Exploring the relationship between toxin and spore production in the human enteric pathogen Clostridium difficile

RESUMO: Clostridium difficile é presentemente a principal causa de doença gastrointestinal associada à utilização de antibióticos em adultos. C. difficile é uma bactéria Gram-positiva, obrigatoriamente anaeróbica, capaz de formar endósporos. Tem-se verificado um aumento dos casos de doença associada a C. difficile com sintomas mais severos, elevadas taxas de morbilidade, mortalidade e recorrência, em parte, devido à emergência de estirpes mais virulentas, mas também devido à má gestão do uso de antibióticos. C. difficile produz duas toxinas, TcdA e TcdB, que são os principais fatores de virulência e responsáveis pelos sintomas da doença. Estas são codificadas a partir do Locus de Patogenicidade (PaLoc) que codifica ainda para um regulador positivo, TcdR, uma holina, TcdE, e um regulador negativo, TcdC. Os esporos resistentes ao oxigénio são essenciais para a transmissão do organismo e recorrência da doença. A expressão dos genes do PaLoc ocorre em células vegetativas, no final da fase de crescimento exponencial, e em células em esporulação. Neste trabalho construímos dois mutantes de eliminação em fase dos genes tcdR e tcdE. Mostrámos que a auto-regulação do gene tcdR não é significativa. No entanto, tcdR é sempre necessário para a expressão dos genes presentes no PaLoc. Trabalho anterior mostrou que, com a exceção de tcdC, os demais genes do PaLoc são expressos no pré-esporo. Mostrámos aqui que TcdA é detectada à superfície do esporo maduro e que a eliminação do tcdE não influencia a acumulação de TcdA no meio de cultura ou em associação às células ou ao esporo. Estas observações têm consequências para o nosso entendimento do processo infecioso: sugeremque o esporo possa ser também um veículo para a entrega da toxina nos estágios iniciais da infecção, que TcdA possa ser libertada durante a germinação do esporo, e que o esporo possa utilizar o mesmo receptor reconhecido por TcdA para a ligação à mucosa do cólon.---------------------------ABSTRACT: Clostridium difficile is currently the major cause of antibiotic-associated gastrointestinal diseases in adults. This is a Gram-positive bacterium, endospore-forming and an obligate anaerobe that colonizes the gastrointestinal tract. Recent years have seen a rise in C. difficile associated disease (CDAD) cases, associated with more severe disease symptoms, higher rates of morbidity, mortality and recurrence, which were mostly caused due to the emergence of “hypervirulent” strains but also due to changing patterns of antibiotics use. C. difficile produces two potent toxins, TcdA and TcdB, which are the main virulence factors and the responsible for the disease symptoms. These are codified from a Pathogenicity Locus (PaLoc), composed also by the positive regulator, TcdR, the holin-like protein, TcdE, and a negative regulator, TcdC. Besides the toxins, the oxygen-resistant spores are also essential for transmission of the organism through diarrhea; moreover, spores can accumulate in the environment or in the host, which will cause disease recurrence. The expression of the PaLoc genes occurs in vegetative cells, at the end of the exponential growth phase, and in sporulating cells. In this work, we constructed two in-frame deletion mutants of tcdR and tcdE. We showed that the positive auto regulation of tcdR is not significant. However, tcdR is always necessary for the expression of the PaLoc genes. A previous work showed that, except tcdC, all the PaLoc genes are expressed in the forespore. Here, we detected TcdA at the spore surface. Furthermore, we showed that the in-frame deletion of tcdE does not affect the accumulation of TcdA in the culture medium or in association with cells or spores. This data was important for us to conclude about the infeccious process: it suggests that the spore may be the vehicle for the delivery of TcdA in early stages of infection, that TcdA may be released during spores germination and that this spore may use the same receptor recognized by TcdA to bind to the colonic mucosa.

Sexual dimorphism in resource acquisition and deployment: both size and timing matter.

Background and Aims The males and females of many dioecious plant species differ from one another in important life-history traits, such as their size. If male and female reproductive functions draw on different resources, for example, one should expect males and females to display different allocation strategies as they grow. Importantly, these strategies may differ not only between the two sexes, but also between plants of different age and therefore size. Results are presented from an experiment that asks whether males and females of Mercurialis annua, an annual plant with indeterminate growth, differ over time in their allocation of two potentially limiting resources (carbon and nitrogen) to vegetative (below-and above-ground) and reproductive tissues.Methods Comparisons were made of the temporal patterns of biomass allocation to shoots, roots and reproduction and the nitrogen content in the leaves between the sexes of M. annua by harvesting plants of each sex after growth over different periods of time.Key Results and Conclusions Males and females differed in their temporal patterns of allocation. Males allocated more to reproduction than females at early stages, but this trend was reversed at later stages. Importantly, males allocated proportionally more of their biomass towards roots at later stages, but the roots of females were larger in absolute terms. The study points to the important role played by both the timing of resource deployment and the relative versus absolute sizes of the sinks and sources in sexual dimorphism of an annual plant.

Prognostication after cardiac arrest and hypothermia: a prospective study.

