Effects of chronic ethanol treatment on monoamine levels in rat hippocampus and striatum

We studied the effects of ethanol on concentrations of noradrenaline (NE), dopamine (DA) and serotonin (5-HT) and their metabolites in rat hippocampus and striatum. Ethanol (2 or 4 g/kg, po, from a 20% aqueous solution) was administered daily to male Wistar rats (4-13 per group) for 30 days and animals were sacrificed 30 min or 48 h after the last administration. Monoamines were measured by HPLC and considered significant at P < 0.05. A 47% increase in 5-HT levels was observed in the hippocampus with 4 g/kg ethanol in the 30-min protocol. Ethanol (2 and 4 g/kg) decreased DA (2114.5 ± 126.4 and 1785.1 ± 234.2 ng/g wet tissue, respectively) and 3,4-dihydroxyphenylacetic acid (DOPAC, 1477.6 ± 132.1 and 1218.8 ± 271.7 ng/g wet tissue, respectively) levels, while the higher dose also decreased NE (159.8 ± 13.5), 5-HT (228.0 ± 46.8) and 5-hydroxy-3-indoleacetic acid (5-HIAA, 304.4 ± 37.2 ng/g wet tissue), in the striatum after a 48-h withdrawal as compared to controls (DA: 3063.9 ± 321.3; DOPAC: 2379.6 ± 256.0; NE: 292.8 ± 50.2; 5-HT: 412.4 ± 36.2; 5-HIAA: 703.9 ± 61.4 ng/g wet tissue). In the 30-min protocol, ethanol (2 or 4 g/kg) decreased striatal NE (66 and 70%) and DA (50 and 36%) levels. On the other hand, increases were seen in 5-HIAA (146 and 153%) and 5-HT (59 and 86%) levels. Ethanol (2 g/kg, po) increased the homovanillic acid (HVA)/DA ratio (129%) in the striatum in the 30-min protocol, while at the higher dose it increased the HVA/DA ratio in the 48-h protocol (61%). These results indicate alterations in monoamines, mainly in the striatum, after chronic ethanol, which are influenced by dose and by the length of time after the last drug administration.

Curcumin induces human HT-29 colon adenocarcinoma cell apoptosis by activating p53 and regulating apoptosis-related protein expression

Curcumin, a major yellow pigment and active component of turmeric, has multiple anti-cancer properties. However, its molecular targets and mechanisms of action on human colon adenocarcinoma cells are unknown. In the present study, we examined the effects of curcumin on the proliferation of human colon adenocarcinoma HT-29 cells by the 3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyltetrazolium bromide method and confirmed the curcumin-induced apoptosis by morphology and DNA ladder formation. At the same time, p53, phospho-p53 (Ser15), and other apoptosis-related proteins such as Bax, Bcl-2, Bcl-xL, pro-caspase-3, and pro-caspase-9 were determined by Western blot analysis. The colon adenocarcinoma cells were treated with curcumin (0-75 µM) for 0-24 h. We observed that p53 was highly expressed in HT-29 cells and curcumin could up-regulate the serine phosphorylation of p53 in a time- and concentration-dependent manner. An increase in expression of the pro-apoptotic factor Bax and a decrease in expression of the anti-apoptotic factor Bcl-2 were also observed in a time-dependent manner after exposure of 50 µM curcumin, while the expression of the anti-apoptotic factor Bcl-xL was unchanged. Curcumin could also down-regulate the expression of pro-caspase-3 and pro-caspase-9 in a time-dependent manner. These data suggest a possible underlying molecular mechanism whereby curcumin could induce the apoptosis signaling pathway in human HT-29 colon adenocarcinoma cells by p53 activation and by the regulation of apoptosis-related proteins. This property of curcumin suggests that it could have a possible therapeutic potential in colon adenocarcinoma patients.

Effect of 5-HT1B receptor agonists injected into the prefrontal cortex on maternal aggression in rats

