Cardiac gene expression and systemic cytokine profile are complementary in a murine model of post-ischemic heart failure

After myocardial infarction (MI), activation of the immune system and inflammatory mechanisms, among others, can lead to ventricular remodeling and heart failure (HF). The interaction between these systemic alterations and corresponding changes in the heart has not been extensively examined in the setting of chronic ischemia. The main purpose of this study was to investigate alterations in cardiac gene and systemic cytokine profile in mice with post-ischemic HF. Plasma was tested for IgM and IgG anti-heart reactive repertoire and inflammatory cytokines. Heart samples were assayed for gene expression by analyzing hybridization to AECOM 32k mouse microarrays. Ischemic HF significantly increased the levels of total serum IgM (by 5.2-fold) and total IgG (by 3.6-fold) associated with a relatively high content of anti-heart specificity. A comparable increase was observed in the levels of circulating pro-inflammatory cytokines such as IL-1β (3.8X) and TNF-α (6.0X). IFN-γ was also increased by 3.1-fold in the MI group. However, IL-4 and IL-10 were not significantly different between the MI and sham-operated groups. Chemokines such as MCP-1 and IL-8 were 1.4- and 13-fold increased, respectively, in the plasma of infarcted mice. We identified 2079 well annotated unigenes that were significantly regulated by post-ischemic HF. Complement activation and immune response were among the most up-regulated processes. Interestingly, 21 of the 101 quantified unigenes involved in the inflammatory response were significantly up-regulated and none were down-regulated. These data indicate that post-ischemic heart remodeling is accompanied by immune-mediated mechanisms that act both systemically and locally.

Plasma cytokine response, lipid peroxidation and NF-κB activation in skeletal muscle following maximum progressive swimming

Our objective was to determine lipid peroxidation and nuclear factor-κB (NF-κB) activation in skeletal muscle and the plasma cytokine profile following maximum progressive swimming. Adult male Swiss mice (N = 15) adapted to the aquatic environment were randomly divided into three groups: immediately after exercise (EX1), 3 h after exercise (EX2) and control. Animals from the exercising groups swam until exhaustion, with an initial workload of 2% of body mass attached to the tail. Control mice did not perform any exercise but were kept immersed in water for 20 min. Maximum swimming led to reactive oxygen species (ROS) generation in skeletal muscle, as indicated by increased thiobarbituric acid reactive species (TBARS) levels (4062.67 ±1487.10 vs 19,072.48 ± 8738.16 nmol malondialdehyde (MDA)/mg protein, control vs EX1). Exercise also promoted NF-κB activation in soleus muscle. Cytokine secretion following exercise was marked by increased plasma interleukin-6 (IL-6) levels 3 h post-exercise (P < 0.05). Interleukin-10 (IL-10) levels were reduced following exercise and remained reduced 3 h post-exercise (P < 0.05). Plasma levels of other cytokines investigated, monocyte chemotactic protein-1 (MCP-1), tumor necrosis factor-alpha (TNF-α), interferon-gamma (IFN-γ) and interleukin-12 (IL-12), were not altered by exercise. The present findings showed that maximum swimming, as well as other exercise models, led to lipid peroxidation and NF-κB activation in skeletal muscle and increased plasma IL-6 levels. The plasma cytokine response was also marked by reduced IL-10 levels. These results were attributed to exercise type and intensity.

Putative role of ischemic postconditioning in a rat model of limb ischemia and reperfusion: involvement of hypoxia-inducible factor-1α expression

Hypoxia-inducible factor-1α (HIF-1α) is one of the most potent angiogenic growth factors. It improves angiogenesis and tissue perfusion in ischemic skeletal muscle. In the present study, we tested the hypothesis that ischemic postconditioning is effective for salvaging ischemic skeletal muscle resulting from limb ischemia-reperfusion injury, and that the mechanism involves expression of HIF-1α. Wistar rats were randomly divided into three groups (n=36 each): sham-operated (group S), hindlimb ischemia-reperfusion (group IR), and ischemic postconditioning (group IPO). Each group was divided into subgroups (n=6) according to reperfusion time: immediate (0 h, T0), 1 h (T1), 3 h (T3), 6 h (T6), 12 h (T12), and 24 h (T24). In the IPO group, three cycles of 30-s reperfusion and 30-s femoral aortic reocclusion were carried out before reperfusion. At all reperfusion times (T0-T24), serum creatine kinase (CK) and lactate dehydrogenase (LDH) activities, as well as interleukin (IL)-6, IL-10, and tumor necrosis factor-α (TNF-α) concentrations, were measured in rats after they were killed. Histological and immunohistochemical methods were used to assess the skeletal muscle damage and HIF-1α expression in skeletal muscle ischemia. In groups IR and IPO, serum LDH and CK activities and TNF-α, IL-6, and IL-10 concentrations were all significantly increased compared to group S, and HIF-1α expression was up-regulated (P<0.05 or P<0.01). In group IPO, serum LDH and CK activities and TNF-α and IL-6 concentrations were significantly decreased, IL-10 concentration was increased, HlF-1α expression was down-regulated (P<0.05 or P<0.01), and the pathological changes were reduced compared to group IR. The present study suggests that ischemic postconditioning can reduce skeletal muscle damage caused by limb ischemia-reperfusion and that its mechanisms may be related to the involvement of HlF-1α in the limb ischemia-reperfusion injury-triggered inflammatory response.

