Identification of novel factors during the establishment of the Casparian strip in the endodermis

Multicellular organisms rely on specialized tissues that allow for the controlled exchange of matter with their surrounding. In order to function properly, these tissues need to establish a tight connection between the individual cells to prevent uncontrolled passive diffusion across the extracellular space. In animals, these connections are called tight and adherens junctions and are a critical feature of epithelia. These connections, however, rely on direct protein-protein interaction of plasma membrane proteins of adjacent cells. Such a mechanism is not possible in plants due to the cell wall, which encases the individual cells. In order to absorb nutrients, while simultaneously preventing uncontrolled diffusion between cells, land plants have evolved the root endodermis, which is functionally equivalent to animal epithelia. Its cells are surrounded by a precisely localized and aligned, ring-like lignin deposition, called the Casparian strip, and therefore tightly connected between each other. Very little was known about the development of the endodermis and the Casparian strip until recently. In the meantime, however, we have identified a family of endodermis- specific proteins, the CASPs, which recruits extracellular proteins the specific Casparian strip membrane domain (CSD) to locally synthesize lignin in the cell wall. Yet, we hardly knew any specifics on how the CSD is initially defined and how the critically important CASPs are being recruited to it. We therefore conducted a forward genetic screen on the localization of CASPI-GFP in order to identify novel mutants, which lack a defined CSD. We identified 48 mutants, which fell into 15 different complementation groups. While some of the isolated genes had previously been identified through different approaches, nine novel genes, which had never been implicated in CSD development and maintenance, were identified. One of them, LORD OF THE RINGS 2 (.LOTR2) is described to greater detail in this work. LOTR2 encodes for EX070A1, a protein of the evolutionary conserved exocyst complex. This complex has frequently been implicated in various secretory processes across kingdoms. In Arabidopsis, it transiently defines the positioning of CASPI-GFP. We have performed a detailed analysis of the dynamics of EX070A1 and CASPI-GFP, including studies with other markers and propose a mechanism, by which the cytosolic EX070A1 transiently defines a plasma membrane domain to recruit transmembrane proteins, which then recruit extracellular enzymes for localized cell wall modification. Considering the ubiquitous expression of EX070A1, we think that this mechanism is potentially of importance not only for the endodermis and the Casparian strip but also for many other tissues, in which the cell wall becomes locally modified. In fact, many other tissues with secondary cell wall modifications contain proteins very similar to the CASPs. It will be interesting to see to which degree this mechanism is employed in other tissues. As for the endodermis, we have now identified the first gene, which is not specific to the endodermis but shows endodermis-specific dynamics. This might give us a better insight on how the plant modulates this ubiquitously present factor in a cell- or tissue-type specific manner. Considering the knowledge, mutants and tools, which are available to us for investigating the endodermis, the Casparian strip, the exocyst complex and EX070A1 might be just the right experimental system to address these questions. -- Les organismes multicellulaires dépendent des tissues spécialisé pour l'échange contrôlé entre eux et leur environnement. Pour leur bon fonctionnement, les cellules de ces tissus ont besoin d'être très étroitement assemblés afin de prévenir la diffusion non-contrôlée à travers l'espace extracellulaire. Chez les animaux, ces connexions sont appelées jonctions serrées et jonctions adhérentes. Ces jonctions dépendent des interactions directes entre les protéines des cellules voisines. Ceci n'est pas possible chez les plantes à cause de la paroi cellulaire qui recouvre chaque cellule individuellement. Pour absorber les nutriments et en même temps empêcher la diffusion non-contrôlé entre cellules, les plantes ont évolué 1'endoderme dans la racine, qui est fonctionnellement équivalent aux épithéliums des animaux. Les cellules de l'endoderme sont ceinturées par une déposition de lignine très précisément localisées comme un anneau et alignées entre les cellules, et qui, donc, connecte étroitement les cellules avoisinante: Le cadre de Caspary. Peu était connu sur le développement de l'endoderme et le cadre de Caspaiy jusqu'à il y a quelques années. Récemment, pourtant, nous avons identifié une famille de protéines spécifiques à l'endoderme, les CASPs, qui définissent le domaine membranaire du cadre de Caspaiy (CSD). Les CASPs recrutent les protéines extracellulaires nécessaire à la synthèse du cadre de Caspary vers une région limité dans la paroi cellulaire. Pourtant, on connaît très peu les processus spécifiques concernant la définition initiale du CSD et comment les CASPs, qui ont une importance cruciale, sont recrutées vers ce domaine. Par conséquent nous avons mené un crible génétique sur la localisation du CASPI- GFP, qui sert comme marqueur pour le CSD. Notre but étant d'isoler de nouveaux mutants affectés dans l'établissement du CSD. Nous avons identifié 48 mutants, en 15 groupes de complémentation. Bien que certains des gènes isolés étaient déjà impliqué dans la formation du cadre de Caspary, neuf nouveaux gènes n'ayant jamais été impliqués dans le développement ou la maintenance du CSD ont pu être identifiés. Un de ces gènes, LORD OF THE RINGS2 (LOTR2) sera décrit plus en détail dans cette étude. LOTR2 code pour EX070A1, qui est une protéine, du complexe exocyste. Ce complexe de protéines a très bien été conservé au cours de l'évolution. Il était souvent impliqué dans plusieurs processus de sécrétion dans toutes les branches de la vie. Chez Arabidopsis, EX070A1 définit la position du CSD d'une façon transitoire et recrute CASP1- GFP. Nous avons mené une analyse détaillée des dynamiques d'EX070Al et CASPI-GFP ainsi que, des études avec des autres mutants. Nous proposons un mécanisme, d'après lequel EX070A1, recruté du cytosol, définit un domaine dans la membrane plasmique pour localiser des protéines transmembranaires, ces dernières ensuite recruteront des enzymes extracellulaires pour la modification locale de la paroi cellulaire. Vu qu'EX070A1 est exprimé dans toute dans la plante, nous pensons que ce mécanisme est potentiellement important non seulement pour l'endoderme et le cadre de Caspary, mais aussi pour les autres tissus où la paroi cellulaire doit être localement modifiée. En effet, plusieurs autres tissus contiennent des protéines très similaires aux CASPs. Il serait intéressant de voir à quelle dégrée ce mécanisme est également utilisé dans ces tissues. En ce qui concerne l'endoderme, nous avons maintenant identifié le premier gène qui n'est pas exprimé spécifiquement dans l'endoderme, mais qui montre tout de même une dynamique caractéristique dans ce tissu. Il serait intéressant de voir comment la plante peut moduler ce facteur omniprésent d'une façon spécifique. Vu les connaissances, les mutants et les outils qu'on a maintenant à notre disposition, l'endoderme et son cadre de Caspary, le complexe exocyste et EX070A1 sont probablement des bons systèmes expérimentaux pour étudier ces questions. -- Identification des nouveaux facteurs pendant l'établissement du cadre de Caspary dans l'endoderme. Lothar Kalmbach, Département de Biologie Moléculaire Végétale (DBMV), Université de Lausanne. Comme tous les autres organismes multicellulaires, les plantes terrestres dépendent de tissus spécialisés pour l'échange contrôlé avec leur environnement. Ces tissus sont importants pour l'absorption des nutriments mais également pour éviter l'influx de composés toxiques. Chez les plantes, ce tissu se trouve dans la racine. C'est l'endoderme. Grâce au cadre de Caspary, qui permet une forte connexion entre les cellules au niveau de leur paroi, l'endoderme empêche les éléments toxiques d'entrer dans le système vasculaire. Depuis quelques années, nous comprenons de plus en plus la nature et la biosynthèse, ainsi que les protéines impliquées dans l'ancrage des enzymes à la membrane plasmique. Nous n'avons eu, par contre, aucune idée sur le mécanisme qui d'abord définit cet endroit dans la membrane plasmique. Nous avons mené un crible génétique sur la localisation de CASPI-GFP, une protéine, qui recrute les enzymes extracellulaires pour la synthèse du cadre de Caspary. Nous avons identifié plusieurs nouveaux gènes qui sont impliqués dans l'intégrité du cadre de Caspary. L'un de ces gènes est EX070A1, qui est un facteur ayant un rôle important lors de la sécrétion des protéines dans tous les organismes eukaryotes. Ces mutants sont gravement affectés au niveau du cadre de Caspary, mais surtout ils ne sont plus capables de localiser CASPI-GFP. Nous avons suivi la dynamique d'EX070Al et de CASP1-GFP en combinaison avec d'autres marqueurs. Nous avons pu montrer que l'accumulation d'EX070Al est spécifique pour l'endoderme et essentielle pour bien localiser CASPI-GFP et donc, le cadre de Caspary. Ces résultats nous aident à mieux comprendre le développement de l'endoderme mais peuvent potentiellement aussi être utilisés pour étudier les modifications de la paroi cellulaire dans d'autres cellules de la plante.