Serotonin (5-HT1B) receptors play an essential role in the inhibition of aggressive behavior in rodents. CP-94,253, a 5-HT1B receptor agonist, can reduce aggression in male mice when administered directly into the ventro-orbitofrontal (VO) prefrontal cortex (PFC). The objective of the current study was to assess the effects of two selective 5-HT1B receptor agonists (CP-94,253 and CP-93,129), microinjected into the VO PFC, on maternal aggressive behavior after social instigation in rats. CP-94,253 (0.56 µg/0.2 µL, N = 8, and 1.0 µg/0.2 µL, N = 8) or CP-93,129 (1.0 µg/0.2 µL, N = 9) was microinjected into the VO PFC of Wistar rats on the 9th day postpartum and 15 min thereafter the aggressive behavior by the resident female against a male intruder was recorded for 10 min. The frequency and duration of aggressive and non-aggressive behaviors were analyzed using ANOVA and post hoc tests. CP-93,129 significantly decreased maternal aggression. The frequency of lateral attacks, bites and pinnings was reduced compared to control, while the non-aggressive behaviors and maternal care were largely unaffected by this treatment. CP-94,253 had no significant effects on aggressive or non-aggressive behaviors when microinjected into the same area of female rats. CP-93,129, a specific 5-HT1B receptor agonist, administered into the VO PFC reduced maternal aggressive behavior, while the CP-94,253 agonist did not significantly affect this behavior after social instigation in female rats. We conclude that only the 5-HT1B receptor agonist CP-93,129 administered into the VO PFC decreased aggression in female rats postpartum after social instigation.

Funktionaalisuus ja formaalisuus suomi toisena kielenä -opetuksessa. Opettajien ja opiskelijoiden haastattelukyselyn ja opiskelijoiden testitehtävän analyysi

Pro gradu -tutkielmani käsittelee funktionaalisuutta ja formaalisuutta suomi toisena kielenä -opetuksessa. Tutkimus on kvalitatiivis-kvantitatiivinen analyysi, ja se koostuu kolmesta eri osasta: S2-opettajien haastattelun tuloksista, S2-oppijoiden haastattelun tuloksista ja S2-oppijoiden tekemän oppimistuloksia mittaavan testitehtävän tuloksista. S2-opettajien haastattelu kartoittaa sitä, missä määrin vastaajat käyttävät suomi toisena kielenä -opetuksessa formaalisen ja funktionaalisen kielenopetuksen menetelmiä sekä sitä, missä määrin nämä menetelmät vastaavat opettajien edustamaa opetusnäkemystä. Tutkimukseen osallistui 30 S2-opettajaa eri puolilta Suomea ja ulkomailta. S2-oppijoiden haastattelussa analysoin sitä, toivovatko vastaajat saavansa ennemmin formaalista vai funktionaalista S2-opetusta ja miten heidän aiemmat kokemuksensa S2-opetuksesta suhteutuvat näiden lähestymistapojen periaatteisiin. Lisäksi opiskelijoiden tuli arvioida omaa rooliaan oppijoina funktionaalisuuden ja formaalisuuden näkökulmasta. S2-oppijoiden testitehtävän analyysissä puolestaan vertailen opiskelijoiden oppimistuloksia prolatiivin reseptiivisessä ja produktiivisessa hallinnassa sen jälkeen, kun he ovat tutustuneet joko formaaliseen tai funktionaaliseen itseopiskelumateriaaliin. Haastatteluun ja testitehtävän tekoon osallistui 22 S2-oppijaa. Kaikki aineisto on kerätty keväällä 2010. Haastattelukyselyn tuloksista käy ilmi, että vastaajien näkemykset S2-opetuksen lähestymistapojen toimivuudesta ovat monipuolisesti sekä funktionaalisen että formaalisen suuntauksen mukaisia. Opettajien haastatteluvastauksissa painottuu opetuksen funktionaalisuus hieman enemmän kuin formaalisuus, ja suurin osa (60 %) opettajista vastasi myös eksplisiittisesti olevansa ennemmin funktionaalisen kuin formaalisen opetusnäkemyksen edustaja. Opiskelijoiden kohdalla haastattelukyselyn tulokset osoittavat, että he arvostavat opetuksessa yhtä lailla sekä funktionaalisia että formaalisia menetelmiä ja sisältöjä, kenties jopa formaalista lähestymistapaa suosien. Funktionaalisen ja formaalisen testitehtävän tulokset osoittavat, että formaalisen itseopiskelumateriaalin saanut ryhmä selvisi aukko- ja lauseselitystehtävästä huomattavasti paremmin. Tämä voi kertoa formaalisen lähestymistavan eduista rakenneasioita opetettaessa. Toisaalta funktionaalisen materiaalin saanut ryhmä osoitti kuitenkin prolatiivin hyvää reseptiivistä hallintaa itseopiskelumateriaalin yhteydessä olleissa alustavissa tehtävissä. Testissä ei myöskään tutkittu sitä, onko lähestymistapojen välillä eroa prolatiivin hallinnassa pitkällä aikavälillä.

