964 resultados para Mécanisme enzymatique
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Comme son titre l'indique, ce mmoire traite de la lgitimit du recours l'action dclaratoire en droit international priv qubcois. L'action dclaratoire, qu'elle soit introduite par dclaration ou par requte, a pour but de faire prononcer un tribunal sur l'existence ou l'inexistence de droits et obligations des parties. Bien que trs ancienne, l'action dclaratoire n'tait que peu utilise au Qubec jusqu' l'avnement en 1966 de la requte en jugement dclaratoire dans notre Code de procdure civile. Aujourd'hui, cette action est largement utilise en droit public dans le cadre du pouvoir de surveillance et de contrle de la Cour suprieure, mais aussi dans le contexte du droit international priv comme une stratgie de dfense, ou parfois d'attaque, dans le cadre d'un litige international. Fondamentalement, la finalit de cette action est d'offrir un mécanisme de protection judiciaire des droits d'un individu lorsque les autres recours ne sont pas disponibles ou accessibles, et de permettre un recours efficace hors du cadre traditionnel de la procdure ordinaire. Ds lors, il semble contestable d'utiliser en droit international priv l'action en jugement dclaratoire pour bloquer les procdures ordinaires autrement applicables. L'objet de cette tude est ainsi de dmontrer que bien que le recours l'action dclaratoire soit lgitime en droit international priv, son utilisation actuelle des fins stratgiques en prsence, ou en prvision, d'une action ordinaire intente dans une autre juridiction, parat difficilement justifiable. Ainsi, la premire partie de ce mmoire est consacre l'tude de la lgitimit de l'action dclaratoire en droit international priv qubcois, et la seconde partie s'intresse aux effets d'une requte en jugement dclaratoire trangre sur la procdure internationale au Qubec.
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Nos tudes ont dmontres que la formation de la cicatrice et la gurison sont associes avec lapparition de cellules de type myocytes cardiaques nestine(+) dans la rgion pri-infarcie. Prsentement, ltude examine le mécanisme, tel que lhypoxie ou les hormones neuronales, possiblement impliqu dans leur recrutement et de dvoiler leur origine cellulaire. La prsence de ces cellules a t dtecte dans les coeurs infarcies dune semaine et maintenue aprs neuf mois suite une sujtion coronaire complte. Aussi, ces cellules de type myocytes cardiaques nestine(+) ont t observes dans le coeur infarci humain. Lhypoxie reprsente un vnement prdominant suite un infarctus de myocarde, mais lexposition des rats normaux un environnement hypoxique na pas pu promouvoir lapparition de ces cellules. Autrement, linfusion de lagoniste -adrnergique non-slectif isoprotrnol (ISO) dans les rats adultes Sprague-Dawley a augment la protine nestine dans le ventricule gauche et a t associ avec la rapparition de cellules de type myocytes cardiaques nestine(+). Cela reprsente possiblement un effet secondaire suite la ncrose des myocytes cardiaques par ladministration disoprotrnol. Dernirement, on a identifi une sous-population de cellules nestine(+) dans le coeur normal du rat qui co-exprime les marqueurs de cellules cardiaques prognitrices Nkx-2.5 et GATA-4. Cette sous-population de cellules nestine/Nkx-2.5/GATA-4 pourrait reprsenter des substrats cellulaires qui puissent se diffrentier en cellules de type myocytes cardiaques nestine(+) suite une ischmie. Mots cls: nestine, isoprotrnol, ncrose, cellule souche, cellule prognitrice, myocyte cardiaque
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La dihydrofolate rductase humaine (DHFRh) est une enzyme essentielle la prolifration cellulaire, ce qui en fait une cible de choix pour le traitement de diffrents cancers. cet effet, plusieurs inhibiteurs spcifiques de la DHFRh, les antifolates, ont t mis au point : le mthotrexate (MTX) et le pemetrexed (PMTX) en sont de bons exemples. Malgr lefficacit clinique certaine de ces antifolates, le dveloppement de nouveaux traitements savre ncessaire afin de rduire les effets secondaires lis leur utilisation. Enfin, dans loptique dorienter la synthse de nouveaux composs inhibiteurs des DHFRh, une meilleure connaissance des interactions entre les antifolates et leur enzyme cible est primordiale. laide de lvolution dirige, il a t possible didentifier des mutants de la DHFRh pour lesquels laffinit envers des antifolates cliniquement actifs se voyait modifie. La mutagense dite de saturation a t utilise afin de gnrer des banques de mutants prsentant une diversit gntique au niveau des rsidus du site actif de lenzyme dintrt. De plus, une nouvelle mthode de criblage a t mise au point, laquelle sest avre efficace pour dpartager les mutations ayant entrain une rsistance aux antifolates et/ou un maintient de lactivit enzymatique envers son substrat natif, soient les phnotypes dactivit. La mthode de criblage consiste dans un premier temps en une slection bactrienne haut dbit, puis dans un second temps en un criblage sur plaques permettant didentifier les meilleurs candidats. Plusieurs mutants actifs de la DHFRh, rsistants aux antifolates, ont ainsi pu tre identifis et caractriss lors dtudes de cintique enzymatique (kcat et IC50). Sur la base de ces rsultats cintiques, de la modlisation molculaire et des donnes structurales de la littrature, une tude structure-activit a t effectue. En regardant quelles mutations ont les effets les plus significatif sur la liaison, nous avons commenc construire un carte molculaire des contacts impliqus dans la liaison des ligands. Enfin, des connaissances supplmentaires sur les proprits spcifiques de liaison ont put tre acquises en variant linhibiteur test, permettant ainsi une meilleure comprhension du phnomne de discrimination du ligand.
