spermatozoïdes lors de l’éjaculation et représentent une proportion significative des protéines du plasma séminal. Au contraire, les BSP épididymaires ne sont retrouvées qu’en faibles quantités dans le fluide séminal. L’étude de leur rôle dans les fonctions spermatiques était donc plus difficile que chez les ongulés, où l’isolement des protéines natives du plasma séminal à l’aide de techniques de chromatographie était possible. Afin d’étudier sa fonction, nous avons exprimé BSPH1 recombinante dans E. coli. Les ponts disulfure des domaines de type-II caractéristiques de ces protéines ont fait en sorte que l’expression de BSPH1 fusionnée à une étiquette hexahistidine ou glutathion-S-transférase a donné lieu à des protéines insolubles dans les corps d’inclusion. La production de BSPH1 soluble a été possible grâce à l’ajout d’une étiquette thiorédoxine et l’expression dans une souche au cytoplasme oxidatif. BSPH1 a été purifiée par affinité et sa liaison aux partenaires connus des BSP, la phosphatidylcholine, les lipoprotéines de faible densité et la membrane des spermatozoïdes, suggérait que la protéine recombinante possédait sa conformation native et pouvait être utilisée pour des essais fonctionnels. La forme native de BSPH1 a été détectée dans le plasma séminal humain suite au fractionnement par gel filtration. La liaison de BSPH1 native à une colonne d’affinité à l’héparine a indiqué qu’elle partage aussi cette propriété de liaison avec la famille des BSP, et pourrait lier les GAGs semblables à l’héparine du tractus génital féminin. Une colonne d’immunoaffinité anti-BSPH1 a été préparée à l’aide d’anticorps générés contre des protéines recombinantes, et a permis d’isoler BSPH1 native à partir d’extraits de spermatozoïdes humains. Nos résultats montrent que BSPH1 native serait localisée dans les microdomaines « rafts » de la membrane. Sa masse moléculaire apparente était de 32 kDa, ce qui est supérieur à la masse prédite selon sa séquence en acides aminés, indiquant la présence probable de modifications post-traductionnelles, ou d’une migration anormale. L’effet de BSPH1 recombinante et des anticorps anti-BSPH1 sur la motilité, la viabilité et la capacitation a aussi été étudié. Les deux dernières variables ont été mesurées par un essai de cytométrie en flux, optimisé dans cette étude. Aucun effet des protéines recombinantes ou des anticorps sur la motilité et la viabilité des spermatozoïdes n’a été noté. Quoiqu’une stimulation modeste, quoique significative, de la capacitation ait été observée à la plus faible concentration de BSPH1, les concentrations plus élevées n’ont pas montré d’effet. De la même manière, les anticorps anti-BSPH1 n’ont pas eu d’effet significatif sur la capacitation. Ces résultats suggèrent que BSPH1 produite dans E. coli n’affecte pas la capacitation de façon marquée. Cependant, puisque BSPH1 native possède probablement des modifications post-traductionnelles, une protéine recombinante produite dans des cellules de mammifères pourrait affecter les fonctions spermatiques. De manière alternative, les BSP épididymaires remplissent peut-être un rôle différent dans les fonctions spermatiques que celles sécrétées par les vésicules séminales des ongulés. Les résultats décrits dans cette thèse pourraient contribuer à améliorer le diagnostic de l’infertilité masculine, ainsi que les techniques de reproduction assistée et éventuellement, pourraient mener au développement de contraceptifs masculins.