The role of raptor in cell death

Selon les statistiques, les maladies cancéreuses sont en augmentation dans les pays en développement ainsi que dans les pays industrialisés. Ceci peut s'expliquer largement par les habitudes alimentaires, le tabagisme, les infections, le manque d'activité physique, la pollution et le stress, entre autres. Ainsi, l'Organisation Mondiale de la Santé (OMS) prévoit une augmentation de la fréquence des cancers avec 15 millions de nouveaux cas par an en 2020. La transformation d'une cellule normale en une cellule cancéreuse se déroule en plusieurs étapes avec, au niveau moléculaire, différentes mutations ciblant des protéines régulant la croissance cellulaire. Un des exemples de protéines qui participent au contrôle des voies cellulaires impliquées lors de la prolifération des cellules sont les complexes de protéines mTORCl et mTORC2 (« mammalian target of rapamycin complex 1 and 2 »). Ces complexes mTORCl et mTORC2 activent des processus anaboliques (la synthèse de protéines et de lipides, le métabolisme énergétique, entre autres) et inhibent en même temps des voies de catabolismes cellulaires (autophagie et synthèse de lysosomes). Ils sont souvent mutés dans de nombreux cas de cancers, c'est pourquoi ils sont la cible de nombreux traitements anti-cancéreux. Pour ces raisons, nous nous sommes intéressés aux mécanismes d'actions moléculaires des drogues qui ciblent les complexes mTORCl et mTORC2. Nous avons ainsi découvert qu'une molécule présente uniquement dans le complexe mTORCl, raptor, était clivée en un fragment plus petit lors du traitement de cellules cancéreuses avec des drogues. Des molécules activées durant la mort cellulaire programmée par apoptose, les caspases, se sont révélées responsables du clivage de raptor. Nous avons ensuite décrit de façon précise les sites de clivage de raptor par les caspases durant la mort cellulaire. Il s'est avéré que le clivage de raptor affaiblissait son interaction avec mTOR au sein du complexe mTORCl, ce qui participe à l'inactivation de mTORCl lors de traitements avec des molécules anti-cancéreuses. Ces résultats nous ont permis de mieux comprendre les mécanismes d'actions de différentes drogues anti-cancéreuses au niveau du complexe mTORCl, ce qui peut être utile pour la synthèse de nouvelles molécules ciblant mTORCl ainsi que pour lutter contre les mécanismes de résistance chimiothérapeutiques. -- La protéine « mammalian target of rapamycin » (mTOR) est une sérine/thréonine kinase qui est hautement conservée des protistes à l'être humain. Deux complexes mTOR existent : le complexe 1 mTOR (mTORCl) et le complexe 2 mTOR (mTORC2). Ils régulent positivement des processus anaboliques (synthèse de protéines et de lipides, le métabolisme énergétique, l'organisation du cytosquelette, la survie cellulaire) et négativement des voies cataboliques (autophagic, biogenèse de lysosomes). Les complexes mTORCl et mTORC2 sont sensibles aux signaux mitogéniques tels que les acides aminés, le glucose, les facteurs de croissance, l'état énergétique (ATP) et les niveaux d'oxygène et induisent des voies de croissance cellulaire essentielles. La voie cellulaire regulée par mTORCl peut être hyperactivée dans de nombreux cancers humains. Puisque plusieurs voies cellulaires convergent et régulent les complexes mTORCl et mTORC2, des mutations dans les kinases en amont peuvent mener à une dérégulation de l'activation de mTOR. Des stratégies thérapeutiques ont été développées pour cibler les complexes mTORCl et mTORC2, ainsi que les kinases en amont qui régulent mTOR. Plusieurs drogues ciblant mTORCl, telles que la rapamycine et la curcumine, affectent l'interaction entre mTOR et un composant spécifique de mTORCl, raptor. Dans cette étude, nous nous sommes intéressés aux mécanismes moléculaires des drogues qui ciblent mTORCl, ainsi que leur effet déstabilisant sur l'interaction entre mTOR et raptor dans des lignées cellulaires de lymphomes. Nous avons démontré que raptor était clivé en un fragment de lOOkDa après traitement avec la rapamycine, la curcumine, l'étoposide, la cisplatine, la staurosporine et le ligand Fas (FasL). Etant donné que ces drogues ont été décrites comme induisant I'apoptose, l'utilisation d'un inhibiteur de caspases (z- VAD-fmk) a révélé que le clivage de raptor, lors de la mort cellulaire, était dépendant des caspases. Des essais caspases in vitro ont permis d'identifier la caspase-6 (ainsi que probablement d'autres caspases) comme étant une protéase impliquée dans le clivage de raptor. La séquence protéique de raptor a montré potentiellement plusieurs sites de clivage de caspases aux extrémités amino-terminale et carboxy-terminale. La mutagénèse a permis d'identifier les sites de clivages de raptor par les caspases comme étant DEAD LTD (acides aminés 17-23) et DDADD (acides aminés 