Kuusamon keskustan liikennejärjestelyjen ja ympäristön kehittämissuunnitelma

Laaditussa kehittämissuunnitelmassa keskeisimpänä suunnittelukohteena on ollut Kitkantien ydinjakso välillä Ouluntaival - Vienantie sekä Kelantien ja Kitkantien risteysalueen läheisyyteen sijoittuva aukio. Ydinjaksolle on tutkittu kolmea eri vaihtoehtoa väylän poikkileikkauksen, autoliikenteen, kevyen liikenteen, pysäköinnin ja ympäristön osalta. Liikennevalo-ohjatun pääliittymän kohdalle Kitkantien ja Ouluntaipaleen liittymässä on tutkittu vaihtoehtona kiertoliittymää. Viereisen aukion kohdalle on tutkittu kahta ympäristön kehittämisvaihtoehtoa. Kelantielle on tutkittu linja-autojen päätepysäkkijärjestelyistä kaksi vaihtoehtoa. Kitkantien jatkeelle, välille Vienantie - Kaarlo Hännisentie, on tutkittu kahta liikennejärjestelyvaihtoehtoa väylän poikkileikkauksen, autopysäköinnin ja ympäristön osalta. Kitkantien pohjoisosalle, välille Kaarlo Hännisentien - valtatie 5, on tutkittu kahta liikennejärjestelyvaihtoehtoa. Ouluntaipaleelle, välille Oulangantie - Kitkantie, on suunniteltu pääasiassa liikenneturvallisuutta parantavia toimenpiteitä. Suunnittelun lähtötietoina ovat olleet tie- ja liikennetiedot sekä asemakaava, maankäyttösuunnitelmat sekä tämän työn yhteydessä perusselvitykseksi laadittu ympäristön nykytila-analyysi. Ympäristön nykytila-analyysin mukaan Kuusamon keskustan sisääntulojakson sekä ydinjakson maisemakuvallisena ongelmana on Kitkantien laaja ja jäsentymätön katutila. Ydinalueella ei ole istutuksia. Koko suunnittelujakson taajamakuvallisena ongelmana on katukalusteiden värimaailman ja tyylin epäyhtenäisyys. Nykyistä vinopysäköintiä ei pidetä myöskään kaikilta osin hyvänä ratkaisuna. Vinopysäköinnin ja kevyen liikenteen väylien päällysteissä, reunatuissa ja pintakuivatuksessa on puutteita. Väylävalaistuksen teho on huono ja valaistus kaipaa uudistusta. Kuusamon keskustan ydinjaksolla (Ouluntaival ja Kitkantie) on sattunut paljon liikenneonnettomuuksia, joista suurin osa on johtanut henkilövahinkoihin. Kaikki vuosina 2009 - 2013 tapahtuneet jalankulkuonnettomuudet ovat tapahtuneet ydinkeskustassa. Kitkantiellä, Kaarlo Hännisentien liittymässä, on sattunut peräänajo-onnettomuuksia, mutta ei henkilövahinkoja. Liikenneturvallisuuden parantamistarvetta on tie-, liittymä- ja pysäköintijärjestelyissä sekä jalankulun ja pyöräilyn olosuhteissa. Kitkantien ydinjaksolle, välille Kaiterantie - Vienantie, on esitetty rakennettavaksi osin kivetty ja osin istutettu keskialue. Nykyinen vinopysäköinti muutetaan pitkittäispysäköinniksi, jolloin kevyelle liikenteelle saadaan myös lisätilaa. Lisäksi katutilaa jäsennellään katupuuistutuksin. Kitkantien varresta vähenevät autopaikat korvataan osittain Kaiterantien varteen rakennettavalla yleisellä pysäköintialueella (LPA). Lisäksi pysäköintiä ohjataan muille ydinkeskustan yleisille pysäköintialueille (Kelantien ja Vanttajantie). Kitkantien ja Vienantien sekä Ouluntaipaleen ja Kaiterantien liittymiin rakennetaan korotukset. Pääliittymän ja aukion kohdalle on esitetty yhtenäinen kävelypainotteinen kivetty alue. Liittymäratkaisuna on kiertoliittymä, jossa ajolinjoja ohjataan pollareilla. Molemmin puolin Kelantietä rakennetaan pysäkkilevennykset, johon tulee nousu- ja jättöpysäkit (kääntöpaikka osittain Vanttajantien pysäköintialueella). Jalankulkuyhteyksiä rakennetaan ydinkeskustan, aukion ja yleisten pysäköintialueiden välille. Kitkantien varteen ja aukiolle suunnitellaan runkolukittavia pyörätelineitä sekä penkkejä. Aukio kivetään kauttaaltaan ja sinne osoitetaan istutusalueita. Aukiotilaa rajaa viereisiin kortteleihin porrastettu osuus, joka toimii aukion rajaavana elementtinä tai, viereisen korttelin kehittyessä, luo sisääntulon palvelukeskittymälle. Välillä Vienantie - Kaarlo Hännisentie, Kitkantien vinopysäköinti muutetaan myös