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La dihydrofolate rductase humaine (DHFRh) est une enzyme essentielle la prolifration cellulaire. Elle rduit le dihydrofolate en ttrahydrofolate, un co-facteur impliqu dans la biosynthse des purines et du thymidylate. La DHFRh est une cible de choix pour des agents de chimiothrapie comme le mthotrexate (MTX), inhibant spcifiquement lenzyme ce qui mne un arrt de la prolifration et ultimement la mort cellulaire. Le MTX est utilis pour le traitement de plusieurs maladies prolifratives, incluant le cancer. La grande utilisation du MTX dans le milieu clinique a men au dveloppement de mécanismes de rsistance, qui rduisent lefficacit de traitement. La prsente tude se penche sur lun des mécanismes de rsistance, soit des mutations dans la DHFRh qui rduisent son affinit pour le MTX, dans le but de mieux comprendre les lments molculaires requis pour la reconnaissance de linhibiteur au site actif de lenzyme. En parallle, nous visons identifier des variantes plus rsistantes au MTX pour leur utilisation en tant que marqueurs de slection en culture cellulaire pour des systmes particuliers, tel que la culture de cellules hmatopotiques souches (CHS), qui offrent des possibilits intressantes dans le domaine de la thrapie cellulaire. Pour tudier le rle des diffrentes rgions du site actif, et pour vrifier la prsence dune corrlation entre des mutations ces rgions et une augmentation de la rsistance au MTX, une stratgie combinatoire a t dvelope pour la cration de plusieurs banques de variantes des rsidus du site actif proximit du MTX li. Les banques ont t slectionnes in vivo dans un systme bactrien en utilisant des milieux de croissance contenant des hautes concentrations de MTX. La banque DHFRh 31/34/35 gnra un nombre considrable de variantes combinatoires de la DHFRh hautement rsistantes au MTX. Les variantes les plus intressantes ont t testes pour leur potentiel en tant que marqueur de slection dans plusieurs lignes cellulaires, dont les cellules hmatopotiques transduites. Une protection complte contre les effets cytotoxiques du MTX a t observe chez ces cellules suite leur infection avec les variantes combinatoires. Pour mieux comprendre les causes molculaires relies la rsistance au MTX, des tudes de structure tridimensionnelle de variantes lies au MTX ont t entreprises. La rsolution de la structure de la double variante F31R/Q35E li au MTX a rvl que le phnotype de rsistance tait attribuable dimportantes diffrences entre le site actif de la double variante et de lenzyme native, possiblement d un phnomme dynamique. Une comprhension plus gnrale de la reconnaissance et la rsistance aux antifolates a t ralise en comparant des squences et des structures de variantes de la DHFR rsistants aux antifolates et provenant de diffrentes espces. En somme, ces travaux apportent de nouveaux lments pour la comprehension des intractions importantes entre une enzyme et un ligand, pouvant aider au dveloppement de nouveaux antifolates plus efficaces pour le traitement de diverses maladies. De plus, ces travaux ont gnr de nouveaux gnes de rsistance pouvant tre utiliss en tant que marqueurs de slection en biologie cellulaire.
