Hepatitis B virus subgenotype C2- and B2-associated mutation patterns may be responsible for liver cirrhosis and hepatocellular carcinoma, respectively

The objective of this study was to examine hepatitis B virus (HBV) subgenotypes and mutations in enhancer II, basal core promoter, and precore regions of HBV in relation to risks of liver cirrhosis (LC) and hepatocellular carcinoma (HCC) in Southeast China. A case-control study was performed, including chronic hepatitis B (CHB; n=125), LC (n=120), and HCC (n=136). HBV was genotyped by multiplex polymerase chain reaction and subgenotyped by restriction fragment length polymorphism. HBV mutations were measured by DNA sequencing. HBV genotype C (68.2%) predominated and genotype B (30.2%) was the second most common. Of these, C2 (67.5%) was the most prevalent subgenotype, and B2 (30.2%) ranked second. Thirteen mutations with a frequency >5% were detected. Seven mutation patterns (C1653T, G1719T, G1730C, T1753C, A1762T, G1764A, and G1799C) were associated with C2, and four patterns (C1810T, A1846T, G1862T, and G1896A) were associated with B2. Six patterns (C1653T, G1730C, T1753C, A1762T, G1764A, and G1799C) were obviously associated with LC, and 10 patterns (C1653T, G1730C, T1753C, A1762T, G1764A, G1799C, C1810T, A1846T, G1862T, and G1896A) were significantly associated with HCC compared with CHB. Four patterns (C1810T, A1846T, G1862T, and G1896A) were significantly associated with HCC compared with LC. Multivariate regression analyses showed that HBV subgenotype C2 and C2-associated mutation patterns (C1653T, T1753C, A1762T, and G1764A) were independent risk factors for LC when CHB was the control, and that B2-associated mutation patterns (C1810T, A1846T, G1862T, and G1896A) were independent risk factors for HCC when LC was the control.

Association between the c.910A>G genetic variant of the XRCC1 gene and susceptibility to esophageal cancer in the Chinese Han population

Esophageal cancer (EC) is a common malignancy worldwide. The X-ray repair cross-complementing 1 gene (XRCC1) is one of the most important candidate genes for influencing susceptibility to EC. This study aimed to investigate the effect of XRCC1 genetic variants on susceptibility to EC. A total of 383 EC patients (males: 239, females: 144, mean age: 56.62) and 387 cancer-free controls (males: 251, females: 136, mean age: 58.23) were enrolled in this study. The c.910A>G genetic variant of theXRCC1 gene was determined by polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism and DNA sequencing methods. The allele and genotype frequencies indicated statistical differences between EC patients and cancer-free controls. The c.910A>G genetic variant was statistically associated with increased susceptibility to EC [GGvs AA: odds ratio (OR)=1.79, 95% confidence interval (CI)=1.12-2.86, P=0.014; GG vs AG/AA: OR=1.76, 95%CI=1.13-2.75, P=0.013; G vs A: OR=1.25, 95%CI=1.01-1.55, P=0.041]. The allele G and genotype GG could contribute to the increased susceptibility to EC. Our findings suggest that the c.910A>G genetic variant is associated with susceptibility to EC in the Chinese Han population, and might be used as a molecular marker for detecting susceptibility to EC.

Spectrum of K ras mutations in Pakistani colorectal cancer patients

The incidence of colorectal cancer (CRC) is increasing daily worldwide. Although different aspects of CRC have been studied in other parts of the world, relatively little or almost no information is available in Pakistan about different aspects of this disease at the molecular level. The present study was aimed at determining the frequency and prevalence of K ras gene mutations in Pakistani CRC patients. Tissue and blood samples of 150 CRC patients (64% male and 36% female) were used for PCR amplification of K ras and detection of mutations by denaturing gradient gel electrophoresis, restriction fragment length polymorphism analysis, and nucleotide sequencing. The K ras mutation frequency was found to be 13%, and the most prevalent mutations were found at codons 12 and 13. A novel mutation was also found at codon 31. The dominant mutation observed was a G to A transition. Female patients were more susceptible to K ras mutations, and these mutations were predominant in patients with a nonmetastatic stage of CRC. No significant differences in the prevalence of K ras mutations were observed for patient age, gender, or tumor type. It can be inferred from this study that Pakistani CRC patients have a lower frequency of K ras mutations compared to those observed in other parts of the world, and that K ras mutations seemed to be significantly associated with female patients.