pitkittäispysäköinniksi. Ajorata kavennetaan 7 metriin. Vienantien liittymän pohjoispuolelle rakennetaan Kitkantien molemmille puolille ajoratapysäkit. Kaarlo Hännisentien liittymän eteläpuoleisia liittymäjärjestelyjä parannetaan ja mm. R-kioskin liittymään rakennetaan suuntaisliittymä. Katutilaa jäsennellään katupuuistutuksin ja ajoratapysäkkien yhteyteen sekä palveluiden lähelle osoitetaan runkolukittavia pyörätelineitä sekä penkkejä. Kitkantien pohjoisosalla, välillä Kaarlo Hännisentie - valtatie 5, Kitkantien ajorataa kavennetaan ja nykyinen länsipuolinen jalkakäytävä levennetään pyörätieksi. Välillä Muikkutie - valtatie 5, Kitkantien ajoradan keskelle rakennetaan keskisaareke. Hautausmaan puoleinen jalkakäytävä puretaan ja Muikkutien liittymän nykyiset linja-autopysäkit parannetaan. Liikuntahallin kohdan liittymä-, kevytliikenne ja pysäkkijärjestelyjä parannetaan. Katuympäristöä parannetaan nurmettamalla tieluiskat ja leveät välisaarekkeet. Kapeat saarekkeet kivetään. Ouluntaipaleella, välillä Oulangantie - Kaiterantie, kavennetaan ajorataa ja pohjoispuolinen kevyen liikenteen väylä levennetään, liittymiä parannetaan, rakennetaan suojatiesaarekkeita sekä kunnostetaan tieympäristöä mm. sisääntulokohdan puuston ja pensaiden harvennuksilla. Katuympäristöä parannetaan pääosin nurmettamalla tieluiskia ja leveitä välikaistoja. Kitronintielle, välille Kitkantie - Kirkkotie, on esitetty kevyen liikenteen väylän reunatuen ja valaistuksen uusimista Kirkolle asti sekä alkuosalla ajoradan päällysteen uusiminen. Ympäristöä parannetaan nurmettamalla uudelleen rakentamisen myötä rikkoutuvia nurmipintoja. Kaikkein suunnitteluosuuksien ajoratavalaistukset uusitaan. Kitkantien ydinjaksolle ja aukiolle tulee perusvalaistuksen lisäksi erikoisvalaistusta (mm. kausivalaistus ja kohdevalaistus). Keskusta- alueella käytetään puupylväitä. Keskustan ulkopuolisilla osuuksilla jatketaan aikaisemmin toteutettuja valaistusratkaisuja. Valaisimina käytetään siniseksi maalattuja CitySoul-valaisimia kartiopylväissä ja Kitkantien pohjoisosan sisääntulojaksolla keskisaarekkeessa valopilarivalaisinpylväitä (vrt. parannettu Ouluntie tai Rukan sisääntulo). Esitetyillä kehittämistoimenpiteillä Kuusamon ydinkeskustan ilme ja tieympäristö saadaan uudistettua sekä liikennejärjestelyjen toimivuutta ja turvallisuutta saadaan parannettua kaikkien liikennemuotojen osalta. Jalankulun ja pyöräilyolosuhteiden parantaminen tukee kestävän liikkumisen edistämisen periaatteita. Kehittämisratkaisuilla parannetaan ydinkeskustan viihtyisyyttä ja houkuttelevuutta. Valaistuksen uusimisella parannetaan viihtyisyyden lisäksi liikenneturvallisuutta sekä yleistä turvallisuuden tunnetta. Suunniteltujen kehittämisratkaisujen kokonaiskustannuksiksi on arvioitu noin 6,9 M€ vuoden 2014 hintatasossa (maku ind. 112; 2010 =100). Kustannukset sisältävät 25 %:n yleiskustannusosuuden. Kustannukset eivät sisällä laitteiden uusimista tai siirtoja eikä aukion alueen rakennusten purkukustannuksia. Ydinkeskustan rakentamiskustannusten osuus katulämmityksineen on noin 4,4 M€. Ydinkeskustan kustannukset sisältävät Kaiterantien varren pysäköintialueen rakentamisen ja Kelantien pysäkkijärjestelyt. Kivetyn aukion ja pääliittymän katulämmityksen rakentamiskustannusosuus on arviolta noin 800 000 € ja vuosittaiset ylläpitokustannukset arviolta noin 170 000 €. Muiden tiejaksojen parantamiskustannukset ovat yhteensä noin 2,5 M€. Hanke voidaan toteuttaa vaiheittain. Kiireisin vaihe on ydinkeskustan parantaminen. Rakentamiskustannusten jaosta ELY-keskuksen ja Kuusamon kaupungin kesken sovitaan erikseen pidettävissä neuvotteluissa. Ratkaisut eivät edellytä asemakaavan muutoksia. Rakentamisen jälkeen maantieosuudet siirtyvät kaupungin omistukseen (hallinnollinen muutos). Kehittämissuunnitelmaratkaisut ovat toteutussuunnitelmien laatimisen lähtökohtana.