939¬943). De plus, le clivage de raptor corrèle avec l'inhibition de l'activité de mTORCl envers ces substrats (S6K et 4E-BP1). Nous avons aussi observé que le clivage de raptor affaiblissait l'interaction entre mTOR et raptor, ce qui indique que ce clivage est une étape critique dans l'inhibition de mTORCl durant I'apoptose. Pour terminer, la mutagénèse du site de clivage de raptor DDADD a montré une résistance à la mort cellulaire de cellules cancéreuses. Notre travail de recherche a révélé un nouveau mécanisme moléculaire qui module l'organisation et l'activité de mTORCl, ce qui peut être d'un grand intérêt pour les recherches dans le domaine de mTOR ainsi que pour la découverte de molécules ciblant mTORCl. -- The mammalian target of rapamycin (mTOR) is a serine/threonine protein kinase, which is highly conserved from yeast to humans. Two different mTOR complexes exist: the mTOR complex 1 (mTORCl) and the mTOR complex 2 (mTORC2). They positively regulate anabolic processes (protein and lipid synthesis, energy metabolism, cytoskeleton organization, cell survival) and negatively regulate catabolic pathways (autophagy, lysosome biogenesis). The mTORCl and mTORC2 respond to mitogenic stimuli such as amino acids, glucose, growth factors, energy levels (ATP) and oxygen levels and drive essential cellular growth pathways. The mTORCl pathway can be found hyperactivated in numerous human cancers. As various cellular pathways converge and regulate mTORCl and mTORC2, mutations in upstream protein kinases can lead to a deregulated mTOR activation. Different therapeutic strategies have been developped to target mTORCl, mTORC2, as well as upstream protein kinases regulating mTOR pathways. Various drugs targeting mTORCl, such as rapamycin and curcumin, affect the interaction between mTOR and a specific mTORCl component, raptor. In this study, we investigated the molecular mechanisms of drugs targeting mTORCl, as well as their destabilizing effect on the mTOR-raptor interaction in lymphoma cell lines. We demonstrated that raptor was processed into a lOOkDa fragment after treatment with rapamycin, curcumin, etoposide, cisplatin, staurosporine and FasL. As these drugs were reported to induce apoptosis, the use of a pan-caspase inhibitor (z-VAD-fmk) revealed that the cleavage of raptor under cell death was caspase-dependent. In vitro caspase assays were performed to identify caspases-6 (and probably other caspases) as an important cysteine protease implicated in the cleavage of raptor. Analysis of raptor protein sequence showed several putative caspase-specific cleavage sites at the N-terminal and the C-terminal ends. Mutagenesis studies allowed us to identify the DEADLTD (amino acids 17-23) and the DDADD (amino acids 939-943) as the caspase-dependent cleavage residues of raptor. Furthermore, the cleavage of raptor correlated with inhibition of mTORCl activity towards its specific targets (4E-BP1 and S6K). We also highlighted that raptor processing weakened the interaction between mTOR and raptor, indicating that raptor cleavage is a critical step in the mTORCl inhibition process during apoptosis. Finally, mutagenesis of raptor C-terminal cleavage site (DDADD) conferred resistance to the chemotherapeutic-mediated cell death cascade of cancer cell. Our research work highlighted a new molecular mechanism modulating mTORCl organization and activity, which can be of great interest in the mTOR field research and for designing drugs trageting mTORCl.

Estimation des coûts engendrés par l'occupation inappropriée des lits de soins aigus du CHUV par des patients en attente de placement

[Table des matières] 1. Pourquoi s'intéresser à l'occupation inappropriée des lits de soins aigus au CHUV ?. - 1.1. Etat des lieux. - 1.1.1. Les chiffres du CHUV. - 1.1.2. La cellule de gestion des flux de patients. - 1.1.3. L'unité de patients en attente de placement. - 1.1.4. La pénurie de lits dans les EMS vaudois. - 1.1.5. Le vieillissement de la population vaudoise. - 1.2. Evidences nationales et internationales. - - 2. Estimation des coûts. - 2.1. Coûts chiffrables. - 2.1.1. Perte financière directe. - 2.1.2. Coûts des transferts pour engorgement. - 2.1.3. Coût d'opportunité. - 2.2. Coûts non chiffrables. - 2.2.1. Patients. - 2.2.2. Personnel médical. - 2.2.3. CHUV. - - 3. Propositions. - 3.1. Prises en charge alternatives. - 3.1.1. Les réseaux intégrés de services aux personnes âgées. - 3.1.2. Les courts séjours gériatriques. - 3.1.3. Autres solutions. - 3.2. Prévention. - 3.2.1. Prévention des chutes. - 3.2.2. La prévention par l'information aux personnes âgées. - 3.2.3. La prévention par l'information à l'ensemble de la population

Optimisation d'une approche pour l'analyse de l'expression de gènes au niveau unicellulaire chez des sous-populations spécialisées de lymphocytes T CD4+ humaines