Single nucleotide polymorphisms predisposing to asthma in children of Mauritian Indian and Chinese Han ethnicity

Our objective was to investigate the distributions of six single nucleotide polymorphisms (SNPs) MS4A2 E237G, MS4A2 C-109T, ADRB2 R16G, IL4RA I75V,IL4 C-590T, and IL13 C1923T in Mauritian Indian and Chinese Han children with asthma. This case-control association study enrolled 382 unrelated Mauritian Indian children, 193 with asthma and 189 healthy controls, and 384 unrelated Chinese Han children, 192 with asthma and 192 healthy controls. The SNP loci were genotyped using polymerase chain reaction (PCR)-restriction fragment length polymorphism for the Chinese Han samples and TaqMan real-time quantitative PCR for the Mauritian Indian samples. In the Mauritian Indian children, there was a significant difference in the distribution of IL13 C1923T between the asthma and control groups (P=0.033). The frequency of IL13 C1923T T/T in the Mauritian Indian asthma group was significantly higher than in the control group [odds ratio (OR)=2.119, 95% confidence interval=1.048-4.285]. The Chinese Han children with asthma had significantly higher frequencies ofMS4A2 C-109T T/T (OR=1.961, P=0.001) and ADRB2 R16G A/A (OR=2.575, P=0.000) than the control group. The IL13 C1923T locus predisposed to asthma in Mauritian Indian children, which represents an ethnic difference from the Chinese Han population. TheMS4A2 C-109T T/T and ADRB2 R16G A/Agenotypes were associated with asthma in the Chinese Han children.

Associations between CD36 gene polymorphisms and susceptibility to coronary artery heart disease

Associations between polymorphisms of the CD36 gene and susceptibility to coronary artery heart disease (CHD) are not clear. We assessed allele frequencies and genotype distributions of CD36 gene polymorphisms in 112 CHD patients and 129 control patients using semi-quantitative polymerase chain reaction (PCR) and restriction fragment length polymorphism (RFLP) analysis. Additionally, we detected CD36 mRNA expression by real-time quantitative PCR, and we quantified plasma levels of oxidized low-density lipoprotein (ox-LDL) using an enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). There were no significant differences between the two groups (P>0.05) in allele frequencies of rs1761667 or in genotype distribution and allele frequencies of rs3173798. The genotype distribution of rs1761667 significantly differed between CHD patients and controls (P=0.034), with a significantly higher frequency of the AG genotype in the CHD group compared to the control group (P=0.011). The plasma levels of ox-LDL in patients with the AG genotype were remarkably higher than those with the GG and AA genotypes (P=0.010). In a randomized sample taken from patients in the two groups, the CD36 mRNA expression of the CHD patients was higher than that of the controls. In CHD patients, the CD36 mRNA expression in AG genotype patients was remarkably higher than in those with an AA genotype (P=0.005). After adjusted logistic regression analysis, the AG genotype of rs1761667 was associated with an increased risk of CHD (OR=2.337, 95% CI=1.336-4.087, P=0.003). In conclusion, the rs1761667 polymorphism may be closely associated with developing CHD in the Chongqing Han population of China, and an AG genotype may be a genetic susceptibility factor for CHD.

Molekulare Studien zur Evolution der Myrmekophytie in der Gattung Macaranga (Euphorbiaceae)

Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde eine detaillierte phylogenetische Analyse der Ameisenpflanzen aus der Gattung Macaranga (Euphorbiaceae) und ihres verwandtschaftlichen Umfelds mit Hilfe von AFLP-Fingerprinting („amplified fragment length polymorphisms“) sowie vergleichender Analyse von mehreren nichtkodierenden Chloroplasten-DNA-Loci vorgenommen. Anhand dieser Untersuchungen sollten im Wesentlichen die folgenden Fragen geklärt werden: (1) Wie stellen sich die Verwandtschaftsverhältnisse zwischen den myrmekophytischen Macaranga-Sektionen Pachystemon, Winklerianae und Pruinosae dar? (2) Wie sind die einzelnen Arten dieser Sektionen miteinander verwandt? (3) Wie oft ist die Lebensweise ”Myrmekophytie” unabhängig voneinander entstanden? Gibt es Hinweise auf Reversionen? (4) Wo liegt genealogisch und auch geographisch der Ursprung der Symbiose zwischen den myrmekophytischen Macaranga-Arten und ihren Partnerameisen? (5) Welche Bedeutung spielen koevolutive Entwicklungen für das Macaranga-Crematogaster-Symbiosesystem? Ist Myrmekophytie im Sinne einer Schlüsselinnovation (Givnish, 1997) als Stimulus für eine adaptive Radiation zu betrachten? (1) Für die AFLP-Analyse wurden 108 Proben aus 43 Macaranga-Arten und 5 unbeschriebenen Morphospezies in die phylogenetische Untersuchung einbezogen. Auf der Basis von 426 Merkmalen wurden Phänogramme sowie Kladogramme rekonstruiert. Zur statistischen Absicherung wurden Bootstrap-Analysen durchgeführt und im Falle der Kladogramme darüber hinaus der „consistency“-Index bestimmt. Die AFLP-Datensätze wurden zusätzlich einer Hauptkomponentenanalyse unterzogen. Mit Hilfe der verschiedenen Untersuchungsmethoden konnten weitgehend übereinstimmende Gruppierungen bzw. evolutive Linien identifiziert werden. Die Sektionen Pachystemon und Pruinosae bilden eine jeweils gut gestützte monophyletische Gruppe. Beide sind vermutlich Schwestergruppen und damit gleich alt. Für die Monophylie der nur aus zwei Arten bestehenden Sektion Winklerianae ergab sich keine Unterstützung. Die Arten der Sektion Pruinosae sind im AFLP-Baum gut aufgelöst. Die nicht myrmekophytische M. gigantea sitzt dabei an der Basis und ist Schwestergruppe zu den myrmekophytischen Arten. Innerhalb der Sektion Pachystemon wurden mit Hilfe der AFLP-Analyse vier gut gestützte Gruppen identifiziert. Für die puncticulata-Gruppe konnte hier erstmals auf molekularer Ebene eine Zugehörigkeit zur Sekt. Pachystemon nachgewiesen werden. Der von Davies (2001) vorgenommene Ausschluss von M. recurvata aus der Sekt. Pachystemon konnte bestätigt werden. Die Verwandtschaftsbeziehungen einzelner Arten zueinander sind in den AFLP-Bäumen nicht aufgelöst. (2) Für die vergleichende Chloroplasten-Sequenzierung wurden nach Maßgabe der Sequenzvariabilität in Testsequenzierungen die Bereiche atpB-rbcL und psbI-trnS für die phylogenetische Untersuchung ausgewählt. Für die Chloroplasten-Phylogenie wurden für jeden Locus mehr als 100 Sequenzen analysiert. Neben 29 Pachystemon-Arten inkl. vier unbekannter Morphospezies, acht Pruinosae-Arten inkl. eines möglichen Hybriden und den beiden Arten der Sekt. Winklerianae wurden 22 weitere Macaranga- und 10 Mallotus-Arten in die Untersuchung einbezogen. Zwischen den südostasiatischen Arten bestanden nur geringe Sequenzunterschiede. Maximum-Parsimonie-Kladogramme wurden rekonstruiert und die Sequenzen der beiden Loci wurden sowohl einzeln, als auch kombiniert ausgewertet. Indels wurden kodiert und als separate Merkmalsmatrix an die Sequenzdaten angehangen. Innerhalb von Macaranga konnten nur wenige abgesicherte Gruppen identifiziert werden. Deutlich war die Zusammengehörigkeit der afrikanischen Arten und ihr Entstehung aus den südostasiatischen Arten. Die von Davies (2001) der Sektion Pruinosae zugeordnete M. siamensis steht deutlich außerhalb dieser Sektion. Die Arten der Sektionen Pruinosae, Pachystemon und Winklerianae bilden keine statistisch gesicherten monophyletischen Gruppen. Während der Pilotstudien stellte sich heraus, dass die Chloroplastensequenzen nahe verwandter Arten der Sektion Pachystemon weniger nach den Artgrenzen, sondern vielmehr nach geographischen Kriterien gruppierten. (3) Es wurde daher zusätzlich eine phylogeographische Analyse der Chloroplasten-Sequenzen auf der Basis eines Parsimonie-Netzwerks durchgeführt. Neben dem atpB-rbcL-Spacer und einer Teilsequenze des psbI-trnS-Locus (ccmp2) wurde dafür zusätzlich der ccmp6-Locus (ein Abschnitt des ycf3-Introns) sequenziert. Die phylogeographische Untersuchung wurde mit 144 Proben aus 41 Macaranga-Arten durchgeführt. Darin enthalten waren 29 Arten (inkl. vier Morphospezies) mit 112 Proben der Sektion Pachystemon, sieben 7 Arten (inkl. eines potentiellen Hybriden) mit 22 Proben der Sekt. Pruinosae und zwei Arten mit 5 Proben der Sekt. Winklerianae. Das voll aufgelöste statistische Parsimonie-Netzwerk umfasste 88 Haplotypen. Die Sektionen Pachystemon und Pruinosae bilden jeweils eine monophyletische Gruppe. Das geographische Arrangement der Haplotypen unabhängig von der Artzugehörigkeit könnte durch Introgression und/oder „lineage sorting“ bedingt sein. Mit Hilfe der im Rahmen dieser Arbeit gewonnenen Ergebnisse kann man davon ausgehen, dass eine enge Ameisen-Pflanzen-Symbiose innerhalb der Gattung Macaranga mindestens drei-, möglicherweise viermal unabhängig voneinander entstanden ist Eine Reversion hat mindestens einmal, möglicherweise häufiger in der bancana-Gruppe stattgefunden. Ob sich die Symbiose dabei in Westmalaysia oder in Borneo entwickelt hat, kann man nicht sicher sagen; Ob und inwieweit die große Artenzahl in der bancana-Gruppe als eine Folge der Myrmekophytie anzusehen ist, bleibt zunächst offen. Wesentliche Teile der vorliegenden Arbeit liegen bereits in publizierter Form vor (AFLP-Analyse: Bänfer et al. 2004; Chloroplasten-Analyse: Vogel et al. 2003; Bänfer et al. 2006).