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Linsomnie, une condition frquemment retrouve dans la population, se caractrise dabord par une difficult initier ou maintenir le sommeil et/ou par des veils prcoces le matin ou encore par un sommeil non-rparateur. Lorsquelle nest pas accompagne par des troubles psychiatriques ou mdicaux ou un autre trouble de sommeil et quelle perdure plus de 6 mois on parle alors dinsomnie primaire chronique. Selon certains, cette condition serait associe un tat dhyperveil caractris par une augmentation de lactivit autonome sympathique durant le sommeil et lveil. Le barorflexe est un important mécanisme de contrle court terme des fluctuations de la tension artrielle (TA) et de la frquence cardiaque agissant sur le cur et les vaisseaux sanguins par lentremise du systme nerveux autonome. On appelle sensibilit barorceptive (SBR) la capacit du barorflexe de ragir et de contrler les fluctuations de TA en modulant le rythme cardiaque. De manire gnrale, la SBR serait augmente durant la nuit par rapport la journe. Aussi, il semblerait que le barorflexe soit impliqu dans le phnomne de baisse physiologique de la TA pendant la nuit. Or, des donnes de notre laboratoire ont dmontr une augmentation de la TA systolique au cours de la nuit ainsi quune attnuation de la baisse nocturne de TA systolique chez des sujets avec insomnie primaire chronique compar des tmoins bons dormeurs. De plus, il a t dmontr que le barorflexe tait altr de faon prcoce dans plusieurs troubles cardiovasculaires et dans lhypertension artrielle. Or, il semblerait que linsomnie soit accompagne dun risque accru de dveloppement de lhypertension artrielle. Ces tudes semblent aller dans le sens dune altration des mécanismes de rgulation de la TA dans linsomnie. Par ailleurs, une rduction de la SBR serait aussi implique dans des tats associs une augmentation de lactivit autonome sympathique. Ainsi, nous nous sommes demand si le barorflexe pouvait constituer un des mécanismes de contrle de la TA qui serait altr dans linsomnie et pourrait tre impliqu dans laugmentation de lactivit sympathique qui semble accompagner linsomnie. Jusqu prsent, le barorflexe reste inexplor dans linsomnie. Lobjectif principal de ce mmoire tait dvaluer de faon non-invasive la SBR lveil et en sommeil chez 11 sujets atteints dinsomnie primaire chronique compar 11 tmoins bons dormeurs. Lvaluation du barorflexe a t effectue de faon spontane par la mthode de lanalyse en squence et par le calcul du coefficient alpha obtenu par lanalyse spectrale croise de lintervalle RR et de la TA systolique. De faon concomitante, les paramtres de la variabilit de lintervalle RR en sommeil et lveil ont aussi t compars chez ces mmes sujets. Aucune diffrence significative na t note au niveau des index de la SBR entre le groupe dinsomniaques et celui des bons dormeurs, lveil ou en sommeil. Cependant, on observe des valeurs lgrement plus faibles de la SBR chez les insomniaques ayant mal dormi (efficacit de sommeil (ES) < 85%) compars aux insomniaques ayant bien dormi (ES 85%) la nuit exprimentale durant lveil et en sommeil. Par ailleurs, aucune diffrence na t note entre le groupe dinsomniaques et celui des bons dormeurs au niveau des paramtres de la variabilit RR considrs (intervalle RR, PNN50, LF et HF en valeurs normalises). En effet, les insomniaques tout comme les bons dormeurs semblent prsenter une variation normale de lactivit autonome en sommeil, telle que reprsente par les paramtres de la variabilit RR. Ces rsultats prliminaires semblent suggrer que les mécanismes du barorflexe sont prservs chez les sujets atteints dinsomnie primaire chronique tels que diagnostiqus de manire subjective. Cependant, il est possible quune altration des mécanismes du barorflexe ne se rvle chez les insomniaques que lorsque les critres objectifs dune mauvaise nuit de sommeil sont prsents.
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Les Cellules Endothliales Prognitrices ("Endothelial Progenitor Cells", EPCs) sont des prcurseurs endothliaux qui jouent un rle mergeant en biologie vasculaire. Les EPCs ont t localises dans le cordon ombilical, la moelle osseuse, le sang priphrique et dans certains tissus rgnrateurs. Les interactions des EPCs avec les cellules sanguines et vasculaires peuvent largement influencer leurs proprits biologiques et dicter leur fonctionnement pendant la rparation endothliale. Plus spcifiquement, les interactions des EPCs avec les plaquettes circulantes induisent leur migration, leur recrutement et leur diffrentiation en cellules endothliales aux sites de lsions vasculaires. Cependant, limpact dune telle interaction sur la fonction plaquettaire na pas t recherch. Le but de mon projet tait de :1) gnrer des EPCs partir des cellules mononuclaires du sang humain priphrique ("Peripheral Blood Mononuclear Cells", PBMCs); 2) tudier les interactions adhsives entre les EPCs et les plaquettes; 3) dterminer leur impact sur la fonction plaquettaire et la formation du thrombus et 4) dcrire le mécanisme daction des EPCs sur les plaquettes et le thrombus. Mises en culture sur une surface de fibronectine dans un milieu conditionn, les PBMCs frachement isoles possdaient une morphologie ronde et une petite taille. Aprs cinq jours, les PBMCs adhrentes donnaient naissance des colonies, puis formaient une monocouche de cellules aplaties caractristiques des EPCs aprs dix jours de culture. Les EPCs diffrencies taient positives pour lUlex-lectine et lActyle des lipoprotines de faible densit ("Acetylated Low Density Lipoprotein", Ac-LDL), exprimaient les marqueurs progniteurs (CD34, P-slectine, VEGFR2, vWF et VE-Cadhrine) tandis que les marqueurs leucocytaires (CD14, PSGL-1 et