Molecular mechanisms and effects of a rasgap-derived peptide on metastatic progression

Cancer is the second leading cause of mortality worldwide. Cancer progression leads to metastasis formation, which accounts for more than ninety percent of cancer-related death. Metastases are more difficult to be surgically removed because of their invasive behavior and shape. In addition, during their transformation journey, they become more and more resistant to anticancer drugs. Significant improvements have been achieved in therapy against cancer in recent years but targeting the metastatic cascade remains the Achilles heel of the cure against cancer. A First step in the metastatic process is the escape of cancer cells from the primary tumor site. This involves an increase in cell motility and the concomitant ability to clear a path through the extracellular matrix. From a therapeutic point of view, inhibition of cell migration is a logical approach to develop anti-metastatic drugs. Our lab previously developed a cell permeable peptide derived from a caspase-3-generaied fragment of the RasGAP protein called TAT-RasGAP317-326. This peptide efficiently and specifically sensitizes cancer cells to chemotherapy- and radiotherapy-induced ceil death, which allows decreasing the anticancer drug doses and eventually their associated side- effects. In the present study we discovered that TAT-RasGAP317.326 also increases cell adhesion which was associated with inhibition of cell migration and invasion into the extracellular matrix. The ability of TAT-RasGAP317.326 to increase ceil adhesion involves the dramatic depolymerization of actin cytoskekton together with redistribution of focal adhesions. We found that the inhibitory effects on migration were mediated by a RhoGAP tumor and metastasis suppressor cailed DLC1 (Deleted in Liver Cancer 1). Moreover. DEC 1 was found to be a direct RasGAP-interacting protein and this interaction requires the RasGAP tryptophan 317 residue, the very first RasGAP residue of TAT-RasGAP317.326. We then evaluated the roie of RasGAP fragments in the in vivo metastatic cascade. We found that breast cancer cells overexpressing the parental RasGAP fragment, to which the TAT-RasGAP317.326 peptide belongs, have a markedly decreased ability to form lung metastases. Unfortunately, we were not able to recapitulate these an ti-metastatic effects when TAT-RasGAP317.326 was injected. However, we later understood that this was due to the fact that TAT-RasGAP317.326 was not properly delivered to the primary tumors. Further work, aimed at better understanding of how TAT-RasGAP317.326 functions, revealed that the ten amino acid TAT-RasGAP317.326 peptide could, be narrowed down to a three amino acid TAT-RasGAP317.329 peptide while keeping its sensitizer activity. In parallel, investigations on the RasGAP-DLCl binding indicated that the arginine linger of the DLC1 GAP domain is required for this interaction, which suggests that TAT-RasGAP317.326 modulates the GAP activity of DLC1. Additional work should be performed to fully elucidate its mechanism of action and render TAT-RasGAP317.326 usable as a tool to fight cancer on two fronts, by improving chemotherapy and preventing metastatic progression. - Le cancer est la deuxième cause de mortalité dans le monde. La formation de métastases est la dernière étape de la progression cancéreuse et représente plus du nonante pour cent des morts induites par le cancer. De par leur morphologie et comportement invasifs, ii est difficile d'avoir recours à la