Charakterisierung der mikrobiellen Population und Untersuchungen zum Quorum Sensing in der Rhizosphäre vom Weidelgras (Lolium perenne) auf einer Rückstandshalde der Kaliindustrie

Im Rahmen dieser Dissertation wurden die Dynamik und die Kommunikation innerhalb der mikrobiellen Population der Rhizosphäre von Deutschem Weidelgras (Lolium perenne) untersucht, welches auf einer teilweise rekultivierten Rückstandshalde der Kaliindustrie wuchs. Um die niederschlagsbedingte Auswaschung von Salzen zu reduzieren, wird die Rückstandshalde des Kaliwerks Sigmundshall (in Bokeloh bei Hannover) schrittweise mit dem technogenen Abdecksubstrat REKAL/SAV ummantelt. Dieses weist eine hohe Standfestigkeit und Wasserspeicherkapazität auf und kann zudem begrünt werden, wofür als Pionierpflanze Lolium perenne dient. Durch diese Rekultivierung wird Niederschlag besser gespeichert und über Evapotranspiration wieder in die Luft abgegeben, was letztendlich die Bildung von Salzwasser vermindert. Da das Abdecksubstrat neben alkalischem pH-Wert auch teilweise hohe Schwermetallkonzentrationen aufweist, sollte in der vorliegenden Arbeit erstmals die mikrobielle Rhizosphären-Gemeinschaft in diesem extremen Habitat mittels einer kulturunabhängigen Methode erforscht werden. Zudem wurden erste Untersuchungen angestellt, ob im Substrat die zelldichte-abhängige bakterielle Kommunikation (Quorum Sensing) nachgewiesen werden kann. Mittels extrahierter Gesamt-DNA wurde anhand der 16S rDNA die Analyse des „Terminalen Restriktonsfragmentlängenpolymorphismus“ (TRFLP) verwendet, um die komplexe bakterielle Rhizosphären-Gemeinschaft unter zeitlichen und lokalen Aspekten zu vergleichen. Auftretende Veränderungen bei den bakteriellen Populationen der jeweiligen Proben wurden durch eine Zu- oder Abnahme der auch als Ribotypen bezeichneten terminalen Restriktionsfragmente (TRF) erfasst. Hierbei zeigten sich am Südhang der Halde während der Sommermonate der Jahre 2008 und 2009 zwar Schwankungen in den bakteriellen Gemeinschaftsprofilen, es lagen jedoch keine eindeutigen Dynamiken vor. Im Vergleich zum Südhang der Halde wies der Nordhang eine höhere Ribotyp-Diversität auf, was mit der fortgeschritteneren Rekultivierung dieses Haldenabschnitts zusammenhängen könnte. Zusätzlich wurden Bakterien aus der Rhizosphäre von Lolium perenne isoliert und mithilfe der Biosensoren Agrobacterium tumefaciens A136 pCF218 pCF372 und Chromobacterium violaceum CV026 auf die Produktion von N-Acylhomoserinlactonen (AHLs) überprüft. Diese AHLs werden von Gram-negativen Mikroorganismen als Signalmoleküle verwendet, um ihre Genexpression zelldichteabhängig zu kontrollieren. Von den 47 getesteten Gram-negativen Rhizosphärenisolaten konnten nur bei einem reproduzierbar AHL-Moleküle mithilfe des Reporterstamms A. tumefaciens nachgewiesen werden. Der AHL-Produzent wurde als Pseudomonas fluorescens identifiziert. Mittels dünnschichtchromatographischer Analysen konnten die extrahierten bakteriellen AHL-Moleküle den N-Octanoyl-L-homoserinlactonen zugeordnet werden.

Phylogeographie und Populationsgenetik der Arten der Gattung Fosterella (Bromeliaceae) in den südamerikanischen Anden

