950 resultados para 6S rRNA


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Se informa sobre la captura y distribución espacial de peces e invertebrados accesibles a la red de arrastre Granton 300/160 utilizada en la segunda etapa del Crucero BIC Olaya 0305-06, del 4 al 17 junio 2003. En 13 días efectivos de pesca con 76 operaciones de arrastre se capturó un total de 21.805 kg de peces e invertebrados. Cuatro especies representaron el 86,8% de esta captura: la merluza, Merluccius gayi peruanus (14.390 kg, 66%); el bereche con barbo, Ctenosciaena peruviana (2.557 kg, 11,7%); el chiri, Peprilus medius (1.235 kg, 5,7%) y la pota Dosidicus gigas (733 kg, 3,4%). Se identificaron 136 especies marinas: 85 peces, 33 crustáceos, 10 moluscos, 6 equinodermos y 2 cnidarios. Esta diversidad fue menor que la encontrada en otoño de los anteriores años 2001 y 2002. En estos tres años sucesivos, la mayor riqueza íctica se encontró al norte de Punta Aguja (6°S), donde se registró entre el 70-92% de las especies, como consecuencia de las condiciones de normalidad en el medio marino.

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El estudio se realizó por el método de área barrida, del 14 de enero al 7 de febrero 2004, en el área comprendida entre el límite norte del dominio marítimo peruano y los 7°30’S, abarcó 5593 mn2 y profundidades de 20 y 280 bz. La biomasa total estimada de la merluza fue de 198.028 t ±37% (1588 millones de individuos), concentrados principalmente en el estrato II (91-182 m) de las subáreas C (5-6°S) y D (6-7°S). La composición de la población, referida a los grupos de edad fue: 94% individuos de 1 y 2 años de edad; 5% el grupo de 3 años; y 1% los grupos entre 4 y 8 años. La biomasa reproductora fue de 159.678 t, cuyo 72% fueron merluzas de la edad 2; el 17% merluza de edad 3, y el 5% por merluzas mayores a 3 años. Los principales indicadores poblacionales manifestaron: (a) un incremento en los valores de biomasa total, (b) la mejora en la amplitud geográfica de distribución de merluza, (c) presencia de importantes reclutamientos sucesivos, en medio de factores ambientales favorables, creando un panorama alentador para la recuperación poblacional de esta especie.

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El estudio comprende cuatro corrientes marinas. La Extensión Sur de la Corriente de Cromwell (ESCC) en otoño e invierno 2008 tuvo proyección hasta los 7°30’S; en primavera y verano se ubicó sobre su posición normal, al norte de 6°S; en otoño e invierno 2009 llegó hasta 9°S, y en primavera hasta los 7°S. La Contra Corriente Peruano Chilena (CCPC) presentó pocas diferencias de ubicación durante el 2008 y 2009, localizándose por fuera de las 40 mn y por debajo de los 50 m de profundidad; pero frente a Pisco y San Juan se aproximó hasta las 20 mn de la costa. La Corriente Costera Peruana (CCP), con escasas diferencias de ubicación, se desplazó de sur a norte sobre los 50 m de profundidad en áreas cercanas a la costa con velocidad de 20 cm/s en 2008, y de 28 cm/s en 2009. La Corriente Oceánica Peruana (COP), en todos los registros se halló por fuera de las 80 mn, se proyectó hasta Punta Falsa desviándose luego al oeste, con velocidad de hasta 37 cm/s en 2008.

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Se analizaron datos de oxígeno disuelto, frente a las costas del Perú, para comprender las variaciones de la ZMO, caracterizadas por: a) el espesor de esa zona, limitada por las isolíneas de oxígeno de 0,5 mL.L-1; y b) la profundidad de su límite superior en la franja marino costera. Se muestran los resultados de las evaluaciones en la columna de agua, en la bahía de Callao en el periodo 1999 – 2009, y además en enero - febrero 2009 en un estudio de la ZMO, durante el Crucero Meteor 77-4 0901-02: Interacción en el Océano Tropical, Biogeoquímica y Clima. En la zona costera del Callao (12°S) se acentúa la hipoxia; la ZMO se ve restringida por la plataforma y su límite superior más superficial se ubicó a los 2,5 m de profundidad. A partir de la información obtenida en enero–febrero 2009 (Crucero 0901-02) se analizó la variabilidad espacial de la ZMO, en donde se halló un espesor de ~637,8 m, en la sección Punta Falsa (6°S). Se analizó la dinámica de la ZMO y su límite superior, debido al gran interés que ha tomado, por el posible incremento de su espesor, en el contexto de cambio climático, con grandes repercusiones sobre los recursos pesqueros.