Molecular patterns behind immunological and metabolic alterations in lysinuric protein intolerance

Lysinuric protein intolerance (LPI) is a recessively inherited disorder characterised by reduced plasma and increased urinary levels of cationic amino acids (CAAs), protein malnutrition, growth failure and hyperlipidemia. Some patients develop severe immunological, renal and pulmonary complications. All Finnish patients share the same LPIFin mutation in the SLC7A7 gene that encodes CAA transporter y+LAT1. The aim of this study was to examine molecular factors contributing to the various symptoms, systemic metabolic and lipid profiles, and innate immune responses in LPI. The transcriptomes, metabolomes and lipidomes were analysed in whole-blood cells and plasma using RNA microarrays and gas or liquid chromatography-mass spectrometry techniques, respectively. Toll-like receptor (TLR) signalling in monocyte-derived macrophages exposed to pathogens was scrutinised using qRT-PCR and the Luminex technology. Altered levels of transcripts participating in amino acid transport, immune responses, apoptosis and pathways of hepatic and renal metabolism were identified in the LPI whole-blood cells. The patients had increased non-essential amino acid, triacylglycerol and fatty acid levels, and decreased plasma levels of phosphatidylcholines and practically all essential amino acids. In addition, elevated plasma levels of eight metabolites, long-chain triacylglycerols, two chemoattractant chemokines and nitric oxide correlated with the reduced glomerular function in the patients with kidney disease. Accordingly, it can be hypothesised that the patients have increased autophagy, inflammation, oxidative stress and apoptosis, leading to hepatic steatosis, uremic toxicity and altered intestinal microbe metabolism. Furthermore, the LPI macrophages showed disruption in the TLR2/1, TLR4 and TLR9 pathways, suggesting innate immune dysfunctions with an excessive response to bacterial infections but a deficient viral DNA response.

Brain tumor and brain endothelial cells' response to ionizing radiation and phytochemical treatments

Le glioblastome multiforme (GBM) représente la tumeur cérébrale primaire la plus agressive et la plus vascularisée chez l’adulte. La survie médiane après le diagnostic est de moins d’un an en l’absence de traitement. Malheureusement, 90% des patients traités avec de la radiothérapie après la résection chirurgicale d’un GBM développent une récidive tumorale. Récemment, le traitement des GBM avec radiothérapie et témozolomide, un agent reconnu pour ses propriétés antiangiogéniques, a permis de prolonger la survie médiane à 14,6 mois. Des efforts sont déployés pour identifier des substances naturelles capables d’inhiber, de retarder ou de renverser le processus de carcinogenèse. Epigallocatechin-3-gallate (EGCG), un polyphénol retrouvé dans le thé vert, est reconnu pour ses propriétés anticancéreuses et antiangiogéniques. L’EGCG pourrait sensibiliser les cellules tumorales cérébrales et les cellules endothéliales dérivées des tumeurs aux traitements conventionnels. Le chapitre II décrit la première partie de ce projet de doctorat. Nous avons tenté de déterminer si l’EGCG pourrait sensibiliser la réponse des GBM à l’irradiation (IR) et si des marqueurs moléculaires spécifiques sont impliqués. Nous avons documenté que les cellules U-87 étaient relativement radiorésistantes et que Survivin, une protéine inhibitrice de l’apoptose, pourrait être impliquée dans la radiorésistance des GBM. Aussi, nous avons démontré que le pré-traitement des cellules U-87 avec de l’EGCG pourrait annuler l’effet cytoprotecteur d’une surexpression de Survivin et potentialiser l’effet cytoréducteur de l’IR. Au chapitre III, nous avons caractérisé l’impact de l’IR sur la survie de cellules endothéliales microvasculaires cérébrales humaines (HBMEC) et nous avons déterminé si l’EGCG pouvait optimiser cet effet. Bien que les traitements individuels avec l’EGCG et l’IR diminuaient la survie des HBMEC, le traitement combiné diminuait de façon synergique la survie cellulaire. Nous avons documenté que le traitement combiné augmentait la mort cellulaire, plus spécifiquement la nécrose. Au chapitre IV, nous avons investigué l’impact de l’IR sur les fonctions angiogéniques des HBMEC résistantes à l’IR, notamment la prolifération cellulaire, la migration cellulaire en présence de facteurs de croissance dérivés des tumeurs cérébrales, et la capacité de tubulogenèse. La voie de signalisation des Rho a aussi été étudiée en relation avec les propriétés angiogéniques des HBMEC radiorésistantes. Nos données suggèrent que l’IR altère significativement les propriétés angiogéniques des HBMEC. La réponse aux facteurs importants pour la croissance tumorale et l’angiogenèse ainsi que la tubulogenèse sont atténuées dans ces cellules. En conclusion, ce projet de doctorat confirme les propriétés cytoréductrices de l’IR sur les gliomes malins et propose un nouveau mécanisme pour expliquer la radiorésistance des GBM. Ce projet documente pour la première fois l’effet cytotoxique de l’IR sur les HBMEC. Aussi, ce projet reconnaît l’existence de HBMEC radiorésistantes et caractérise leurs fonctions angiogéniques altérées. La combinaison de molécules naturelles anticancéreuses et antiangiogéniques telles que l’EGCG avec de la radiothérapie pourrait améliorer l’effet de l’IR sur les cellules tumorales et sur les cellules endothéliales associées, possiblement en augmentant la mort cellulaire. Cette thèse supporte l’intégration de nutriments avec propriétés anticancéreuses et antiangiogéniques dans le traitement des gliomes malins pour sensibiliser les cellules tumorales et endothéliales aux traitements conventionnels.

