A multi-locus approach to barcoding in the Anopheles strodei subgroup (Diptera: Culicidae)

Abstract Background The ability to successfully identify and incriminate pathogen vectors is fundamental to effective pathogen control and management. This task is confounded by the existence of cryptic species complexes. Molecular markers can offer a highly effective means of species identification in such complexes and are routinely employed in the study of medical entomology. Here we evaluate a multi-locus system for the identification of potential malaria vectors in the Anopheles strodei subgroup. Methods Larvae, pupae and adult mosquitoes (n = 61) from the An. strodei subgroup were collected from 21 localities in nine Brazilian states and sequenced for the COI, ITS2 and white gene. A Bayesian phylogenetic approach was used to describe the relationships in the Strodei Subgroup and the utility of COI and ITS2 barcodes was assessed using the neighbor joining tree and “best close match” approaches. Results Bayesian phylogenetic analysis of the COI, ITS2 and white gene found support for seven clades in the An. strodei subgroup. The COI and ITS2 barcodes were individually unsuccessful at resolving and identifying some species in the Subgroup. The COI barcode failed to resolve An. albertoi and An. strodei but successfully identified approximately 92% of all species queries, while the ITS2 barcode failed to resolve An. arthuri and successfully identified approximately 60% of all species queries. A multi-locus COI-ITS2 barcode, however, resolved all species in a neighbor joining tree and successfully identified all species queries using the “best close match” approach. Conclusions Our study corroborates the existence of An. albertoi, An. CP Form and An. strodei in the An. strodei subgroup and identifies four species under An. arthuri informally named A-D herein. The use of a multi-locus barcode is proposed for species identification, which has potentially important utility for vector incrimination. Individuals previously found naturally infected with Plasmodium vivax in the southern Amazon basin and reported as An. strodei are likely to have been from An. arthuri C identified in this study.

Transformation with human dihydrofolate reductase renders malaria parasites insensitive to WR99210 but does not affect the intrinsic activity of proguanil

Increasing resistance of Plasmodium falciparum malaria parasites to chloroquine and the dihydrofolate reductase (DHFR) inhibitors pyrimethamine and cycloguanil have sparked renewed interest in the antimalarial drugs WR99210 and proguanil, the cycloguanil precursor. To investigate suggestions that WR99210 and proguanil act against a target other than the reductase moiety of the P. falciparum bifunctional DHFR–thymidylate synthase enzyme, we have transformed P. falciparum with a variant form of human DHFR selectable by methotrexate. Human DHFR was found to fully negate the antiparasitic effect of WR99210, thus demonstrating that the only significant action of WR99210 is against parasite DHFR. Although the human enzyme also resulted in greater resistance to cycloguanil, no decrease was found in the level of susceptibility of transformed parasites to proguanil, thus providing evidence of intrinsic activity of this parent compound against a target other than DHFR. The transformation system described here has the advantage that P. falciparum drug-resistant lines are uniformly sensitive to methotrexate and will complement transformation with existing pyrimethamine-resistance markers in functional studies of P. falciparum genes. This system also provides an approach for screening and identifying novel DHFR inhibitors that will be important in combined chemotherapeutic formulations against malaria.

Transformation of malaria parasites by the spontaneous uptake and expression of DNA from human erythrocytes

The uptake and expression of extracellular DNA has been established as a mechanism for horizontal transfer of genes between bacterial species. Such transfer can support acquisition of advantageous elements, including determinants that affect the interactions between infectious organisms and their hosts. Here we show that erythrocyte-stage Plasmodium falciparum malaria parasites spontaneously take up DNA from the host cell cytoplasm into their nuclei. We have exploited this finding to produce levels of reporter expression in P.falciparum that are substantially improved over those obtained by electroporation protocols currently used to transfect malaria parasites. Parasites were transformed to a drug-resistant state when placed into cell culture with erythrocytes containing a plasmid encoding the human dihydrofolate reductase sequence. The findings reported here suggest that the malaria genome may be continually exposed to exogenous DNA from residual nuclear material in host erythrocytes.

Isolation of multiple sequences from the Plasmodium falciparum genome that encode conserved domains homologous to those in erythrocyte-binding proteins.

