The first strand transfer reaction of HIV-1 reverse transcription is more efficient in infected cells than in cell-free natural endogenous reverse transcription reactions

Background: In the presence of dNTPs, intact HIV-1 virions are capable of reverse transcribing at least part of their genome, a process known as natural endogenous reverse transcription (NERT). PCR analysis of virion DNA produced by NERT revealed that the first strand transfer reaction (1stST) was inefficient in intact virions, with minus strand (-) strong stop DNA (ssDNA) copy numbers up to 200 times higher than post-1stST products measured using primers in U3 and U5. This was in marked contrast to the efficiency of 1stST observed in single-round cell infection assays, in which (-) ssDNA and U3-U5 copy numbers were indistinguishable. Objectives: To investigate the reasons for the discrepancy in first strand transfer efficiency between intact cell-free virus and the infection process. Study design: Alterations of both NERT reactions and the conditions of cell infection were used to test whether uncoating and/or entry play a role in the discrepancy in first strand transfer efficiency. Results and Conclusions: The difference in 1stST efficiency could not be attributed simply to viral uncoating, since addition of very low concentrations of detergent to NERT reactions removed the viral envelope without disrupting the reverse transcription complex, and these conditions resulted in no improvement in 1stST efficiency. Virus pseudotyped with surface glycoproteins from either vesicular stomatitis virus or amphotrophic murine leukaemia virus also showed low levels of 1stST in low detergent NERT assays and equivalent levels of (-) ssDNA and 1stST in single-round infections of cells, demonstrating that the gp120-mediated infection process did not select for virions capable of carrying out 1stST. These data indicate that a post-entry event or factor may be involved in efficient HIV-1 reverse transcription in vivo. (C) 2002 Elsevier Science B.V. All rights reserved.

DNA vaccine coding for the full-length infectious Kunjin virus RNA protects mice against the New York strain of West Nile virus

A plasmid DNA directing transcription of the infectious full-length RNA genome of Kunjin (KUN) virus in vivo from a mammalian expression promoter was used to vaccinate mice intramuscularly. The KUN viral cDNA encoded in the plasmid contained the mutation in the NS1 protein (Pro-250 to Leu) previously shown to attenuate KUN virus in weanling mice. KUN virus was isolated from the blood of immunized mice 3-4 days after DNA inoculation, demonstrating that infectious RNA was being transcribed in vivo; however, no symptoms of virus-induced disease were observed. By 19 days postimmunization, neutralizing antibody was detected in the serum of immunized animals. On challenge with lethal doses of the virulent New York strain of West Nile (WN) or wild-type KUN virus intracerebrally or intraperitoneally, mice immunized with as little as 0.1-1 mug of KUN plasmid DNA were solidly protected against disease. This finding correlated with neutralization data in vitro showing that serum from KUN DNA-immunized mice neutralized KUN and WN,viruses with similar efficiencies. The results demonstrate that delivery of an attenuated but replicating KUN virus via a plasmid DNA vector may provide an effective vaccination strategy against virulent strains of WN virus.

Field evaluation of a sentinel mosquito (Diptera : culicidae) trap system to detect Japanese encephalitis in remote Australia

Incursions of Japanese encephalitis (JE) virus into northern Queensland are currently monitored using sentinel pigs. However, the maintenance of these pigs is expensive, and because pigs are the major amplifying hosts of the virus, they may contribute to JE transmission. Therefore, we evaluated a mosquito-based detection system to potentially replace the sentinel pigs. Single, inactivated JE-infected Culex annulirostris Skuse and C. sitiens Wiedemann were placed into pools of uninfected mosquitoes that were housed in a Mosquito Magnet Pro (MM) trap set under wet season field conditions in Cairns, Queensland for 0, 7, or 14 d. JE viral RNA was detected (cycling threshold [CT] = 40) in 11/ 12, 10/14, and 2/5 pools containing 200, 1,000, and 5,000 mosquitoes, respectively, using a TaqMan real-time reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR). The ability to detect virus was not affected by the length of time pools were maintained under field conditions, although the CT score tended to increase with field exposure time. Furthermore, JE viral RNA was detected in three pools of 1,000 mosquitoes collected from Badu Island using a MM trap. These results indicated that a mosquito trap system employing self-powered traps, such as the MosquitoMagnet, and a real-time PCR system, could be used to monitor for JE in remote areas.

