Expressão e purificação da proteína E3 do vírus chikungunya (CHIKV)

RESUMO: O vírus chikungunya (CHIKV) é um vírus de RNA, com invólucro, da família Togaviridae, transmitido por mosquitos Aedes spp. Distribuído por largas regiões de África e Ásia, causa grandes epidemias de artrite grave. A semelhança de sintomas com outras doenças como a dengue e a malária e a persistência de IgM específicas, dificultam o diagnóstico da infeção por CHIKV. A deteção no sangue de E3, uma glicoproteína viral secretada, a incluir num ensaio imunoenzimático poderá melhorar o diagnóstico nos países onde as técnicas de biologia molecular são de difícil acesso. Para testar a utilidade de E3 num ensaio de diagnóstico, esta deverá ser expressa em quantidade, purificada e usada para produção de anticorpos específicos. Para expressar E3 numa forma solúvel, suscetível de ser purificada num único passo cromatográfico sem proteases, recorreu-se à estratégia da fusão com o domínio de ligação à quitina (CBD)-inteína (IMPACT™ System, NEB). A sequência codificadora de E3 foi amplificada a partir de RNA viral, clonada em pTYB21 e expressa em E. coli como uma proteína de fusão insolúvel de 64 kDa. A expressão a 12ºC induzida por IPTG 0,1 mM aumentou a solubilidade de CBD-inteína-E3. A aplicação de lisados celulares em colunas de quitina originou a retenção de CBD-inteína-E3 na matriz. Porém, a autoclivagem da inteína na coluna, induzida com reagentes tiol, foi pouco eficiente e mesmo a proteína E3 separada não eluiu da coluna. E3 foi ainda expressa em E. coli com uma cauda de seis histidinas (E3[His]6) por clonagem no vetor pET28b(+). Lisados celulares aplicados em colunas de níquel permitiram a eluição de uma proteína de 9 kDa, compatível com a massa molecular estimada para E3[His]6, ainda que com outros contaminantes proteicos. A identidade da proteína de 9 kDa será confirmada pela indução de anticorpos com esta preparação e reatividade daqueles com células infetadas com CHIKV.----------------ABSTRACT: Chikungunya virus (CHIKV) is an enveloped, positive strand RNA virus belonging to the family Togaviridae. Transmitted by Aedes spp mosquitoes, CHIKV causes large epidemics of severe arthritogenic disease in Africa and Asia and represents a serious threat in countries where vectors are present. Symptoms similarity with other diseases, e.g. dengue and malaria, along with CHIKV IgM persistence turns accurate CHIKV diagnosis a difficult task in low-income countries. Detection of E3, a small secreted viral glycoprotein, to be included in an immunoenzymatic test was envisaged as a possible improvement in CHIKV diagnosis. To test the diagnostic value of E3, recombinant E3 should be expressed and purified to generate antibodies. In order to express CHIKV E3 in a soluble form amenable to purification by a single step affinity chromatography, the chitin binding domain (CBD)-intein fusion strategy without proteases (IMPACT™ System, NEB) was employed. The E3 coding sequence was amplified from viral RNA, cloned in pTYB21 and expressed in E. coli ER2566 as an insoluble 64 kDa CBD-intein-E3 fusion protein. Solubility was partially achieved by lowering the expression temperature to 12ºC and the inducer (IPTG) concentration to 0.1 mM. Clarified cell lysate loaded onto a chitin column allowed ligation of the fusion protein but the intein-mediated cleavage efficiency was low and E3 failed to elute from the column as demonstrated by SDS-PAGE. E3 was further expressed with a six histidine tag, E3[His]6, employing the pET System (Novagen). E3[His]6 was expressed in E. coli Rosetta (30ºC, 0.4 mM IPTG) as a 9 kDa protein. Soluble cell extracts in 20-40 mM imidazole, applied onto a nickel column and eluted with 500 mM imidazole yielded a protein preparation enriched in the 9kDa protein. The 9 kDa will be used as antigen to generate antibodies that upon reaction with CHIKV infected cells will confirm its identity.