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El Crucero BIC Olaya 0401-02 se efectuó del 14 enero al 7 febrero 2004, de Puerto Pizarro (3°29’S) a Punta Pacasmayo (7°23’S). Se utilizó la red de arrastre Granton 300/160. Se efectuaron 87 arrastres de fondo, la captura total fue 42.015,8 kg, constituida por 169 especies: peces (102), crustáceos (32), moluscos (21), equinodermos (9), cnidarios (4) y anélidos (1). Las especies más importantes fueron: merluza peruana, Merluccius gayi peruanus (31.429,42 kg; 75% del total); bereche con barbo, Ctenosciaena peruviana (2815,67 kg; 6,7%); pota, Dosidicus gigas (1.777,27 kg; 4,2%); lenguado ojón, Hippoglossina macrops (611,82 kg; 1,5%); chiri Peprilus medius (543,67 kg; 1,3%); y el pampanito, Peprilus snyderi (497,54 kg; 1,2%). En conjunto, estas seis especies, representaron el 90% del monto total. Esta diversidad es similar al verano 2003 y también la distribución de los peces, cuya mayor diversidad específica se encontró al norte de Punta Aguja (6°S), indicando condiciones de normalidad.

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Abstract This thesis investigates the pathogenicity of a Chlamydia-related bacterium: Waddlia chondrophila, which is suspected to cause abortion in bovines as well as miscarriages in humans. Macrophages represent the first line of defense of the innate immunity against invading pathogens, we thus studied the interaction between W. chondrophila and human macrophages. We observed that W. chondrophila multiplied very efficiently inside monocyte-derived macrophages. Diagnostic tools to detect obligate intracellular bacteria are lacking so we developed a Waddlia specific real-time PCR based on the 16S rRNA encoding gene. Since W. chondrophila could be involved in human miscarriage, we analyzed samples from women having miscarriage or uneventful pregnancy. Waddlia serologies results confirmed an association between the presence of W. chondrophila antibodies and miscarriage (23.2% versus 14.6% in the control group, p-value 0.044). As W. chondrophila's pathogenicity was suggested, we studied its antibiotic susceptibility. W. chondrophila revealed to be susceptible to macrolides and tetracylines but resistant to beta-lactams and fluoroquinolones. This resistance to fluoroquinolones could be explained by mutations in the quinolone resistance determining region of the gyrase (GyrA) and topoisomerase IV (ParC) encoding genes. In conclusion, this thesis allowed to precise the role of W. chondrophila in human miscarriage. However, more studies will be necessary to fully understand the pathogenesis of W. chondrophila in adverse pregnancy outcomes. Résumé Le but de cette thèse a été d'étudier la pathogénicité d'une bactérie apparentée aux Chlamydia: Waddlia chondrophila. Les macrophages représentant la première ligne de défense du système immunitaire inné contre les pathogènes, nous avons d'abord étudié l'interaction entre W. chondrophila and les macrophages humains. Nous avons pu observer que W. chondrophila résistait aux effecteurs microbicides des macrophages et se multipliait efficacement au sein de ces cellules. Au vu du manque d'outils diagnostiques pour détecter cette bactérie intracellulaire obligatoire, nous avons également développé une PCR en temps réel, spécifique pour Waddlia, basée sur le gène de l'ARN ribosomal 16S. Cette PCR a été utilisée dans les différents projets afin de détecter la présence de W. chondrophila. W. chondrophila étant suspectée de pouvoir causer des fausses couches chez la femme, nous avons analysé des échantillons provenant de femmes ayant souffert de fausse couche, ainsi que, comme contrôles, des femmes ayant eu une grossesse normale. Les sérologies ont révélé une association entre la présence d'anticorps dirigés contre Waddlia et la fausse couche (23.2% versus 14.6% chez les contrôles, p-value=0.044). La présence de la bactérie a aussi été détectée par PCR et immunohistochimie dans plusieurs échantillons. L'implication de W. chondrophila dans la fausse couche se précisant, nous avons étudié sa susceptibilité aux antibiotiques. W. chondrophila s'est révélée sensible aux macrolides et aux tetracyclines mais résistante aux beta-lactames et aux quinolones. Cette résistance aux quinolones peut être expliquée par la présence de mutations dans le QRDR (région déterminant la résistance aux quinolones) des gènes gyrA et parC. En conclusion, cette thèse a permis de préciser l'implication de W. chondrophila dans la fausse couche. Des études complémentaires seront cependant nécessaires pour confirmer et préciser le rôle exact de W. chondrophila dans les problèmes obstétricaux.