Open reading frames in the Plasmodium falciparum genome encode domains homologous to the adhesive domains of the P. falciparum EBA-175 erythrocyte-binding protein (eba-175 gene product) and those of the Plasmodium vivax and Plasmodium knowlesi Duffy antigen-binding proteins. These domains are referred to as Duffy binding-like (DBL), after the receptor that determines P. vivax invasion of Duffy blood group-positive human erythrocytes. Using oligonucleotide primers derived from short regions of conserved sequence, we have developed a reverse transcription-PCR method that amplifies sequences encoding the DBL domains of expressed genes. Products of these reverse transcription-PCR amplifications include sequences of single-copy genes (including eba-175) and variably transcribed genes that cross-hybridize to multiple regions of the genome. Restriction patterns of the multicopy genes show a high degree of polymorphism among different parasite lines, whereas single-copy genes are generally conserved. Characterization of the single-copy genes has identified a gene (ebl-1) that is related to eba-175 and is likely to be involved in erythrocyte invasion.

Genetic diversity of Plasmodium falciparum histidine-rich protein 2 (PfHRP2) and its effect on the performance of PfHRP2-based rapid diagnostic tests

Rising costs of antimalarial agents are increasing the demand for accurate diagnosis of malaria. Rapid diagnostic tests (RDTs) offer great potential to improve the diagnosis of malaria, particularly in remote areas. Many RDTs are based on the detection of Plasmodium falciparum histidine-rich protein (PfHRP) 2, but reports from field tests have questioned their sensitivity and reliability. We hypothesize that the variability in the results of PfHRP2-based RDTs is related to the variability in the target antigen. We tested this hypothesis by examining the genetic diversity of PfHRP2, which includes numerous amino acid repeats, in 75 P. falciparum lines and isolates originating from 19 countries and testing a subset of parasites by use of 2 PfHRP2-based RDTs. We observed extensive diversity in PfHRP2 sequences, both within and between countries. Logistic regression analysis indicated that 2 types of repeats were predictive of RDT detection sensitivity (87.5% accuracy), with predictions suggesting that only 84% of P. falciparum parasites in the Asia-Pacific region are likely to be detected at densities

Population pharmacokinetics and pharmacodynamics of lumefantrine in young Ugandan children treated with artemether-lumefantrine for uncomplicated malaria

Background. The pharmacokinetics and pharmacodynamics of lumefantrine, a component of the most widely used treatment for malaria, artemether-lumefantrine, has not been adequately characterized in young children. Methods. Capillary whole-blood lumefantrine concentration and treatment outcomes were determined in 105 Ugandan children, ages 6 months to 2 years, who were treated for 249 episodes of Plasmodium falciparum malaria with artemether-lumefantrine. Results. Population pharmacokinetics for lumefantrine used a 2-compartment open model with first-order absorption. Age had a significant positive correlation with bioavailability in a model that included allometric scaling. Children not receiving trimethoprim-sulfamethoxazole with capillary whole blood concentrations <200 ng/mL had a 3-fold higher hazard of 28-day recurrent parasitemia, compared with those with concentrations >200 ng/mL (P =. 0007). However, for children receiving trimethoprim-sulfamethoxazole, the risk of recurrent parasitemia did not differ significantly on the basis of this threshold. Day 3 concentrations were a stronger predictor of 28-day recurrence than day 7 concentrations. Conclusions. We demonstrate that age, in addition to weight, is a determinant of lumefantrine exposure, and in the absence of trimethoprim-sulfamethoxazole, lumefantrine exposure is a determinant of recurrent parasitemia. Exposure levels in children aged 6 months to 2 years was generally lower than levels published for older children and adults. Further refinement of artemether-lumefantrine dosing to improve exposure in infants and very young children may be warranted. © 2016 The Author.

Alterações à fisiologia e infeção por Plasmodium berghei do mosquito Anopheles gambiae mediadas pela ativação de recetores GPCR

Dissertação de Mestrado, Ciências Biomédicas, Departamento de Ciências Biomédicas e Medicina, Universidade do Algarve, 2015

Polirradiculoneurite e malária: relato de um caso

Case report of a patient who three weeks after a Plasmodium falciparum malaria presented the Guillain-Barré syndrome. There was a severe type of polyradiculoneuritis with tetraplegia and involvement of several cranial nerves (VI, VII, IX, X) evolving to death. The Guillain-Barré syndrome has been considered a immune disorder with several eliciting antigenic stimuli. The case suggests that protozoan may be one these antigenic factors.