Studies on the exaggerated inflammatory response caused by streptococcus suis at systemic and central nervous system levels

Streptococcus suis de type 2 est un microorganisme pathogène d’importance chez le porc. Il est la cause de différentes pathologies ayant comme caractéristique commune la méningite. C’est également un agent émergeant de zoonose : des cas cliniques humains ont récemment été rapportés en Asie. Cependant, la pathogénèse de S. suis n’est pas encore complètement élucidée. Jusqu’à présent, la réponse pro-inflammatoire initiée par S. suis n’a été étudiée qu’in vitro. L’étude du choc septique et de la méningite requiert toujours des modèles expérimentaux appropriés. Au cours de cette étude, nous avons développé un modèle in vivo d’infection chez la souris qui utilise la voie d’inoculation intra-péritonéale. Ce modèle a servi à l’étude de la réponse pro-inflammatoire associée à ce pathogène, tant au niveau systémique qu’au niveau du système nerveux central (SNC). Il nous a également permis de déterminer si la sensibilité aux infections à S. suis pouvait être influencée par des prédispositions génétiques de l’hôte. Le modèle d’infection par S. suis a été mis au point sur des souris de lignée CD1. Les résultats ont démontré une bactériémie élevée pendant les trois jours suivant l’infection. Celle-ci était accompagnée d’une libération rapide et importante de différentes cytokines pro-inflammatoires (TNF-α, IL-6, IL-12p40/p70, IFN-ɣ) et de chémokines (KC, MCP-1 and RANTES), qui ont entraîné un choc septique et la mort de 20 % des animaux. Ensuite, pour confirmer le rôle de l’inflammation sur la mortalité et pour déterminer si les caractéristiques génétiques de l’hôte pouvaient influencer la réponse inflammatoire et l’issue de la maladie, le modèle d’infection a été étendu à deux lignées murines consanguines différentes considérées comme résistante : la lignée C57BL/6 (B6), et sensible : la lignée A/J. Les résultats ont démontré une importante différence de sensibilité entre les souris A/J et les souris B6, avec un taux de mortalité atteignant 100 % à 20 h post-infection (p.i.) pour la première lignée et de seulement 16 % à 36 h p.i. pour la seconde. La quantité de bactéries dans le sang et dans les organes internes était similaire pour les deux lignées. Donc, tout comme dans la lignée CD1, la bactériémie ne semblait pas être liée à la mort des souris. La différence entre les taux de mortalité a été attribuée à un choc septique non contrôlé chez les souris A/J infectées par S. suis. Les souris A/J présentaient des taux exceptionnellement élevés de TNF-α, IL-12p40/p70, IL-1β and IFN- γ, significativement supérieurs à ceux retrouvés dans la lignée B6. Par contre, les niveaux de chémokines étaient similaires entre les lignées, ce qui suggère que leur influence est limitée dans le développement du choc septique dû à S. suis. Les souris B6 avaient une production plus élevée d’IL-10, une cytokine anti-inflammatoire, ce qui suppose que la cascade cytokinaire pro-inflammatoire était mieux contrôlée, entraînant un meilleur taux de survie. Le rôle bénéfique potentiel de l’IL-10 chez les souris infectées par S. suis a été confirmé par deux approches : d’une part en bloquant chez les souris B6 le récepteur cellulaire à l’IL-10 (IL-10R) par un anticorps monoclonal anti-IL-10R de souris et d’autre part en complémentant les souris A/J avec de l’IL-10 de souris recombinante. Les souris B6 ayant reçu le anticorps monoclonal anti-IL-10R avant d’être infectées par S. suis ont développé des signes cliniques aigus similaires à ceux observés chez les souris A/J, avec une mortalité rapide et élevée et des taux de TNF-α plus élevés que les souris infectées non traitées. Chez les souris A/J infectées par S. suis, le traitement avec l’IL-10 de souris recombinante a significativement retardé l’apparition du choc septique. Ces résultats montrent que la survie au choc septique dû à S. suis implique un contrôle très précis des mécanismes pro- et anti-inflammatoires