chirurgie pour exciser des métastases. De plus, les cellules cancéreuses en progression deviennent souvent de plus en plus résistantes aux drogues anticancéreuses. Ces dernières années, des avancements significatifs ont contribué à l'amélioration de la lutte contre le cancer. Néanmoins, pouvoir cibler spécifiquement la cascade métastatique demeure cependant le talon d'Achille des thérapies anticancéreuses. Une première étape dans ie processus métastatique est l'évasion des cellules cancéreuses du site de la tumeur primaire. Ceci requiert une augmentation de la motiliié cellulaire couplée à la capacité de se frayer un chemin au sein de la matrice extracelluiaire. D'un point de vue thérapeutique, inhiber la migration cellulaire est une approche attrayante. Notre laboratoire a développé un peptide, nommé TAT-RasGAP317.326 dérivé d'un fragment qui est lui-même le résultat du clivage de la protéine RasGAP par la caspase-3. Ce peptide est capable de pénétrer les cellules cancéreuses et de les sensibiliser spécifiquement à la mort induite par la radiothérapie et la chimiothérapie. La finalité des effets de ce peptide est de pouvoir diminuer les doses des traitements anti-cancéreux et donc des effets secondaires qu'ils engendrent. Dans cette étude, nous avons découvert que TAT-RasGAP317.326 augmente l'adhésion des cellules et inhibe la migration cellulaire ainsi que l'invasion des cellules à travers une matrice extracellulaire. La capacité de TAT-RasGAP317.326 à induire l'adhésion repose sur ia dépolymérisation du cytosquelette d'actine associée à une redistribution des points d'ancrage cellulaire. Nous avons découvert que l'inhibition de ia migration par TAT-RasGAP317.326 nécessitait la présence d'un suppresseur de tumeur et de métastases appelé DLC1 (Deleted in Liver Cancer l), qui par ailleurs s'avère aussi être une protéine RhoGAP. De plus, nous avons aussi trouvé que DLC1 était un partenaire d'interaction de RasGAP et que cette interaction s'effectuait via l'acide aminé tryptophane 317 de RasGAP. qui s'avère être le premier acide aminé du peptide TAT-RasGAP317.326. Nous avons ensuite évalué le rôle joué par certains fragments de RasGAP dans le processus de métastatisation. Dans ce contexte, des cellules de cancer du sein qui sur-expriment un fragment de RasGAP contenant la séquence TAT-RasGAP317.326 ont vu leur potentiel métastatique diminuer drastiquerment. Malheureusement, aucun effet anti-métastatique n'a été obtenu après injection de TAT-RasGAP317.326 dans les souris. Cependant, nous avons réalisé rétrospectivement que TAT-RasGAP317.326 n'était pas correctement délivré à la tumeur primaire, ce qui nous empêche de tirer des conclusions sur le rôle anti-métastatique de ce peptide. La suite de cette étude visant à mieux comprendre comment TAT-RasGAP317.326 agit, a mené à la découverte que les dix acides aminés de TAT-RasGAP317.326 pouvaient être réduits à trois acides aminés, TAT-RasGAP317.329, tout en gardant l'effet sensibilisateur à la chimiothérapie. En visant à élucider le mode d'interaction entre RasGAP et DLC1, nous avons découvert qu'un acide aminé nécessaire à l'activité GAP de DLC1 était requis pour lier RasGAP, ce qui laisse présager que TAT-RasGAp317.32c, module i'activité GAP de DLC1. Des travaux supplémentaires doivent encore être effectués pour complètement élucider les mécanismes d'action de TAT-RasGAP317.326 et afin de pouvoir l'utiliser comme un outil pour combattre le cancer sur deux fronts, en améliorant les chimiothérapies et en inhibant la formation de métastases.