Die tropischen Anden sind eines der artenreichsten Gebiete der Erde. Fast die Hälfte der 45.000 in diesem Gebiet vorkommenden Gefäßpflanzenarten sind in den Anden endemisch (Myers et al. 2000). Die Gattung Fosterella (Bromeliaceae) ist eine den Anden zugeordnete Pflanzengruppe, denn die meisten ihrer 31 Arten kommen in den Anden vor. Achtzehn Arten sind kleinräumige Endemiten. Fosterella hat damit Modellcharakter für diese Region. In der vorliegenden Arbeit wurde die Evolution der Gattung in Raum und Zeit mithilfe der vergleichenden Sequenzierung von sechs plastidären Loci (atpB-rbcL, matK, psbB-psbH, rpl32-trnL, rps16-trnK, rps16-Intron) und einem nukleären Marker (PHYC) untersucht. Es wurden über 90 Akzessionen von 24 Fosterella-Arten untersucht. Mit 5,6 % informativer Merkmale innerhalb der Gattung war rpl32-trnL der informativste Chloroplastenmarker. Es wurden mit den kombinierten Sequenzdaten eine Maximum Parsimony-, eine Maximum Likelihood- und eine Bayes´sche Analyse berechnet. Weiterhin wurden biogeographische und ultrametrische Untersuchungen durchgeführt. Die 6-Locus-Phylogenie zeigt eine Aufteilung der monophyletischen Gattung Fosterella in sechs Gruppen, von denen vier – die penduliflora-, weddelliana-, weberbaueri- und micrantha-Gruppe - klar monophyletisch und gut gestützt sind. Die albicans- und die rusbyi-Gruppe bilden hingegen einen Komplex. Ultrametrische Analysen legen ein Alter der Gattung von ca. 9,6 Mio. Jahren nahe. Der geographische Ursprung von Fosterella befindet sich nach den vorliegenden biogeographischen Analysen in den Anden und nach der Biom-Analyse zu gleicher Wahrscheinlichkeit entweder in andinen Trockenwäldern (seasonally dry tropical forests, SDTFs) oder in azonalen Standorten des amazonischen Tieflands östlich der Anden. Es gab mehrere Ausbreitungsereignisse, von denen die beiden Fernausbreitungsereignisse nach Mittelamerika (F. micrantha) und in das zentrale Amazonasgebiet (F. batistana) die auffälligsten sind. Die feuchten Bergregenwälder (Yungas) der Anden wurden offenbar mehrfach unabhängig von Fosterella-Arten besiedelt. Insgesamt wurden elf nukleäre Marker (XDH, GS, RPB2, MS, ADH, MS, GLO/PI, CHS, FLO/LFY, NIAi3 und PHYC) auf ihre Anwendbarkeit für molekularsystematische Studien in Fosterella getestet. Davon konnten acht Marker erfolgreich mithilfe einer PCR amplifiziert werden. Die Fragmentgrößen lagen zwischen 350 bp und 1.500 bp. Nur für drei Loci (FLO/LFY, NIAi3 und PHYC) konnten lesbare DNA-Sequenzen in Fosterella erzeugt werden. FLO/LFY zeigte nur 1,5 % Variabilität innerhalb der Gattung. Der NIA-Locus erzeugte bei der Amplifikation mehrere Fragmente, die separat voneinander sequenziert wurden. Der Locus PHYC konnte hingegen aufgrund der guten Amplifizier- und Sequenzierbarkeit für das gesamte Probenset sequenziert werden. Dieser Marker zeigte eine Variabilität innerhalb der Gattung von 10,2 %, davon waren 6,8 % informativ. In der Phylogenie basierend auf PHYC ist Fosterella klar monophyletisch, innerhalb der Gattung zeigt sich jedoch an der Basis eine unaufgelöste Polytomie. Es lassen sich neun mehr oder weniger gut gestützte Artengruppen definieren – rusbyi-, villosula-, albicans-, weddelliana-, penduliflora-, weberbaueri-, micrantha-, robertreadii- und spectabilis-Gruppe - die sich in ihrer Zusammensetzung mit Ausnahme der weddelliana-Gruppe von den nach Chloroplastendaten definierten Gruppen unterscheiden. Viele Arten sind para- oder polyphyletisch, so z. B. F. albicans, F. penduliflora und F. rusbyi. Bei den beiden erstgenannten Arten weisen die unterschiedlichen Stellungen in Chloroplasten- und Kernphylogenie auf Hybridisierungsereignisse hin.

Genotypic comparison of Pantoea agglomerans plant and clinical strains

Pantoea agglomerans strains are among the most promising biocontrol agents for a variety of bacterial and fungal plant diseases, particularly fire blight of apple and pear. However, commercial registration of P. agglomerans biocontrol products is hampered because this species is currently listed as a biosafety level 2 (BL2) organism due to clinical reports as an opportunistic human pathogen. This study compares plant-origin and clinical strains in a search for discriminating genotypic/phenotypic markers using multi-locus phylogenetic analysis and fluorescent amplified fragment length polymorphisms (fAFLP) fingerprinting. Results: Majority of the clinical isolates from culture collections were found to be improperly designated as P. agglomerans after sequence analysis. The frequent taxonomic rearrangements underwent by the Enterobacter agglomerans/Erwinia herbicola complex may be a major problem in assessing clinical associations within P. agglomerans. In the P. agglomerans sensu stricto (in the stricter sense) group, there was no discrete clustering of clinical/biocontrol strains and no marker was identified that was uniquely associated to clinical strains. A putative biocontrol-specific fAFLP marker was identified only in biocontrol strains. The partial ORF located in this band corresponded to an ABC transporter that was found in all P. agglomerans strains. Conclusion: Taxonomic mischaracterization was identified as a major problem with P. agglomerans, and current techniques removed a majority of clinical strains from this species. Although clear discrimination between P. agglomerans plant and clinical strains was not obtained with phylogenetic analysis, a single marker characteristic of biocontrol strains was identified which may be of use in strain biosafety determinations. In addition, the lack of Koch's postulate fulfilment, rare retention of clinical strains for subsequent confirmation, and the polymicrobial nature of P. agglomerans clinical reports should be considered in biosafety assessment of beneficial strains in this species