et que la réponse anti-inflammatoire doit être activée simultanément ou très rapidement après le début de la réponse pro-inflammatoire. Grâce à ces expériences, nous avons donc fait un premier pas dans l’identification de gènes associés à la résistance envers S. suis chez l’hôte. Une des réussites les plus importantes du modèle d’infection de la souris décrit dans ce projet est le fait que les souris CD1 ayant survécu à la septicémie présentaient dès 4 jours p.i. des signes cliniques neurologiques clairs et un syndrome vestibulaire relativement similaires à ceux observés lors de méningite à S. suis chez le porc et chez l’homme. L’analyse par hybridation in situ combinée à de l’immunohistochimie des cerveaux des souris CD1 infectées a montré que la réponse inflammatoire du SNC débutait avec une augmentation significative de la transcription du Toll-like receptor (TLR)2 et du CD14 dans les microvaisseaux cérébraux et dans les plexus choroïdes, ce qui suggère que S. suis pourrait se servir de ces structures comme portes d’entrée vers le cerveau. Aussi, le NF-κB (suivi par le système rapporteur de l’activation transcriptionnelle de IκBα), le TNF-α, l’IL-1β et le MCP-1 ont été activés, principalement dans des cellules identifiées comme de la microglie et dans une moindre mesure comme des astrocytes. Cette activation a également été observée dans différentes structures du cerveau, principalement le cortex cérébral, le corps calleux, l’hippocampe, les plexus choroïdes, le thalamus, l’hypothalamus et les méninges. Partout, cette réaction pro-inflammatoire était accompagnée de zones extensives d’inflammation et de nécrose, de démyélinisation sévère et de la présence d’antigènes de S. suis dans la microglie. Nous avons mené ensuite des études in vitro pour mieux comprendre l’interaction entre S. suis et la microglie. Pour cela, nous avons infecté des cellules microgliales de souris avec la souche sauvage virulente (WT) de S. suis, ainsi qu’avec deux mutants isogéniques, un pour la capsule (CPS) et un autre pour la production d’hémolysine (suilysine). Nos résultats ont montré que la capsule était un important mécanisme de résistance à la phagocytose pour S. suis et qu’elle modulait la réponse inflammatoire, en dissimulant les composants pro-inflammatoires de la paroi bactérienne. Par contre, l’absence d’hémolysine, qui est un facteur cytotoxique potentiel, n’a pas eu d’impact majeur sur l’interaction de S. suis avec la microglie. Ces études sur les cellules microgliales ont permis de confirmer les résultats obtenus précédemment in vivo. La souche WT a induit une régulation à la hausse du TLR2 ainsi que la production de plusieurs médiateurs pro-inflammatoires, dont le TNF-α et le MCP-1. S. suis a induit la translocation du NF-kB. Cet effet était plus rapide dans les cellules stimulées par le mutant déficient en CPS, ce qui suggère que les composants de la paroi cellulaire représentent de puissants inducteurs du NF-kB. De plus, la souche S. suis WT a stimulé l’expression de la phosphotyrosine, de la PKC et de différentes cascades liées à l’enzyme mitogen-activated protein kinase (MAPK). Cependant, les cellules microgliales infectées par le mutant déficient en CPS ont montré des profils de phosphorylation plus forts et plus soutenus que celles infectées par le WT. Finalement, la capsule a aussi modulé l’expression de l’oxyde nitrique synthétase inductible (iNOS) induite par S. suis et par la production subséquente d’oxyde nitrique par la microglie. Ceci pourrait être lié in vivo à la neurotoxicité et à la vasodilatation. Nous pensons que ces résultats contribueront à une meilleure compréhension des mécanismes sous-tendant l’induction de l’inflammation par S. suis, ce qui devrait permettre, d’établir éventuellement des stratégies plus efficaces de lutte contre la septicémie et la méningite. Enfin, nous pensons que ce modèle expérimental d’infection chez la souris pourra être utilisé dans l’étude de la pathogénèse d’autres bactéries ayant le SNC pour cible.