Mise en oeuvre de protocoles spatiaux pour analyser la modulation de processus cognitifs en fonction de la dimension émotionnelle chez le rongeur

Résumé : Emotion et cognition sont deux termes généralement employés pour désigner des processus psychiques de nature opposée. C'est ainsi que les sciences cognitives se sont longtemps efforcées d'écarter la composante «chaude »des processus «froids »qu'elles visaient, si ce n'est pour montrer l'effet dévastateur de la première sur les seconds. Pourtant, les processus cognitifs (de collecte, maintien et utilisation d'information) et émotioAnels (d'activation subjective, physiologique et comportementale face à ce qui est attractif ou aversif) sont indissociables. Par l'approche neuro-éthologique, à l'interface entre le substrat biologique et les manifestations comportementales, nous nous sommes intéressés à une fonction cognitive essentielle, la fonction mnésique, classiquement exprimée chez le rongeur par l'orientation spatiale. Au niveau du substrat, McDonald et White (1993) ont montré la dissociation de trois systèmes de mémoire, avec les rôles de l'hippocampe, du néostriatum et de l'amygdale dans l'encodage des informations respectivement épisodiques, procédurales et émotionnelles. Nous nous sommes penchés sur l'interaction entre ces systèmes en fonction de la dimension émotionnelle par l'éclairage du comportement. L'état émotionnel de l'animal dépend de plusieurs facteurs, que nous avons tenté de contrôler indirectement en comparant leurs effets sur l'acquisition, dans diverses conditions, de la tâche de Morris (qui nécessite la localisation dans un bassin de la position d'une plate-forme submergée), ainsi que sur le style d'exploration de diverses arènes, ouvertes ou fermées, plus ou moins structurées par la présence de tunnels en plexiglas transparent. Nous avons d'abord exploré le rôle d'un composant du système adrénergique dans le rapport à la difficulté et au stress, à l'aide de souris knock-out pour le récepteur à la noradrénaline a-1 B dans un protocole avec 1 ou 4 points de départ dans un bassin partitionné. Ensuite, nous nous sommes penchés, chez le rat, sur les effets de renforcement intermittent dans différentes conditions expérimentales. Dans ces conditions, nous avons également tenté d'analyser en quoi la situation du but dans un paysage donné pouvait interférer avec les effets de certaines formes de stress. Finalement, nous avons interrogé les conséquences de perturbations passées, y compris le renforcement partiel, sur l'organisation des déplacements sur sol sec. Nos résultats montrent la nécessité, pour les souris cont~ô/es dont l'orientation repose sur l'hippocampe, de pouvoir varier les trajectoires, ce qui favoriserait la constitution d'une carte cognitive. Les souris a->B KO s'avèrent plus sensibles au stress et capables de bénéficier de la condition de route qui permet des réponses simples et automatisées, sous-tendues par l'activité du striatum. Chez les rats en bassin 100% renforcé, l'orientation apparaît basée sur l'hippocampe, relayée par le striatum pour le développement d'approches systématiques et rapides, avec réorientation efficace en nouvelle position par réactivation dépendant de l'hippocampe. A 50% de renforcement, on observe un effet du type de déroulement des sessions, transitoirement atténué par la motivation Lorsque les essais s'enchaînent sans pause intrasession, les latences diminuent régulièrement, ce qui suggère une prise en charge possible par des routines S-R dépendant du striatum. L'organisation des mouvements exploratoires apparaît dépendante du niveau d'insécurité, avec différents profils intermédiaires entre la différentiation maximale et la thigmotaxie, qui peuvent être mis en relation avec différents niveaux d'efficacité de l'hippocampe. Ainsi, notre travail encourage à la prise en compte de la dimension émotionnelle comme modulatrice du traitement d'information, tant en phase d'exploration de l'environnement que d'exploitation des connaissances spatiales. Abstract : Emotion and cognition are terms widely used to refer to opposite mental processes. Hence, cognitive science research has for a long time pushed "hot" components away from "cool" targeted processes, except for assessing devastating effects of the former upon the latter. However, cognitive processes (of information collection, preservation, and utilization) and emotional processes (of subjective, physiological, and behavioral activation roue to attraction or aversion) are inseparable. At the crossing between biological substrate and behavioral expression, we studied a chief cognitive function, memory, classically shown in animals through spatial orientation. At the substrate level, McDonald et White (1993) have shown a dissociation between three memory systems, with the hippocampus, neostriatum, and amygdala, encoding respectively episodic, habit, and emotional information. Through the behavior of laboratory rodents, we targeted the interaction between those systems and the emotional axis. The emotional state of an animal depends on different factors, that we tried to check in a roundabout way by the comparison of their effects on acquisition, in a variety of conditions, of the Morris task (in which the