Current American Academy of Neurology (AAN) guidelines for outcome prediction in comatose survivors of cardiac arrest (CA) have been validated before the therapeutic hypothermia era (TH). We undertook this study to verify the prognostic value of clinical and electrophysiological variables in the TH setting. A total of 111 consecutive comatose survivors of CA treated with TH were prospectively studied over a 3-year period. Neurological examination, electroencephalography (EEG), and somatosensory evoked potentials (SSEP) were performed immediately after TH, at normothermia and off sedation. Neurological recovery was assessed at 3 to 6 months, using Cerebral Performance Categories (CPC). Three clinical variables, assessed within 72 hours after CA, showed higher false-positive mortality predictions as compared with the AAN guidelines: incomplete brainstem reflexes recovery (4% vs 0%), myoclonus (7% vs 0%), and absent motor response to pain (24% vs 0%). Furthermore, unreactive EEG background was incompatible with good long-term neurological recovery (CPC 1-2) and strongly associated with in-hospital mortality (adjusted odds ratio for death, 15.4; 95% confidence interval, 3.3-71.9). The presence of at least 2 independent predictors out of 4 (incomplete brainstem reflexes, myoclonus, unreactive EEG, and absent cortical SSEP) accurately predicted poor long-term neurological recovery (positive predictive value = 1.00); EEG reactivity significantly improved the prognostication. Our data show that TH may modify outcome prediction after CA, implying that some clinical features should be interpreted with more caution in this setting as compared with the AAN guidelines. EEG background reactivity is useful in determining the prognosis after CA treated with TH.

The cells and peripheral representation of sodium taste in mice.

Salt taste in mammals can trigger two divergent behavioural responses. In general, concentrated saline solutions elicit robust behavioural aversion, whereas low concentrations of NaCl are typically attractive, particularly after sodium depletion. Notably, the attractive salt pathway is selectively responsive to sodium and inhibited by amiloride, whereas the aversive one functions as a non-selective detector for a wide range of salts. Because amiloride is a potent inhibitor of the epithelial sodium channel (ENaC), ENaC has been proposed to function as a component of the salt-taste-receptor system. Previously, we showed that four of the five basic taste qualities-sweet, sour, bitter and umami-are mediated by separate taste-receptor cells (TRCs) each tuned to a single taste modality, and wired to elicit stereotypical behavioural responses. Here we show that sodium sensing is also mediated by a dedicated population of TRCs. These taste cells express the epithelial sodium channel ENaC, and mediate behavioural attraction to NaCl. We genetically engineered mice lacking ENaCalpha in TRCs, and produced animals exhibiting a complete loss of salt attraction and sodium taste responses. Together, these studies substantiate independent cellular substrates for all five basic taste qualities, and validate the essential role of ENaC for sodium taste in mice.

The effect of age on the structure and compostition of the cell walls of Choanephora cucurbitarum

The effect of age on the structure and composition of isolated and purified cell walls from cultures of Choanephora cucurbitarum was investigated by microchemical analyses, visible and infrared spectrophotometry, x-ray diffractometry and electron microscopy. Qualitative evaluation revealed the presence of lipids, proteins, neutral sugars, strong alkali soluble sugars, chitin, chitosan and uronic acids in the cell walls of both the 1 and 7 day old cultures. As the mycelium aged, there was a slight but statistically significant increase in the protein content, and a pronounced rise in the chitin and neutral sugar constituents of the cell walls. Conversely, the decrease in the chitosan content during this period had the net effect of altering the chitin: chitosan ratio from near unity in the younger cultures, to a 2:1 ratio in the 7 day old cell wall samples. Glutaraldehyde-osmium fixed thin sections of the 1 day old vegetative hyphae of £. curbitarum revealed the presence of a monolayered cell wall, which upon aging became bilayered. Replicas of acid hydrolysed cell walls demonstrated that both the 1 and 7 day old samples possessed an outer layer which was composed of finely granular amorphous material and randomly distributed microfibrils. The deposition of an inner secondary layer composed of parallel oriented microfibrils in the older hypha was correlated with an increase in the chitin content in the cell wall. The significance of these results with respect to the intimate relationship between composition and structure is discussed.

The impact of wine closure and packaging type, and light and temperature exposure on the concentration of 3-alkyl-2 -methoxypyrazines and other key constituents of wine

3-alkyl-2-methoxypyrazines (MPs) are grape- and insect-derived odor-active compounds responsible for vegetative percepts that are detrimental to wine quality when elevated. This study tested both the effect of closure/packaging types and light/temperature storage conditions on MPs (isopropyl-, secbutyl-, and isobutyl-MP) in wine. An MP-emiched wine rapidly (after 140 hours) and significantly decreased in MP concentration after natural and synthetic cork contact (immersion of closures in wine). This decrease was greatest with synthetic closures (70% - 89% reduction) and secbutyl-MP. Subsequently storage trials tested the effects of commercial closure/packaging options (natural cork, agglomerate cork, synthetic corks, screwcaps and TetraPak® cartons) on MPs in MP-emiched Riesling and Cabernet Franc over 18 months. Regardless of packaging, isobutyl-MP was the most altered from bottling. Notably, all MP levels tended to decrease to the greatest extent in TetraPak® cartons (~34% for all MPs) and there was evidence of contribution ofisoproyl- and secbutyl-MP from cork-based closures (i.e. ~30% increase in secbutyl-MP after 6 months) or from an unidentified wine constituent. To test the effects of various light/temperature conditions (light exposed at ambient temperature in three different bottle hues, light excluded at ambient temperature and light excluded at a "cellar" temperature (14°C)), MP-emiched Riesling and Cabernet Franc were also analyzed for MP concentrations over 12 months. MPs did not vary consistently with light or temperature. Other odorants and physico-chemical properties were tested in all wines during storage trials and closely agree with previous literature. These results provide novel insights into MPs during ageing, interactions with packaging and storage conditions, and assist in the selection of storage conditions/packaging for optimal wine quality.