Caracterização da qualidade da energia entregue à rede por centrais de energia dos oceanos

Dissertação para obtenção do Grau de Mestre em Engenharia Electrotécnica e de Computadores

Métrica vertebral: avaliação da omoplata

Dissertação para obtenção do Grau de Mestre em Engenharia Biomédica

Risco de frio no período reprodutivo do arroz irrigado no Rio Grande do Sul.

2009

Mapeamento da redução do risco de frio em arroz irrigado no Rio Grande do Sul e sua relação com o aquecimento global.

2011

Espondilodiscite brucelósica: relato de caso

A localização vertebral da brucelose apresenta ocorrência pouco freqüente atualmente. Por este motivo é indispensável a atenção para as modificações estruturais no segmento vertebral causadas pela espondilodiscite bacteriana. A partir do caso clínico, em que se relatam aspectos radiográficos, anatomopatológicos e laboratoriais relacionados ao diagnóstico, bem como ao tratamento desta doença, chama-se a atenção para sua importância, e para as graves conseqüências em caso de demora para a definição diagnóstica.

Hidatidose policística: cisto hidático calcificado, simulando neoplasia mesentérica, descoberto acidentalmente

É descrito um caso de hidatidose abdominal, sem comprometimento hepático, em paciente do Estado do Acre. O cisto, já em degeneração e parcialmente calcificado, foi descoberto, por acaso, mediante estudo radiológico da coluna vertebral feito para avaliação de hérnia de disco, detectada algum tempo antes. Embora as imagens sugerissem uma neoplasia do mesentério, o achado de acúleos rostelares no conteúdo pastoso da hidátide, removida cirurgicamente, permitiu reconhecer-se a natureza parasitária da lesão.

Conceitos de viscoelasticidade na modelação da fluência em estruturas mistas aço-betão

Dissertação para obtenção do Grau de Mestre em Engenharia Civil - Perfil Estruturas

Determinação de anti-estreptolisina "O" e proteína C reativa entre escolares do município de Laranjal, PR

Para a determinação de anti-estreptolisina "O" e proteína C reativa, no município de Laranjal-PR, foram analisados soros de 411 escolares, entre 5 a 16 anos. Para anti-estreptolisina "O", 13,6% tiveram títulos elevados e 5,1% foram reativos para proteína C reativa. Não foram observadas diferenças em relação ao sexo e faixa etária.

Encurvadura de colunas mistas aço-betão segundo o Eurocódigo 4

A construção mista aço-betão é uma área da Engenharia Civil em constante actualização, oferecendo diversas vantagens face à construção em betão armado e metálica. Existem vários regulamentos que tratam este tema, destacando-se o Eurocódigo 4. No presente trabalho aborda-se a verificação à encurvadura de colunas mistas segundo esta norma, incluindo o método simplificado e o geral. São desenvolvidos dois programas de cálculo para a avaliação da resistência de secções mistas duplamente simétricas à flexão composta desviada. O primeiro considera que o comportamento dos materiais é rígido-plástico e o segundo elasto-plástico não-linear. Os programas são validados por comparação com resultados encontrados na bibliografia. Estes programas constituem uma ferramenta útil para Projectistas na avaliação da resistência deste tipo de secções. Estuda-se a modelação numérica de colunas mistas, pelo método dos elementos finitos, recorrendo aos programas Adina e Ansys. Para além de exemplos de validação, apresenta-se um estudo original de uma coluna parcialmente betonada, o qual permite extrair conclusões e recomendações relativamente à aplicação das disposições regulamentares do Eurocódigo 4.