L-slectine) taient absents. Ces EPCs interagissaient avec les plaquettes actives par un mécanisme dpendant de la P-slectine plaquettaire, inhibaient lactivation et lagrgation plaquettaire et rduisaient significativement ladhsion plaquettaire, principalement par laction de prostacycline (PGI2). En fait, ceci tait associ avec une augmentation de lexpression de la cyclooxygnase-2 (COX-2) et du monoxyde dazote (NO) synththase inductible (iNOS). Toutefois, les effets inhibiteurs des EPCs sur la fonction plaquettaire ont t renverss par une inhibition de la COX et non pas du NO. Bien que les EPCs fussent en mesure de lier les plaquettes via la P-slectine, leurs effets prdominants taient mdis essentiellement par une scrtion paracrine, impliquant la PGI2. Nanmoins, un rapprochement troit ou un bref contact entre les EPCs et les plaquettes tait requis pour que cette fonction soit compltement ralise. Dailleurs, cet aspect a t investigu chez des souris dficientes en P-slectine (P-sel-/-) et chez leurs congnres de phnotype sauvage (Wild Type, WT). Chez les souris WT, les EPCs inhibaient lagrgation plaquettaire dans le sang complet de manire concentration-dpendante alors que dans les souris P-sel-/-, laction des EPCs navait pas deffet significatif. De plus, en utilisant un modle murin de thrombose artrielle, nous avons dmontr que linfusion systmique des EPCs altraient la formation du thrombus et rduisaient significativement sa masse chez les souris WT, mais non pas chez les souris P-sel-/-. En outre, le nombre des EPCs incorpores au niveau du thrombus et de la paroi vasculaire tait visiblement rduit chez les P-sel-/- par rapport aux souris WT. Dans cette tude, nous sommes parvenus diffrentier adquatement des EPCs partir des PBMCs, nous avons tudi les interactions adhsives entre les EPCs et les plaquettes, et nous avons dcrit leur impact sur la fonction plaquettaire et la formation du thrombus. De plus, nous avons identifi la PGI2 comme tant le principal facteur soluble scrt par les EPCs en culture et responsable de leurs effets inhibiteurs sur lactivation, ladhsion et lagrgation plaquettaire in vitro. De surcrot, nous avons lucid le mécanisme daction des EPCs sur lagrgation plaquettaire et la formation du thrombus, in vivo, et nous avons soulign le rle de la P-slectine plaquettaire dans ce processus. Ces rsultats ajoutent de nouvelles connaissances sur la biologie des EPCs et dfinissent leur rle potentiel dans la rgulation de la fonction plaquettaire et la thrombogense.
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Nous avons tudi les relations anatomiques entre les systmes de neurotransmission substance P (SP) et srotonine (5-hydroxytryptamine, 5-HT) dans le noyau du raph dorsal (NRD) du rongeur, afin de mieux comprendre les interactions entre ces systmes durant la rgulation de lhumeur. Le NRD reoit une innervation SP provenant de lhabenula, et le blocage pharmacologique des rcepteurs neurokinine-1 (rNK1) de la SP aurait des effets antidpresseurs. Chez le rongeur, le traitement par les antagonistes des rNK1 saccompagne dune dsensibilisation des autorcepteurs 5-HT1A de la 5-HT et dune hausse de lactivit des neurones 5-HT dans le NRD, suggrant des interactions locales entre ces deux systmes. Dans un premier temps, nous avons dmontr par doubles marquages immunocytochimiques en microscopies optique, confocale et lectronique, la prsence du rNK1 dans une sous-population de neurones 5-HT du NRD caudal. Lors de lanalyse en microscopie lectronique, nous avons pu constater que les rNK1 taient principalement cytoplasmiques dans les neurones 5-HT et membranaires sur les neurones non 5-HT du noyau. Grce dautres doubles marquages, nous avons aussi pu identifier les neurones non-5-HT porteurs de rNK1 comme tant GABAergiques. Nous avons ensuite combin limmunomarquage de la SP avec celui du rNK1, dans le but dexaminer les relations entre les terminaisons (varicosits *) axonales SP et les neurones 5-HT (pourvus de rNK1 cytoplasmiques du NRD caudal. En simple marquage de la SP, nous avons pu estimer 41% la frquence avec laquelle les terminaisons SP font synapse. Dans le matriel doublement marqu pour la SP et son rcepteur, les terminaisons SP ont t frquemment retrouves en contact direct ou proximit des dendrites munies de rNK1 cytoplasmiques, mais toujours loignes des dendrites rNK1 membranaires. Pour tester lhypothse dune internalisation soutenue des rNK1 par la SP dans les neurones 5-HT, nous avons ensuite examin la localisation subcellulaire du rcepteur chez le rat trait avec un antagoniste du rNK1, le RP67580. La densit du marquage des rNK1 a t mesure dans le cytoplasme et sur la membrane des deux types de dendrites (5-HT: rNK1 cytoplasmiques; non 5-HT: rNK1 membranaires). Une heure aprs une injection unique de lantagoniste, la distribution du rNK1 est apparue inchange dans les deux types de neurones (5-HT et non 5-HT). Par contre, aprs un traitement quotidien de 7 ou 21 jours avec lantagoniste, nous avons mesur une augmentation significative des densits cytoplasmique et membranaire du rNK1 dans les neurones 5-HT, sans aucun changement dans les neurones non 5-HT. Ces traitements ont aussi augment lexpression du gne rNK1 dans le NRD. Enfin, nous avons mesur une hausse de la densit membranaire du rNK1 dans les neurones 5-HT, sans hausse de densit cytoplasmique, par suite dune lsion bilatrale de lhabenula. Ces rsultats confortent lhypothse dune activation et dune internalisation soutenues des rNK1 par la SP dans les neurones 5-HT du NRD caudal. Ils suggrent aussi que le trafic des rNK1 dans les neurones 5-HT du NRD reprsente un mécanisme cellulaire en contrle de lactivation du systme 5-HT par les affrences SP en provenance de lhabenula.