Chez les patients cancéreux, les cellules malignes sont souvent reconnues et détruites par les cellules T cytotoxiques du patient. C'est pourquoi, depuis plusieurs années, des recherches visent à produire des vaccins sensibilisant les cellules de l'immunité adaptative, afin de prévenir certains cancers. Bien que les vaccins ciblant les cellules T CD8+ (cytotoxiques) ont une efficacité in-vitro élevée, un vaccin pouvant cibler les cellules T CD8+ et CD4+ aurait une plus grande efficacité (1-3). En effet, les cellules T helper (CD4+) favorisent la production et la maintenance des cellules T CD8+ mémoires à longue durée de vie. Il existe un grand nombre de sous-types de cellules T CD4+ et leur action envers les cellules cancéreuses est différente. Par exemple, les lymphocytes Treg ont une activité pro-tumorale importante (4) et les lymphocytes Th1 ont une activité anti-tumorale (5). Cependant, le taux naturel des différents sous-types de cellules T CD4+ spécifiques aux antigènes tumoraux est variable. De plus, une certaine flexibilité des différents sous-types de cellules T CD4+ a été récemment démontrée (6). Celle-ci pourrait être ciblée par des protocoles de vaccination avec des antigènes tumoraux administrés conjointement à des adjuvants définis. Pour cela, il faut approfondir les connaissances sur le rôle des cellules T CD4+ spécifiques aux antigènes dans l'immunité anti-tumorale et connaître précisément la proportion des sous-types de cellules T CD4+ activées avant et après la vaccination. L'analyse des cellules T, par la cytométrie de flux, est très souvent limité par le besoin d'un nombre très élevé de cellules pour l'analyse de l'expression protéique. Or dans l'analyse des cellules T CD4+ spécifiques aux antigènes tumoraux cette technique n'est souvent pas applicable, car ces cellules sont présentes en très faible quantité dans le sang et dans les tissus tumoraux. C'est pourquoi, une approche basée sur l'analyse de la cellule T individuelle a été mise en place afin d'étudier l'expression du profil génétique des cellules T CD8+ et CD4+. (7,8) Méthode : Ce nouveau protocole (« single cell ») a été élaboré à partir d'une modification du protocole PCR-RT, qui permet la détection spécifique de l'ADN complémentaire (ADNc) après la transcription globale de l'ARN messager (ARNm) exprimé par une cellule T individuelle. Dans ce travail, nous optimisons cette nouvelle technique d'analyse pour les cellules T CD4+, en sélectionnant les meilleures amorces. Tout d'abord, des clones à profils fonctionnels connus sont générés par cytométrie de flux à partir de cellules T CD4+ d'un donneur sain. Pour cette étape d'optimisation des amorces, la spécificité des cellules T CD4+ n'est pas prise en considération. Il est, donc, possible d'étudier et de trier ces clones par cytométrie de flux. Ensuite, grâce au protocole « single cell », nous testons par PCR les amorces des différents facteurs spécifiques de chaque sous-type des T CD4+ sur des aliquotes issus d'une cellule provenant des clones générés. Nous sélectionnons les amorces dont la sensibilité, la spécificité ainsi que les valeurs prédictives positives et négatives des tests sont les meilleures. (9) Conclusion : Durant ce travail nous avons généré de l'ADNc de cellules T individuelles et sélectionné douze paires d'amorces pour l'identification des sous-types de cellules T CD4+ par la technique d'analyse PCR « single cell ». Les facteurs spécifiques aux cellules Th2 : IL-4, IL-5, IL-13, CRTh2, GATA3 ; les facteurs spécifiques aux cellules Th1 : TNFα, IL-2 ; les facteurs spécifiques aux cellules Treg : FOXP3, IL-2RA ; les facteurs spécifiques aux cellules Th17 : RORC, CCR6 et un facteur spécifique aux cellules naïves : CCR7. Ces amorces peuvent être utilisées dans le futur en combinaison avec des cellules antigènes-spécifiques triées par marquage des multimères pMHCII. Cette méthode permettra de comprendre le rôle ainsi que l'amplitude et la diversité fonctionnelle de la réponse de la cellule T CD4+ antigène-spécifique dans les cancers et dans d'autres maladies. Cela afin d'affiner les recherches en immunothérapie oncologique. (8)

Vestibular schwannoma : the evolution of hearing and tumor size in natural course and after treatment by Linac stereotactic radiosurgery

Objectif : D'analyser l'évolution naturelle de la taille de la tumeur et de l'audition chez 151 patients avec schwannome vestibulaire (VS) en suivi et d'évaluer les mêmes paramètres pour une partie du group traité par Radiochirurgie Stéréotaxique Linac (SRS). Méthodes: Etude prospective des patients bilantés par IRM et tests audio-vestibulaires à l'inclusion, pendant la période du suivi et après SRS. L'audition a été gradé selon l'échelle de Gardner-Robertson (GR) et la taille tumorale selon l'échelle de Koos. L'analyse statistique inclut l'analyse de survie de Kaplan-Meier, analyse multivariée avec régression linéaire et logistique. Les patients avec une audition utile ont étés spécifiquement analysés. Résultats: Pendant la période du suivi (moyenne 24 mois, déviation 6-96), le risqué annuel de dégradation de la classe GR était 6% pour les patients GRI et 15% pour les GRII. La perte auditive comme symptôme initial était un facteur signifïcativement prédictif pour une aggravation auditive ultérieure (p=0.003). La croissance tumorale était de 25% à la dernière observation pendant le suivi. Pour les patients traités par Linac, la préservation d'une audition utile était 51% à 1 an et 36% à 3 ans. Le contrôle tumoral était 94 % and 91% respectivement. Conclusion: Chez les patients avec VS, la perte auditive déjà présente au diagnostique est un facteur prédictif négatif pour l'évolution de l'audition. La Radiochirurgie Stéréotaxique Linac est efficace pour le contrôle tumoral. Les patients ayant préservés leur status auditif prétraitement présentent un rythme annuel de perte auditive diminué après SRS compare à celle-ci avant le traitement. Cette constatation suggère un effet protectif potentiel de la SRS, à condition que la fonction cochléaire soit préservée.