Rôles des kinases IKK et IKK-related dans les maladies inflammatoires chroniques : implications dans l’athérosclérose et la réponse hypoxique

L’inflammation est un procédé complexe qui vise l’élimination de l’agent causal de dommages tissulaires en vue de faciliter la réparation du tissu affecté. La persistance de l’agent causal ou l’incapacité à résoudre l’inflammation mène à un dérèglement homéostatique chronique qui peut avoir une incidence sur la morbidité et la mortalité. L’athérosclérose est une condition inflammatoire chronique des vaisseaux sanguins dont l’origine est multifactorielle. L’hypertension et l’état infectieux représentent respectivement des facteurs de risque classiques et émergents du développement de cette maladie. Les fondements initiaux de l’inflammation font intervenir l’immunité innée, la première ligne de défense dont disposent les cellules pour répondre à un signal de danger. Le but de cette thèse est d’examiner le rôle pro-inflammatoire d’une famille de kinases essentielles à l’immunité innée, soit celle des kinases de IkappaB (IKK) et des kinases IKK-related. Les kinases IKKalpha et IKKbeta forment le complexe IKK avec la molécule adaptatrice NEMO/IKKgamma. Ce complexe est chargé d’effectuer la phosphorylation de l’inhibiteur de NF-kappaB, IkappaBalpha, ce qui mène à sa dégradation et à la libération du facteur de transcription NF-kappaB. Nous montrons que le peptide vasoactif angiotensine II (AngII) induit l’activité phosphotransférase d’IKKbeta dans les VSMC par immunoprécipitation de NEMO puis essai kinase in vitro. Grâce à une approche ARN interférence (ARNi) dirigée contre IKK, nous montrons que cette kinase est responsable de la phosphorylation de p65/RelA. Nous montrons que le mécanisme d’induction de NF-kappaB par l’AngII est atypique, puisqu’il ne module pas IkappaBalpha, et montrons à l’aide d’inhibiteurs pharmacologiques que l’activation de p65 est indépendante des voies MEK-ERK-RSK, PI3K et de la transactivation du récepteur de l’EGF. Les kinases IKK-related Tank-binding kinase 1 (TBK1) et IKK-i sont quant à elles principalement activées suite à une infection bactérienne ou virale. Ces kinases phosphorylent directement le facteur de transcription interferon regulatory factor (IRF)-3. Nous montrons que le cytomégalovirus humain, un pathogène associé à l’athérosclérose, a la capacité d’induire l’activation de TBK1 dans les VSMC. L’usage d’ARNi dirigé contre TBK1 et IKKi montre que les 2 kinases sont impliquées dans l’activation d’IRF-3. De plus, nous montrons à l’aide d’une lignée de VSMC exprimant une version dominante négative d’IRF-3 que ce dernier est essentiel à la synthèse des chimiokines RANTES et IP-10, tel qu’analysé par RT-PCR. Par ailleurs, il a récemment été montré que les kinases IKK-related étaient étroitement liées à la transformation oncogénique, et que TBK1 était pro-angiogénique. Or, l’angiogenèse est le plus souvent modulée par la réponse hypoxique qui est d’ailleurs commune à la majorité des processus inflammatoires. Le facteur de transcription hypoxia inducible factor (HIF)-1 module l’angiogenèse, l’inflammation et la survie cellulaire. Nous montrons à l’aide de cellules Tbk1 et Ikbke -/- et d’une approche lentivirale que TBK1 est spécifiquement impliquée dans l’induction traductionnelle de HIF-1alpha en condition de stress hypoxique. L’expression de TBK1 est induite sous ces conditions, et cette kinase module la phosphorylation de ERK, RSK, Akt et TSC1. Les résultats originaux présentés dans cette thèse montrent donc que les kinases IKK et IKK-related exercent leurs actions pro-inflammatoires par des mécanismes distincts.