Anàlisi polifàsica de soques de "Pseudomonas fluorescens" potencials agents de biocontrol de malalties de fruiters

Molts bacteris del grup fluorescent del gènere Pseudomonas són capaços de controlar malalties de les plantes causades per fongs i bacteris fitopatògens (ACBs) o mostren activitat com a bacteris promotors del creixement de les plantes (BPCPs). S'han descrit diversos metabòlits que intervenen de manera important en la seva activitat com a ACBs i BPCPs entre els quals en destaquen el 2,4-diacetilfloroglucinol (Phl), àcid fenazin-1-carboxílic (PCA), Pirrolnitrina (Prn), àcid cianhídric (HCN), àcid 3-indolacètic (IAA), sideròfors i quitinases. L'objectiu principal del nostre treball ha estat la comparació de les característiques d'un grup de Pseudomonas del grup fluorescent utilitzant una aproximació polifàsica amb la finalitat d'establir possibles relacions entre algunes de les característiques i la capacitat d'actuar com a ACB o BPCP. Atesa la importància en el biocontrol de la producció de metabòlits com Phl, PCA i Prn, l'objectiu preliminar ha estat la recerca i obtenció de soques productores d'aquests metabòlits. Per assolir aquest objectiu s'ha emprat una aproximació molecular basada en la detecció dels gens biosintètics implicats en la seva producció en lloc de la detecció directa dels metabòlits per evitar els efectes que poden tenir les condicions de cultiu en la inducció o repressió de la seva síntesi. S'han realitzat diferents protocols basats (i) en la cerca assistida de productors mitjançant l'ús de marcadors fenotípics i posterior confirmació per PCR i, (ii) en l'ús de la PCR per a la detecció dels gens directament dels extractes bacterians, d'enriquiments d'aquests extractes i la realització de la hibridació en colònies per al posterior aïllament. La cerca assistida de productors de Phl mitjançant marcadors fenotípics i posteriorment la utilització de tècniques moleculars (amplificació per PCR del gen phlD), ha estat el millor mètode en el tipus de mostres processades en el nostre treball, on la proporció de productors és relativament baixa. En total s'han aïllat a partir de diversos ambients 4 soques portadores dels gens de la síntesi de PCA, 15 de Phl i 1 de Prn. S'ha constituït una col·lecció de 72 soques de Pseudomonas del grup fluorescent que inclou 18 aïllats propis portadors dels gens biosintètics necessaris per la producció de Phl PCA i Prn; 6 soques de referència procedents de col·leccions de cultius tipus, 14 soques productores dels diferents antibiòtics cedides per altres investigadors i una selecció de 34 soques procedents d'un treball previ realitzat en el nostre grup de recerca. A la col·lecció s'hi troben soques candidates a ACB i BPCP de diverses malalties i plantes. Les 72 soques s'han caracteritzat fenotípica i genotípicament. La caracterització fenotípica s'ha portat a terme mitjançant la identificació a nivell d'espècie amb galeries API 20NE i proves bioquímiques específiques; la producció de metabòlits com PCA, Phl, Prn, IAA, HCN, quitinases i sideròfors mitjançant l'ús de diferents tècniques; antagonisme in vitro en diversos medis enfront dos fongs (Stemphylium vesicarium i Penicillium expansum) i tres bacteris fitopatògens (Erwinia amylovora, Pseudomonas syringae pv. syringae i Xanthomonas arboricola pv. juglandis); l'eficàcia de la inhibició de la infecció en bioassaigs in vivo sobre material vegetal enfront els fongs P. expansum en poma i S. vesicarium en fulles de perera i enfront el bacteri E. amylovora en fruits immadurs de perera i, finalment, en assaigs de promoció de creixement en dos portaempelts comercials de Prunus. Cal destacar que P. expansum causa la podridura blava en pomes i peres en postcollita, S. vesicarium la taca bruna de la perera i E. amylovora el foc bacterià de les rosàcies. El nombre de soques de Pseudomonas, sobre el total de les 72 estudiades, productores d'IAA (4) i quitinases (6) és baix, mentre que és elevat en el cas del HCN (32), que a més està associat a la producció de Phl. Els resultats obtinguts en l'antagonisme in vitro han mostrat en el cas dels bacteris que és dependent del patogen indicador i del medi de cultiu. La presència o absència de ferro no sembla ser un factor que potencií l'antagonisme. En el cas dels fongs no s'ha observat però, influència del medi de cultiu emprat. En el total de 72 soques s'ha observat un percentatge baix de soques que manifesten antagonisme en tots els medis assajats vers 3 o 4 dels patògens (7). Solament 2 d'aquestes 7 soques han mostrat ser també efectives en bioassaigs d'inhibició de les infeccions causades per 2 dels 3 patògens assajats. Algunes de les soques efectives en els bioassaigs no són antagonistes in vitro en cap dels medis assajats enfront el mateix patogen. En el cas de la promoció del creixement, s'han observat més soques promotores del creixement del portaempelts de prunera Marianna 2624 que no en l'híbrid de presseguer-ametller GF677 i les eficàcies assolides són també majors en el cas de Marianna 2624, detectant una elevada especificitat soca/portaempelts La caracterització genotípica s'ha realitzat mitjançant l'anàlisi dels polimorfismes en la longitud dels fragments de restricció de DNA ribosomal (RFLP-rDNA) i l'anàlisi dels polimorfismes en la longitud dels fragments de macrorestricció genòmica de DNA cromosòmic separats per electroforesi en camp polsant (MRFLP-PFGE). Ambdues anàlisis van mostrar una gran heterogeneïtat genètica entre les soques caracteritzades i no s'ha pogut relacionar les agrupacions obtingudes amb les característiques fenotípiques o capacitat d'actuar com a ACB o BPCP. Els patrons de macrorestricció genòmica (MRFLP-PFGE) del bacteri model P. fluorescens EPS288 són estables en el temps i independents de les condicions de cultiu assajades al laboratori o en mostres naturals, mostrant ser una tècnica eficaç en la identificació de reaïllats de mostres naturals inoculades prèviament amb el bacteri. Una selecció de soques que comparteixen el fet de produir floroglucinol s'han caracteritzat mitjançant RFLP i seqüenciació del gen phlD. S'ha establert una relació entre les agrupacions obtingudes en les anàlisis RFLP-rDNA, RFLP-phlD i les seqüències del gen. En l'anàlisi filogenètica de les seqüències del gen phlD s'ha observat un elevat grau de polimorfisme obtenint-se 3 agrupacions principals. Les agrupacions semblen relacionar-se amb els patrons de producció de metabòlits (Phl, HCN i Prn en una primera agrupació; Phl i HCN en la segona i solament Phl en la tercera), però aquestes no s'han pogut relacionar amb l'origen geogràfic de les soques o la seva activitat com a ACBs i/o BPCP. Amb les dades obtingudes de la caracterització fenotípica i genotípica s'ha realitzat una anàlisi multivariant (correspondències, correlacions d'Spearman i de freqüències amb variables categòriques). S'ha demostrat la importància de disposar d'una tècnica que permeti depurar una col·lecció de soques descartant les soques genèticament idèntiques, ja que influeixen en els resultats de les anàlisis. Pels tres patògens assajats com a indicadors i els dos portaempelts emprats, no s'ha observat cap correlació entre la inhibició de la infecció o la promoció del creixement amb les característiques fenotípiques i genotípiques de les soques que fos significatiu i consistent en les tres tècniques emprades.