Synergistic antitumor effect of TRAIL and adriamycin on the human breast cancer cell line MCF-7

The aim of the present study was to determine the effect of the combination of tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand (TRAIL) and adriamycin (ADM) on the human breast cancer cell line MCF-7 and to identify potential mechanisms of apoptosis. Cell viability was analyzed by the MTT assay and the synergistic effect was assessed by the Webb coefficient. Apoptosis was quantified using the annexin V-FITC and propidium iodide staining flow cytometry. The mRNA expression of TRAIL receptors was measured by RT-PCR. Changes in the quantities of Bax and caspase-9 proteins were determined by Western blot. MCF-7 cells were relatively resistant to TRAIL (IC50 >10 µg/mL), while MCF-7 cells were sensitive to ADM (IC50 <10 µg/mL). A subtoxic concentration of ADM (0.5 µg/mL) combined with 0.1, 1, or 10 µg/mL TRAIL had a synergistic cytotoxic effect on MCF-7 cells, which was more marked with the combination of TRAIL (0.1 µg/mL) and ADM (0.5 µg/mL). In addition, the combined treatment with TRAIL and ADM significantly increased cell apoptosis from 9.8% (TRAIL) or 17% (ADM) to 38.7%, resulting in a synergistic apoptotic effect, which is proposed to be mediated by up-regulation of DR4 and DR5 mRNA expression and increased expression of Bax and caspase-9 proteins. These results suggest that the combination of TRAIL and ADM might be a promising therapy for breast cancer.

Effect of hyperoxia on the intestinal IgA secretory component in neonatal rats and on intestinal epithelial cells in vitro

Oxygen therapy is essential for the treatment of some neonatal critical care conditions but its extrapulmonary effects have not been adequately investigated. We therefore studied the effects of various oxygen concentrations on intestinal epithelial cell function. In order to assess the effects of hyperoxia on the intestinal immunological barrier, we studied two physiological changes in neonatal rats exposed to hyperoxia: the change in intestinal IgA secretory component (SC, an important component of SIgA) and changes in intestinal epithelial cells. Immunohistochemistry and Western blot were used to detect changes in the intestinal tissue SC of neonatal rats. To detect intestinal epithelial cell growth, cells were counted, and 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) and Giemsa staining were used to assess cell survival. Immunohistochemistry was used to determine SC expression. The expression of intestinal SC in neonatal rats under hyperoxic conditions was notably increased compared with rats inhaling room air (P < 0.01). In vitro, 40% O2 was beneficial for cell growth. However, 60% O2 and 90% O2 induced rapid cell death. Also, 40% O2 induced expression of SC by intestinal epithelial cells, whereas 60% O2did not; however, 90% O2 limited the ability of intestinal epithelial cells to express SC. In vivo and in vitro, moderate hyperoxia brought about increases in intestinal SC. This would be expected to bring about an increase in intestinal SIgA. High levels of SC and SIgA would serve to benefit hyperoxia-exposed individuals by helping to maintain optimal conditions in the intestinal tract.