IMP2 provides an alternative to LIN28B for LET-7 target gene protection and glioma stem cell maintenance

Glioblastoma multiforme (GBM) is the most frequent and lethal primary brain tumor in adults. Accumulating evidence suggests that tumors comprise a hierarchical organization that is, at least partially, not genetically driven. Cells that reside at the apex of this hierarchy are commonly referred to as cancer stem cells (CSCs) and are believed to largely contribute to recurrence and therapeutic failure. Although the complexity of epigenetic regulation of the genome precludes prediction as to which epigenetic changes dominate CSC specification in different cancer types, the ability of microRNAs (miRNAs) to fine-tune expression of entire gene networks places them among prime candidates for establishing CSC properties. In this study we characterized the miRNA expression profile of primary GBM grown either under conditions that enrich for GSCs or their differentiated non-tumorigenic progeny (DGCs). Although, we identified a subset of miRNAs that was strongly differentially expressed between GSCs and DGCs, we observed that in GSCs both let-7 and, paradoxically, their target genes are highly expressed, suggesting protection against let-7 action. Using PAR-CLIP we show that insulin-like growth factor-2 mRNA-binding protein 2 (IMP2) provides a mechanism for let-7 target gene protection that represents an alternative to LIN28A/B, which abrogates let-7 biogenesis in normal embryonic and certain malignant stem cells. By direct binding to miRNA recognition elements, IMP2 protects its targets from let-7 mediated decay. Importantly, depletion of IMP2 in GSCs strongly impairs their self- renewal properties and tumorigenicity in vivo, a phenotype that can be rescued by expression of LIN28B, suggesting that IMP2 mainly contributes to GSC maintenance by protecting let-7 target genes from silencing. Using mouse models, we show that depletion of IMP2 in neural stem cells (NSCs) induces let-7 target gene down-regulation, impairs their clonogenic capacity, and affects differentiation. Taken together, our observations describe a novel regulatory function of IMP2 in the let-7 axis whereby it supports GSC and NSC specification. Résumé (Français) Le glioblastome (GBM) est la tumeur primaire maligne du cerveau la plus fréquente. De nombreuses études ont démontré l'existence d'une organisation hiérarchique des cellules cancéreuses liée à des mécanismes épigénétiques. Les cellules qui se trouvent au sommet de cette hiérarchie sont appelées cellules souches cancéreuses (CSC), et contribuent à l'échec thérapeutique. Bien que la complexité des régulateurs épigénétiques permette difficilement de prédire quel mécanisme contribue le plus aux propriétés des CSC, la capacité des microRNAs (miRNAs) de réguler des réseaux entiers de gènes, les placent comme des candidats de premiers choix. Ici, nous avons caractérisé le profil d'expression des miRNAs dans des tumeurs primaires de GBM cultivées dans des conditions qui enrichissent soit pour les CSC, soit pour leur contrepartie de cellules cancéreuses différences (CCD). De manière surprenante et paradoxale la famille de miRNA let-7 et leurs gènes cibles étaient hautement exprimés dans les CSC, suggérant un mécanisme de protection contre l'action des let-7. Avec l'aide de la technologie PAR-CLIP, nous démontrons que la protéine IMP2, protège les mRNAs de l'action des let-7 et représente une alternative à Lin28A/B, qui d'ordinaire réprime fortement la maturation des let-7 dans les cellules souches embryonnaires et divers cancers. En se liant à la région ciblée par les let-7, IMP2 protège ses transcrits de l'action de cette classe de microRNA qui est tumoro-supressive. La déplétion d'IMP2 dans des CSC de GBM réduit fortement leur clonogénicité in vitro et leur tumorigénicité in vivo. Ceci peut être reversé en introduisant Lin28B dans des CSC de GBM, suggérant qu'IMP2 exerce ses fonctions pro-tumorigéniques en modulant l'axe let-7. Avec l'aide de modèles murins, nous observons que la déplétion de IMP2 dans les cellules souches neurales (CSN) induit une baisse de leur clonogénicité et des cibles des miRNAs let-7, suggérant une conservation de ce mécanisme entre les CSC de GBM et les CSN. En résumé, nos observations définissent une nouvelle fonction de IMP2 dans l'axe let-7 par lequel il contribue au maintien des propriétés des CSC et des CSN.

Les tiers : ces acteurs de la dynamique juridique dans le Code civil du Québec

La vie en société s’organise autour de systèmes structurants : politique, économique, juridique, religieux, etc. En démocratie, le droit a pour mission essentielle d’assurer la paix, la stabilité et la sécurité ; pour ce faire, il tend à rendre toute chose prévisible, en normalisant les comportements, en uniformisant les règles. Ainsi, les rapports privés s’incarneront dans la fixité et la linéarité autour d’une figure relationnelle unique, le duo. La mouvance sociale, l’effervescence économique semblent faire fi de ce moule trop contraignant. Les acteurs s’inscrivent dans la pluralité et tissent des rapports densément enchevêtrés. Selon la théorie juridique classique, le droit doit alors adopter une stratégie de simplification : fragmenter les situations, circonscrire des espaces clos autour de la cellule nucléaire d’origine, en chasser ceux qu’il perçoit comme des parasites. La tactique consiste à se donner une structure binaire, à opposer par exemple les parties aux tiers. L’auteure soutient que la seule présence des tiers, identifiés juridiquement à des étrangers, constitue la marque indélébile du bouillonnement communicationnel. Que le droit refuse d’en rendre compte expressément dévoile l’artificialité de sa construction.

Lung cancer risk associated with occupational exposure to nickel, chromium VI, and cadmium in two population-based case-control studies in Montreal.