Étude du rôle de la MAP Kinase non-conventionnelle ERK3 dans le développement thymique et l'activation des lymphocytes T

Les voies de signalisation des MAP kinases (MAPK) conventionnelles jouent des rôles essentiels pendant le développement des lymphocytes T (LT) ainsi que lors de leur activation suite à la reconnaissance antigénique. En raison de ses différences structurelles ainsi que de son mode de régulation, ERK3 fait partie des MAPK dites non-conventionnelles. Encore aujourd’hui, les événements menant à l’activation de ERK3, ses substrats ou partenaires ainsi que sa fonction physiologique demeurent peu caractérisés. Nous avons entrepris dans cette thèse d’étudier le rôle de ERK3 lors du développement et de l’activation des LT en utilisant un modèle de souris déficient pour l’expression de ERK3. Nous avons premièrement établi que ERK3 est exprimée chez les thymocytes. Ensuite, nous avons évalué le développement thymique chez la souris ERK3-déficiente et nous avons observé une diminution significative de la cellularité aux étapes DN1, DP et SP CD4+ du développement des LT. La création de chimères hématopoïétiques ERK3-déficientes nous a permis de démontrer que la diminution du nombre de cellules observée aux étapes DN1 et DP est autonome aux thymocytes alors que le phénotype observé à l’étape SP CD4+ est dépendant de l’abolition simultanée de ERK3 dans l’épithélium thymique et dans les thymocytes. Une étude plus approfondie de l’étape DP nous a permis de démontrer qu’en absence de ERK3, les cellules DP meurent plus abondamment et accumulent des cassures doubles brins (DSB) dans leur ADN. De plus, nous avons démontré que ces cassures dans l’ADN sont réalisées par les enzymes RAG et qu’en absence de ces dernières, la cellularité thymique est presque rétablie chez la souris ERK3-déficiente. Ces résultats suggèrent que ERK3 est impliquée dans un mécanisme essentiel à la régulation des DSB pendant le réarrangement V(D)J de la chaîne  du récepteur des cellules T (RCT). Dans le deuxième article présenté dans cette thèse, nous avons montré que ERK3 est exprimé chez les LT périphériques, mais seulement suite à leur activation via le RCT. Une fois activés in vitro les LT ERK3-déficients présentent une diminution marquée de leur prolifération et dans la production de cytokines. De plus, les LT ERK3-déficients survivent de façon équivalente aux LT normaux, mais étonnamment, ils expriment des niveaux plus faibles de la molécule anti-apoptotique Bcl-2. Ces résultats suggèrent que la prolifération réduite des LT ERK3-déficients est la conséquence d’une altération majeure de leur activation. Ainsi, nos résultats établissent que ERK3 est une MAPK qui joue des rôles essentiels et uniques dans le développement thymique et dans l’activation des lymphocytes T périphériques. Grâce à ces travaux, nous attribuons pour la toute première fois une fonction in vivo pour ERK3 au cours de deux différentes étapes de la vie d’un LT.

Analyse fonctionnelle de la polycystine-1 et de son domaine intracellulaire dans le développement de la polykystose rénale autosomique dominante