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En junio del 2002 se realizó el estudio de bancos naturales entre Punta Herradura-Playa Chica (11°15’17,6”S a 11°11’10,7”S) dentro de una franja costera de 1mn. Se encontraron aguas costeras frías (ACF), con salinidad entre 35,1 y 34,8 ups y TSM entre 14,8 °C y 15,4 °C; substratos mayormente de arena fina compacta, fondos algosos y duros de roca volcánica. Entre 3,5 y 22 m de profundidad, la fauna bentónica estuvo compuesta por crustáceos: Platyxanthus orbignyi, Romaleon polyodon, Hepatus chiliensis y Pleuroncodes monodon; moluscos: Loligo gahi y Octopus mimus; peces: Odontesthes regia regia y equinodermos.

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Las Floraciones Algales Nocivas (FAN) o Mareas Rojas son decoloraciones del agua visible a simple vista debido a la proliferación de uno o más microorganismos planctónicos como las microalgas, estas pueden alcanzar niveles altos y producir efectos adversos a la salud humana, como también, causar daños a otros organismos marinos cercanos a la costa. Por tal motivo, existió el interés de aislar, identificar y hacer un estudio filogenético de la especie Prorocentrum minimum encontrada en la Bahía del Callao- Perú. Se realizaron varias tomas de muestras de agua de mar para su posterior identificación morfológica, se les efectuó la técnica de purificación de la microalga, y a su vez, se adquirió un estándar de Prorocentrum minimum del Instituto Provasoli- Guillard National Center for Culture of Marine Phytoplankton (CCMP), USA. Se realizó la curva de crecimiento para la concentración de la densidad microalgal, posteriormente se efectuó la extracción de ADN y la filogenia molecular a partir de las secuencias de las subunidades del ribosoma LSU rRNA de la especie Prorocentrum minimum. Se identificó P. minimum y P gracile, que fueron especies epibentónicos cercanas por ser más recientes evolutivamente. Para la confirmación de la presencia ausencia de alguna biotoxina marina en el cultivo de Prorocentrun minimum, se estableció un análisis cuantitativo de la dosis respuesta del animal en el bioensayo en ratón. Se logró obtener la purificación de cultivo de Prorocentrum minimum y estandarizar el protocolo de trabajo, se confirmó la filogenia de la especie de microalgas. No se logró obtener la toxina DSP del cultivo de la microalga.

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La distribución de tallas de pulpo fluctuó entre 40 y 200 mm de longitud del manto. El peso promedio fue 588,20 g, el 85% de los ejemplares no superó el peso mínimo de extracción (1 kg). En hembras predominaron estadios en desarrollo (63%), madurez total (16%); en machos predominaron estadios en desove (64%) y maduros (28%). La mayor concentración del recurso se registró al norte de la isla El Ladrón y frente a isla Quita Calcal. Las tallas de percebes fluctuaron entre 1 y 40 mm de longitud carina-rostral (Lcr), 55% de ejemplares estuvieron maduros. El percebes estuvo distribuido en el intermareal rocoso entre 6°56’9’’S y 6°57’30,6’’S en un área de 887,50 m2. La biomasa se estimó en 3,06 t ±27,18% y la población en 0,42 millones de individuos ±47,30%; el stock de juveniles (<17 mm) fue 0,17 millones de ejemplares; el stock adulto (≥17 mm) estuvo constituido por 0,24 millones de individuos y 2,90 t de la biomasa.

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Las tallas de Transennella pannosa fluctuaron entre 10 y 34 mm de altura valvar, con media en 27,2 mm; predominaron ejemplares maduros (55,56%) y en evacuación (27,78%); se distribuyó entre 6°25’46,6’’S y 6°27’24,8’’S, en concentraciones de 4478 ind.m-2, la biomasa estimada fue 1566,7 t y la población 248,4 millones de ejemplares. La talla de Pollicipes elegans varió entre 6 y 40 mm de longitud carina rostral, media 26,2 mm; los juveniles (Lcr<17 mm) fueron el 11,63% y los adultos (Lcr≥17 mm) el 88,37%; predominaron ejemplares maduros (72,09%). La talla de Argopecten purpuratus varió entre 9 y 82 mm de altura valvar, media de 56,7 mm; los juveniles (<25 mm) fueron el 0,41% y los adultos comerciales (≥65 mm) el 15,27%; predominaron los desovantes (73,62%); se distribuyó entre 6°21’54,8’’S y 6°25’33,6’’S con concentraciones absolutas de 1 a 121 ejem.m-2 en profundidades de 6,2 a 24,9 m. Las tallas de Octopus mimus fluctuaron entre 100 y 200 mm de longitud del manto; en hembras predominó madurez total y post-fresa, ambos con 40%.