Cancer du poumon associé à l’exposition au nickel, au chrome VI et au cadmium dans le milieu de travail utilisant deux études populationnelles cas-témoins à Montréal. Au début des années 1990, le nickel, le chrome VI et le cadmium ont été classés en tant qu’agents cancérigènes de classe 1 par le CIRC (Centre International de Recherche sur le Cancer). Cependant, les résultats des études ayant permis la classification de ces métaux n’ont pas toujours été reproduits, et d’importantes questions demeurent quant aux effets de ces métaux à de faibles niveaux d’exposition. Un plus grand nombre de recherches empiriques est donc nécessaire afin de réaffirmer la cancérogénicité de ces agents, et d’identifier les circonstances dans lesquelles ils peuvent être néfastes. L'objectif de cette étude était d'explorer la relation entre l’exposition à un des métaux (soit le nickel, le chrome VI, ou le cadmium) et les risques subséquents de développer un cancer du poumon chez des travailleurs provenant de différents milieux de travail qui sont exposés à ces métaux à de différents degrés. Deux études cas-témoins de base populationnelle menées à Montréal ont fourni les données nécessaires pour examiner la cancérogénicité de ces métaux. La première étude était menée entre 1979 et 1986 chez des hommes âgés de 35 à 70 ans ayant un cancer dans l’un de 19 sites anatomiques de cancer sélectionnés. La seconde étude était menée entre 1996 et 2001 chez des hommes et des femmes âgés de 35 à 75 ans, avec un diagnostic de tumeur maligne au poumon. Dans ces deux études, les cas ont été recensés dans tous les hôpitaux de l'île de Montréal, tandis que les contrôles populationnels appariés par âge et stratifiés par sexe, ont été sélectionnés des listes électorales. Une entrevue avec chaque sujet a permis d'obtenir un historique d'emploi détaillé ainsi que des informations précises sur les facteurs de risques socio-économiques et personnels. Les descriptions de poste ont été évaluées par une équipe d'experts chimistes et hygiénistes afin de déterminer si le sujet a été exposé à chaque agent, et pour mesurer à la fois la concentration et la durée de chaque exposition, ainsi que l’exposition cumulative tout au long de la vie de chaque participant. Pour déterminer si une exposition à l’un des trois métaux en cause était associée à une augmentation de l'incidence du cancer du poumon, des données ont été analysées par régression logistique : des ajustements ont été effectués pour des facteurs de confusion pertinents incluant un historique détaillé du tabagisme. Des mesures catégoriques d'exposition cumulée ont été également analysées, ainsi que la modification des effets par le tabagisme. Les deux études ont été analysées séparément, puis par la suite combinées afin d'augmenter la puissance statistique. Les niveaux d'exposition mesurés dans cette population ne semblaient pas poser un excès de risque de cancer du poumon pour les travailleurs exposés au chrome VI. Cependant, ceux qui ont été exposés au nickel ont subi une augmentation significative du risque, et ce, quel que soit leur niveau d'exposition. Le risque de développer un cancer du poumon suite à une exposition au cadmium était élevé, mais pas de manière significative. Pour chacun des trois métaux, le risque de cancer du poumon était très élevé parmi les non-fumeurs, mais pas parmi les fumeurs. L’effet combiné du tabagisme et de l’exposition aux métaux était compatible avec un excès de risque additif. Cependant, les intervalles de confiance dans cette étude tendaient à être larges, et une faiblesse de puissance statistique peut limiter l’interprétation de certains résultats. Cette étude est unique dans la mesure où elle a fourni des preuves empiriques sur les risques de développer le cancer du poumon liés aux faibles niveaux d’exposition au nickel, au chrome VI, ou au cadmium provenant de divers contextes de travail. Dans la plupart des autres études, la majorité des expositions pertinentes n’ont pas été bien contrôlées. À l'inverse, cette étude a bénéficié de la collecte et de la disponibilité d'information détaillée concernant le tabagisme et d’autres facteurs de risque. Les résultats de cette étude ont d'importantes conséquences pour la santé publique, tant au niveau de la détermination des risques pour les travailleurs actuellement exposés à ces métaux, qu'au niveau de l’évaluation des risques pour la population en général, elle-même exposée à ces métaux par le biais de la pollution et de la fumée de cigarette. Cette analyse contribuera fort probablement à une réévaluation par le CIRC de la cancérogénicité de ces métaux. L'exploration de la relation entre les risques de cancer du poumon et l'exposition au nickel, au chrome VI et au cadmium est donc opportune et pertinente.

Vieillissement vasculaire chez des patients athérosclérotiques: Sénescence prématurée des cellules endothéliales?

La dysfonction de l’endothélium vasculaire, associée à une diminution de ses propriétés vasorelaxantes et anti-thrombogéniques, survient avec le vieillissement mais également chez de plus jeunes patients athérosclérotiques présentant plusieurs facteurs de risque cardiovasculaire. Au niveau cellulaire, le vieillissement des cellules endothéliales (CE) mène à un état irréversible de non division cellulaire appelé sénescence. Ces cellules sénescentes présentent des changements spécifiques au niveau de leur morphologie et de l’expression génique, menant à leur dysfonction. La sénescence dite réplicative est déclenchée par le raccourcissement des télomères survenant à chaque division cellulaire, mais peut également être induite prématurément par le stress oxydant (SIPS). L’objectif principal de cette étude est de caractériser la sénescence de CE vasculaires isolées à partir de patients athérosclérotiques, et d’observer l’impact des facteurs de risque sur cette sénescence. Afin de confirmer la contribution des deux principales voies de la sénescence, nous avons par la suite étudié conjointement ou séparément, l’impact d’un traitement chronique avec un antioxydant sur la sénescence de CE, et d’une surexpression de la sous-unité catalytique de la télomérase (hTERT), une enzyme responsable de l’allongement des télomères. Nous avons isolé et cultivé des CE provenant d’artères mammaires internes prélevées lors de pontages coronariens. Selon les études, les cellules ont été infectées ou non avec un lentivirus surexprimant la hTERT, et cultivées in vitro jusqu’à sénescence, en présence ou en absence de l’antioxydant N-acétyl-L-cystéine (NAC). Différents marqueurs des deux principales voies de la sénescence (réplicative ou SIPS) ont été quantifiés. La sénescence cellulaire se développe exponentiellement avec le temps et est associée à une réduction de la viabilité et de la prolifération cellulaires. Chez les patients athérosclérotiques, le vieillissement des CE passe par les deux principales voies de la sénescence : des télomères courts initialement en culture et la durée d’exposition in vivo aux facteurs de risque cardiovasculaire prédisent une apparition prématurée de la sénescence. Toutefois, chez les fumeurs, la sénescence est exclusivement du type SIPS. Ces facteurs de risque cardiovasculaire et principalement l’hypertension, semblent accélèrer le vieillissement biologique et favoriser la dysfonction des CE. Lorsque traitées chroniquement avec le NAC, les CE présentant initialement de moindres dommages cellulaires et moléculaires ainsi qu’une meilleure défense antioxydante développent une sénescence retardée. Lorsque le NAC est combiné à une surexpression de la hTERT, les deux voies de la sénescence sont bloquées et une immortalisation cellulaire est observée. À l’inverse, dans les CE les plus endommagées par les ROS in vivo, le NAC n’a aucun effet sur le développement de la sénescence, la hTERT, seule ou en combinaison avec le NAC, retarde légèrement la sénescence mais aucune immortalisation n’est observée lorsque ces traitements sont combinés. En conclusion, nos études démontrent que l’exposition chronique au stress oxydant associé aux facteurs de risque cardiovasculaire accélère le développement de la sénescence de CE vasculaires, contribuant potentiellement à l’athérogénèse. Dans les cellules de patients athérosclérotiques, il semble exister un seuil de dommages cellulaires et moléculaires subis in vivo au-delà duquel, aucun traitement (antioxydant ou hTERT) ne peut être bénéfique.