Impact of different irrigation strategies on grapes and wine quality of four grapevine cultivars (Vitis sp.) in cool climate conditions. An investigation into the relationships among ABA, water status, grape cultivar and wine quality

Niagara Peninsula of Ontario is the largest viticultural area in Canada. Although it is considered to be a cool and wet region, in the last decade many water stress events occurred during the growing seasons with negative effects on grape and wine quality. This study was initiated to understand and develop the best strategies for water management in vineyards and those that might contribute to grape maturity advancement. The irrigation trials investigated the impact of time of initiation (fruit set, lag phase and veraison), water replacement level based on theoretical loss through crop evapotranspiration (ETc; 100,50 and 25%) and different irrigation strategies [partial root zone drying (PRD) versus regulated deficit irrigation (RD!)] on grape composition and wine sensory profiles. The irrigation experiments were conducted in a commercial vineyard (Lambert Vineyards Inc.) located in Niagara-on-the-Lake, Ontario, from 2005 through 2009. The two experiments that tested the combination of different water regimes and irrigation time initiation were set up in a randomized block design as follows: Baco noir - three replicates x 10 treatments [(25%, 50% and 100% of ETc) x (initiation at fruit set, lag phase and veraison) + control]; Chardonnay - three replicates x seven treatments [(25%, 50% and 100% of ETc) x (initiation at fruit set and veraison) + control]. The experiments that tested different irrigation strategies were set up on two cultivars as follows: Sauvignon blanc - four replicates x four treatments [control, fully irrigated (100% ETc), PRD (100% ETc) and RDI (25% ETc)]; Cabemet Sauvignon - four replicates x five treatments [control, fully irrigated (100% ETc), PRD (100% ETc), RDI (50% ETc) and RDI (25% ETc)]. The controls in each experiment were nonirrigated. The irrigation treatments were compared for many variables related to soil water status, vine physiology, berry composition, wine sensory profile, and hormone composition [(abscisic acid (ABA) and its catabolites]. Soil moisture profile was mostly affected by irrigation treatments between 20 and 60 em depth depending on the grapevine cultivar and the regime of water applied. Overall soil moisture was consistently higher throughout the season in 100 and 50% ETc compare to the control. Transpiration rates and leaf temperature as well as shoot growth rate were the most sensitive variables to soil water status. Drip irrigation associated with RDI treatments (50% ETc and 25% ETc) had the most beneficial effects on vine physiology, fruit composition and wine varietal typicity, mainly by maintaining a balance between vegetative and reproductive parts of the vine. Neither the control nor the 100 ETc had overall a positive effect on grape composition and wine sensory typicity. The time of irrigation initiation affected the vine physiology and grape quality, the most positive effect was found in treatments initiated at lag phase and veraison. RDI treatments were overall more consistent in their positive effect on grape composition and wine varietal typicity comparing to PRD treatment. The greatest difference between non-irrigated and irrigated vines in most of the variables studied was found in 2007, the driest and hottest season of the experimental period. Soil water status had a greater and more consistent effect on red grapevine cultivars rather than on white winegrape cultivars. To understand the relationships among soil and plant water status, plant physiology and the hormonal profiles associated with it, abscisic acid (ABA) and its catabolites [phaseic acid (PA), dihydrophaseic acid (DPA), 7-hydroxy-ABA (TOH-ABA), 8' -hydroxy-ABA, neophaseic acid and abscisic acid glucose ester (ABA-GE)] were analyzed in leaves and berries from the Baco noir and Chardonnay irrigation trials over two growing seasons. ABA and some of its catabolites accurately described the water status in the vines. Endogenous ABA and some of its catabolites were strongly affected in Baco noir and Chardonnay by both the water regime (i.e. ET level) and timing of irrigation initiation. Chardonnay grapevines produced less ABA in both leaves and berries compared to Baco noir, which indicated that ABA synthesis is also cultivar dependant. ABA-GE was the main catabolite in treatments with high water deficits, while PA and DPA were higher in treatments with high water status, suggesting that the vine produced more ABA-GE under water deficits to maintain rapid control of the stomata. These differences between irrigation treatments with respect to ABA and catabolites were particularly noticeable in the dry 2007 season. Two trials using exogenous ABA investigated the effect of different concentrations of ABA and organs targeted for spraying, on grape maturation and berry composition of Cabemet Sauvignon grapevines, in two cool and wet seasons (2008-2009). The fIrst experiment consisted of three replicates x three treatments [(150 and 300 mg/L, both applications only on clusters) + untreated control] while the second experiment consisted in three replicates x four treatments [(full canopy, only clusters, and only leaves sprayed with 300 ppm ABA) + untreated control]. Exogenous ABA was effective in hastening veraison, and improving the composition of Cabemet Sauvignon. Ability of ABA to control the timing of grape berry maturation was dependant on both solution concentration and the target organ. ABA affected not only fruit composition but also yield components. Berries treated with ABA had lower weight and higher skin dry mass, which constitutes qualitative aspects desired in the wine grapes. Temporal advancement of ripening through hormonal control can lead to earlier fruit maturation, which is a distinct advantage in cooler areas or areas with a high risk of early frost occurrence. Exogenous ABA could provide considerable benefits to wine industry in terms of grape composition, wine style and schedule activities in the winery, particularly in wet and cool years. These trials provide the ftrst comprehensive data in eastern North America on the response of important hybrid and Vitis vinifera winegrape cultivars to irrigation management. Results from this study additionally might be a forward step in understanding the ABA metabolism, and its relationship with water status. Future research should be focused on ftnding the ABA threshold required to trigger the ripening process, and how this process could be controlled in cool climates.