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Cette tude vise estimer lapport en glutamine (Gln) alimentaire chez des athltes soumis un protocole de supplmentation en glutamine ainsi qu clarifier les informations diffuses au grand public en ce qui concerne les sources alimentaires de glutamine. Des tudes cliniques ont dmontr que la supplmentation en glutamine pouvait rduire la morbidit et la mortalit chez des sujets en phase critique (grands bruls, chirurgie). Le mécanisme en cause semble impliquer le systme immunitaire. Cependant, les tudes chez les sportifs, dont le systme immunitaire a de fortes chances dtre affaibli lors de priodes dentranement prolonges impliquant des efforts longs et intenses, nont pas t concluantes. Or, ces tudes ngligent systmatiquement lapport alimentaire en glutamine, si bien quil est probable que les rsultats contradictoires observs puissent en partie tre expliqus par les choix alimentaires des sujets. Puisque la mthode conventionnelle de dosage des acides amins dans les protines alimentaires transforme la glutamine en glutamate, les tables de composition des aliments prsentent la glutamine et le glutamate ensemble sous la dnomination glutamate ou Glu , ce qui a comme consquence de crer de lambigut. La dnomination Glx devrait tre utilise. Partant de la probabilit quun apport en Glx lev soit un bon indicateur de lapport en glutamine, nous avons cr un calculateur de Glx et avons valu lalimentation de 12 athltes faisant partie dune tude de supplmentation en glutamine. Nous avons alors constat que lapport en Glx tait directement proportionnel lapport en protines, avec 20,64 % 1,13 % de lapport protique sous forme de Glx. Grce quelques donnes sur la squence primaire des acides amins, nous avons pu constater que le rapport Gln/Glx pouvait tre trs variable dun type de protine lautre. Alors que le ratio molaire Gln/Glx est de ~95 % pour les et -gliadines, il nest que de ~43 % pour la casine, de ~36 % pour la -lactoglobuline, de ~31 % pour lovalbumine et de ~28 % pour lactine. Il est donc possible que certaines protines puissent prsenter des avantages par rapport dautres, quantit gale de Glx.
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La sclrose systmique (ScS) est une maladie auto-immune dont lun des principaux auto-anticorps, dirig contre la protine centromrique B (CENP-B), est fortement associ lhypertension artrielle pulmonaire, lune des causes majeures de dcs d la ScS. Lhypertension rsulte de locclusion progressive des vaisseaux suite une hyperactivation des cellules musculaires lisses (CML) de la paroi vasculaire. Cependant, les facteurs responsables de ce remodelage vasculaire restent inconnus. Plusieurs tudes rcentes ont dmontr que certains auto-antignes possdent des fonctions biologiques additionnelles lorsqu'ils se retrouvent dans le milieu extracellulaire. En effet, une fois librs par ncrose ou apoptose, ces auto-antignes adoptent une activit biologique qui s'apparente celles des cytokines et peuvent ainsi participer aux processus normaux de rparation de blessure et/ou acqurir une activit pathogne qui contribue au dveloppement de certaines maladies auto-immunes. Nos rsultats suggrent que la CENP-B peut tre ajoute cette liste de molcules bifonctionnelles. l'aide des techniques d'immunofluorescence, d'ELISA cellulaire et de cytomtrie en flux, nous avons dmontr que la CENP-B se liait spcifiquement la surface des CML vasculaire de lartre pulmonaire avec une plus grande affinit pour le phnotype contractile que synthtique. Cette liaison provoquait la migration des cellules ainsi que la scrtion de cytokines pro-inflammatoires telles que linterleukine 6 et 8. Les mécanismes par lesquels la protine exerait ces effets impliquaient la phosphorylation de FAK et Src ainsi que la voie des MAP kinases, avec ERK1/2 et p38. Des tudes de signalisation intracellulaire effectues laide de plusieurs inhibiteurs spcifiques ainsi que des tudes de dsensibilisation nous ont permis didentifier le rcepteur de la CENP-B en plus didentifier les mécanismes complets de sa signalisation membranaire. Nous avons dmontr que la CENP-B se liait de manire spcifique aux CML vasculaire via le rcepteur de chmokine 3 (CCR3) pour ensuite transactiver le rcepteur EGF, selon un mécanisme mtalloprotase-dpendant qui implique le relargage du HB-EGF. Cette transactivation est un processus important dans lactivation de la voie des MAP kinases ainsi que dans la scrtion dIL-8 induite par la CENP-B. Finalement, nous avons dmontr que les auto-anticorps anti-CENP-B pouvaient abolir cette cascade de signalisation, empchant ainsi la CENP-B dexercer son rle de cytokine. Lidentification de la CENP-B comme ligand du CCR3 ouvre donc plusieurs perspectives quant ltude du rle pathogne des auto-anticorps anti-CENP-B dans la ScS.