Nouvelles stratégies d’imageries afin de faciliter l’étude des interactions entre les récepteurs couplés aux protéines G

L’étude de l’assemblage et de l’acheminement à la membrane plasmique des complexes de signalisation des RCPGs va jouer un rôle crucial dans le développement de nouveaux médicaments ayant moins d’effets secondaires. Des outils permettant l’étude de ces phénomènes existent déjà, mais un outil polyvalent qui permettrait d’étudier plusieurs aspects pourrait grandement faciliter et accélérer ces études. L’étiquette SNAP est un candidat intéressant puisqu’avec cette étiquette il est possible de marquer une seule construction avec une variété de différents substrats. Une construction encodant pour le récepteur β2AR avec une étiquette SNAP à son extrémité C-terminale a été ingénérée. Cette construction est apte à lier son ligand, à être acheminée à la membrane plasmique et à homodimériser. La protéine exprimée a été marquée avec le fluorophore BG-430. De la fluorescence non spécifique a été détectée dans la cellule (même en absence de l’étiquette SNAP sur le récepteur). Un essai BRET a été développé, utilisant la construction HA-β2AR-SNAP en tant qu’accepteur et est fonctionnel. L’étiquette SNAP, comme utilisée ici, ne présente pas un aussi bon candidat qu’attendu, puisque le substrat n’ayant pas réagi demeure coincé dans la cellule. Le facteur activateur de plaquette (PAF) et son récepteur (PAFR) jouent un rôle critique dans plusieurs réponses inflammatoires et le récepteur FP est impliqué dans l’accouchement prématuré. Une meilleure compréhension des complexes de signalisation associés à ces récepteurs pourrait être la première étape dans la compréhension de leur signalisation dans des situations normales ou de maladies. Des expériences de BRET étudiant des interactions de bases entre les récepteurs et leurs partenaires d’interactions connus ont été réalisées. Elles ont permis de déterminer que : les récepteurs PAF et FP homodimérisent, que les récepteurs PAF et FP hétérodimérisent, que les protéines Gβγ interagissent de manière constitutive avec ces récepteurs et qu’aucun signal de BRET n’a été détecté avec la protéine Gα et ce, en présence ou en absence de stimulation par un agoniste (suggérant qu’il est nécessaire d’optimiser le système présentement utilisé).

Étude des mécanismes moléculaires menant à la migration cellulaire associée à Rac1 et ARF6.

Le facteur de l’ADP-ribosylation 6 (ARF6) et Rac1 sont des petites protéines liant le GTP qui régulent plusieurs voies de signalisation comprenant le trafic de vésicules, la modification des lipides membranaires et la réorganisation du cytosquelette d’actine. Cependant, les mécanismes moléculaires par lesquels ARF6 et Rac1 agissent de concert afin de contrôler ces différents processus cellulaires restent méconnus. Dans cette étude, nous montrons que, dans les cellules HEK293, ARF6 et Rac1 sont retrouvées en complexe suite à la stimulation du récepteur à l’angiotensine. Des expériences réalisées in vitro nous indiquent que ces deux GTPases interagissent ensemble directement, et que ARF6 s’associe préférentiellement avec la forme inactive de Rac1. L’inhibition de l’expression de ARF6 par interférence à l’ARN entraîne une activation marquée en cellule de Rac1 via le facteur PIX, indépendamment de la stimulation d’un récepteur, ce qui provoque la migration non contrôlée des cellules. Les arrestines, protéines de régulation de la désensibilisation des récepteurs couplés aux protéines G, servent de protéines d’échafaudage pour Rac1 et ARF6, en interagissant directement avec les GTPases et en augmentant leur association stimulée par l’angiotensine. De plus, les arrestines permettent l’activation, en s’en dissociant, de la MAP Kinase p38 qui régule l’activité de ARF6 et son interaction précoce avec les arrestines. Mis ensemble, ces résultats montrent que les arrestines contrôlent l’activité de ARF6, en influençant p38. ARF6 joue un rôle inhibiteur sur l’activation basale de Rac1 pour permettre ensuite son recrutement et son activation dépendante de l’angiotensine. Cette étude nous a permis de préciser le mode de régulation mis en jeu dans l’initiation de la migration cellulaire, suite à l’activation d’un récepteur couplé aux protéines G. Par le fait même, nous avons identifié certains des acteurs impliqués dans ce processus, offrant ainsi de nouvelles cibles pour le traitement des déséquilibres pathophysiologiques de la migration cellulaire.

Caractérisation de la SERPINA1, une antiprotéase différentiellement exprimée dans le cancer épithélial de l’ovaire

Le cancer épithélial de l’ovaire est le cancer gynécologique le plus létal. La survie à 5 ans est de 30-40% chez les patientes atteintes d’une tumeur invasive (TOV), comparativement à 95% chez les patientes diagnostiquées pour une tumeur à faible potentiel de malignité ou borderline (LMP). Au laboratoire, l’analyse de l’expression des gènes de la micropuce à ADN U133 d’Affymetrix a révélé que la SERPINA1 est un gène dont l’expression varie entre les tumeurs LMP et TOV. La validation par Q-PCR nous a confirmé que cette antiprotéase est majoritairement surexprimée dans les tumeurs LMP, par rapport aux tumeurs bénignes (BOV) et aux tumeurs TOV. Nous avons donc surexprimé la SERPINA1 dans les lignées cellulaires invasives TOV 112D et TOV 1946 du cancer de l’ovaire et dérivé des clones stables. Les résultats obtenus nous indiquent que la surexpression de la SERPINA1 a un effet sur la capacité d’invasion et de migration cellulaire et non au niveau de la croissance cellulaire et la formation de structures tridimensionnelles. Les résultats issus de l’étude in vivo dans les souris SCID nous permettront de déterminer si la surexpression de la SERPINA1 a un effet sur la tumorigénèse ovarienne. Ainsi, la SERPINA1 demeure à notre avis un candidat d’intérêt pour tenter de mieux comprendre les différences biologiques entre les tumeurs LMP et TOV, ainsi que le rôle des protéases et de leurs inhibiteurs dans la progression tumorale du cancer de l’ovaire.