An SNP-based PCR assay to differentiate between Listeria monocytogenes lineages derived from phylogenetic analysis of the sigB gene

The alternative sigma factor sigB gene is involved in the stress response regulation of Listeria monocytogenes, and contributes towards growth and survival in adverse conditions. This gene was examined to determine if it could be a useful indicator of lineage differentiation, similar to the established method based on ribotyping. The sigB sequence was resolved in four local L. monocytogenes strains and the phylogenetic relationship among these, and a further 21 sigB gene sequences from strains of different serotype and lineage including two Listeria innocua strains, obtained from the GenBank database were determined. The sigB nucleotide sequences of these 25 Listeria strains were then examined for single nucleotide polymorphic (SNP) sites that could differentiate between the three lineages. Based on nucleotide sequences L. monocytogenes lineage F serotype 1/2b and 4b clustered together, lineage II/serotype 1/2a and 1/2c strains clustered together, lineage III/serotypes 4a and 4c strains clustered together and L. innocua strains clustered together as an outgroup. SNPs differentiating the three lineages were identified. Individual allele-specific PCR reactions based on these polymorphisms were successful in grouping known and a further 37 local L. monocytogenes isolates into the three lineages. (C) 2003 Elsevier B.V. All fights reserved.

Gene flow in great bustard populations across the Strait of Gibraltar as elucidated from excremental PCR and mtDNA sequencing

Recent advances in molecular biology have made it possible to use the trace amounts of DNA in faeces to non-invasively sample endangered species for genetic studies. Here we use faeces as a source of DNA and mtDNA sequence data to elucidate the relationship among Spanish and Moroccan populations of great bustards. 834 bp of combined control region and cytochrome-b mtDNA fragments revealed four variable sites that defined seven closely related haplotypes in 54 individuals. Morocco was fixed for a single mtDNA haplotype that occurs at moderate frequency (28%) in Spain. We could not differentiate among the sampled Spanish populations of Caceres and Andalucia but these combined populations were differentiated from the Moroccan population. Estimates of gene flow (Nm = 0.82) are consistent with extensive observations on the southern Iberian peninsular indicating that few individuals fly across the Strait of Gibraltar. We demonstrate that both this sea barrier and mountain barriers in Spain limit dispersal among adjacent great bustard populations to a similar extent. The Moroccan population is of high ornithological significance as it holds the only population of great bustards in Africa. This population is critically small and genetic and observational data indicate that it is unlikely to be recolonised via immigration from Spain should it be extirpated. In light of the evidence presented here it deserves the maximum level of protection.

A protective effect of early pregnancy factor on experimental autoimmune encephalomyelitis induced in Lewis rats by inoculation with myelin basic protein

Experimental antoimmune encephalomyelitis (EAE) is an organ-specific autoimmune disease characterised by inflammation and demyelination of the central nervous system and is the best available animal model of multiple sclerosis (MS). Since previous studies have shown that EAE is less severe or is delayed in onset during pregnancy and that administration of the pregnancy hormone early pregnancy factor (EPF) down-regulates EAE, experiments in the present study were designed to explore further the role of EPF in EAE. By using the rosette inhibition test, the standard bioassay for EPF and, by semi-quantitative RT-PCR techniques, we have now shown that inflammatory cells from the spinal cord of rats with EAE can produce and secrete EPF, with production being greatest during recovery from disease. Administration of EPF to rats with EAE resulted in a significant increase in the expression of IL-4 and IL-10 mRNA and a significant decrease in IFN-gamma mRNA expression in spinal cord inflammatory cells. Encephalitogenic MBP-specific T cell lines were prepared from popliteal lymph nodes of rats with EAE. Proliferation assays using these cells demonstrated the ability of exogenous EPF to down-regulate the responses of T lymphocytes to MBP. (C) 2003 Elsevier B.V. All rights reserved.

Prevalência elevada do Alloiococcus otitidis na otite média com efusão através da PCR simultânea