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La stabilit gnomique, qui est essentielle la vie, est possible grce la rplication et la rparation de lADN. Une des enzymes responsables de la rplication et de la rparation de lADN est la ribonucleotide reductase (RNR), qui est retrouve chez la levure et chez lhumain. Cette enzyme catalyse la formation de doxyribonuclotides et maintien le pool de dNTP requis pour la rparation et la rplication de lADN. Lenzyme RNR est un ttramre 22 constitu dune grande (R1, 2) et dune petite (R2, 2) sous-unit. Chez S. cerevisiae, les gnes RNR1 et RNR3 encodent la sous-unit 2 (R1). Lactivit catalytique de RNR dpend dune interaction avec le fer et de la formation dun complexe entre R1 et R2. Lexpression de toutes les sous-units est inductible par les dommages causs lADN. Dans cette tude, nous dmontrons que des cellules qui nexpriment pas une des sous-units, Rnr4, du complexe RNR sont sensibles divers agents endommageant lADN, tels que le mthyl mthane sulfonate, la blomycine, le proxyde dhydrogne et les rayons ultraviolets (UVC 254 nm). Au contraire, le mutant est rsistant au 4-nitroquinoline-1- oxide (4-NQO), un compos qui engendre des lsions encombrantes. Par consquent, le mutant rnr4 dmontre une rduction marque en mutations induites par le 4-NQO comparativement la souche parentale. Nous voulions identifier la voie de rparation de lADN qui confrait cette rsistance au 4-NQO ainsi que les protines impliques. Les voies BER, NER et MMR nont pas aboli la rsistance au 4-NQO de la souche rnr4. La protine recombinante Rad51 ne joue pas un rle critique dans la rparation de lADN et dans la rsistance au 4-NQO. La dltion du gne REV3, qui encode une polymrase de contournement, implique dans la rparation post-rplication, a partiellement aboli la rsistance au 4-NQO dans rnr4. Ces rsultats suggrent que la polymrase Rev3 et possiblement dautres polymrases translsion (Rev1, Rev7, Rad30) pourraient tre impliques dans la rparation de lsions encombrantes dans lADN dans des conditions de carence en dNTP. La rparation de lADN, un mécanisme complexe chez la levure, implique une vaste gamme de protines, dont certaines encore inconnues. Nos rsultats indiquent quil y aurait plus quune protine implique dans la rsistance au 4-NQO. Des investigations plus approfondies seront ncessaires afin de comprendre la recombinaison et la rparation post-rplication.
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Le rcepteur DcR3 (Decoy receptor 3) est un membre de la famille des rcepteurs aux facteurs de ncrose tumorale (TNF). Il est fortement exprim dans les tissus humains normaux ainsi que les tumeurs malignes. DcR3 est un rcepteur pour trois ligands de la famille du TNF tels que FasL, LIGHT et TL1A. tant une protine soluble donc dpourvue de la portion transmembranaire et intracytoplasmique, le rcepteur DcR3 est incapable deffectuer une transduction de signal intracellulaire la suite de son interaction avec ses ligands. De ce fait, DcR3 joue un rle de comptiteur pour ces derniers, afin dinhiber la signalisation via leurs rcepteurs fonctionnels tels que Fas, HVEM/LTbetaR et DR3. Lors de nos prcdentes tudes, nous avons pu dmontrer, que DcR3 pouvaist moduler la fonction des cellules immunitaires, et aussi protger la viabilit des lots de Langerhans. la suite de ces rsultats, nous avons gnr des souris DcR3 transgniques (Tg) en utilisant le promoteur du gne -actine humaine afin dtudier plus amplement la fonction de ce rcepteur. Les souris Tg DcR3 ont finalement dvelopp le syndrome lupus-like (SLE) seulement aprs lge de 6 mois. Ces souris prsentent une varit d'auto-anticorps comprenant des anticorps anti-noyaux et anti-ADN. Elles ont galement manifest des lsions rnales, cutanes, hpatiques et hmatopotiques. Contrairement aux modles de lupus murin lpr et gld, les souris DcR3 sont plus proche du SLE humain en terme de rponse immunitaire de type Th2 et de production d'anticorps d'anti-Sm. En pus, nous avons constat que les cellules hmatopotiques produisant DcR3 sont suffisantes pour causer ces pathologies. DcR3 peut agir en perturbant lhomostasie des cellules T pour interfrer avec la tolrance priphrique, et ainsi induire l'autoimmunit. Chez l'humain, nous avons dtect dans le srum de patients SLE des niveaux levs de la protine DcR3. Chez certains patients, comme chez la souris, ces niveaux sont lis directement aux titres levs dIgE. Par consquent, DcR3 peut reprsenter un facteur pathognique important du SLE humain. Ltude des souris Tg DcR3, nous a permis aussi dlucider le mécanisme de protection des lots de Langerhans. Le blocage de la signalisation des ligands LIGHT et TL1A par DcR3 est impliqu dans une telle protection. D'ailleurs, nous avons identifi par ARN microarray quelques molcules en aval de cette interaction, qui peuvent jouer un rle dans le mécanisme daction. Nous avons par la suite confirm que Adcyap1 et Bank1 joue un rle critique dans la protection des lots de Langerhans mdie par DcR3. Notre tude a ainsi lucid le lien qui existe entre la signalisation apoptotique mdie par Fas/FasL et la pathognse du SLE humain. Donc, malgr labsence de mutations gntiques sur Fas et FasL dans le cas de cette pathologie, DcR3 est capable de beoquer cette signalisation et provoquer le SLE chez lhumain. Ainsi, DcR3 peut simultanment interfrer avec la signalisation des ligands LIGHT et TL1A et causer un phnotype plus complexe que les phnotypes rsultant de la mutation de Fas ou de FasL chez certains patients. DcR3 peut galement tre utilis comme paramtre diagnostique potentiel pour le SLE. Les dcouvertes du mécanisme de protection des lots de Langerhans par DcR3 ouvrent la porte vers de nouveaux horizons afin d'explorer de nouvelles cibles thrapeutiques pour protger la greffe d'lots.