Consommation alimentaire d’antioxydants et risque de cancer du poumon : une étude cas-témoins montréalaise

Objectif : Examiner l’association entre la consommation alimentaire de caroténoïdes (β-carotène, α-carotène, β-cryptoxanthine, lutéine/zéaxanthine, lycopène) et de vitamine C et le risque de cancer du poumon, selon le sexe, l’intensité de tabagisme et le sous-type histologique de la tumeur. Méthodes : Les données proviennent d’une étude cas-témoins menée à Montréal, Canada. Des entrevues ont été effectuées auprès de 1 105 cas incidents de cancer du poumon et 1 449 témoins issus de la population générale. Leur fréquence de consommation moyenne de 49 fruits et légumes deux ans auparavant a été convertie en apports en antioxydants. Les rapports de cotes (RC) et les intervalles de confiance (IC) à 95% caractérisant l’association entre les antioxydants et le risque de cancer du poumon ont été estimés à l’aide de modèles de régression logistique et polytomée, en tenant compte de facteurs de confusion potentiels. Résultats : Une consommation élevée en antioxydants était généralement associée à une diminution du risque de cancer du poumon de l’ordre de 30%. Un effet protecteur a été observé chez les hommes et les femmes, pour les non fumeurs, les fumeurs quelque soit l’intensité de tabagisme, ainsi que pour les carcinomes à petites cellules, épidermoïde et l’adénocarcinome. Conclusions : Plusieurs antioxydants alimentaires protégeraient du cancer du poumon. Les efforts de prévention bénéficieraient de cibler la promotion de la consommation de fruits et de légumes riches en caroténoïdes et en vitamine C.

Optimisation de la domiciliation des cellules CD34+ de sang de cordon ombilical: élucider les mécanismes en cause dépendant du CXCR4.

Le sang provenant d’un cordon ombilical (SCO) représente une bonne source de cellules souches hématopoïétiques (CSH) pour des transplantations. Cependant, le nombre de cellules souches contenues dans ce sang est souvent insuffisant pour greffer un adulte. Le mécanisme intervenant dans la domiciliation de ces cellules au sein de la moelle osseuse (MO) est encore mal compris. On sait que l’interaction entre la chimiokine SDF-1 et le récepteur CXCR4, présent sur les cellules CD34+ de SCO, mène à la migration de ces cellules en direction de la MO. Nous pensons que l’augmentation de la proportion de cellules qui réussit à se greffer pourra pallier au problème du nombre. Les produits de dégradation, C3a et le C3desarg,, issus du système du complément, sont connus pour favoriser la réponse de cellules exprimant CXCR4 vers SDF-1. Nous avons analysé l’effet du C3adesarg, molécule non anaphylatoxique, sur la migration cellulaire vers SDF-1, de même que sur la prise de greffe des cellules CD34+ issues de SCO suite à une transplantation sur des souris NOD/SCIDyC-. Nos expériences ont démontré que le C3a ainsi que le C3adesarg augmentaient tous les deux la réponse des cellules CD34+ vers SDF-1. Toutefois, nous n’avons pas pu démontrer que ces molécules liaient directement le récepteur CXCR4. Par contre, le composé C3adesarg favorise la prise de greffe des cellules CD34+ de SCO. Il serait donc un bon candidat pour poursuivre une optimisation de ses propriétés. Nous avons également constaté que suite à une transplantation chez la souris, les cellules CD34+ de SCO subissent une hausse d’expression transitoire de leur CXCR4 environ quatre jours après la greffe. Cette hausse d’expression coïncide avec la multiplication des cellules CD34+ dans la MO. Nous avons également confirmé qu’une cellule CD34+ avec une forte expression de CXCR4 était dans un état prolifératif. Nos données suggèrent que l’interaction directe avec les cellules stromales soit responsable de cette hausse d’expression de CXCR4.

Assessing waiting times in the clinical trajectory of patients with lung cancer

Le cancer du poumon a une incidence et une létalité parmi les plus hautes de tous les cancers diagnostiqués au Canada. En considérant la gravité du pronostic et des symptômes de la maladie, l’accès au traitement dans les plus brefs de délais est essentiel. Malgré l’engagement du gouvernement fédéral et les gouvernements provinciaux de réduire les délais de temps d’attente, des balises pour les temps d’attente pour le traitement d’un cancer ne sont toujours pas établis. En outre, le compte-rendu des indicateurs des temps d’attente n’est pas uniforme à travers les provinces. Une des solutions proposées pour la réduction des temps d’attente pour le traitement du cancer est les équipes interdisciplinaires. J’ai complété un audit du programme interdisciplinaire traitant le cancer du poumon à l’Hôpital général juif (l’HGJ) de 2004 à 2007. Les objectifs primaires de l’étude étaient : (1) de faire un audit de la performance de l’équipe interdisciplinaire à l’HGJ en ce qui concerne les temps d’attente pour les intervalles critiques et les sous-groupes de patients ; (2) de comparer les temps d’attente dans la trajectoire clinique des patients traités à l’HGJ avec les balises qui existent ; (3) de déterminer les facteurs associés aux délais plus longs dans cette population. Un objectif secondaire de l’étude était de suggérer des mesures visant à réduire les temps d’attente. Le service clinique à l’HGJ a été évalué selon les balises proposées par le British Thoracic Society, Cancer Care Ontario, et la balise pan-canadienne pour la radiothérapie. Les patients de l’HGJ ont subi un délai médian de 9 jours pour l’intervalle «Ready to treat to first treatment», et un délai médian de 30 jours pour l’intervalle entre le premier contact avec l’hôpital et le premier traitement. Les patients âgés de plus de 65 ans, les patients avec une capacité physique diminuée, et les patients avec un stade de tumeur limité étaient plus à risque d’échouer les balises pour les temps d’attente.