Simulação da secção de recuperação de solvente do processo de produção do PEAD

A presente dissertação foi realizada no âmbito de um estágio curricular no complexo petroquímico da Repsol Polímeros em Sines e teve como objectivo implementar uma simulação da secção de recuperação de solvente da unidade de produção de PEAD. A simulação foi realizada através do software Aspen Hysys (v. 7.3) e posteriormente validada, onde se verificou uma boa correspondência entre o comportamento simulado e o do processo industrial. Após validação, com o intuito de analisar a resposta do sistema a alterações processuais, foram elaborados dois casos de estudo: Alteração do comonómero para 1-hexeno e substituição do n-hexano para n-pentano como solvente. No primeiro caso de estudo foram encontrados problemas na purificação do solvente. A separação da mistura n-hexano/1-hexeno foi estudada por destilação convencional e extractiva (com adição de n-metil-2-pirrolidona). Por destilação convencional não foi possível separar completamente os dois compostos, mas foi conseguida a condição mínima requerida pelas limitações do processo, de um caudal de 10 ton/h de hexano na corrente de topo, juntamente com os 700 kg/h de comonómero, com uma coluna a operar a 110 kPa, com 130 pratos e cuja alimentação entrava no 5º andar. A destilação extractiva revelou-se o método mais eficaz, conseguindo-se separar completamente as duas espécies através de uma coluna de destilação com 10 pratos a 110 kPa com a alimentação e solvente a entrar respectivamente no 4º e 5º andar. Para remoção do agente extractivo, cada uma das correntes sofre outra destilação. No segundo caso de estudo verificou-se que a secção simulada com pentano apresenta temperaturas de operação inferiores, o que por um lado vai diminuir o consumo de vapor de média e de alta pressão, mas por outro aumenta a 47992% a utilização de brine. Desta forma, atendendo ao custo elevado desta utilidade, a substituição não apresenta clara vantagem energética ao processo.

Medições experimentais de ar exalado em ambiente hospitalar no serviço de Nefrologia

As análises ao ar exalado assumem cada vez uma maior importância como meio de diagnóstico não invasivo. O ar exalado encerra informações acerca do estado metabólico de cada pessoa, em particular, acerca das doenças, nutrição e medicação. Cada vez são em maior número os compostos encontrados na respiração humana com ligação a estados fisiológicos. A matriz respiratória, de caráter mais simples que a matriz sanguínea e urinária, é composta por gases inorgânicos, substâncias não voláteis e compostos orgânicos voláteis (VOCs). As concentrações individuais de cada VOC são na gama das partes por milhão (ppm) a partes por trilião (ppt), pelo que a sua deteção exige a utilização de uma técnica analítica com elevada sensibilidade. Este trabalho experimental teve como objetivo principal analisar os compostos orgânicos voláteis em doentes renais. Neste sentido, analisou-se o ar exalado de doentes em hemodiálise, antes e após o tratamento. Realizaram-se, também, análises ao ar exalado de doentes em estádios intermédios da doença renal crónica (DRC3 e DRC4), a fim de verificar a existência de um padrão evolutivo através da análise ao ar exalado. Para tal utilizou-se o BreathSpec®, uma técnica analítica não invasiva e de elevada sensibilidade, cujo princípio físico de funcionamento é a espetrometria de mobilidade iónica acoplada a uma coluna multicapilar (MCC-IMS). Este trabalho foi realizado em colaboração com a Faculdade de Ciências e Tecnologia da Universidade Nova de Lisboa (FCT/UNL), NMT,S.A. e o serviço de Nefrologia do Hospital Garcia de Orta. Futuramente, pretende-se que esta técnica seja utilizada como meio de diagnóstico precoce da doença renal, bem como, nos casos de pacientes em estádio final da doença, avaliar a eficácia da hemodiálise.

Divulgar ciência para diferentes públicos. Uma experiência no projeto STOL - Science Through Our Lives