Recognition of hepatitis C virus RNA by toll like receptors 7 and 8 : implications for the initiation of innate immune response

Le virus de l’hépatite C (VHC) est un virus à ARN simple brin positif (ssARN) qui se replique dans le foie. Deux cents millions de personnes sont infectées par le virus dans le monde et environ 80% d’entre elles progresseront vers un stade chronique de l’infection. Les thérapies anti-virales actuelles comme l’interféron (IFN) ou la ribavirin sont de plus en plus utilisées mais ne sont efficaces que dans la moitié des individus traités et sont souvent accompagnées d’une toxicité ou d’effets secondaires indésirables. Le système immunitaire inné est essentiel au contrôle des infections virales. Les réponses immunitaires innées sont activées suite à la reconnaissance par les Pathogen Recognition Receptors (PRRs), de motifs macromoléculaires dérivés du virus appelés Pathogen-Associated Molecular Patterns (PAMPs). Bien que l'activation du système immunitaire par l'ARN ou les protéines du VHC ait été largement étudiée, très peu de choses sont actuellement connues concernant la détection du virus par le système immunitaire inné. Et même si l’on peut très rapidement déceler des réponses immunes in vivo après infection par le VHC, l’augmentation progressive et continue de la charge virale met en évidence une incapacité du système immunitaire à contrôler l’infection virale. Une meilleure compréhension des mécanismes d’activation du système immunitaire par le VHC semble, par conséquent, essentielle au développement de stratégies antivirales plus efficaces. Dans le présent travail nous montrons, dans un modèle de cellule primaire, que le génome ARN du VHC contient des séquences riches en GU capables de stimuler spécifiquement les récepteurs de type Toll (TLR) 7 et 8. Cette stimulation a pour conséquence la maturation des cellules dendritiques plasmacytoïdes (pDCs), le production d’interféron de type I (IFN) ainsi que l’induction de chémokines et cytokines inflammatoires par les différentes types de cellules présentatrices d’antigènes (APCs). Les cytokines produites après stimulation de monocytes ou de pDCs par ces séquences ssARN virales, inhibent la production du virus de façon dépendante de l’IFN. En revanche, les cytokines produites après stimulation de cellules dendritiques myéloïdes (mDCs) ou de macrophages par ces mêmes séquences n’ont pas d’effet inhibiteur sur la production virale car les séquences ssARN virales n’induisent pas la production d’IFN par ces cellules. Les cytokines produites après stimulation des TLR 7/8 ont également pour effet de diminuer, de façon indépendante de l’IFN, l’expression du récepteur au VHC (CD81) sur la lignée cellulaire Huh7.5, ce qui pourrait avoir pour conséquence de restreindre l’infection par le VHC. Quoiqu’il en soit, même si les récepteurs au VHC comme le CD81 sont largement exprimés à la surface de différentes sous populations lymphocytaires, les DCs et les monocytes ne répondent pas aux VHC, Nos résultats indiquent que seuls les macrophages sont capables de reconnaître le VHC et de produire des cytokines inflammatoires en réponse à ce dernier. La reconnaissance du VHC par les macrophages est liée à l’expression membranaire de DC-SIGN et l’engagement des TLR 7/8 qui en résulte. Comme d’autres agonistes du TLR 7/8, le VHC stimule la production de cytokines inflammatoires (TNF-α, IL-8, IL-6 et IL-1b) mais n’induit pas la production d’interféron-beta par les macrophages. De manière attendue, la production de cytokines par des macrophages stimulés par les ligands du TLR 7/8 ou les séquences ssARN virales n’inhibent pas la réplication virale. Nos résultats mettent en évidence la capacité des séquences ssARN dérivées du VHC à stimuler les TLR 7/8 dans différentes populations de DC et à initier une réponse immunitaire innée qui aboutit à la suppression de la réplication virale de façon dépendante de l’IFN. Quoiqu’il en soit, le VHC est capable d’échapper à sa reconnaissance par les monocytes et les DCs qui ont le potentiel pour produire de l’IFN et inhiber la réplication virale après engagement des TLR 7/8. Les macrophages possèdent quant à eux la capacité de reconnaître le VHC grâce en partie à l’expression de DC-SIGN à leur surface, mais n’inhibent pas la réplication du virus car ils ne produisent pas d’IFN. L’échappement du VHC aux défenses antivirales pourrait ainsi expliquer l’échec du système immunitaire inné à contrôler l’infection par le VHC. De plus, la production de cytokines inflammatoires observée après stimulation in vitro des macrophages par le VHC suggère leur potentielle contribution dans l’inflammation que l’on retrouve chez les individus infectés par le VHC.