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Entre el 14 y 23 de diciembre 2010, se efectuó la evaluación poblacional de la concha de abanico en la isla Lobos de Tierra, su distribución se registró entre 6°21’12,6”S y 6°24’12,6”S, (noreste de Cabo Cruz y sur de Juanchuquita) y entre 6°26’38,8”S y 6°27’18,4”S (sur de Roca Blanca y norte de El Ñopo) a profundidades de 14,3 a 26,3 m. La altura valvar varió entre 7 y 107 mm. El rango más amplio de tallas y la mayor talla media (69,9 mm), se presentó en el estrato III. Predominaron los ejemplares desovados (37,50%) y desovantes (28,41%). Las densidades fluctuaron entre 1 y 77 ejem.m-2, predominando el rango entre 1 a 10 ind.m-2. La biomasa total fue estimada en 4962,716 t y la población en 87,61 millones de individuos El stock de juveniles (≤25 mm) fue de 0,18 millones de ejemplares y 0,012 t. El stock explotable (≥65 mm) estuvo constituido por 53,81 millones de individuos (61,42%) y 3.725,81 t (75,08%) de la biomasa. Se observó alta mortandad de individuos entre 14 y 77 mm de altura valvar, distribuidos en áreas con niveles de oxígeno menores a 0,1 mL/L, que coincidieron con sustratos reducidos localizados frente a La Grama.

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Los volúmenes de plancton presentaron un rango entre 0,008 y 5,251 mL.m-3 localizados frente a Punta La Negra y Salaverry, promedio 0,61 mL.m-3. El fitoplancton de red fue muy abundante y predominó en el 52% de las estaciones costeras conformado por especies de afloramiento. A 10 m de profundidad el fitoplancton registró una variación entre 69,32x103 cels.L-1 (San Juan) y 2.439,76x103 cels.L-1 (Chimbote), diversidad (H’) entre 0,05 bits.cel-1 (1 mn de Ilo) y 2,84 bits.cel-1 (7 mn de San Juan), y uniformidad entre 0,02 (Ilo) y 0,921 (San Juan). Las diatomeas Cerataulina pelagica y Chaetoceros spp. fueron las que aportaron las mayores densidades celulares en la zona costera. La distribución de los indicadores biológicos demostraron una relación con las condiciones ambientales, cuando Protoperidinium obtusum, indicador de Aguas Costeras Frías (ACF) se distribuyó desde Paita hasta Mollendo (30 mn), Ceratium breve, indicador de AES fue registrado de manera normal al norte de los 6°S asociado en algunas estaciones a Ceratium praelongum y C. incisum, indicadores de Aguas Subtropicales Superficiales (ASS).

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Nucleotide composition analyses of bacterial genomes such as cumulative GC skew highlight the atypical, strongly asymmetric architecture of the recently published chromosome of Idiomarina loihiensis L2TR, suggesting that an inversion of a 600-kb chromosomal segment occurred. The presence of 3.4-kb inverted repeated sequences at the borders of the putative rearrangement supports this hypothesis. Reverting in silico this segment restores (1) a symmetric chromosome architecture; (2) the co-orientation of transcription of all rRNA operons with DNA replication; and (3) a better conservation of gene order between this chromosome and other gamma-proteobacterial ones. Finally, long-range PCRs encompassing the ends of the 600-kb segment reveal the existence of the reverted configuration but not of the published one. This demonstrates how cumulative nucleotide-skew analyses can validate genome assemblies.