Inhibition of STAT3 by RNA interference suppresses angiogenesis in colorectal carcinoma

In order to investigate signal transduction and activation of transcription 3 (STAT3) signaling on angiogenesis in colorectal carcinoma (CRC) after inhibiting STAT3 expression, we constructed the HT-29-shSTAT3 cell line by lentivirus-mediated RNAi. Cell growth was assessed with MTT and the cell cycle distribution by flow cytometry. CRC nude mouse models were established and tumor growth was monitored periodically. On day 30, all mice were killed and tumor tissues were removed. Microvessel density (MVD) was determined according to CD34-positive staining. The expression of vascular endothelial growth factor A (VEGFA), matrix metalloproteinase-2 (MMP2) and basic fibroblast growth factor (FGF2) was monitored by quantitative real-time PCR and Western blot analysis. Knockdown of STAT3 expression significantly inhibited cell growth in HT-29 cells, with a significantly higher proportion of cells at G0/G1 (P < 0.01). Consistently, in vivo data also demonstrated that tumor growth was significantly inhibited in mice injected with HT-29-shSTAT3 cells. MVD was 9.80 ± 3.02 in the HT-29-shSTAT3 group, significantly less than that of the control group (P < 0.01). mRNA and protein levels of VEGFA and MMP2 in the HT-29-shSTAT3 group were significantly lower than in the control group (P < 0.05), but no significant difference was observed in the mRNA or protein level of FGF2 (P > 0.05). Taken together, these results demonstrate that STAT3 signaling is important to the growth of CRC and promotes angiogenesis by regulating VEGFA and MMP2 expression.

Effect of activation of canonical Wnt signaling by the Wnt-3a protein on the susceptibility of PC12 cells to oxidative and apoptotic insults

Wnt proteins are involved in tissue development and their signaling pathways play an important role during embryogenesis. Wnt signaling can promote cell survival, which is beneficial for neurons, but could also lead to tumor development in different tissues. The present study investigated the effects of a Wnt protein on the susceptibility of a neural tumor cell line (PC12 cells) to the cytotoxic compounds ferrous sulfate (10 mM), staurosporine (100 and 500 nM), 3-nitropropionic acid (5 mM), and amyloid β-peptide (Aβ25-35; 50 µM). Cells (1 x 10(6) cells/mL) were treated with the Wnt-3a recombinant peptide (200 ng/mL) for 24 h before exposure to toxic insults. The Wnt-3a protein partially protected PC12 cells, with a 6-15% increase in cell viability in the presence of toxic agents, similar to the effect measured using the MTT and lactate dehydrogenase cell viability assays. The Wnt-3a protein increased protein expression of β-catenin by 52% compared to control. These findings suggest that Wnt signaling can protect neural cells against apoptosis induced by toxic agents, which are relevant to the pathogenesis of Alzheimer’s and Huntington’s diseases.

In vitro anti-inflammatory, cytotoxic and antioxidant activities of boesenbergin A, a chalcone isolated from Boesenbergia rotunda (L.) (fingerroot)

The current in vitro study was designed to investigate the anti-inflammatory, cytotoxic and antioxidant activities of boesenbergin A (BA), a chalcone derivative of known structure isolated from Boesenbergia rotunda. Human hepatocellular carcinoma (HepG2), colon adenocarcinoma (HT-29), non-small cell lung cancer (A549), prostate adenocarcinoma (PC3), and normal hepatic cells (WRL-68) were used to evaluate the cytotoxicity of BA using the MTT assay. The antioxidant activity of BA was assessed by the ORAC assay and compared to quercetin as a standard reference antioxidant. ORAC results are reported as the equivalent concentration of Trolox that produces the same level of antioxidant activity as the sample tested at 20 µg/mL. The toxic effect of BA on different cell types, reported as IC50, yielded 20.22 ± 3.15, 10.69 ± 2.64, 20.31 ± 1.34, 94.10 ± 1.19, and 9.324 ± 0.24 µg/mL for A549, PC3, HepG2, HT-29, and WRL-68, respectively. BA displayed considerable antioxidant activity, when the results of ORAC assay were reported as Trolox equivalents. BA (20 µg/mL) and quercetin (5 µg/mL) were equivalent to a Trolox concentration of 11.91 ± 0.23 and 160.32 ± 2.75 µM, respectively. Moreover, the anti-inflammatory activity of BA was significant at 12.5 to 50 µM and without any significant cytotoxicity for the murine macrophage cell line RAW 264.7 at 50 µM. The significant biological activities observed in this study indicated that BA may be one of the agents responsible for the reported biological activities of B. rotunda crude extract.