location of a hidden platform in a pool is required), as well as on the exploration profile in different apparatus, open-field and closed mazes, more or less organized by clear Plexiglas tunnels. We first tracked the role, under more or less difficult and stressful conditions, of an adrenergic component, with knock-out mice for the a-1 B receptor in a partitioned water maze with 1 or 4 start positions. With rats, we looked for the consequences of partial reinforcement in the water maze in different experimental conditions. In those conditions, we further analyzed how the situation of the goal in the landscape could interfere with the effect of a given stress. At last, we conducted experiments on solid ground, in an open-field and in radial mazes, in order to analyze the organization of spatial behavior following an aversive life event, such as partial reinforcement training in the water maze. Our results emphasize the reliance of normal mice to be able to vary approach trajectories. One of our leading hypotheses is that such strategies are hippocampus-dependent and are best developed for of a "cognitive map like" representation. Alpha-1 B KO mice appear more sensitive to stress and able to take advantage of the route condition allowing simple and automated responses, most likely striatum based. With rats in 100% reinforced water maze, the orientation strategy is predominantly hippocampus dependent (as illustrated by the impairment induced by lesions of this structure) and becomes progressively striatum dependent for the development of systematic and fast successful approaches. Training towards a new platform position requires a hippocampus based strategy. With a 50% reinforcement rate, we found a clear impairment related to intersession disruption, an effect transitorily minimized by motivation enhancement (cold water). When trials are given without intrasession interruption, latencies consistently diminish, suggesting a possibility for striatum dependent stimulus-response routine to occur. The organization of exploratory movements is shown to depend on the level of subjective security, with different intermediary profiles between maximum differentiation and thigmotaxy, which can be considered in parallel with different efficiency levels of the hippocampus dependent strategies. Thus, our work fosters the consideration of emotion as a cognitive treatment modulator, during spatial exploration as well as spatial learning. It leads to a model in which the predominance of hippocampus based exploration is challenged by training conditions of various nature.

Molecular dissection of Arabidopsis thaliana endodermis development, structure and function

In vascular plants, the endodermis establishes a protective diffusion barrier surrounding the vasculature preventing the passive, uncontrolled entry of nutrients absorbed by the plant. It does so by means of a differentiation feature, the "Casparian Strip" (CS), a highly localized cell wall impregnation made of lignin, which seals the extracellular space. Although the existence of this differentiation feature has been intensively described, the mechanisms establishing this hallmark remain obscure. In this work I report, the developmental sequence of events that leads to a differentiated endodermis, in the plant model Arabidopsis thaliana. In addition, my descriptive approach gave important insights as to how these cells define membrane domains involved in the directional transport of nutrients. I also participated in characterizing a new transmembrane protein family, the CASPs, localized to the membrane domain underlying the CS, which we accordingly named the Casparian Strip membrane Domain (CSD). Our molecular analysis indicates that these proteins drive CS establishment. To identify more molecular factors of CS establishment, I performed a forward genetic screen. This screen led to the identification of 11 endodermis permissive mutants, which we named schengen (sgn) mutants. The causative mutations have been mapped to 5 independent loci: SGN1 to SGN5. SGN1 and SGN3 encode Receptor Like Kinases involved in the correct establishment of the CSD. A lack of those kinases leads to an incomplete CSD, which gives rise to interrupted CS barriers. Interestingly, SGN1 seems to also regulate CSD positioning to the middle of endodermal transversal walls. SGN4 encodes an NADPH oxidase involved in lignin polymerization essential for CS formation. The sgn5 mutant induces extra divisions of cortical cells strongly affecting the cell identity, but also leading to incorrect differentiation. A thorough characterization of the sgn2 mutant will follow elsewhere, yet preliminary results indicate that SGN2 encodes an Acyl-CoA N-acyltransferase. . In summary, with my work I have contributed a first set of molecular players of Casparian strip formation and initiated their characterization. Eventually, this might lead to an understanding of the molecular mechanisms of CS establishment in A.thaliana . This in turn will hopefully help to better understand nutrient uptake in higher plants and their response to environmental stresses. - Au sein des plantes vasculaires, l'endoderme représente un tissu protecteur mettant en place une barrière