Single-chain antibodies produced by phage display against the C-terminal 19 kDa region of merozoite surface protein-1of Plasinodium yoelii reduce parasite growth following challenge

Antibodies have the potential to be therapeutic reagents for malaria. Here we describe the production of a novel phage antibody display library against the C-terminal 19 kDa region of the Plasmodium yoelii YM merozoite surface protein-1 (MSP1(19)). In vivo studies against homologous lethal malaria challenge show an anti-parasite effect in a dose dependent manner, and analysis by plasmon resonance indicates binding to the antigen is comparable to the binding of a protective monoclonal antibody. The data support the lack of a need for any antibody Fc-related function and hold great significance for the development of a therapeutic reagent for malaria. (C) 2002 Elsevier Science Ltd. All rights reserved.

Nota sobre surto de malária em usuários de drogas injetáveis

Relata-se surto de malária por Plasmodium vivax entre usuários de drogas injetáveis, detectado na cidade de Bauru, Estado de São Paulo, Brasil. Até julho de 1989 12 casos haviam sido confirmados pelo exame de gota espessa, e 20 outros contactantes suspeitos estavam sendo investigados. Todos os casos relataram uso freqüente de cocaína injetável, compartilhando seringas e agulhas, e negaram viagens por áreas endêmicas de malária.

Malária em usuários de drogas de administração endovenosa associada à soropositividade para HIV

Infecções induzidas de malária têm sido verificadas nos últimos anos no Estado de São Paulo, Brasil concomitantemente com o aumento de casos importados procedentes da região endêmica do país. Destaca-se o registro de um caso em 1988 e onze casos em 1989 de malária induzida por Plasmodium vivax, em indivíduos residentes na cidade de Presidente Prudente, situada a oeste do Estado e considerada uma das "portas de entrada" de pessoas procedentes da Região Amazônica. Os pacientes afirmaram não terem se deslocado recentemente ou negaram deslocamentos para áreas com possibilidade de transmissão de malária. Todos fizeram uso de drogas injetáveis, participando de círculos de conhecidos afins e geralmente dividiam a mesma agulha e seringa no uso da cocaína. Foi detectado o doente de malária que transmitiu inicialmente a doença ao caso de 1988, e a um primeiro grupo de três indivíduos em 1989. Destes três casos, um transmitiu a doença a outro grupo de dois indivíduos em 1989. A partir destas primeiras infecções e do uso continuado das drogas injetáveis entre grupos, surgiram dois novos casos e houve reinfecção em dois indivíduos (um destes apresentou duas reinfecções). O exame para detecção de HIV foi positivo em cinco indivíduos, um apresentou resultado negativo e não foi realizado em outros três indivíduos. São analisadas as informações desses casos e discutida a importância de sua ocorrência no momento atual.

Surto de malária induzida entre usuários de drogas injetáveis

Em julho de 1990, foi registrado na cidade de Bauru, Estado de São Paulo, Brasil, um surto de malária envolvendo usuários de cocaína injetável. Uma ampla investigação epidemiológica, conduzida de 19 de julho a 13 de setembro, revelou que pelo menos 119 pessoas estavam envolvidas no surto, uma vez que haviam compartilhado seringas e agulhas com um ou mais casos confirmados nos 3 meses anteriores à ocorrência. Cento e duas dessas pessoas foram localizadas e entrevistadas, e destas, 99 foram submetidas a exame de gota espessa e 91 a exames sorológicos para malária. Foram confirmados por exame hemoscópico 21 casos de malária por P. vivax, e 3 outros tiveram exame sorológico positivo para P. vivax. O controle da transmissão foi obtido fornecendo-se cloroquina aos envolvidos no surto, numa dose inicial de 10 comprimidos, seguida de doses supressivas semanais de 2 comprimidos até que fosse identificado o último comunicante. Amostras de soro coletadas na ocasião revelaram, ao lado da malária, uma alta prevalência de infecções pelo HIV (58%) e pelo vírus da hepatite B (40%). Foram discutidas as dificuldades para o controle do surto e a possibilidade da malária vir a se tornar uma doença endêmica entre usuários de drogas injetáveis, no Estado de São Paulo.