Effect of the 5-HT4 receptor and serotonin transporter on visceral hypersensitivity in rats

Visceral hypersensitivity plays an important role in motor and sensory abnormalities associated with irritable bowel syndrome, but the underlying mechanisms are not fully understood. The present study was designed to evaluate the expression of the 5-HT4 receptor and the serotonin transporter (SERT) as well as their roles in chronic visceral hypersensitivity using a rat model. Neonatal male Sprague-Dawley rats received intracolonic injections of 0.5% acetic acid (0.3-0.5 mL at different times) between postnatal days 8 and 21 to establish an animal model of visceral hypersensitivity. On day 43, the threshold intensity for a visually identifiable contraction of the abdominal wall and body arching were recorded during rectal distention. Histological evaluation and the myeloperoxidase activity assay were performed to determine the severity of inflammation. The 5-HT4 receptor and SERT expression of the ascending colon were monitored using immunohistochemistry and Western blot analyses; the plasma 5-HT levels were measured using an ELISA method. As expected, transient colonic irritation at the neonatal stage led to visceral hypersensitivity, but no mucosal inflammation was later detected during adulthood. Using this model, we found reduced SERT expression (0.298 ± 0.038 vs 0.634 ± 0.200, P < 0.05) and increased 5-HT4 receptor expression (0.308 ± 0.017 vs 0.298 ± 0.021, P < 0.05). Treatment with fluoxetine (10 mg·kg-1·day-1, days 36-42), tegaserod (1 mg·kg-1·day-1, day 43), or the combination of both, reduced visceral hypersensitivity and plasma 5-HT levels. Fluoxetine treatment increased 5-HT4 receptor expression (0.322 ± 0.020 vs 0.308 ± 0.017, P < 0.01) but not SERT expression (0.219 ± 0.039 vs 0.298 ± 0.038, P = 0.654). These results indicate that both the 5-HT4 receptor and SERT play a role in the pathogenesis of visceral hypersensitivity, and its mechanism may be involved in the local 5-HT level.

In vitro inhibitory effects of imatinib mesylate on stromal cells and hematopoietic progenitors from bone marrow

Imatinib mesylate (IM) is used to treat chronic myeloid leukemia (CML) because it selectively inhibits tyrosine kinase, which is a hallmark of CML oncogenesis. Recent studies have shown that IM inhibits the growth of several non-malignant hematopoietic and fibroblast cells from bone marrow (BM). The aim of the present study was to evaluate the effects of IM on stromal and hematopoietic progenitor cells, specifically in the colony-forming units of granulocyte/macrophage (CFU-GM), using BM cultures from 108 1.5- to 2-month-old healthy Swiss mice. The results showed that low concentrations of IM (1.25 µM) reduced the growth of CFU-GM in clonogenic assays. In culture assays with stromal cells, fibroblast proliferation and α-SMA expression by immunocytochemistry analysis were also reduced in a concentration-dependent manner, with a survival rate of approximately 50% with a dose of 2.5 µM. Cell viability and morphology were analyzed using MTT and staining with acrydine orange/ethidium bromide. Most cells were found to be viable after treatment with 5 µM IM, although there was gradual growth inhibition of fibroblastic cells while the number of round cells (macrophage-like cells) increased. At higher concentrations (15 µM), the majority of cells were apoptotic and cell growth ceased completely. Oil red staining revealed the presence of adipocytes only in untreated cells (control). Cell cycle analysis of stromal cells by flow cytometry showed a blockade at the G0/G1 phases in groups treated with 5-15 µM. These results suggest that IM differentially inhibits the survival of different types of BM cells since toxic effects were achieved.

Effect of penehyclidine hydrochloride on β-arrestin-1 expression in lipopolysaccharide-induced human pulmonary microvascular endothelial cells

β-arrestins are expressed proteins that were first described, and are well-known, as negative regulators of G protein-coupled receptor signaling. Penehyclidine hydrochloride (PHC) is a new anti-cholinergic drug that can inhibit biomembrane lipid peroxidation, and decrease cytokines and oxyradicals. However, to date, no reports on the effects of PHC on β-arrestin-1 in cells have been published. The aim of this study was to investigate the effect of PHC on β-arrestin-1 expression in lipopolysaccharide (LPS)-induced human pulmonary microvascular endothelial cells (HPMEC). Cultured HPMEC were pretreated with PHC, followed by LPS treatment. Muscarinic receptor mRNAs were assayed by real-time quantitative PCR. Cell viability was assayed by the methyl thiazolyl tetrazolium (MTT) conversion test. The dose and time effects of PHC on β-arrestin-1 expression in LPS-induced HPMEC were determined by Western blot analysis. Cell malondialdehyde (MDA) level and superoxide dismutase (SOD) activity were measured. It was found that the M3 receptor was the one most highly expressed, and was activated 5 min after LPS challenge. Furthermore, 2 μg/mL PHC significantly upregulated expression of β-arrestin-1 within 10 to 15 min. Compared with the control group, MDA levels in cells were remarkably increased and SOD activities were significantly decreased in LPS pretreated cells, while PHC markedly decreased MDA levels and increased SOD activities. We conclude that PHC attenuated ROS injury by upregulating β-arrestin-1 expression, thereby implicating a mechanism by which PHC may exert its protective effects against LPS-induced pulmonary microvascular endothelial cell injury.