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La drgulation de l'expression gntique est une base pathophysiologique de plusieurs maladies. On a utilis le locus du gne -globine humain comme modle pour lucider le mécanisme de rgulation de la transcription gntique et valuer son expression gntique durant l'rythropose. La famille des protines 'E' est compose de facteurs de transcription qui possdent plusieurs sites de liaison au sein de locus du gne -globine, suggrant leur rle potentiel dans la rgulation de lexpression de ces gnes. Nous avons montr que les facteurs HEB, E2A et ETO2 interagissent dune manire significative avec la rgion contrle du Locus (LCR) et avec les promoteurs des gnes de la famille -globine. Le recrutement de ces facteurs au locus est modifi lors de l'rythropose dans les cellules souches hematopoitiques et les cellules erythroides de souris transgniques pour le locus de la -globine humain, ainsi que dans les cellules prognitrices hmatopotiques humaines. De plus par cette tude, nous dmontrons pour la premire fois que le gne -globine humain est dans une chromatine active et quil interagit avec des facteurs de transcriptions de type suppresseurs dans les cellules prognitrices lymphodes (voie de diffrentiation alternative). Cette tude a aussi t faite dans des souris ayant une gntique mutante caractrise par l'absence des facteurs de transcription E2A ou HEB.
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Les voies de signalisation des MAP kinases (MAPK) conventionnelles jouent des rles essentiels pendant le dveloppement des lymphocytes T (LT) ainsi que lors de leur activation suite la reconnaissance antignique. En raison de ses diffrences structurelles ainsi que de son mode de rgulation, ERK3 fait partie des MAPK dites non-conventionnelles. Encore aujourdhui, les vnements menant lactivation de ERK3, ses substrats ou partenaires ainsi que sa fonction physiologique demeurent peu caractriss. Nous avons entrepris dans cette thse dtudier le rle de ERK3 lors du dveloppement et de lactivation des LT en utilisant un modle de souris dficient pour lexpression de ERK3. Nous avons premirement tabli que ERK3 est exprime chez les thymocytes. Ensuite, nous avons valu le dveloppement thymique chez la souris ERK3-dficiente et nous avons observ une diminution significative de la cellularit aux tapes DN1, DP et SP CD4+ du dveloppement des LT. La cration de chimres hmatopotiques ERK3-dficientes nous a permis de dmontrer que la diminution du nombre de cellules observe aux tapes DN1 et DP est autonome aux thymocytes alors que le phnotype observ ltape SP CD4+ est dpendant de labolition simultane de ERK3 dans lpithlium thymique et dans les thymocytes. Une tude plus approfondie de ltape DP nous a permis de dmontrer quen absence de ERK3, les cellules DP meurent plus abondamment et accumulent des cassures doubles brins (DSB) dans leur ADN. De plus, nous avons dmontr que ces cassures dans lADN sont ralises par les enzymes RAG et quen absence de ces dernires, la cellularit thymique est presque rtablie chez la souris ERK3-dficiente. Ces rsultats suggrent que ERK3 est implique dans un mécanisme essentiel la rgulation des DSB pendant le rarrangement V(D)J de la chane du rcepteur des cellules T (RCT). Dans le deuxime article prsent dans cette thse, nous avons montr que ERK3 est exprim chez les LT priphriques, mais seulement suite leur activation via le RCT. Une fois activs in vitro les LT ERK3-dficients prsentent une diminution marque de leur prolifration et dans la production de cytokines. De plus, les LT ERK3-dficients survivent de faon quivalente aux LT normaux, mais tonnamment, ils expriment des niveaux plus faibles de la molcule anti-apoptotique Bcl-2. Ces rsultats suggrent que la prolifration rduite des LT ERK3-dficients est la consquence dune altration majeure de leur activation. Ainsi, nos rsultats tablissent que ERK3 est une MAPK qui joue des rles essentiels et uniques dans le dveloppement thymique et dans lactivation des lymphocytes T priphriques. Grce ces travaux, nous attribuons pour la toute premire fois une fonction in vivo pour ERK3 au cours de deux diffrentes tapes de la vie dun LT.