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Thousands of chemical compounds enter the natural environment but many have unknown effects and consequences, in particular at low concentrations. This thesis work contributes to our understanding of pollution effects by using bacteria as test organisms. Bacteria are important for this question because some of them degrade and transform pollutants into less harmful compounds, but secondly because they themselves can be inhibited in their reproduction by exposure to toxic compounds. When inhibitory effects occur this may change the composition of the microbial com¬munity in the long run, leading to altered or diminished ecosystem services by those communities. As a result chemicals of anthropogenic origin may accumulate and per¬sist in the environment, and finally, affect higher organisms as well. In addition to acquiring basic understanding of pollutant effects at low concentrations on bacterial communities an applied goal of this thesis work was to develop bacteria-based tests to screen new organic chemicals for toxicity and biodégradation. In the first part of this work we developed a flow cytometry-based assay on SYT09 plus ethidium-bromide or propidium-iodide stained cells of Pseudomonas ûuorescens exposed or not to a variety of pollutants under oligotrophic growth conditions. Flow cytometry (FC) allows fast and accurate counting of bacterial cells under simul¬taneous assessment of their physiological state, in particular in combination with different fluorescent dyes. Here we employed FC and fluorescent dyes to monitor the effect that pollutants may exert on Pseudomonas ûuorescens SV3. First we designed an oligotrophic growth test, which enabled us to follow population growth at low densities (104 - 10 7 cells per ml) using 0.1 mM sodium acetate as carbon source. Cells in the oligotrophic milieu were then exposed or not to a variety of common pollutants, such as 2-chlorobiphenyl (2CBP), naphthalene (NAH), 4-chlorophenol (4CP), tetradecane (TD), mercury chloride (HgCl2) or benzene, in different dosages. Exposed culture samples were stained with SYT09 (green fluorescent dye binding nucleic acids, generally staining all cells) in combination with propidium iodide (PI) or ethidium bromide (EB), both dyes being membrane integrity indicators. We ob- served that most of the tested compounds decreased population growth in a dosage- dependent manner. SYT09/PI or SYT09/EB staining then revealed that chemical exposure led to arisal of subpopulations of live and injured or dead cells. By modeling population growth on the total cell numbers in population or only the subpopulation of live cells we inferred that even in stressed populations live cells multiply at rates no different to unexposed controls. The net decrease in population growth would thus be a consequence of more and more cells being not able to multiply at all, rather than all cells multiplying at slower rates. In addition, the proportion of injured cells correlated to the compound dosage. We concluded that the oligotrophic test may be useful to asses toxicity of unknown chemicals on a variety of model bacteria. Mul¬tiple tests can be run in parallel and effects are rapidly measured within a period of 8 hours. Interestingly, in the same exposure tests with P. fluorescens SV3 we observed that some chemicals which did not lead to a reduction of net population growth rates did cause measurable effects on live cells. This was mainly observed in cells within the live subpopulation as an increase of the EB fluorescence signal. We showed that SYT09/EB is a more useful combination of dyes than SYT09/PI because PI fluorescence tend to increase only when cells are effectively dead, but not so much in live cells (less then twofold). In contrast, EB geometric mean fluorescence in live cells increased up to eightfold after exposure to toxic compounds. All compounds even at the lowest concentration caused a measurable increase in EB geometric mean fluorescence especially after 2 h incubation time. This effect was found to be transient for cells exposed to 2CBP and 4CP, but chronic for cells incubated with TD and NAH (ultimately leading to cell death). In order to understand the mechanism underlying the observed effects we used known membrane or energy uncouplers. The pattern of EB signal increase in chemical-exposed populations resembled mostly that of EDTA, although EB fluorescence in EDTA-treated or pasteurized cells was even higher than after exposure to the four test chemicals. We conclude that the ability of cells to efflux EB under equilibrium conditions is an appropriate measure for the potential of a chemical to exert toxicity. Since most bacterial species possess efflux systems for EB that all require cellular energy, our test should be more widely relevant to infer toxicity effects of chemical exposure on the physiological status of the bacterial cell. To better understand the effect of toxicant exposure on efflux defense systems, we studied 2-hydroxybiphenyl toxicity to Pseudomonas azeiaica HBP1. We showed that 2-HBP exerts toxicity even to P. azelaica HBP1, but only at concentrations higher than 0.5 mM. Above this concentration transient loss of membrane polarization and integrity occurred, which we conclude from staining of growing cells with fluorescent dyes. Cells finally recover and resume growth on 2HBP. The high resistance of P. azelaica HBP1 to 2-HBP was found to be the result of an efficient MexABOprM- type