Expressão e purificação da proteína E3 do vírus chikungunya (CHIKV)

RESUMO: O vírus chikungunya (CHIKV) é um vírus de RNA, com invólucro, da família Togaviridae, transmitido por mosquitos Aedes spp. Distribuído por largas regiões de África e Ásia, causa grandes epidemias de artrite grave. A semelhança de sintomas com outras doenças como a dengue e a malária e a persistência de IgM específicas, dificultam o diagnóstico da infeção por CHIKV. A deteção no sangue de E3, uma glicoproteína viral secretada, a incluir num ensaio imunoenzimático poderá melhorar o diagnóstico nos países onde as técnicas de biologia molecular são de difícil acesso. Para testar a utilidade de E3 num ensaio de diagnóstico, esta deverá ser expressa em quantidade, purificada e usada para produção de anticorpos específicos. Para expressar E3 numa forma solúvel, suscetível de ser purificada num único passo cromatográfico sem proteases, recorreu-se à estratégia da fusão com o domínio de ligação à quitina (CBD)-inteína (IMPACT™ System, NEB). A sequência codificadora de E3 foi amplificada a partir de RNA viral, clonada em pTYB21 e expressa em E. coli como uma proteína de fusão insolúvel de 64 kDa. A expressão a 12ºC induzida por IPTG 0,1 mM aumentou a solubilidade de CBD-inteína-E3. A aplicação de lisados celulares em colunas de quitina originou a retenção de CBD-inteína-E3 na matriz. Porém, a autoclivagem da inteína na coluna, induzida com reagentes tiol, foi pouco eficiente e mesmo a proteína E3 separada não eluiu da coluna. E3 foi ainda expressa em E. coli com uma cauda de seis histidinas (E3[His]6) por clonagem no vetor pET28b(+). Lisados celulares aplicados em colunas de níquel permitiram a eluição de uma proteína de 9 kDa, compatível com a massa molecular estimada para E3[His]6, ainda que com outros contaminantes proteicos. A identidade da proteína de 9 kDa será confirmada pela indução de anticorpos com esta preparação e reatividade daqueles com células infetadas com CHIKV.----------------ABSTRACT: Chikungunya virus (CHIKV) is an enveloped, positive strand RNA virus belonging to the family Togaviridae. Transmitted by Aedes spp mosquitoes, CHIKV causes large epidemics of severe arthritogenic disease in Africa and Asia and represents a serious threat in countries where vectors are present. Symptoms similarity with other diseases, e.g. dengue and malaria, along with CHIKV IgM persistence turns accurate CHIKV diagnosis a difficult task in low-income countries. Detection of E3, a small secreted viral glycoprotein, to be included in an immunoenzymatic test was envisaged as a possible improvement in CHIKV diagnosis. To test the diagnostic value of E3, recombinant E3 should be expressed and purified to generate antibodies. In order to express CHIKV E3 in a soluble form amenable to purification by a single step affinity chromatography, the chitin binding domain (CBD)-intein fusion strategy without proteases (IMPACT™ System, NEB) was employed. The E3 coding sequence was amplified from viral RNA, cloned in pTYB21 and expressed in E. coli ER2566 as an insoluble 64 kDa CBD-intein-E3 fusion protein. Solubility was partially achieved by lowering the expression temperature to 12ºC and the inducer (IPTG) concentration to 0.1 mM. Clarified cell lysate loaded onto a chitin column allowed ligation of the fusion protein but the intein-mediated cleavage efficiency was low and E3 failed to elute from the column as demonstrated by SDS-PAGE. E3 was further expressed with a six histidine tag, E3[His]6, employing the pET System (Novagen). E3[His]6 was expressed in E. coli Rosetta (30ºC, 0.4 mM IPTG) as a 9 kDa protein. Soluble cell extracts in 20-40 mM imidazole, applied onto a nickel column and eluted with 500 mM imidazole yielded a protein preparation enriched in the 9kDa protein. The 9 kDa will be used as antigen to generate antibodies that upon reaction with CHIKV infected cells will confirm its identity.

Leptospirosis patient with AIDS the first case reported

A case of renal icterohaemorrhagic leptospirosis involving a patient with acquired immunodeficiency syndrome (AIDS) is reported. Despite the low levels of CD4+ Tlymphocytes, the clinical course of leptospirosis was similar to that observed in non-immunodepressed patients, and no worsening of AIDS occurred due to the infebtion by the spirochete. Serologic conversion was observed in the microscopic agglutination test, with maximum titer of1:3,200. The patient had positive urine cultures for Leptospira interrogans for two months, whereas blood cultures were negative.

Soroepidemiologia da infecção pelo vírus da hepatite A em "meninos de/na rua" de Goiânia-Goiás

Um estudo soroepidemiológico, para anticorpos contra o vírus da hepatite A (anti- VHA total - IgM e IgG), foi realizado no período de 1991-1992, em 397 "meninos de/na rua" em Goiânia. Destes, 313 apresentavam vínculo familiar e desmvolviam, em sua maioria, atividades de trabalho informal, eitquanto que 84 não possuíam vínculo familiar e se encontravam na rua ou em Instituições do Governo Estadual. A taxa média de prevalência foi de 90,4%, variando de 80,0% a 92,9%, sem contudo apresentar diferença estatística significante relativa à idade (7-21). Também não se evidenciou qualquer diferença quando este grupo foi estratificado para presença ou ausência de vínculo familiar ou mesmo quando analisado em relação a outras variáveis sócio-demogrãficas. Estes dados sugerem que a hepatite A ê endêmica na população de baixa condição sócio-econômica da região e que nesta faixa etãria a maioria dos indivíduos já adquiriu a infecção. Outras investigações em grupos e camadas sociais diferentes são necessárias a fim de parametrar estratégias vacinais em países subdesenvolvidos.