Les facteurs à homéodomaine Pitx et Irx au cours du développement des membres postérieurs

Les facteurs de transcription Pitx ont été impliqués dans la croissance et la détermination de l’identité des membres postérieurs. D’abord, l’inactivation de Pitx1 chez la souris résulte en la transformation partielle des membres postérieurs en membres antérieurs. Ensuite, la double mutation de Pitx1 et de Pitx2 a montré l’activité redondante de ces facteurs pour la croissance des membres postérieurs. Ainsi, les souris mutantes Pitx1-/-;Pitx2néo/néo montrent une perte des éléments squelettiques proximaux et antérieurs. Des travaux récents ont impliqué les gènes de la famille des Iroquois dans le développement des membres. Tout particulièrement, les souris Irx3-/-;Irx5-/- montrent la perte des éléments squelettiques proximaux et antérieurs, exclusivement au niveau des membres postérieurs. Cette phénocopie entre les souris mutantes pour Pitx1/2 et Irx3/5 nous a amenés à poser trois hypothèses : (1) les Pitx sont responsables de l’expression de Irx dans les bourgeons postérieurs ; (2) à l’inverse, les Irx dirigent l’expression des Pitx ; (3) les Pitx et les Irx participent ensemble au programme génétique de croissance des bourgeons postérieurs. Nous avons pu conclure que les Pitx et les Irx font partie de cascades de régulation indépendantes l’une de l’autre et qu’ils sont capables d’interaction transcriptionnelle autant sur un promoteur générique que sur des régions conservées du locus de Tbx4. Enfin, autant l’inactivation Pitx que celle des Irx mène à un retard d’expression de Pax9 exclusivement dans les bourgeons postérieurs. Ainsi, les Pitx et les Irx semblent agir sur des programmes génétiques parallèles impliqués dans la croissance et le patterning des membres postérieurs.

Rôle de la protéine ScFRK1 dans le développement du sac embryonnaire et son impact sur le guidage des tubes polliniques

Le gène Solanum chacoense Fertilization-Related Kinase 1 (ScFRK1) code pour une protéine de la famille des MAPKK kinases exprimée spécifiquement dans les ovules. Son transcrit s’accumule principalement dans la zone micropylaire du sac embryonnaire à l’anthèse et diminue rapidement après pollinisation. Ces résultats suggèrent un rôle possible avant ou pendant la fécondation. Bien qu'aucune expression ne soit détectée dans le pollen à maturité, la protéine est cependant présente dans les cellules mères de microspores. Des plantes transgéniques sous-exprimant ScFRK1 ne montrent aucun phénotype au niveau des tissus végétatifs, mais présentent de petits fruits dépourvus de graines. L’étude microscopique du gamétophyte femelle révèle que son développement ne progresse pas au-delà du stade de la mégaspore fonctionnelle et une grande proportion de sacs embryonnaires anormaux est corrélée avec une faible expression de ScFRK1. De plus, la production de pollen viable diminue en fonction de la baisse des niveaux d’expression du gène, ce qui pourrait s’expliquer par un problème au cours de la mitose I. Puisque l’intégrité du sac embryonnaire est essentielle au guidage des tubes polliniques, nous avons conçu un système de guidage semi-in vivo permettant d’évaluer la capacité des ovules du mutant ScFRK1 à les attirer. L’attraction est sévèrement affectée dans de telles conditions, ce qui confirme l'implication des cellules de la zone micropylaire comme source attractive. Notre système nous a également permis de démontrer que le guidage est très spécifique à l’espèce et que cette attraction constitue un mécanisme important favorisant la spéciation et la maintenance des barrières interspécifiques dans la reproduction sexuée des végétaux.