La polykystose rénale autosomique dominante (PKRAD) est la maladie génétique rénale la plus commune touchant 1/500 personnes. Elle se caractérise principalement par la formation de kystes rénaux dans tous les segments du néphron, entraînant l’insuffisance rénale, et par des manifestations extrarénales kystiques (foie, pancréas, rate) et non-kystiques (anomalies cardiaques, vasculaires et cérébrales). Deux gènes, PKD1 et PKD2, sont responsables de 85 et 15% des cas respectivement. Ces gènes encodent les polycystine-1 (PC-1) et -2 (PC-2) qui forment un complexe à la membrane plasmique et ciliaire des cellules épithéliales rénales. PC-1 est une protéine transmembranaire de 4302 acides aminés possédant un court domaine intracellulaire incluant un motif coiled-coil impliqué dans l’interaction entre PC-1 et PC-2 in-vitro. L’importance du coiled-coil est démontrée par des mutations affectant spécifiquement ce motif chez des patients PKRAD. Le mécanisme pathogénétique responsable de la PKRAD est indéterminé. Chez la souris, la PKRAD se développe suite à l’ablation (Pkd1-/-) ou lors de la surexpression (SBPkd1TAG) de Pkd1, ce qui suggère un effet de dosage. Des anomalies ciliaires sont aussi souvent associées à PKRAD. Mon objectif était de déterminer in-vivo le mécanisme pathogénétique de la polycystine-1 dans le développement des symptômes PKRAD rénaux et extrarénaux et plus spécifiquement, le rôle du motif coiled-coil dans le mécanisme de kystogenèse. Pour ce faire, nous avons généré deux constructions, Pkd1 sauvage (Pkd1TAG) et Pkd1 tronquée de son motif coiled-coil (Pkd1ΔCoiled-coil), par recombinaison homologue à partir du BAC-Pkd1 sauvage comprenant la séquence murine entière de Pkd1. Trois lignées de souris Pkd1TAG générées par microinjection démontrent un niveau d’expression de Pkd1 qui corrèle avec le nombre de copie du transgène (2, 5 et 15 copies). Les souris Pkd1TAG reproduisent la PKRAD en développant des kystes rénaux dans toutes les parties du néphron et des cils primaires plus longs que les contrôles non transgéniques. Les analyses physiologiques supportent que les souris Pkd1TAG développent une insuffisance rénale et démontrent une augmentation du volume urinaire de même qu’une diminution de l’osmolalité, de la créatinine et des protéines urinaires. De plus, les souris Pkd1TAG développent des kystes hépatiques, des anomalies cardiaques associées à des dépôts de calcium et des anévrismes cérébraux. La sévérité du phénotype augmente avec l’expression de Pkd1 appuyant l’hypothèse d’un mécanisme de dosage. Nous avons aussi déterminé que l’expression du transgène Pkd1TAG complémente le phénotype létal-embryonnaire des souris Pkd1-/-. D’autre part, nous avons générés 4 lignées de souris Pkd1ΔCoiled-coil (2 et 15 copies du transgène) dont le nombre de copies corrèle avec le niveau d’expression du transgène. Ces souris Pkd1ΔCoiled-coil, contrairement aux Pkd1TAG de même âge, ne développent pas de kystes et possèdent des cils primaires de longueur normale. Afin d’évaluer le rôle du motif coiled-coil en absence de polycystine-1 endogène, nous avons croisé les souris Pkd1ΔCoiled-coil avec les souris Pkd1-/-. Contrairement aux souris Pkd1-/- qui meurent in-utéro, les souris Pkd1ΔCoiled-coil; Pkd1-/- survivent ~10 à 14 jours après la naissance. Elles démontrent des kystes rénaux et pancréatiques sévères, un retard de croissance et des anomalies pulmonaires. Tous les segments du néphron sont affectés. Mon projet démontre que la surexpression de Pkd1 est un mécanisme pathogénique de la PKRAD tant au niveau rénal qu’extrarénal. De plus, il démontre que le motif coiled-coil est un élément déterminant dans la kystogenèse/PKRAD in-vivo.

L'étude du rôle immunomodulateur des IVIG dans un modèle murin humanisé de réaction du greffon contre l'hôte

La maladie du greffon contre l’hôte (GvHD) est une complication majeure des greffes de cellules souches hématopoïétiques (HSCT) qui survient dans 30 à 70% des cas et peut causer la mort, malgré un traitement prophylactique bien conduit. Il existe donc une réelle demande clinique pour améliorer ces traitements prophylactiques. Parce que ces traitements prophylactiques reposent en général sur des agents immunosuppresseurs, ceux-ci contribuent à diminuer la reconstitution immunitaire du patient, ce qui a un impact défavorable sur les infections et les taux de rechute d’hémopathie maligne, et donc limite leur utilisation. Les immunoglobulines (IVIG) pourraient représenter une alternative intéressante puisqu’elles ont des propriétés immunomodulatrices et qu’elles sont de plus couramment utilisées en clinique pour traiter des patients ayant un déficit immunitaire. Leur capacité à réduire l’apparition et la sévérité de la GvHD, sans toutefois inhiber ou nuire à la reconstitution immunitaire chez le patient n’a néanmoins jamais été clairement démontrée. Les objectifs de ce projet sont donc d’évaluer l’efficacité des IVIG à réduire l’incidence et la sévérité de la GvHD dans un modèle murin humanisé de GvHD, ainsi que de déterminer le mécanisme d’action des IVIG. Ce modèle consiste à injecter des huPBMCs à des souris immunodéprimées ne pouvant les rejeter. Les résultats obtenus suggèrent que les IVIG possèdent un effet immunomodulateur permettant de réduire les signes cliniques et de retarder l’apparition de la GvHD, tout en permettant l’apparition de cellules NK. Les IVIG agiraient de façon indirecte sur les huPBMCs afin d’induire l’apparition des cellules NK.