Aspectos epidemiológicos da malária no Estado de São Paulo, Brasil, 1983 a 1992

São apresentados aspectos epidemiológicos da malária no Estado de São Paulo, baseados nas notificações de casos do período de 1983 a 1992. Foram confirmados 20.200 casos, nos quais em 65,7% foi diagnosticado Plasmodium vivax (P.v.) e em 27,3% P.falciparum (P.f.), sem diferença entre os anos. Também não se constataram diferenças na distribuição quanto ao sexo (85,4% masculino) e faixa etária (63,6% com idade entre 20 e 39 anos). As investigações epidemiológicas demonstraram que em 2,0% a transmissão ocorreu no próprio Estado, em duas áreas bem distintas: área coberta por Mata Atlântica, onde a malária pode ser considerada endêmica, com predomínio de P.v. com baixas parasitemias e onde estão presentes anofelinos do subgênero Kerteszia e área correspondente ao Planalto Paulista, onde a presença de anofelinos do subgênero Nyssorhynchus, associada à circulação de pacientes com malária importada, tem sido responsabilizada por focos de P.v. e P.f.. Constatou-se que 91,6% dos casos procederam de outras regiões, sendo que destes 89,0% se originaram nos Estados de Rondônia, Mato Grosso e Pará. Verificou-se no decênio o aumento progressivo de casos importados de Mato Grosso, correspondendo a 51,7%, em 1992. Malária induzida por transfusão de sangue ou pelo uso de seringas e agulhas contaminados entre usuários de drogas totalizou 27 e 58 casos, respectivamente. A letalidade observada foi de 5,0/1.000 doentes e esteve associada à infecção por P.f. em primo-infectados com diagnóstico tardio. O estudo do conjunto dessas informações acrescenta subsídios para as ações de vigilância epidemiológica da malária.

Malária adquirida durante atividade entomológica na Serra do Mar, região Sudeste do Brasil

No início de 1993 foi detectado um foco de malária no Parque Estadual da Serra do Mar, área de Mata Altântica no Estado de São Paulo (Brasil). Quando da realização da pesquisa entomológica ocorreu a infecção malárica por Plasmodium vivax em três capturadores da equipe de campo. A transmissão ocorreu em área que vem apresentando baixos níveis de incidência de malária, e os capturadores tiveram um período de exposição extremamente reduzido, sendo de apenas três horas em um dos casos.

Vetores de malária em duas reservas indígenas da Amazônia Brasileira

OBJETIVO: Descrever a composição, características ecológicas e comportamentais e infectividade das espécies de anofelinos em reservas indígenas da região Amazônica. MÉTODOS: O estudo foi conduzido no ano de 2002 em aldeias das reservas indígenas Nhamundá-Mapuera e Cuminapanema no estado do Pará. Foram realizadas três coletas de duas semanas em cada reserva, com capturas de adultos e de imaturos. Anofelinos adultos foram capturados com capturador de Castro por atração humana nos ambientes intra e peridomiciliares, no período das 18h às 21h e das 18 às 06h e avaliados para verificação da paridade e infectividade para plasmódios por dissecção e ELISA. As coleções hídricas próximas às aldeias foram pesquisadas utilizando conchas de 500 ml, sendo 20 conchadas a cada 10 m, cobrindo-se a extensão máxima de 200 m de perímetro do criadouro. RESULTADOS: Foram capturadas 8.668 fêmeas somando-se as coletas das duas reservas. Anopheles darlingi foi a espécie predominante, com maior freqüência no peridomicílio. Na reserva Mapuera, a atividade hematofágica concentrou-se entre as 20h e 24h e, em Cuminapanema, manteve-se elevada até as 24h, diminuindo após esse horário e voltando a elevar-se no início da manhã. Das 6.350 fêmeas de An. darlingi examinadas, 18 estavam infectadas por Plasmodium vivax VK 247, VK 210, P. falciparum e P. malariae. Outras 1.450 fêmeas de outras espécies foram examinadas, mas nenhuma foi encontrada infectada. An. nuneztovari e Chagasia bonnae foram as espécies mais freqüentes nos criadouros das aldeias Mapuera e Cuminapanema, respectivamente. Imaturos de An. darlingi não foram localizados em Mapuera e foram capturados em apenas uma das coletas da reserva Cuminapanema. CONCLUSÕES: As populações de An. darlingi das duas reservas apresentaram comportamento exofílico e intensa atividade noturna. A ocorrência de imaturos foi pouco freqüente e a densidade larvária foi baixa. As características comportamentais dos vetores não se mostraram favoráveis às atividades usuais de controle vetorial.