A etiologia da otite média com efusão (OME) não é completamente conhecida, mas agentes infecciosos podem contribuir para sua patogênese. O conhecimento sobre a epidemiologia bacteriana da OME em áreas geográficas distintas é essencial para a implementação de tratamentos racionais, quando indicados. OBJETIVO: Determinar a prevalência do Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenzae, Moraxella catarrhalis e Alloiococcus otitidis nas efusões da orelha média de crianças com otite média recorrente (OMR) e otite média com efusão crônica (OMEC) que foram submetidas à miringotomia e comparar os resultados obtidos por cultura e PCR. FORMA DE ESTUDO: Estudo clínico com coorte transversal. MATERIAL E MÉTODO: 128 efusões obtidas por timpanocentese de 75 crianças entre 11 meses e 10 anos de idade foram analisadas por cultura e PCR simultânea. RESULTADOS: Cultivaram-se bactérias em 25,1% das amostras e os patógenos principais foram encontrados em 19,6%. O A.otitidis não foi isolado em cultura. A PCR identificou bactérias em 85,9%, com os seguintes resultados individuais: A.otitidis, 52,3%; H.influenzae, 39,1%; S.pneumoniae, 12,5% e M.catarrhalis, 10,2%. A PCR foi significativamente mais sensível que a cultura (P<0,01). O S.pneumoniae foi mais encontrado em OMR do que em OMEC (P=0,038). CONCLUSÕES: A prevalência das bactérias na OME em um grupo de crianças brasileiras é semelhante àquelas relatadas em outros países, sendo o H.influenzae o mais encontrado dentre os patógenos principais da orelha média. O S.pneumoniae foi mais freqüente em OMR do que em OMEC. A PCR é mais sensível na detecção de bactérias na efusão da orelha média, comparada com cultura, e é essencial para a identificação do A.otitidis. O elevado percentual de detecção do A.otitidis sugere mais investigações sobre sua atuação no início e no prolongamento de doenças da orelha média.

Efeito da mitomicina C em polipose nasossinusal eosinofílica, in vivo: dosagem de IL5 e GM-CSF, RT-PCR

A polipose nasossinusal eosinofílica (PNS) é manifestação de uma doença inflamatória crônica na mucosa do nariz e nos seios paranasais caracterizada por infiltração de granulócitos eosinófilos. O fator responsável pela eosinofilia e manutenção dessas células com a perpetuação do processo inflamatório e formação polipóide é objeto constante de estudos. As citocinas como IL5 (interleucina 5) e GM-CSF (fator estimulador de colônia granulócito macrófago) aumentam a sobrevida dos eosinófilos e prolongam a sua presença no tecido polipóide, diminuindo o índice de apoptose eosinofílica. OBJETIVO: Avaliar o efeito da mitomicina C - MMC - por meio de aplicação tópica em pacientes portadores de PNS eosinofílica quanto à presença de IL5 e GM-CSF. CASUÍSTICA E MÉTODOS: Quinze pacientes portadores de PNS eosinofílica foram submetidos à aplicação tópica de MMC na concentração de 0,5mg/ml, 1ml, durante cinco minutos, na cavidade nasal direita, e submetidos à biópsia para RT-PCR 24hs após. O grupo-controle foi a cavidade nasal esquerda. O perfil de citocinas foi analisado para IL5 e GM-CSF. RESULTADOS: A comparação dos resultados de GM-CSF pré e pós-uso de MMC quando usamos o teste t pareado apresenta p=0,041. A comparação para IL5 resulta em p < 0,001. CONCLUSÃO: O uso de MMC em pacientes com PNS mostra redução com significância estatística par GM-CSF e importante significância para IL5.

Análise de citocinas pela RT-PCR em pacientes com rinite alérgica

Rinite alérgica é uma doença que decorre de um processo inflamatório da mucosa nasal conseqüente à reação de hipersensibilidade a alérgenos inalatórios e, eventualmente, alimentares. É mediada por IgE, envolvendo diferentes células, mediadores e citocinas. OBJETIVO: Avaliar as transcrições para as seguintes citocinas: IL-4, IL-5, IL-8 e IFN-gama, particularmente importantes no processo alérgico nasal, principalmente IL-4 e IL-5. Neste estudo, optou-se por avaliar os pacientes atópicos fora das crises alérgicas, com a finalidade de se conhecer as expressões das citocinas neste período. MATERIAL E MÉTODO: Realizou-se um estudo transversal e prospectivo, selecionando-se 30 pacientes, sendo 13 pacientes portadores de rinite alérgica paucissintomáticos e 17 pacientes não-atópicos. Os grupos foram selecionados através da história, do exame clínico otorrinolaringológico e do teste alérgico cutâneo - Prick Test. O perfil das citocinas foi pesquisado nos fragmentos de mucosa nasal, através da RT-PCR semiquantitativa, escolhida por apresentar boa reprodutibilidade e especificidade, utilizando-se como referência o gene da Beta-actina. RESULTADOS: Os valores de IL-5, IL-8, IFN-gama mantiveram-se homogêneos em relação ao grupo controle. A IL-4 apresentou diferença com significância estatística. CONCLUSÃO: Os pacientes alérgicos paucissintomáticos apresentaram normalização da expressão das citocinas na mucosa nasal à exceção de IL-4.