Resumo:
La polykystose rnale autosomique dominante (PKRAD) est la maladie gntique rnale la plus commune touchant 1/500 personnes. Elle se caractrise principalement par la formation de kystes rnaux dans tous les segments du nphron, entranant linsuffisance rnale, et par des manifestations extrarnales kystiques (foie, pancras, rate) et non-kystiques (anomalies cardiaques, vasculaires et crbrales). Deux gnes, PKD1 et PKD2, sont responsables de 85 et 15% des cas respectivement. Ces gnes encodent les polycystine-1 (PC-1) et -2 (PC-2) qui forment un complexe la membrane plasmique et ciliaire des cellules pithliales rnales. PC-1 est une protine transmembranaire de 4302 acides amins possdant un court domaine intracellulaire incluant un motif coiled-coil impliqu dans linteraction entre PC-1 et PC-2 in-vitro. Limportance du coiled-coil est dmontre par des mutations affectant spcifiquement ce motif chez des patients PKRAD. Le mécanisme pathogntique responsable de la PKRAD est indtermin. Chez la souris, la PKRAD se dveloppe suite lablation (Pkd1-/-) ou lors de la surexpression (SBPkd1TAG) de Pkd1, ce qui suggre un effet de dosage. Des anomalies ciliaires sont aussi souvent associes PKRAD. Mon objectif tait de dterminer in-vivo le mécanisme pathogntique de la polycystine-1 dans le dveloppement des symptmes PKRAD rnaux et extrarnaux et plus spcifiquement, le rle du motif coiled-coil dans le mécanisme de kystogense. Pour ce faire, nous avons gnr deux constructions, Pkd1 sauvage (Pkd1TAG) et Pkd1 tronque de son motif coiled-coil (Pkd1Coiled-coil), par recombinaison homologue partir du BAC-Pkd1 sauvage comprenant la squence murine entire de Pkd1. Trois lignes de souris Pkd1TAG gnres par microinjection dmontrent un niveau dexpression de Pkd1 qui corrle avec le nombre de copie du transgne (2, 5 et 15 copies). Les souris Pkd1TAG reproduisent la PKRAD en dveloppant des kystes rnaux dans toutes les parties du nphron et des cils primaires plus longs que les contrles non transgniques. Les analyses physiologiques supportent que les souris Pkd1TAG dveloppent une insuffisance rnale et dmontrent une augmentation du volume urinaire de mme quune diminution de losmolalit, de la cratinine et des protines urinaires. De plus, les souris Pkd1TAG dveloppent des kystes hpatiques, des anomalies cardiaques associes des dpts de calcium et des anvrismes crbraux. La svrit du phnotype augmente avec lexpression de Pkd1 appuyant lhypothse dun mécanisme de dosage. Nous avons aussi dtermin que lexpression du transgne Pkd1TAG complmente le phnotype ltal-embryonnaire des souris Pkd1-/-. Dautre part, nous avons gnrs 4 lignes de souris Pkd1Coiled-coil (2 et 15 copies du transgne) dont le nombre de copies corrle avec le niveau dexpression du transgne. Ces souris Pkd1Coiled-coil, contrairement aux Pkd1TAG de mme ge, ne dveloppent pas de kystes et possdent des cils primaires de longueur normale. Afin dvaluer le rle du motif coiled-coil en absence de polycystine-1 endogne, nous avons crois les souris Pkd1Coiled-coil avec les souris Pkd1-/-. Contrairement aux souris Pkd1-/- qui meurent in-utro, les souris Pkd1Coiled-coil; Pkd1-/- survivent ~10 14 jours aprs la naissance. Elles dmontrent des kystes rnaux et pancratiques svres, un retard de croissance et des anomalies pulmonaires. Tous les segments du nphron sont affects. Mon projet dmontre que la surexpression de Pkd1 est un mécanisme pathognique de la PKRAD tant au niveau rnal quextrarnal. De plus, il dmontre que le motif coiled-coil est un lment dterminant dans la kystogense/PKRAD in-vivo.
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La maladie du greffon contre lhte (GvHD) est une complication majeure des greffes de cellules souches hmatopotiques (HSCT) qui survient dans 30 70% des cas et peut causer la mort, malgr un traitement prophylactique bien conduit. Il existe donc une relle demande clinique pour amliorer ces traitements prophylactiques. Parce que ces traitements prophylactiques reposent en gnral sur des agents immunosuppresseurs, ceux-ci contribuent diminuer la reconstitution immunitaire du patient, ce qui a un impact dfavorable sur les infections et les taux de rechute dhmopathie maligne, et donc limite leur utilisation. Les immunoglobulines (IVIG) pourraient reprsenter une alternative intressante puisquelles ont des proprits immunomodulatrices et quelles sont de plus couramment utilises en clinique pour traiter des patients ayant un dficit immunitaire. Leur capacit rduire lapparition et la svrit de la GvHD, sans toutefois inhiber ou nuire la reconstitution immunitaire chez le patient na nanmoins jamais t clairement dmontre. Les objectifs de ce projet sont donc dvaluer lefficacit des IVIG rduire lincidence et la svrit de la GvHD dans un modle murin humanis de GvHD, ainsi que de dterminer le mécanisme daction des IVIG. Ce modle consiste injecter des huPBMCs des souris immunodprimes ne pouvant les rejeter. Les rsultats obtenus suggrent que les IVIG possdent un effet immunomodulateur permettant de rduire les signes cliniques et de retarder lapparition de la GvHD, tout en permettant lapparition de cellules NK. Les IVIG agiraient de faon indirecte sur les huPBMCs afin dinduire lapparition des cellules NK.