Characterization and mechanism of action of the biological control agent Pantoea agglomerans EPS125

La soca EPS125 ha mostrat ser un efectiu agent de control biològic de diferents patògens fúngics de postcollita en diferents fruits. Degut a la seva elevada eficàcia, es va plantejar desenvolupar aquesta soca comercialment i per aquest motiu en el present treball es plantejà complementar la informació necessària pel seu registre. D'acord amb els resultats obtinguts mitjançant proves fenotípiques i genotípiques, la soca EPS125 queda inclosa dins l'espècie Pantoea agglomerans (Enterobacter agglomerans-Erwinia herbicola). En relació a la utilització de fonts de carboni, en el perfil i contingut d'àcids grassos cel·lulars i en el polimorfisme en la longitud dels fragments de macrorestricció genòmica (MRFLP), la soca EPS125 mostrà trets característics que la diferencien d'altres soques. Els dos marcadors moleculars (125.2 i 125.3) específics per la soca EPS125 dissenyats en el present treball mostraren ser semiespecífics per la seva detecció mitjançant la tècnica PCR i Real Time PCR. Quedant pendent l'anàlisi d'especificitat de l'ús combinat dels dos marcadors moleculars en una reacció PCR multiplex. P. agglomerans EPS125 ha mostrat ser molt efectiva en el control de Penicillium expansum en poma amb una dosi efectiva mitjana de 2.7x105 a 7x105 ufc/ml, i una ratio de 25-101 cèl·lules de la soca EPS125 per inactivar una espora del patogen segons el model de saturació hiperbòlica. Segons les aproximacions fenotípiques i estudis genotípics realitzats, sembla que els mecanismes de biocontrol utilitzats per la soca EPS125 contra P. expansum en poma estan directament relacionats amb la capacitat de formació de biofilm per aquesta soca.