Les manifestations subtiles du stress dans le continuum de la psychose

RÉSUMÉ L’étiologie de la schizophrénie est complexe et le modèle de vulnérabilité-stress (Nuechterlein & Dawson, 1984) propose que des facteurs de vulnérabilité d’ordre génétique combinés à une histoire environnementale de stress particulier pousseraient l’individu vers un état clinique de psychose. L’objectif principal de cette thèse est de mieux comprendre la réaction physiologique des personnes schizophrènes face à un stress psychologique, tout en conceptualisant les symptômes psychotiques comme faisant partie d’un continuum, plutôt que de les restreindre sur un plan catégoriel. Afin de faire la différence entre les patients schizophrènes et les individus de la population générale, au-delà de la sévérité de leurs symptômes psychotiques, leur réaction au stress est comparée et le phénomène de seuil critique dans la réaction de cortisol est exploré en tant que point décisif pouvant distinguer entre les deux groupes. La première étude de cette thèse (Brenner et al., 2007) examine la fiabilité, la validité et la structure factorielle du Community Assessment of Psychic Experiences (CAPE) (Stefanis et al., 2002), avec un échantillon francophone et anglophone de la population nord américaine, un questionnaire auto-administré de 42 items qui évalue les expériences quasi-psychotiques présentes dans la population générale : des symptômes positifs (ou psychotiques), négatifs (ou végétatifs) et dépressifs. Ce questionnaire a été complété par un échantillon de 2 275 personnes de la population montréalaise. Les résultats appuient la consistance interne des 3 sous-échelles originales. De plus, l’analyse factorielle exploratoire suggère des solutions de 3-5 facteurs, où les solutions à 4 et 5 facteurs proposent de séparer les symptômes positifs en sous-catégories plus spécifiques. Finalement, cette étude suggère une version plus courte du CAPE, avec seulement 23 items, tout en préservant les mêmes trois échelles originales. La toile de fond de cet article confirme l’existence du phénomène du continuum de la psychose, où une variation de symptômes psychotiques peut se retrouver aussi bien dans la population générale que dans la population clinique. Dans une deuxième étude (Brenner et al., 2009), cette thèse examine à quel point la réponse de l’hormone de stress, le cortisol, à un test de stress psychosocial nommé le Trier Social Stress Test (TSST) (Kirschbaum, Pirke, & Hellhammer, 1993), peut établir une différence entre les sujets témoins et les patients schizophrènes, tout en contrôlant des variables importantes. Un groupe de 30 personnes schizophrènes et un groupe de 30 sujets de la population générale, recrutés lors de la première étude de cette thèse, ont participé à cette recherche qui est construite selon un plan expérimental. Le groupe témoin inclut des personnes légèrement symptomatiques et un chevauchement des scores psychotiques existe entre les deux groupes. Suite au stresseur, les deux groupes démontrent une augmentation significative de leur rythme cardiaque et de leur pression artérielle. Cependant, leur réponse de cortisol a tendance à différer : les patients schizophrènes présentent une réponse de cortisol plus petite que celle des témoins, mais en atteignant un seuil statistique significatif seulement à la mesure qui suit immédiatement le stresseur. Ces résultats significatifs sont obtenus en contrôlant pour la sévérité des symptômes positifs, un facteur discriminant significatif entre les deux groupes. Ainsi, le niveau de cortisol mesuré immédiatement après le stresseur se révèle être un marqueur de seuil critique pouvant établir une distinction entre les deux groupes. Aussi, leur réponse de cortisol maximale a tendance à apparaître plus tard que chez les sujets témoins. De façon générale, la réaction au stress des deux groupes étudiés est un autre moyen d’observer la continuité d’un comportement présent chez les individus, jusqu’à ce qu’un seuil critique soit atteint. Ainsi, il est possible de trancher, à un moment donné, entre psychose clinique ou absence de diagnostic.

Le diabète maternel influence la morphogenèse rénale et la programmation périnatale