efflux pump system counteracting passive influx of this compound into the membrane and cellular interior. Mutants with disrupted mexA, mexB and oprM genes did no longer grow on 2-HBP at concentrations above 100 μΜ, whereas below this concentration we found 2-HBP-concentration dependent decrease of growth rate. The MexAB-OprM system in P. azeiaica HBP1 is indeed an efflux pump for ethidium bromide as well. By introducing gfp reporter fusions responsive to intracellular 2- HBP concentrations into HBP1 wild-type or the mutants we demonstrated that 2HBP enters into the cells in a similar way. In contrast, the reporter system in the wild-type cells does not react to 2-HBP at an outside concentration of 2.4 μΜ, whereas in mutant cells it does. This suggests that wild-type cells pump 2-HBP to the outside very effectively preventing accumulation of 2-HBP. 2HBP metabolism, therefore, is not efficient enough to lower the intracellular concentration and prevent toxicity. We conclude that P. azelaica HBP1 resistance to 2-HBP is mainly due to an efficient efflux system and that 2HBP in high concentrations exerts narcotic effects on the bacterial membrane. In the part of this thesis, we investigated the possibilities of bacteria to degrade pollutants at low concentrations (1 mg per L and below). As test components we used 2-hydroxybiphenyl, antibiotics and a variety of fragrances, many of which are known to be difficult to biodegrade. By using accurate counting of low numbers of bacterial cells we could demonstrate that specific growth on these compounds is possible. We demonstrated the accuracy of FC counting at low cell numbers (down to 103 bacterial cells per ml). Then we tested whether bacterial population growth could be specifically monitored at the expense of low substrate concentrations, us¬ing P. azelaica HBP1. A perfect relationship was found between growth rate, yield and 2-HBP concentrations in the range of 0.1 up to 5 mg per L. Mixing P. azelaica within sludge, however, suggested that growth yields in a mixed community can be much lower than in pure culture, perhaps because of loss of metabolic intermediates. We then isolated new strains from activated sludge using 2-HBP or antibiotics (Nal, AMP, SMX) at low concentrations (0.1-1 mg per L) as sole carbon and energy sub¬strate and PAO microdishes. The purified strains were then examined for growth on their respective substrate, which interestingly, showed that all strains can not with¬stand higher than 1 or 10 mg per L concentrations of target substrate. Thus, bacteria must exist that contribute to compound degradation at low pollutant concentrations but are inhibited at higher concentrations. Finally we tested whether specific biomass growth (in number of cells) at the expense of pollutants can also be detected with communities as starting material. Hereto, we focused on a number of fragrance chemicals and measured community biomass increase by flow cytometry cell counting on two distinct starter communities: (i) diluted Lake Geneva water, and dilute activated sludge from a wastewater treatment plant. We observed that most of the test compounds indeed resulted in significant biomass increase in the starter community compared to a no-carbon added control, but activated sludge and lake Geneva water strongly differed (almost mutually ex¬clusive) in their capacity to degrade the test chemicals. In two cases for activated sludge the same type of microbial community developed upon compound exposure, as concluded from transcription fragment length polymorphism analysis on community purified and PCR amplified 16S rRNA gene fragments. To properly test compound biodegradability it is thus important to use starter communities of different origin. We conclude that FC counting can be a valuable tool to screen chemicals for their biodegradability and toxicity. - Des milliers de produits chimiques sont libérés dans l'environnement mais beaucoup ont des effets inconnus, en particulier à basses concentrations. Ce travail de thèse contribue à notre comprehension des effets de la pollution en utilisant des bacteries comme des organismes-tests. Les bacteries sont importantes pour etudier cette ques¬tion car certaines d'entre elles peuvent degrader ou transformer les polluants, mais également parce qu'elles-mmes peuvent tre inhibees dans leur reproduction après avoit ete exposees à ces composes toxiques. Quand des effets inhibiteurs ont lieu, la composition de la communauté microbienne peut tre changee à long terme, ce qui mène à une reduction du service d'ecosystème offert par ces communautés. En consequence, après leur liberation dans l'environnement, les produits chimiques d'origine anthropogenique peuvent soit s'y accumuler et per¬sister, exerant ainsi des effets encore inconnus sur les organismes vivants. En plus d'acquérir des connaissances de base sur les effets des polluants à basses concentra¬tions sur les communautés microbiennes, un but applique de cette thèse était de développer des tests bases sur les bacteries afin d'identifier de nouveau composes pour leur toxicité ou leur biodégradation. Dans la première partie de ce travail, nous avons developpe un test base sur la cytometrie de flux (FC) sur des cellules de Pseudomonas fluorescens colorees par du bromure d'ethidium ou de l'iodure de propidium et exposees ou non à une palette de polluants sous des conditions de croissance oligotrophique. La cytometrie de flux est une technique qui connaît de nombreuses applications