Suitability of cryopreservation for the long-term storage of rare and endangered plant species: a case history for Cosmos atrosanguineus

The suitability of cryopreservation for the secure, long-term storage of the rare and endangered species Cosmos atrosanguineus was investigated. Using encapsulation/dehydration of shoot tips in alginate strips, survival rates of up to 100 % and shoot regeneration of up to 35 % were achieved. Light and electron microscopy studies indicated that cellular damage to some regions of the shoot tip during the freeze/thaw procedure was high, although cell survival in and around the meristematic region allowed shoot tip regeneration. The genetic fingerprinting technique, amplified fragment length polymorphisms (AFLPs), showed that no detectable genetic variation was present between material of C. atrosanguineus at the time of initiation into tissue culture and that which had been cryopreserved, stored in liquid nitrogen for 12 months and regenerated. Wearied plantlets that were grown under glasshouse conditions exhibited no morphological variation from non-frozen controls. (C) 2003 Annals of Botany Company.

Genomic analysis of recombinant Sabin clinical isolates

Recombination in Poliovirus vaccine strains is a very frequent phenomenon. In this report 23 polio/Sabin strains isolated from healthy vaccinees or from VAPP patients after OPV administration, were investigated in order to identify recombination sites from 2C to 3D regions of the poliovirus genome. RT-PCR, followed by Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP) screening analysis were applied in four distant genomic regions (5' UTR, VP1, 2C and 3C-3D) in order to detect any putative recombinant. The detected recombinants were sequenced from 2C to the end of the genome (3' UTR) and the exact recombination sites were determined with computational analysis. Five of the 23 isolated strains were recombinant in one genomic region, two of them in 2C, isolates EP16:S3/S2, EP23:S3/S1, two in 3D isolates EP6:S2/S1, EP12:S2/S1 and one in 3A isolate EP9:S2/Sl. Point mutations were found in strains EP3, EP6, EP9 and EP12. Recombination specific types and sites re-occurrence along with point mutations are discussed concerning the polioviruses evolution.

Comparison of the euryarchaeal microbial community in guts and food-soil of the soil-feeding termite Cubitermes fungifaber across different soil types

Termites are an important component of tropical soil communities and have a significant affect on the structure and nutrient content of soil. Digestion in termites is related to gut structure, gut physico-chemical conditions and gut symbiotic microbiota. Here we describe the use of 16S rRNA gene sequencing and Terminal-restriction Fragment Length Polymorphism (T-RFLP) analysis to examine methanogenic Archaea (MA) in the guts and food-soil of the soil-feeder Cubitermes fungifaber Sjostedt across a range of soil types. If they are strictly vertically inherited, then MA in guts should be the same in all individuals even if the soils differ across sites. In contrast, gut MA should reflect what is present in soil if populations are merely a reflection of what is ingested as the insects forage. We show clear differences between the euryarchaeal communities in termite guts and in food-soils from five different sites. Analysis of 16S rRNA gene clones indicated little overlap between the gut and soil communities. Gut clones were related to a termite-derived Methanomicrobiales cluster, to Methanobrevibacter and, surprisingly, to the haloalkaliphile Natronococcus. Soil clones clustered with Methanosarcina, Methanomicrococcus or Rice Cluster I. T-RFLP analysis indicated that the archaeal communities in the soil samples differed from site to site, whereas those in termite guts were similar between sites. There was some overlap between the gut and soil communities but these may represent transient populations in either guts or soil. Our data does not support the hypothesis that termite gut MA are derived from their food soil but also does not support a purely vertical transmission of gut microflora.

Comparison of Euryarchaea strains in the guts and food-soil of the soil-feeding termite Cubitermes fungifaber across different soil types

Termites are an important component of tropical soil communities and have a significant effect on the structure and nutrient content of soil. Digestion in termites is related to gut structure, gut physicochemical conditions, and gut symbiotic microbiota. Here we describe the use of 16S rRNA gene sequencing and terminal-restriction fragment length polymorphism (T-RFLP) analysis to examine methanogenic archaea (MA) in the guts and food-soil of the soil-feeder Cubitermes fungifaber Sjostedt across a range of soil types. If these MA are strictly vertically inherited, then the MA in guts should be the same in all individuals even if the soils differ across sites. In contrast, gut MA should reflect what is present in soil if populations are merely a reflection of what is ingested as the insects forage. We show clear differences between the euryarchaeal communities in termite guts and in food-soils from five different sites. Analysis of 16S rRNA gene clones indicated little overlap between the gut and soil communities. Gut clones were related to a termite-derived Methanomicrobiales cluster, to Methanobrevibacter and, surprisingly, to the haloalkaliphile Natronococcus. Soil clones clustered with Methanosarcina, Methanomicrococcus, or rice cluster I. T-RFLP analysis indicated that the archaeal communities in the soil samples differed from site to site, whereas those in termite guts were similar between sites. There was some overlap between the gut and soil communities, but these may represent transient populations in either guts or soil. Our data do not support the hypothesis that termite gut MA are derived from their food-soil but also do not support a purely vertical transmission of gut microflora.