Le diabète maternel est un facteur de risque majeur pour le développement de malformations congénitales. Dans le syndrome de l’embryopathie diabétique, l’exposition prolongée du fœtus à de hautes concentrations ambientes de glucose induit des dommages qui peuvent affecter plusieurs organes, dont les reins. Les malformations rénales sont la cause de près de 40 pourcent des cas d’insuffisance rénale infantile. L’hyperglycémie constitue un environnement utérin adverse qui nuit à la néphrogenèse et peut causer l’agenèse, la dysplasie (aplasie) ou l’hypoplasie rénale. Les mécanismes moléculaires par lesquels les hautes concentrations ambientes de glucose mènent à la dysmorphogenèse et aux malformations demeurent toutefois mal définis. Le diabète maternel prédispose aussi la progéniture au développement d’autres problèmes à l’âge adulte, tels l’hypertension, l’obésité et le diabète de type 2. Ce phénomène appelé ‘programmation périnatale’ a suscité l’intérêt au cours des dernières décennies, mais les mécanismes responsables demeurent mal compris. Mes études doctorales visaient à élucider les mécanismes moléculaires par lesquels le diabète maternel ou un environnement in utero hyperglycémique affecte la néphrogenèse et programme par la suite la progéniture a développer de l’hypertension par des observations in vitro, ex vivo et in vivo. Nous avons utilisé les cellules MK4, des cellules embryonnaires du mésenchyme métanéphrique de souris, pour nos études in vitro et deux lignées de souris transgéniques (Tg) pour nos études ex vivo et in vivo, soient les souris HoxB7-GFP-Tg et Nephrin-CFP-Tg. Les souris HoxB7-GFP-Tg expriment la protéine fluorescente verte (GFP) dans le bourgeon urétérique (UB), sous le contrôle du promoteur HoxB7. Les souris Nephrin-CFP expriment la protéine fluorescente cyan (CFP) dans les glomérules, sous le contrôle du promoteur nephrin spécifique aux podocytes. Nos études in vitro visaient à déterminer si les hautes concentrations de glucose modulent l’expression du gène Pax2 dans les cellules MK4. Les cellules MK4 ont été traitées pendant 24h avec du milieu contenant soit 5mM D-glucose et 20mM D-mannitol ou 25mM D-glucose et avec ou sans antioxydants ou inhibiteurs de p38 MAPK, p44/42 MAPK, PKC et NF-kB. Nos résultats ont démontré que le D-glucose élevé (25mM) augmente la génération des espèces réactives de l’oxygène (ROS) dans les cellules MK4 et induit spécifiquement l’expression du gène Pax2. Des analogues du glucose tels le D-mannitol, L-glucose ou le 2-Deoxy-D-glucose n’induisent pas cette augmentation dans les cellules MK4. La stimulation de l’expression du gène Pax2 par le D-glucose dans les cellules MK4 peut être bloquée par des inhibiteurs des ROS et de NF-kB, mais pas par des inhibiteurs de p38 MAPK, p44/42 MAPK ou PKC. Ces résultats indiquent que la stimulation de l’expression du gène Pax2 par les concentrations élevées de glucose est due, au moins en partie, à la génération des ROS et l’activation de la voie de signalisation NF-kB, et non pas via les voies PKC, p38 MAPK et p44/42 MAPK. Nos études ex vivo s’intéressaient aux effets d’un milieu hyperglycémique sur la morphogenèse de la ramification du bourgeon urétérique (UB). Des explants de reins embryonnaires (E12 à E18) ont été prélevés par micro-dissection de femelles HoxB7-GFP gestantes. Les explants ont ensuite été cultivés dans un milieu contenant soit 5mM D-glucose et 20mM D-mannitol ou 25mM D-glucose et avec ou sans antioxydants, catalase ou inhibiteur de PI3K/AKT pour diverses durées. Nos résultats ont démontré que le D-glucose stimule la ramification du UB de manière spécifique, et ce via l’expression du gène Pax2. Cette augmentation de la ramification et de l’expression du gène Pax2 peut être bloquée par des inhibiteurs des ROS et de PI3K/AKT. Ces études ont démontré que les hautes concentrations de glucose altèrent la morphogenèse de la ramification du UB via l’expression de Pax2. L’effet stimulant du glucose semble s’effectuer via la génération des ROS et l’activation de la voie de signalisation Akt. Nos études in vivo visaient à déterminer le rôle fondamental du diabète maternel sur les défauts de morphogenèse rénale chez la progéniture. Dans notre modèle animal, le diabète maternel est induit par le streptozotocin (STZ) chez des femelles HoxB7-GFP gestantes (E13). Les souriceaux ont été étudiés à différents âges (naissants et âgés de une, deux ou trois semaines). Nous avons examiné leurs morphologie rénale, nombre de néphrons, expression génique et les événements apoptotiques lors de cette étude à court terme. La progéniture des mères diabétiques avait un plus faible poids, taille et poids des reins, et possédait des glomérules plus petits et moins de néphrons par rapport à la progéniture des mères contrôles. La dysmorphogenèse rénale observée est peut-être causée par l’augmentation de l’apoptose des cellules dans la région du glomérule. Nos résultats ont montré que les souriceaux nés de mères diabétiques possèdent plus de podocytes apoptotiques et plus de marquage contre la caspase-3 active dans leurs tubules rénaux que la progéniture des mères contrôles. Les souriceaux des mères diabétiques montrent une augmentation de l’expression des composants du système rénine angiotensine (RAS) intrarénal comme l’angiotensinogène et la rénine, ainsi qu’une augmentation des isoformes p50 et p65 de NF-kB. Ces résultats indiquent que le diabète maternel active le RAS intrarénal et induit l’apoptose des glomérules, menant à une altération de la morphogenèse rénale de la progéniture. En conclusion, nos études ont permis de démontrer que le glucose élevé ou l’environnement in utero diabétique altère la morphogenèse du UB, qui résulte en un retard dans la néphrogenèse et produit des reins plus petits. Cet effet est dû, au moins en partie, à la génération des ROS, à l’activation du RAS intrarénal et à la voie NF-kB. Nos études futures se concentreront sur les mécanismes par lesquels le diabète maternel induit la programmation périnatale de l’hypertension chez la progéniture adulte. Cette étude à long terme porte sur trois types de progénitures : adultes nés de mères contrôles, diabétiques ou diabétiques traitées avec insuline pendant la gestation. Nous observerons la pression systolique, la morphologie rénale et l’expression de divers gènes et protéines. Nous voulons de plus déterminer si la présence d’un système antioxydant (catalase) peut protéger la progéniture des effets néfastes des ROS causés par l’environnement in utero hyperglycémique. Les souris Catalase-Tg expriment la catalase spécifiquement dans les tubules proximaux et nous permettrons d’explorer notre hypothèse sur le rôle des ROS dans notre modèle expérimental de diabète maternel.