dans la microbiologie environ¬nementale. Cela est principalement du au fait qu'elle permet un comptage rapide et precis ainsi que l'évaluation de l'état physiologique, en particulier lorsqu'elle est combinée h des colorations fluorescentes. Ici, nous avons utilise la technique FC et des colorants fluorescents afin de mesurer l'effet que peuvent exercer certains pollu¬ants sur Pseudomonas ûuorescens SV3 . D'abord nous avons conu des tests oligo- trophiques qui nous permettent de suivre la croissance complète de cellules en culture h des densites faibles (104 -10 7 cellules par ml), sur de l'acetate de sodium à 0.1 mM, en presence ou absence de produits chimiques (2-chlorobiphenyl (2CBP), naphthalène (NAH), 4-chlorophenol (4CP), tetradecane (TD), chlorure de mercure(II) (HgCl2)) à différentes concentrations. Afin de montrer le devenir des bacteries tant au niveau de la cellule individuelle que celui de la population globale, après exposition à des series de composes chimiques, nous avons compte les cellules colorees avec du SYT09 (col¬orant fluorescent vert des acides nucléiques pour la discrimination des cellules par rapport au bruit de fond) en combinaison avec l'iodure de propidium (PI) ou le bromure d'ethidium (EB), indicateurs de l'intégrité de la membrane cellulaire avec FC. Nous avons observe que de nombreux composes testes avaient un effet sur la croissance bacterienne, resultant en une baisse du taux de reproduction de la pop¬ulation. En outre, la double coloration que nous avons utilisee dans cette etude SYT09/PI ou SYT09/EB a montre que les produits chimiques testes induisaient une reponse heterogène des cellules dans la population, divisant celle-ci en sous- populations "saine", "endommagee" ou "morte". Les nombres de cellules à partir du comptage et de la proportion de celles "saines" et "endommagees/mortes" ont ensuite ete utilises pour modeliser la croissance de P. ûuorescens SV3 exposee aux produits chimiques. La reduction nette dans la croissance de population est une consequence du fait que de plus en plus de cellules sont incapables de se reproduire, plutt que du fait d'une croissance plus lente de l'ensemble de la population. De plus, la proportion de cellules endommagees est correllee au dosage du compose chimique. Les résultats obtenus nous ont permis de conclure que le test oligotrophique que nous avons developpe peut tre utilise pour l'évaluation de la toxicité de produits chimiques sur différents modèles bacteriens. Des tests multiples peuvent tre lances en parallèle et les effets sont mesures en l'espace de huit heures. Par ailleurs, nous en déduisons que les produits chimiques exercént un effet sur la croissance des cellules de P. ûuorescens SV3, qui est heterogène parmi les cellules dans la population et depend du produit chimique. Il est intéressant de noter que dans les mmes tests d'exposition avec P. ûuorescens SV3, nous avons observe que certains composes qui n'ont pas conduit à une reduction du taux de la croissance nette de la population, ont cause des effets mesurables sur les cellule saines. Ceci a ete essentiellement observe dans la portion "saine" des cellules en tant qu'augmentation du signal de la fluorescence de 1ΈΒ. D'abord nous avons montre que SYT09/EB était une com¬binaison de colorants plus utile que celle de SYT09/PI parce que la fluorescence du PI a tendance à augmenter uniquement lorsque les cellules sont effectivement mortes, et non pas dans les cellules saines (moins de deux fois plus). Par opposi¬tion, la fluorescence moyenne de l'EB dans les cellules saines augmente jusqu'à huit fois plus après exposition aux composes toxiques. Tous les composes, mme aux plus basses concentrations, induisent une augmentation mesurable de la fluorescence moy¬enne de 1ΈΒ, plus particulièrement après deux heures d'incubation. Cet effet s'est revele tre transitoire pour les cellules exposees aux 2CNP et 4CP, mais est chro¬nique pour les cellules incubees avec le TD et le NAH (entranant la mort cellulaire). Afin de comprendre les mécanismes qui sous-tendent les effets observes, nous avons utilise des decoupleurs d'energie ou de membrane. L'augmentation du signal EB dans les populations causee par des produits chimiques ressemblait à celle exerce par le chelateur des ions divalents EDTA. Cependant, les intensités du signal EB des cellules exposees aux produits chimiques testees n'ont jamais atteint les valeurs des cellules traitees avec l'EDTA ou pasteurises. Nous en concluons que le test oli- gotrophique utilisant la coloration (SYT09/)EB des cellules exposees ou non à un produit chimique est utile afin d'evaluer l'effet toxique exerce par les polluants sur la physiologie bacterienne. Afin de mieux comprendre la reaction d'un système de defense par pompe à efflux après exposition à une toxine, nous avons étudié la toxicité du 2-hydroxybiphenyl (2-HBP) sur Pseudomonas azeiaica HBP1. Nous avons montre que le 2-HBP exerce une toxicité mme sur HBP1, mais uniquement à des concentrations supérieures à 0.5 mM. Au-dessus de cette concentration, des pertes transitoires d'intégrité et de polarization membranaire ont lieu, comme cela nous a ete montre par coloration des cellules en croissance. Les cellules sont finalement capables de se rétablir et de reprendre leur croissance sur 2-HBP. La forte resistance de P. azeiaica HBP1 h 2-HBP physiologie bacterienne s'est revele tre le résultat d'un système de pompe h efflux de type MexABOprM qui contre-balance l'influx passif de ce compose h travers la