Transcriptional approach to study porcine tracheal epithelial cells individually or dually infected with swine influenza virus and Streptococcus suis

Background: Swine influenza is a highly contagious viral infection in pigs affecting the respiratory tract that can have significant economic impacts. Streptococcus suis serotype 2 is one of the most important post-weaning bacterial pathogens in swine causing different infections, including pneumonia. Both pathogens are important contributors to the porcine respiratory disease complex. Outbreaks of swine influenza virus with a significant level of co-infections due to S. suis have lately been reported. In order to analyze, for the first time, the transcriptional host response of swine tracheal epithelial (NPTr) cells to H1N1 swine influenza virus (swH1N1) infection, S. suis serotype 2 infection and a dual infection, we carried out a comprehensive gene expression profiling using a microarray approach. Results: Gene clustering showed that the swH1N1 and swH1N1/S. suis infections modified the expression of genes in a similar manner. Additionally, infection of NPTr cells by S. suis alone resulted in fewer differentially expressed genes compared to mock-infected cells. However, some important genes coding for inflammatory mediators such as chemokines, interleukins, cell adhesion molecules, and eicosanoids were significantly upregulated in the presence of both pathogens compared to infection with each pathogen individually. This synergy may be the consequence, at least in part, of an increased bacterial adhesion/invasion of epithelial cells previously infected by swH1N1, as recently reported. Conclusion: Influenza virus would replicate in the respiratory epithelium and induce an inflammatory infiltrate comprised of mononuclear cells and neutrophils. In a co-infection situation, although these cells would be unable to phagocyte and kill S. suis, they are highly activated by this pathogen. S. suis is not considered a primary pulmonary pathogen, but an exacerbated production of proinflammatory mediators during a co-infection with influenza virus may be important in the pathogenesis and clinical outcome of S. suis-induced respiratory diseases.

CXCR3 biased signaling, heteromerization and decoy properties

Le récepteur de chimiokine CXCR3 est un récepteur couplé à la protéine G (RCPG) exprimé, entre autre, sur les cellules T activées lors d’une réponse immune. CXCR3 est activé par trois ligands inductibles par l’interféron-γ (CXCL9, 10, 11) et, plus récemment, il a été découvert que CXCL4 liait CXCR3. Nous savons que CXCR3 joue un rôle dans la chimiotaxie des leucocytes, mais peu d’attention a été portée sur la signalisation biaisée induite par ces quatre ligands. Alors que l’homodimérisation entre récepteurs de chimiokine est un concept grandement observé, l’hétéromérisation entre deux récepteurs reste un domaine de recherche active. La signalisation biaisée et l’hétéromérisation ont été testées grâce à la technique de bioluminescene resonance energy transfer (BRET) dans des cellules HEK293E. Nous présentons une caractérisation pharmacologique des quatre ligands de CXCR3 et démontrons l’hétéromérisation de CXCR3 avec CXCR4 et avec CXCR7. Nos résultats suggèrent que les ligands de CXCR3 n’agissent pas de manière redondante.

Modeling chemotaxis reveals the role of reversed phosphotransfer and a bi-functional kinase-phosphatase

Understanding how multiple signals are integrated in living cells to produce a balanced response is a major challenge in biology. Two-component signal transduction pathways, such as bacterial chemotaxis, comprise histidine protein kinases (HPKs) and response regulators (RRs). These are used to sense and respond to changes in the environment. Rhodobacter sphaeroides has a complex chemosensory network with two signaling clusters, each containing a HPK, CheA. Here we demonstrate, using a mathematical model, how the outputs of the two signaling clusters may be integrated. We use our mathematical model supported by experimental data to predict that: (1) the main RR controlling flagellar rotation, CheY6, aided by its specific phosphatase, the bifunctional kinase CheA3, acts as a phosphate sink for the other RRs; and (2) a phosphorelay pathway involving CheB2 connects the cytoplasmic cluster kinase CheA3 with the polar localised kinase CheA2, and allows CheA3-P to phosphorylate non-cognate chemotaxis RRs. These two mechanisms enable the bifunctional kinase/phosphatase activity of CheA3 to integrate and tune the sensory output of each signaling cluster to produce a balanced response. The signal integration mechanisms identified here may be widely used by other bacteria, since like R. sphaeroides, over 50% of chemotactic bacteria have multiple cheA homologues and need to integrate signals from different sources.

Diverse signalling by different chemokines through the chemokine receptor CCR5

We have investigated the signalling properties of the chemokine receptor, CCR5, using several assays for agonism: stimulation of changes in intracellular Ca2+ or CCR5 internalisation in CHO cells expressing CCR5 or stimulation of [S-35]GTP gamma S binding in membranes of CHO cells expressing CCR5. Four isoforms of the chemokine CCL3 with different amino termini (CCL3, CCL3(2-70), CCL3(5-70), CCL3L1) were tested in these assays in order to probe structure/activity relationships. Each isoform exhibited agonism. The pattern of agonism (potency, maximal effect) was different in the three assays, although the rank order was the same with CCL3L1 being the most potent and efficacious. The data show that the amino terminus of the chemokine is important for signalling. A proline at position 2 (CCL3L1) provides for high potency and efficacy but the isoform with a serine at position 2 (CCL3(2-70)) is as efficacious in some assays showing that the proline is not the only determinant of high efficacy. We also increased the sensitivity of CCR5 signalling by treating cells with sodium butyrate, thus increasing the receptor/G protein ratio. This allowed the detection of a change in intracellular Ca2+ after treatment with CCL7 and Met-RANTES showing that these ligands possess measurable but low efficacy. This study therefore shows that sodium butyrate treatment increases the sensitivity of signalling assays and enables the detection of efficacy in ligands previously considered as antagonists. The use of different assay systems, therefore, provides different estimates of efficacy for some ligands at this receptor. (c) 2006 Elsevier Inc. All rights reserved.