Enjeux éthiques, défis dans les soins de santé et prise de décisions pour les patients souffrant de troubles neurologiques de la conscience

Le coma, l’état végétatif et l’état de conscience minimale sont classés comme « troubles de la conscience ». La caractéristique commune à ces diagnostics est un état de conscience altéré. La technologie permet désormais de maintenir en vie les individus affligés de ces diagnostics. La nature même de leur condition et les soins disponibles pour ces patients conduisent à des dilemmes médicaux et éthiques importants. Ce mémoire propose une brève introduction des troubles de la conscience suivie d’une recension des écrits sur les enjeux éthiques et sociaux en lien avec ces diagnostics. Force est de constater que certains enjeux perdurent depuis des années comme le retrait de traitement. D’autres sont apparus plus récemment, comme l’enjeu lié à l’usage de la neuroimagerie. Un deuxième volet présente les résultats d’une étude qualitative examinant les perspectives et l’expérience des professionnels de la santé face aux enjeux éthiques lors de la prise en charge des patients atteints de troubles de la conscience. Cette étude a été réalisée par le biais d’un court questionnaire et d’entrevues semi-dirigées qui furent enregistrées puis analysées à l’aide du logiciel Nvivo. Les résultats démontrent entre autres que les répondants éprouvent un niveau de certitude élevé face au diagnostic bien qu’il soit souvent signalé comme un défi important dans la littérature. Le pronostic représente un enjeu crucial, y compris sa divulgation aux proches. Enfin, la relation avec la famille est un élément clé dans la prise en charge des patients et celle-ci est teintée par de multiples facteurs.

Expression des cotransporteurs cation-chlorure KCC2 et NKCC1 au cours du développement de la moelle épinière de l’opossum Monodelphis domestica

L’inhibition est nécessaire à la génération d’outputs coordonnés entre muscles antagonistes lors de la locomotion. Une baisse de la concentration neuronale en ions chlorure au cours du développement des mammifères conduit à l’émergence de l’inhibition. Cette baisse repose sur l’équilibre entre deux cotransporteurs cation-chlorure, KCC2 et NKCC1. KCC2 expulse Cl- de la cellule alors que NKCC1 pompe Cl- dans la cellule. L’opossum Monodelphis domestica naît dans un état très immature. Le seul comportement locomoteur qu’il présente à la naissance consiste en des mouvements rythmiques et alternés des membres antérieurs pour grimper le long du ventre de la mère vers une tétine. Les membres postérieurs sont des bourgeons immobiles dont le développement est en grande partie postnatal. Pour cette raison, cette espèce constitue un modèle idéal pour l’étude du développement locomoteur. Afin d’étudier les mécanismes conduisant à l’émergence de l’inhibition durant le développement moteur, nous avons décrit l’expression développementale de KCC2 et NKCC1 chez l’opossum postnatal par immunohistochimie au niveau des renflements spinaux. Les motoneurones et afférences primaires ont été identifiés en utilisant un marquage rétrograde au TRDA. Le marquage pour KCC2 et NKCC1 est détecté dans la moelle épinière ventrale dans la matière grise et blanche présomptive dès la naissance, ce qui suggère que l’inhibition serait déjà mise en place avant la naissance, permettant subséquemment l’alternance des membres antérieurs observée chez les nouveau-nés. L’expression développementale de KCC2 et NKCC1 suit des gradients ventrodorsal et médiolatéral, tels qu’observés chez les rongeurs (rats et souris). Le patron mature d’expression de ces cotransporteurs est observé aux alentours de la 5ème semaine postnatale lorsque la locomotion de l’opossum est mature. Enfin, entre la naissance et P5, les dendrites exprimant KCC2 au niveau de la corne dorsale sont retrouvées en apposition aux afférences primaires ce qui suggère un rôle de KCC2 dans la formation des circuits sensori-moteurs.

Lignes d'argumentation de la littérature relative à la non-initiation, l'arrêt de traitement, et l'euthanasie de patients inaptes

Des décisions médicales en fin de vie sont souvent prises pour des patients inaptes. Nous avons souhaité connaître les argumentations éthiques entourant ces décisions difficiles. Notre objectif était de pouvoir comprendre et apprécier ces lignes d’argumentation. Pour atteindre cet objectif, nous avons répertorié et analysé les lignes argumentatives présentes dans des articles scientifiques, incluant les sections de correspondance et commentaires des journaux savants. Afin d’éviter que les résultats de notre analyse soient trop influencés par les caractéristiques d’un problème médical spécifique, nous avons décidé d’analyser des situations cliniques distinctes. Les sujets spécifiques étudiés sont la non-initiation du traitement antibiotique chez des patients déments souffrant de pneumonie, et l’euthanasie de nouveau-nés lourdement hypothéqués selon le protocole de Groningen. Notre analyse des lignes d’argumentation répertoriées à partir des débats entourant ces sujets spécifiques a révélé des caractéristiques communes. D’abord, les arguments avancés avaient une forte tendance à viser la normativité. Ensuite, les lignes d’argumentation répertoriées étaient principalement axées sur les patients inaptes et excluaient largement les intérêts d’autrui. Nous n’avons trouvé aucune des lignes d’argumentation à visée normative répertoriés concluante. De plus, nous avons trouvé que l’exclusion catégorique d’arguments visant l’intérêt d’autrui des considérations entrainait l’impossibilité d’ évaluer leur validité et de les exclure définitivement de l’argumentaire. Leur présence non-explicite et cachée dans les raisonnements motivant les décisions ne pouvait alors pas être exclue non plus. Pour mieux mettre en relief ces conclusions, nous avons rédigé un commentaire inspiré par les argumentaires avancés dans le contexte de l’arrêt de traitement de Terri Schiavo, patiente en état végétatif persistant. Nous pensons que l’utilisation d’un argumentaire qui viserait davantage à rendre les actions intelligibles, et sans visée normative immédiate, pourrait contribuer à une meilleure compréhension réciproque des participants au débat. Une telle argumentation nous semble aussi mieux adaptée à la complexité et l’unicité de chaque cas. Nous pensons qu’elle pourrait mieux décrire les motivations de tous les acteurs participant à la décision, et ainsi contribuer à une plus grande transparence. Cette transparence pourrait renforcer la confiance dans l’authenticité du débat, et ainsi contribuer à une meilleure légitimation de pratiques cliniques.