imperméable, empêchant n'importe quel élément de rejoindre les tissus conducteurs par simple diffusion. Cette barrière, appelée « Cadre de Caspary », correspond à une lignification de la paroi de l'endoderme et donne lieu à un cloisonnement de l'espace intercellulaire. Bien que cet élément de différenciation soit décrit en détail, sa mise en place reste incomprise. Cette étude indique la suite d'événements aboutissant à l'établissement du cadre de Caspary chez la plante modèle Arabidopsis thaliana. De plus, ce travail apporte de nouvelles connaissances expliquant comment ces cellules définissent des domaines membranaires importants pour le transport des nutriments. Nous décrivons une nouvelle famille de protéines membranaires, les CASPs (« CAparian Strip membrane domain Proteins »), localisées dans un domaine membranaire longeant le cadre de Caspary : le domaine de Caspary (CSD). L'analyse moléculaire des CASPs indique qu'elles dirigent la formation du cadre de Caspary. Par ailleurs, une approche génétique directe nous a permis d'identifier 11 mutants ayant un endoderme perméable. Nous avons nommé ces mutants Schengen, en référence à la zone de libre échange européenne. Les mutations impliquées dans ces mutants affectent 5 gènes désignés de SGN1 à SGN5. SGN1 et SGN3 produisent des protéines de type kinases (« Receptor-like Kinases », RLK) qui participent à la délimitation du CSD. L'absence de ces kinases aboutit à un domaine CSD incomplet, se traduisant par un cadre de Caspary discontinu. De plus, SGN1 semble réguler le positionnement du CSD au milieu de la paroi transversale de l'endoderme. SGN4 produit une enzyme de type NADPH oxydase impliquée dans la polymérisation du cadre de Caspary. Dans le mutant sgn5, on observe une division anormale des cellules du cortex créant ainsi une nouvelle couche cellulaire incapable d'achever sa différenciation en endoderme. Quant à la mutation sgn2, bien que nous pensons qu'elle affecte une Acyl-CoA N-acyltransferase, sa caractérisation ne sera réalisée que prochainement. Au final, ce travail procure de nouveaux éléments sur l'établissement du cadre de Caspary qui pourraient être importants afin de comprendre comment les plantes sélectionnent leurs nutriments et résistent à des conditions environnementales parfois hostiles. - De par leur immobilité, les plantes terrestres n'ont pas d'autre choix que de puiser leurs ressources dans leur environnement direct. La plante extrait du sol les nutriments qui lui sont nécessaires et les redistribue grâce à des tissus conducteurs. Afin de ne pas s'intoxiquer, il est donc essentiel de pouvoir sélectionner les éléments entrant dans la racine. Etonnement, ce n'est pas la surface des racines qui permet ce contrôle mais un tissu interne appelé endoderme. Ce dernier forme une barrière imperméable qui entoure chaque cellule et crée une jointure permettant de bloquer le passage des éléments entre les cellules. Cette structure, appelée « cadre de Caspary », oblige les éléments à entrer dans les cellules de l'endoderme et à être ainsi sélectionnés. Bien que cette structure soit décrite en détail, sa mise en place reste incomprise. Cette étude indique la suite d'événements qui aboutit à la formation du cadre de Caspary chez la plante modèle Arabidopsis thaliana. Ce travail apporte également de nouvelles connaissances expliquant comment ces cellules définissent, organisent et dirigent le transport des nutriments. Nous décrivons comment certains éléments de la cellule, les protéines CASPs (CAsparian Strip membrane domain Proteins), sont organisées un domaine particulier des membranes afin de créer une plateforme de construction longeant le cadre de Caspary : le domaine de Caspary (CSD). Afin de déterminer ce qu'il se passerait si une plante ne possédait pas de cadre de Caspary, nous avons réalisé une mutagénèse, ou approche génétique directe, et identifié 11 mutants (individu ayant un gène défectueux conduisant à la perte d'une fonction) ayant un endoderme perméable. Nous avons nommé ces mutants schengen, en référence à la zone de libre échange européenne. Les mutations impliquées dans ces mutants affectent 5 gènes désignés de SGN1 à SGN5. Les gènes SGN1 et SGN3 produisent des protéines de type kinases (« Receptor-like Kinases », RLK) servant à l'établissement de la plateforme de construction. L'absence de ces kinases aboutit à une base incomplète, se traduisant par un cadre de Caspary discontinu. Qui plus est, la kinase SGN1 semble réguler le positionnement de la plateforme au milieu de l'endoderme. Le gène SGN4 est par contre, impliqué dans la construction à proprement dite du cadre de Caspary. Dans le mutant sgn5, on observe une nouvelle couche de cellules ressemblant à de l'endoderme mais incapable de former correctement une barrière identique au cadre de Caspary. Quant au dernier mutant, sgn2, bien que cette étude fournisse des indices permettant de comprendre pourquoi le mutant sgn2 est défectueux, nous n'expliquerons ce cas que prochainement. En résumé, ce travail procure de nouvelles connaissances sur l'établissement du cadre de Caspary qui pourraient être importantes afin de comprendre comment les plantes sélectionnent leurs nutriments et résistent à des conditions environnementales parfois hostiles.