O estágio que aqui se relata enquadra-se no âmbito do mestrado em Comunicação de Ciência, da Faculdade de Ciências Sociais Humanas (FCSH) da Universidade Nova de Lisboa (UNL) e do Instituto de Tecnologia Química e Biológica (ITQB). Foi realizado no projeto STOL – Science Through Our Lives, do Centro de Biologia Molecular e Ambiental (CBMA) da Escola de Ciências da Universidade do Minho (ECUM), e teve a duração de três meses. Esta componente prática do mestrado permitiu desenvolver um trabalho in loco, com o objetivo de servir, sobretudo, a comunicação de ciência informal. As principais atividades desenvolvidas foram exposições (Homo numericus; “Ponto a Ponto Enche a Ciência o Espaço), produção de materiais educativos (Objetos Educativos para a Casa das Ciências), campanhas de sensibilização (Comemoração do Dia Mundial da Água), auscultação do público (Vox Pop), crónicas de jornal (coluna “Aqui há Ciência”) e estabelecimento de parcerias estratégicas entre o STOL e outras forças vivas da região (AVianense e “Diário do Minho”). Ao integrar as atividades a decorrer no projeto STOL, foi possível contribuir com sugestões e novos materiais, e implementar projetos cujo principal objetivo foi o contacto direto com o público. De todo o trabalho se obteve um feedback positivo, conforme se documenta neste relatório e respetivos anexos. Se alguns constrangimentos podem ser enunciados (falta de recursos económicos e humanos, fraca tradição de envolvimento da população com a ciência e vice-versa, e a considerável falta de apoio institucional a atividades de divulgação de ciência), também devem ser evidenciados aspetos muito positivos como a dinâmica do grupo STOL, a capacidade de envolver diferentes públicos nas suas atividades, diferenciar estratégias para esses grupos, e finalmente, avaliar, sempre que possível, o seu desempenho, incluindo os resultados nas atividades seguintes. Neste contexto foram aplicados os conhecimentos adquiridos durante o primeiro ano curricular do mestrado, permitindo o ganho de experiência na área de trabalho onde a autora se sente realizada e pretende permanecer.

Extração de DNA a partir de sangue humano coagulado para aplicação nas técnicas de genotipagem de antígenos leucocitários humanos e de receptores semelhantes à imunoglobulina

O objetivo deste estudo foi padronizar uma metodologia de extração de DNA de alta qualidade a partir de amostras de sangue coagulado. Quarenta e oito amostras de sangue humano coagulado foram utilizadas para a extração de DNA pelo kit comercial EZ-DNA® (Biological Industries, Beit Haemek, Israel), pelo kit de coluna Neoscience® (One Lambda Inc., San Diego, CA) e pelo método modificado de salting out. Apenas o método de salting out foi capaz de extrair altas concentrações de DNA (média, 180ng/µL), as quais foram medidas pelo detector de fluorescência Qubit® (Invitrogen, USA). Este método permitiu a amplificação dos genes HLA (human leukocyte antigens) pela tecnologia PCR-SSO (polymerase chain reaction - specific sequence of oligonucleotides) Luminex, a qual exige DNA de boa qualidade, e de genes KIR (killer cell immunoglobulin-like receptors) pela técnica made in house PCR-SSP (polymerase chain reaction-sequence specific of primers), a qual demanda uma concentração específica de DNA (10ng/µL). Concluímos que a técnica de salting out modificada foi muito eficiente, simples e rápida para a extração de DNA de amostras de sangue humano coagulado, com o objetivo de realizar a genotipagem de genes HLA e KIR.

Equações de previsão dos movimentos sísmicos à superfície para a região Autónoma dos Açores

Um dos principais problemas e interesses da engenharia sísmica prende‐se com a previsão dos efeitos que eventos sísmicos futuros possam provocar à superfície do terreno de um dado local que permita o desenvolvimento de estratégias de prevenção e mitigação de efeitos assim como de estratégias que visem incrementar a resiliência da região em questão. Esta previsão requer informação relativa quer a movimentos sísmicos ocorridos anteriormente quer ao solo existente no local a fim de se estabelecer uma relação entre as características de eventos e os deslocamentos verificados à superfície. Para a região Autónoma dos Açores ambos os conjuntos de informação disponível revelam‐se em número insuficiente para que daí resulte uma análise adequada. No sentido de contribuir para a resolução do problema apresentado, o presente trabalho recorre num primeiro momento à metodologia estatística para a elaboração de colunas de solo, com caracter sintético, que permitam a colmatação das lacunas existentes na base de dados da região. Num segundo momento recorre‐se ao modelo de propagação unidireccional de ondas de corte através de uma coluna de solo, como forma de avaliar os efeitos que um conjunto de acções sísmicas produzem no topo da coluna fazendo‐se recurso do conjunto de colunas sintéticas, elaborado no presente trabalho, assim como da base de dados de acções sísmicas, de caracter sintético, existente para o afloramento rochoso no arquipélago dos Açores. Da avaliação do modo de propagação de ondas sísmicas resulta um conjunto de espectros que servemde base à elaboração de equações de previsão dos movimentos sísmicos para os diferentes tipos de terreno da região.