Etude des propriétés physicochimiques des vecteurs nanoparticulaires

Cette thèse rapporte l’étude des propriétés physicochimiques des nanoparticles polymériques et leur impact sur l’interaction avec les cellules vivantes. Nous nous sommes tout spécialement attachés à étudier l’effet des propriétés adhésives et mécaniques des nanoparticules sur leur capacité de pénétration de la membrane cellulaire. Pour ce faire, nous avons tout d’abord utilisé des nanoparticules d’acide polylactique (PLA) fonctionnalisées en surface avec un ligand des sélectines E et P. Le greffage du ligand sur la particule s’est fait par une nouvelle méthode expérimentale garantissant la présence du ligand à la surface de la particule durant toute sa durée de vie. Cette méthode consiste à mélanger un polymère fonctionnalisé avec le ligand avec un autre polymère non fonctionnalisé. La présence du ligand à la surface des nanoparticules formées à partir de ce mélange de polymères a été confirmée par analyse ToF SIMS. Nous avons pu prouver que les particules possédant le ligand greffé à leur surface démontraient une capacité adhésive supérieure à leurs homologues non fonctionnalisés sur des cellules endothéliales HUVEC activées par différentes drogues. De plus, le captage des particules par les cellules HUVEC est modulé par le niveau d’expression des récepteurs selectine E et P et aussi par la quantité de ligand libre. Ces résultats montrent clairement que le greffage du ligand confère aux particules des propriétés adhésives accrues et spécifiques ce qui permet leur usage postérieure comme vecteur pharmaceutique capable de cibler un récepteur particulier à la surface d’une cellule. Nous avons aussi démontré que l’interaction entre les nanoparticules et la membrane cellulaire peut aussi être contrôlée aussi bien par les propriétés mécaniques de la cellule que de la nanoparticule. Dans une première étape, nous avons mesuré à l’aide de l’appareil de forces de surface l’élasticité de cellules macrophagiques déposées sur différents substrats. En contrôlant l’interaction entre la cellule et le substrat sur lequel elle repose nous avons montré qu’il était possible de modifier à ii volonté les propriétés mécaniques cellulaire. Une augmentation de l’élasticité cellulaire s’accompagne d’une augmentation systématique de l’internalisation de nanoparticules de PLA non fonctionnalisées. Ceci suggère un rôle prépondérant des propriétés mécaniques du cortex cellulaire dans le captage des nanoparticules de PLA. Dans une seconde étape, nous avons étudié l’effet des propriétés mécaniques des nanoparticules sur leur capacité de pénétration cellulaire. Pour ce faire, nous avons synthétisé des particules d’hydrogel dont l’élasticité était contrôlée par le degré d’agent réticulant inclus dans leur formulation. Le contrôle des propriétés mécaniques des nanoparticules a été confirmé par la mesure du module de Young des particules par microscopie de force atomique. L’impact des propriétés mécaniques de ces particules sur leur capacité de pénétration dans les cellules vivantes a été étudié sur des cellules macrophagiques de souris. Les résultats ont montré que la cinétique d’internalisation, la quantité de particules internalisées et le mécanisme d’internalisation dépendent tous du module de Young des nanoparticules. Aucune différence dans le trajet intracellulaire des particules n’a pu être observée malgré le fait que différentes voies d’internalisation aient été observées. Ce dernier résultat peut s’expliquer par le fait que les nanoparticules sont internalisées par plusieurs voie simultanément ce qui facilite leur accumulation dans les organelles digestives intracellulaires. Un modèle simple permettant d’expliquer ces résultats a été proposé et discuté.