Predicting spatial patterns of plant biodiversity : from species to communities

Understanding the distribution and composition of species assemblages and being able to predict them in space and time are highly important tasks io investigate the fate of biodiversity in the current global changes context. Species distribution models are tools that have proven useful to predict the potential distribution of species by relating their occurrences to environmental variables. Species assemblages can then be predicted by combining the prediction of individual species models. In the first part of my thesis, I tested the importance of new environmental predictors to improve species distribution prediction. I showed that edaphic variables, above all soil pH and nitrogen content could be important in species distribution models. In a second chapter, I tested the influence of different resolution of predictors on the predictive ability of species distribution models. I showed that fine resolution predictors could ameliorate the models for some species by giving a better estimation of the micro-topographic condition that species tolerate, but that fine resolution predictors for climatic factors still need to be ameliorated. The second goal of my thesis was to test the ability of empirical models to predict species assemblages' characteristics such as species richness or functional attributes. I showed that species richness could be modelled efficiently and that the resulting prediction gave a more realistic estimate of the number of species than when obtaining it by stacking outputs of single species distribution models. Regarding the prediction of functional characteristics (plant height, leaf surface, seed mass) of plant assemblages, mean and extreme values of functional traits were better predictable than indices reflecting the diversity of traits in the community. This approach proved interesting to understand which environmental conditions influence particular aspects of the vegetation functioning. It could also be useful to predict climate change impacts on the vegetation. In the last part of my thesis, I studied the capacity of stacked species distribution models to predict the plant assemblages. I showed that this method tended to over-predict the number of species and that the composition of the community was not predicted exactly either. Finally, I combined the results of macro- ecological models obtained in the preceding chapters with stacked species distribution models and showed that this approach reduced significantly the number of species predicted and that the prediction of the composition is also ameliorated in some cases. These results showed that this method is promising. It needs now to be tested on further data sets. - Comprendre la manière dont les plantes se répartissent dans l'environnement et s'organisent en communauté est une question primordiale dans le contexte actuel de changements globaux. Cette connaissance peut nous aider à sauvegarder la diversité des espèces et les écosystèmes. Des méthodes statistiques nous permettent de prédire la distribution des espèces de plantes dans l'espace géographique et dans le temps. Ces modèles de distribution d'espèces, relient les occurrences d'une espèce avec des variables environnementales pour décrire sa distribution potentielle. Cette méthode a fait ses preuves pour ce qui est de la prédiction d'espèces individuelles. Plus récemment plusieurs tentatives de cumul de modèles d'espèces individuelles ont été réalisées afin de prédire la composition des communautés végétales. Le premier objectif de mon travail est d'améliorer les modèles de distribution en testant l'importance de nouvelles variables prédictives. Parmi différentes variables édaphiques, le pH et la teneur en azote du sol se sont avérés des facteurs non négligeables pour prédire la distribution des plantes. Je démontre aussi dans un second chapitre que les prédicteurs environnementaux à fine résolution permettent de refléter les conditions micro-topographiques subies par les plantes mais qu'ils doivent encore être améliorés avant de pouvoir être employés de manière efficace dans les modèles. Le deuxième objectif de ce travail consistait à étudier le