Detecção de HPV na mucosa oral e genital pela técnica PCR em mulheres com diagnóstico histopatológico positivo para HPV genital

A infecção do papilomavírus humano (HPV) é uma das mais freqüentes doenças sexualmente transmissíveis em todo o mundo. A relação entre o HPV genital e oral permanece incerta, assim como o seu papel na carcinogênese oral. O objetivo deste estudo foi verificar a presença do DNA do HPV na mucosa oral e genital de mulheres com infecção genital por HPV, pela técnica de reação em cadeia de polimerase (PCR). FORMA DE ESTUDO: Coorte transversal. MATERIAL E MÉTODO: Trata-se de um estudo piloto, prospectivo, com 30 mulheres, idade de 14 a 51 anos, portadoras de infecção genital por HPV confirmada pelo exame de histopatológico. Todas as pacientes foram submetidas a exame e coleta por raspagem da cavidade oral e genital para pesquisa do DNA do HPV pela técnica PCR. RESULTADOS: Nenhuma das amostras da cavidade oral foi positiva para HPV, enquanto no genital, o HPV foi detectado em 17 (57%) das 30 pacientes, principalmente o HPV 6b e 16. CONCLUSÃO: Os resultados mostraram maior porcentagem do HPV genital em relação à cavidade oral, e sugerem que o HPV genital não parece ser fator predisponente para a infecção oral no mesmo paciente.

Infeccão tuberculosa natural e o uso do BCG oral e intradérmico em escolares de Laranjal Paulista, SP, Brasil

Foi pesquisado no 2.° semestre de 1969, o índice de infecção tuberculosa nos escolares de nível primário da sede municipal de Laranjal Paulista, SP, com faixa etária de 7 a 15 anos. Utilizou-se PPD RT23 com 2UT (0,04 mcg) de acordo com a 2.ª recomendação do Serviço Nacional de Tuberculose, sendo encontrado nível de 8% de reatores fortes o que sugere necessidade de intensificação local do controle da tuberculose. Houve diferenças significativas a 5% quanto à cor e grupo etário, predominando nos "não brancos" e nos de 11 a 15 anos, o mesmo não ocorrendo, entretanto, quanto ao sexo. Os reatores e seus conviventes foram encaminhados ao Dispensário de Tuberculose. Foi também pesquisada a viragem tuberculínica pelo BCG oral e intradérmico, comparados com grupo controle, encontrando-se resultados significantes. O resultado verificado no grupo que tomou BCG por via intradérmica foi quase duas vezes maior que os observados no grupo de BCG oral. Não houve diferenças quanto ao sexo e grupo etário, mas o grupo "não branco" mostrou-se mais reativo. Não foram definidas estatisticamente as reações pós-vacinais e a expectativa populacional foi considerada dentro da esperada para atividades desse tipo.

Nível de infecção tuberculosa e viragem tuberculínica pelo BCG intradérmico em escolares de Botucatu, SP (Brasil) em 1969

Procurou-se determinar, no 2.° semestre de 1969, o nível de infecção tuberculosa nos escolares da sede municipal de Botucatu, nas idades de 7 a 15 anos (exclusive) e o efeito do BCG intradérmico e da própria prova em si na viragem tuberculínica. Utilizamos PPD RT23 com 2UT (0,04 mcg) de acordo com a recomendação do Serviço Nacional de Tuberculose. A prevalência desta infecção se situou em torno de 6%, a qual, embora aparentemente baixa, ainda sugere ser a tuberculose problema de Saúde Pública local, com necessidade de melhor controle. Não houve diferença estatística significante entre os níveis encontrados nos grupos bases (A + B) e o controle, C, mas em relação aos atributos considerados, ela predominou na faixa etária de 11 a 15 anos, nos não brancos e no sexo masculino, com aumento significante de nível entre as provas realizadas num período de 90 dias. Não houve diferença significativa para os resultados encontrados entre a primeira e segunda provas realizadas no grupo B o que, entretanto se apresentou evidente no grupo A, após a utilização do BCG intradérmico, sugerindo forte estímulo alérgico para o mesmo. Os resultados foram encaminhados ao Dispensário Regional de Tuberculose para as necessárias medidas de controle.