Effects of acute administration of selective serotonin reuptake inhibitors on sympathetic nerve activity

Serotonergic mechanisms have an important function in the central control of circulation. Here, the acute effects of three selective serotonin (5-HT) reuptake inhibitors (SSRIs) on autonomic and cardiorespiratory variables were measured in rats. Although SSRIs require 2-3 weeks to achieve their full antidepressant effects, it has been shown that they cause an immediate inhibition of 5-HT reuptake. Seventy male Wistar rats were anesthetized with urethane and instrumented to record blood pressure, heart rate, renal sympathetic nerve activity (RSNA), and respiratory frequency. At lower doses, the acute cardiovascular effects of fluoxetine, paroxetine and sertraline administered intravenously were insignificant and variable. At middle and higher doses, a general pattern was observed, with significant reductions in sympathetic nerve activity. At 10 min, fluoxetine (3 and 10 mg/kg) reduced RSNA by -33±4.7 and -31±5.4%, respectively, without changes in blood pressure; 3 and 10 mg/kg paroxetine reduced RSNA by -35±5.4 and -31±5.5%, respectively, with an increase in blood pressure +26.3±2.5; 3 mg/kg sertraline reduced RSNA by -59.4±8.6%, without changes in blood pressure. Sympathoinhibition began 5 min after injection and lasted approximately 30 min. For fluoxetine and sertraline, but not paroxetine, there was a reduction in heart rate that was nearly parallel to the sympathoinhibition. The effect of these drugs on the other variables was insignificant. In conclusion, acute peripheral administration of SSRIs caused early autonomic cardiovascular effects, particularly sympathoinhibition, as measured by RSNA. Although a peripheral action cannot be ruled out, such effects are presumably mostly central.

Effect of exercise training on Ca2+ release units of left ventricular myocytes of spontaneously hypertensive rats

In cardiomyocytes, calcium (Ca2+) release units comprise clusters of intracellular Ca2+ release channels located on the sarcoplasmic reticulum, and hypertension is well established as a cause of defects in calcium release unit function. Our objective was to determine whether endurance exercise training could attenuate the deleterious effects of hypertension on calcium release unit components and Ca2+ sparks in left ventricular myocytes of spontaneously hypertensive rats. Male Wistar and spontaneously hypertensive rats (4 months of age) were divided into 4 groups: normotensive (NC) and hypertensive control (HC), and normotensive (NT) and hypertensive trained (HT) animals (7 rats per group). NC and HC rats were submitted to a low-intensity treadmill running protocol (5 days/week, 1 h/day, 0% grade, and 50-60% of maximal running speed) for 8 weeks. Gene expression of the ryanodine receptor type 2 (RyR2) and FK506 binding protein (FKBP12.6) increased (270%) and decreased (88%), respectively, in HC compared to NC rats. Endurance exercise training reversed these changes by reducing RyR2 (230%) and normalizing FKBP12.6 gene expression (112%). Hypertension also increased the frequency of Ca2+ sparks (HC=7.61±0.26 vs NC=4.79±0.19 per 100 µm/s) and decreased its amplitude (HC=0.260±0.08 vs NC=0.324±0.10 ΔF/F0), full width at half-maximum amplitude (HC=1.05±0.08 vs NC=1.26±0.01 µm), total duration (HC=11.51±0.12 vs NC=14.97±0.24 ms), time to peak (HC=4.84±0.06 vs NC=6.31±0.14 ms), and time constant of decay (HC=8.68±0.12 vs NC=10.21±0.22 ms). These changes were partially reversed in HT rats (frequency of Ca2+ sparks=6.26±0.19 µm/s, amplitude=0.282±0.10 ΔF/F0, full width at half-maximum amplitude=1.14±0.01 µm, total duration=13.34±0.17 ms, time to peak=5.43±0.08 ms, and time constant of decay=9.43±0.15 ms). Endurance exercise training attenuated the deleterious effects of hypertension on calcium release units of left ventricular myocytes.