développement de modèles prédictifs pour des attributs des communautés végétales tels que, par exemple, la richesse en espèces rencontrée à chaque point. Je démontre qu'il est possible de prédire par ce biais des valeurs de richesse spécifiques plus réalistes qu'en sommant les prédictions obtenues précédemment pour des espèces individuelles. J'ai également prédit dans l'espace et dans le temps des caractéristiques de la végétation telles que sa hauteur moyenne, minimale et maximale. Cette approche peut être utile pour comprendre quels facteurs environnementaux promeuvent différents types de végétation ainsi que pour évaluer les changements à attendre au niveau de la végétation dans le futur sous différents régimes de changements climatiques. Dans une troisième partie de ma thèse, j'ai exploré la possibilité de prédire les assemblages de plantes premièrement en cumulant les prédictions obtenues à partir de modèles individuels pour chaque espèce. Cette méthode a le défaut de prédire trop d'espèces par rapport à ce qui est observé en réalité. J'ai finalement employé le modèle de richesse en espèce développé précédemment pour contraindre les résultats du modèle d'assemblage de plantes. Cela a permis l'amélioration des modèles en réduisant la sur-prédiction et en améliorant la prédiction de la composition en espèces. Cette méthode semble prometteuse mais de nouveaux tests sont nécessaires pour bien évaluer ses capacités.

Les troubles alimentaires atypiques : recherche qualitative auprès d'adolescentes suivies dans un groupe thérapeutique

RESUMELes troubles des conduites alimentaires atypiques (TCAA) représentent une catégorie diagnostique émergente, relativement peu décrite. Ils regroupent des tableaux cliniques ne satisfaisant pas entièrement aux critères des troubles alimentaires typiques anorexie et boulimie. Désignés par le terme de EDNOS' dans le DSM-IV2 (American Psychiatrie Association, 1994), ils sont appelés troubles atypiques dans la CIM-103 (World Health Organization, 1993).Les TCAA représentent la majorité des demandes dans les consultations pour troubles alimentaires, concernent une grande proportion de la population non-consultante et constituent un enjeu de santé publique prioritaire.Cette étude se penche sur le parcours de 24 jeunes filles présentant de tels troubles, qui ont été suivies dans le cadre d'un groupe thérapeutique à l'UMSA (Unité Multidisciplinaire de Santé des Adolescents, CHUV, Lausanne). Elle a pour but de mieux connaître ces troubles alimentaires atypiques.Deux axes de questions de recherche organisent ce travail: le premier, orienté autour du trouble alimentaire atypique, de sa définition (avec les questions de classification diagnostique) et de son évolution (avec les questions de passages d'une catégorie à une autre), le second autour du groupe thérapeutique, de son utilité et de ses indications.1. Résultats cliniquesLes résultats de l'analyse thématique décrivent un trouble important, qui induit une souffrance plus intense que ne tendraient à le laisser penser la relative banalité de la présentation clinique en comparaison des troubles typiques ainsi que la catégorisation en tant que troubles résiduels. Des moyens compensatoires -qui visent au maintien d'un poids stable en dépit des crises alimentaires ainsi qu'à la perte de poids, soit par des méthodes non-purgatives (restrictions massives, diètes, jeûnes, pratique du sport à outrance), soit par des méthodes purgatives (vomissements auto-induits, usage de laxatifs, diurétiques) - sont présents chez 15 participantes, sous forme de vomissements chez 6 d'entre elles. Seize participantes ont présenté des troubles des menstruations. Des difficultés de la lignée anxio-dépressive sont relevées chez la moitié des participantes, alliées à un perfectionnisme important. L'estime de soi apparaît globalement basse, excessivement influencée par l'insatisfaction attachée au poids et aux formes corporelles. L'analyse fait clairement apparaître le lien complexe unissant les attitudes face à l'alimentation et le désir de maigrir aux crises de frénésie alimentaire. Les crises permettent aux patientes de moduler leurs émotions, tant .positives que négatives. Le vécu de la maladie et des préoccupations pour le