Mechanisms of internalization and recycling of the chemokine receptor, CCR5

CCR5 is a G protein-coupled receptor that binds several natural chemokines but it is also a coreceptor for the entry of M tropic strains of HIV-1 into cells. Levels of CCR5 on the cell surface are important for the rate of HIV-1 infection and are determined by a number of factors including the rates of CCR5 internalization and recycling. Here we investigated the involvement of the actin cytoskeleton in the control of ligand-induced internalization and recycling of CCR5. Cytochalasin D, an actin depolymerizing agent, inhibited chemokine-induced internalization of CCR5 and recycling of the receptor in stably transfected CHO cells and in the monocytic cell line, THP-1. CCR5 internalization and recycling were inhibited by Toxin B and C-3 exoenzyme treatment in CHO and THP-1 cells, confirming activation of members of the RhoGTPase family by CCR5. The specific Rho kinase inhibitor Y27632, however, had no effect on CCR5 internalization or recycling. Ligand-induced activation of CCR5 leads to Rho kinase-dependent formation of focal adhesion complexes. These data indicate that CCR5 internalization and recycling are regulated by actin polymerization and activation of small G proteins in a Rho-dependent manner.

Age-related increases in circulating inflammatory markers in men are independent of BMI, blood pressure and blood lipid concentrations

Objective: To examine whether age-related increase in concentrations of circulating inflammatory mediators is due to concurrent increases in cardiovascular risk factors or is independent of these. Methods and results: Cytokines (IL-6, IL-18), chemokines (6Ckine, MCP-1, IP-10), soluble adhesion molecules (sICAM-1, sVCAM-1, sE-selectin) and adipokines (adiponectin) were measured in the plasma of healthy male subjects aged 18-84 years (n = 162). These were related to known cardiovascular risk factors (age, BMI, systolic and diastolic blood pressure, plasma total cholesterol, LDL cholesterol, HDL cholesterol and triacylglycerol concentrations) in order to identify significant associations. Plasma concentrations of sVCAM-1, sE-selectin, IL-6, IL-18, MCP-1, 6Ckine, IP-10 and adiponectin, but not sICAM-1, were significantly positively correlated with age, as well as with several other cardiovascular risk factors. The correlations with other risk factors disappeared when age was controlled for. In contrast, the correlations with age remained significant for sVCAM-1, IL-6, MCP-1, 6Ckine and IP-10 when other cardiovascular risk factors were controlled for. Conclusions: Plasma concentrations of some inflammatory markers (sVCAM-1, IL-6, MCP-L 6Ckine, IP-10) are positively correlated with age, independent of other cardiovascular risk factors. This suggests that age-related inflammation may not be driven by recognised risk factors. (C) 2006 Elsevier Ireland Ltd. All rights reserved.

Genistein affects the expression of genes involved in blood pressure regulation and angiogenesis in primary human endothelial cells

Background: Several lines of evidence suggest that the dietary isoflavone genistein (Gen) has beneficial effects with regard to cardiovascular disease and in particular on aspects related to blood pressure and angiogenesis. The biological action of Gen may be, at Least in part, attributed to its ability to affect cell signalling and response. However, so far, most of the molecular mechanisms underlying the activity of Gen in the endothelium are unknown. Methods and results: To examine the transcriptional response to 2.5 mu M Gen on primary human endothelial cells (HUVEC), we applied cDNA array technology both under baseline condition and after treatment with the pro-atherogenic stimulus, copper-oxidized LDL. The alteration of the expression patterns of individual transcripts was substantiated using either RT-PCR or Northern blotting. Gen significantly affected the expression of genes encoding for proteins centrally involved in the vascular tone such as endothelin-converting enzyme-1, endothetin-2, estrogen related receptor a and atria[ natriuretic peptide receptor A precursor. Furthermore, Gen countered the effect of oxLDL on mRNA levels encoding for vascular endothelial growth factor receptor 165, types 1 and 2. Conclusions: Our data indicate that physiologically achievable levels of Gen change the expression of mRNA encoding for proteins involved in the control of blood pressure under baseline conditions and reduce the angiogenic response to oxLDL in the endothelium. (c) 2005 Elsevier B.V. All rights reserved.