Paracoccidioidomicose em paciente coma infecção pelo vírus da imunodeficiência humana: relato de necrópsia

Relata-se caso da associação paracoccidioidomicose - infecção pelo vírus da imunodeficiência humana (HIV) em homem de 43 anos, em que se descreve, pela primeira vez, de modo detalhado, o quadro anatomopatológico da referida associação. Discutem-se a baixa freqüência desta associação, o comportamento, evolução e tratamento da paracoccidioidomicose em pacientes HIV positivos e chama-se a atenção para a importância da associação da infecção pelo HIV com as doenças tropicais mais comuns em nosso meio.

Tratamento da criptosporidiase, em pacientes com AIDS, por meio da paromomicina

A criptosporidíase de 25 pacientes adultos, com síndrome da imunodeficiência adquirida (AIDS) foi tratada por meio da paromomicina, sendo administrados, por via oral, 500mg quatro vezes ao dia, durante duas semanas. Houve boa resposta clínica, representada por redução considerável ou cessação da diarréia em 19 (76%), tendo a tolerância sido satisfatória. Somente em um (4%) doente ocorreram tonturas e, em outro (4%), surgiram náuseas e vômitos, possivelmente devido à medicação. Controle parasitológico de cura teve lugar em 20, verificando-se na maioria deles (75%) persistência do agente causal. Apesar do freqüente insucesso quanto à eliminação do parasita, a melhoria obtida na maioria das vezes e a apreciável tolerância ao medicamento, tornam a paromomicina opção muito útil na terapêutica da infecção intestinal causada pelo Cryptosporidium sp nos indivíduos com AIDS.

Prevalência dos marcadores sorológicos dos vírus da hepatite B e D em crianças das tribos Caiabietxucarramãe do parque indígena do Xingu, Brasil central

O Parque Indígena do Xingu (PIX) está localizado no estado do Mato Grosso, na região de transição de cenado ao sul e da floresta Amazônica ao norte. Dados de literatura mostram que a população adulta apresenta elevada prevalência de marcadores do vírus da hepatite B (HBV). O presente estudo visa determinar a prevalência dos marcadores do HBV e do HDV na população indígena do PIX de zero a 14 anos, e investigar a forma de transmissão do HBV na região. Entre as 17 tribos existentes no PIX escolheu-se os Caiabi e os Txucairamãe que diferem em seus hábitos de vida e habitam a região Norte do parque com características de clima, vegetação e fauna semelhantes ás da região Amazônica. Avaliaram-se 222 crianças (116 Txucarramãe e 106 Caiabi) e 33 mulheres em idade fértil. A pesquisa de marcadores sorológicos para HBV e HDV foi feita por técnica imunoenzimãtica. A prevalência global dos marcadores sorológicos nas crianças foi: HBsAg 4,5%; anti-HBs 39,6%; anti- HBc 44,1%; presença de algum marcador do HBV 47,3% e anti-HDV 0,0%, enquanto que nas mulheres em idade fértil foi: HBsAg 12%, todas anti-HBe positivas. A infecção pelo HBV ocoireu mais precocemente entre os Txucarramãe, quando se considerou algum marcador do HBV (p < 0,001). No PIX, área de alta endemicidadepara infecção pelo HBV, a transmissão do vírus ocorre provavelmente de maneira horizontal e não vertical como seria de se esperar, características culturais, condições de habitação e presença de insetos hematófagos são importantes determinantes na sua transmissão. Apesar de não ter sido detectado nenhum caso com hepatite Delta, o PIX é uma área propícia para a sua disseminação.

Imunogenicidade da cepa avirulenta RV194-2 do vírus rábico em camundongos

O vírus rábico RV194-2, uma variante avirulenta da cepa CVS (Challenge Vírus Standard), produz uma infecção inaparente quando inoculado intracerebralmente em camundongos adultos. Sugerindo que a resposta imunológica do hospedeiro permite a eliminação do vírus do sistema nervoso central. Por esta razão foram estudadas a indução de interferon e a resposta imune humoral em camundongos BALB/c inoculados com vírus RV194-2. Durante a infecção, estes camundongos apresentaram elevados níveis de interferon no plasma e no cérebro com altos títulos de anticorpos neutralizantes anti-rábicos. A 2-5A sintetase. um marcador da ação dos interferons,foi também analisada no cérebro destes animais. Sua atividade, aumentou, paralelamente, á produção de interferon, demonstrando que este interferon é bioquímicamente ativo. O vírus RV194-2 também induziu, 45 dias após sua inoculação, proteção aos animais quando desafiados com a cepa virulenta CVS. Estes resultados demonstram que a cepa RV194-2possui um alto nível imunogênico.