Systematics and floral evolution of the Dialiinae (Caesalpinioideae), a diverse lineage of tropical legumes

Le clade Dialiinae représente l’une des premières lignées de la sous-famille Caesalpinioideae des Leguminosae. Il se compose de 17 genres (environ 90 espèces), avec des taxons qui sont répandus dans toutes les régions tropicales du monde. Morphologiquement, le groupe comprend un assemblage divers de taxons qui peut représenter une «phase expérimentale» dans l’évolution florale des légumineuses. Différents représentants du clade présentent de la poly-, mono-, et asymétrie, et semblent avoir subi un haut degré de perte d’organe, produisant, dans certains cas, des fleurs extrêmement réduites qui sont à peine reconnaissables comme appartenant à la famille des légumineuses. Afin d’obtenir une image plus claire de l’évolution florale du clade Dialiinae, une phylogénie bien résolue et bien soutenue est nécessaire. Dans le but de créer une telle phylogénie, un total de 37 échantillons d’ADN des Dialiinae a été séquencé pour deux régions chloroplastiques, soit rps16 et trnL. De plus, une étude morphologique complète a été réalisée. Un total de 135 caractères végétatifs et reproductifs a été évalué pour 79 espèces de Dialiinae et pour quatre groupes externes. Les analyses phylogénétiques ont d’abord été effectuées sur un groupe restreint de taxons pour lesquels les trois types de données étaient disponibles. Les nœuds fortement soutenus de cette phylogénie ont ensuite été utilisés comme contrainte pour une seconde analyse de parcimonie avec les données morphologiques d’un ensemble plus important de taxons. Les caractères morphologiques ont été optimisés sur l’un des arbres les plus parcimonieux de cette seconde analyse. Un certain nombre de nouvelles relations au niveau de l’espèce ont été résolues, créant une image plus claire quant à l’évolution de la forme florale dans le temps, particulièrement pour les genres Labichea et Dialium. En plus de leur morphologie florale mature diverse, les Dialiinae sont également très variables dans leur ontogénèse florale, affichant à la fois la perte et la suppression des organes, et présentant une variété de modes d’initiation d’organes. Afin de construire une image plus complète du développement floral et de l’évolution dans ce clade, l’ontogénèse florale de plusieurs espèces non documentées à ce jour a été étudiée. La série complète du développement a été compilée pour six espèces de Dialiinae; quatre de Dialium, ainsi que Poeppigia procera et Mendoravia dumaziana. Le mode et le moment de l’initiation des organes étaient pour la plupart uniforme pour toutes les espèces de Dialium étudiés. Tant pour ce qui est des gains ou des pertes d’organes chez Dialium, une tendance est apparente – l’absence d’organe abaxial. Que ce soit pour les sépales ou les étamines, les gains se produisent toujours en position médiane adaxiale, tandis que les étamines et les pétales perdus sont toujours les organes les plus ventraux. Les taxons étudiés ici illustrent le manque apparent de canalisation du développement observé chez les Caesalpinioideae. Cette plasticité ontogénétique est le reflet de la diversité morphologique au niveau des fleurs tel qu’observée dans l’ensemble de la sous-famille. Une des espèces de Dialiinae, Apuleia leiocarpa, produit une inflorescence andromonoïque, une caractéristique qui est unique en son clade et rare dans les légumineuses dans son ensemble. La microscopie optique et électronique ont été utilisées pour entreprendre une étude détaillée de la morphologie florale de ce taxon. On a constaté que tandis que les fleurs hermaphrodites produisent un seul carpelle et deux étamines, les fleurs staminées produisent trois étamines sans toutefois montrer signe de développement du carpelle. Les inflorescences semblent produire près de quatre fois plus de fleurs staminées que de fleurs hermaphrodites, lesquelles occupent toujours la position centrale de l’inflorescence cymeuse. Ce ratio élevé mâle/bisexuel et la détermination précoce du sexe chez Apuleia sont rares chez les Caesalpinioideae, ce qui suggère que l’andromonoecie se développe dans ce genre comme un moyen d’accroître la dispersion du pollen plutôt qu’en réponse à des limitations de ressources.