membrane. Nous avons montre, en construisant des mutants avec des insertions dans les gènes mexA, mexB and oprM et des fusions avec le gène rapporteur gfp, que l'altération de n'importe quelle partie du système d'efflux conduisait à accroître l'accumulation de 2-HBP dans la cellule, en comparaison avec la souche sauvage HBP1, provoquant une diminution de la resistance au 2-HBP ainsi qu'une baisse du taux de reproduction des cellules. Des systèmes d'efflux similaires sont répandus chez de nombreuses espèces bactériennes. Ils seraient responsables de la resistance aux produits chimiques tels que les colorants fluorescents (bromure d'ethidium) et des antibiotiques. Nous concluons que la resistance de P. azelaica HBP1 à 2-HBP est principalement due à un système d'efflux efficace et que 2-HBP, à des concentrations elevees, exerce un effet deletère sur la membrane bacterienne. En se basant sur le comptage des cellules avec la FC, nous avons developpe ensuite une methode pour evaluer la biodegradabilite de polluants tels que le 2-HBP ainsi que les antibiotiques (acide nalidixique (Nal), ampicilline (AMP) ou sulfamethoxazole (SMX)) à de faibles concentrations lmg par L et moins), par le suivi de la croissance spécifique sur le compose de cultures microbiennes pures et mixtes. En utilisant un comptage precis de faibles quantités de cellules nous avons pu demontrer que la croissance spécifique sur ces composes est possible. Nous avons pu illustrer la precision du comptage par cytometrie de flux à faible quantité de cellules (jusqu'à 10 3 cellules par ml). Ensuite, nous avons teste s'il était possible de suivre dynamiquement la croissance de la population de cellules sur faibles concentrations de substrats, en utilisant P. azelaica HBP1. Une relation parfaite a ete trouvee entre le taux de croissance, le rendement et les concentrations de 2-HBP (entre 0.1 et 5 mg par L). En mélangeant HBP1 à de la boue active, nous avons pu montrer que le rendement en communauté mixtes pouvait tre bien inférieur qu'en culture pure. Ceci étant peut tre le résultat d'une perte d'intermédiaires métaboliques. Nous avons ensuite isole de nouvelles souches à partir de la boue active en utilisant le 2-HBP ou des antibiotiques (Nal, AMP, SMX) h basses concentrations (0.1-1 mg par L) comme seules sources de carbone et d'energie. En combinaison avec ceci, nous avons également utilise des microplaques PAO. Les souches purifiees ont ensuite ete examinees pour leurs croissances sur leurs substrats respectifs. De faon intéressante, toutes ces souches ont montre qu'elles ne pouvaient pas survivre à des concentrations de substrats supérieures à 1 ou 10 mg par L. Ainsi, il existe des bacteries qui contribuent à la degradation de composes à basses concentrations de polluant mais sont inhibes lorsque ces concentrations deviennent plus hautes. Finalement, nous avons cherche à savoir s'il est possible de detecter une croissance spécifique à une biomasse au depend d'un polluant, en partant d'une communauté microbienne. Ainsi, nous nous sommes concentre sur certains composes et avons mesure l'augmentation de la biomasse d'une communauté grce à la cytometrie de flux. Nous avons compte deux communautés de depart distinctes: (i) une dilution d'eau du Lac Léman, et une dilution de boue active d'une station d'épuration. Nous avons observe que la plupart des composes testes ont entrane une augmentation de la biomasse de depart par rapport au control sans addition de source de carbone. Néanmoins, les échantillons du lac Léman et de la station d'épuration différaient largement (s'excluant mutuellement l'un l'autre) dans leur capacité à degrader les composes chimiques. Dans deux cas provenant de la station d'épuration, le mme type de communauté microbienne s'est developpe après exposition aux composes, comme l'a démontré l'analyse TRFLP sur les fragments d'ARN 16S purifie de la communauté et amplifie par PCR. Afin de tester correctement la biodegradabilite d'un compose, il est donc important d'utiliser des communautés de depart de différentes origines Nous en concluons que le comptage par cytometrie de flux peut tre un outil de grande utilité pour mettre en valeur la biodegradabillite et la toxicité des composes chimiques.

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Resumo:

Sponge morphological plasticity has been a long-standing source of taxonomic difficulty. In the Caribbean, several morphotypes of the sponge Callyspongia vaginalis have been observed. To determine the taxonomic status of three of these morphotypes and their relationship with the congeneric species C. plicifera and C. fallax, we compared the spicule composition, spongin fiber skeleton and sequenced fragments of the mitochondrial genes 16S and COI and nuclear genes 28S and 18S ribosomal RNA. Phylogenetic analyses with ribosomal markers 18S and 28S rRNA confirmed the position of our sequences within the Callyspongiidae. None of the genetic markers provided evidence for consistent differentiation among the three morphotypes of C. vaginalis and C. fallax, and only C. plicifera stood as a distinct species. The 16S mtDNA gene was the most variable molecular marker for this group, presenting a nucleotide variability (π = 0.024) higher than that reported for COI. Unlike recent studies for other sponge genera, our results indicate that species in the genus Callyspongia maintain a high degree of phenotypic plasticity, and that morphological characteristics may not reflect reproductive boundaries in C. vaginalis.