corps et l'alimentation semble généralisable. et «transcatégorique», bien que les troubles alimentaires de l'ordre de l'anorexie atypique restrictive, du fait de l'absence de crises de frénésie, semblent appartenir à un registre différent des troubles avec perte de contrôle sur l'alimentation et crises, notamment en termes d'implications dans la vie quotidienne.Lorsque les participantes sont revues (au minimum un an après la sortie du groupe thérapeutique), 15 d'entre elles sont indemnes de tout symptôme, 5 présentent encore un TCAA type boulimie atypique, et 4 ont parfois des crises résiduelles. Des préoccupations pour l'alimentation et le poids subsistent. Le pronostic d'évolution n'apparaît lié ni à la durée de participation au groupe, ni uniquement à la catégorie diagnostique ou aux seuls éléments de co-morbidité, mais davantage à un investissement rapidement positif du groupe, ainsi qu'à la qualité des prises en charge parallèles en présence d'éléments de co-morbidité importants ou d'antécédents d'autres troubles alimentaires.Notre collectif atteste de passages d'une catégorie de trouble à une autre (anorexie puis boulimie, comme décrit dans la littérature) et de changements d'intensité (trouble typique puis atypique) au cours de la maladie, confirmant un continuum possible, tant entre les troubles typiques, qu'entre les troubles typiques et atypiques. Néanmoins, la multiplicité des parcours possibles dans la maladie, ainsi que l'existence de formes stables, sans passages d'une catégorie à une autre, incite à la prudence et ne permet pas de confirmer en tout point l'hypothèse de la nature dimensionnelle (même nature, intensité différente) des troubles alimentaires.Le trouble atypique représente parfois une étape dans l'évolution à partir d'un trouble typique, pouvant être envisagé comme moment sur le chemin de la guérison, ce qui pose la question des critères de guérison.2. Nature des troubles alimentaires atypiquesDu collectif émergent 4 catégories diagnostiques de troubles alimentaires atypiques: hyperphagie boulimique, boulimie atypique non-purgative, boulimie atypique purgative et anorexie atypique restrictive. Le tableau clinique.de l'hyperphagie boulimique comporte des crises de boulimie, mais peu de préoccupations concernant le poids et les formes corporelles en compá= raison des 3 autres catégories, et pas de moyens de compensation des crises, ce qui induit fréquemment un surpoids voire une obésité pour les patientes concernées. Les moyens de compensation des crises de boulimie demeurent non-purgatives (jeûne, sport) dans la boulimie atypique non-purgative, alors que vomissements et usage de laxatifs suite aux crises caractérisent la boulimie atypique purgative. Le tableau clinique de l'anorexie atypique restrictive ne présente ni crises de boulimie ni moyens de compensation purgatifs type vomissements. Ces catégories sont retrouvées dans la littérature.Nos résultats rejoignent la littérature actuelle qui envisage la nécessité d'une reclassification des troubles alimentaires en vue du DSM-V. Dans l'intervalle, adopter la classification de la CIM et parler d'anorexie atypique, de -type restrictif ou avec crises, de boulimie atypique, purgative ou non, et y ajouter l'hyperphagie boulimique, rendrait mieux compte de la réalité clinique des troubles alimentaires atypiques que ne le fait la classe des EDNOS du DSM, peu différenciée, mêlant des tableaux très divers et au final insatisfaisante.3. Utilité et indication du groupeLe groupe recèle un fort pouvoir thérapeutique pour les patientes qui s'y impliquent. L'étayage sur les autres émerge comme facteur thérapeutique principal, ainsi que le décrit la littérature. Cette prise en charge thérapeutique convient particulièrement à des patientes présentant un trouble alimentaire sur le versant boulimique, comprenant l'hyperphagie boulimique, la boulimie atypique, purgative ou non, ainsi que certaines boulimies de moyenne gravité. Les patientes du collectif qui présentent des difficultés de l'ordre de l'anorexie atypique restrictive bénéficient moins du groupe que les participantes qui expérimentent des pertes de contrôle sur la nourriture.4. ImplicationsL'intensité de la souffrance, la complexité des tableaux symptomatiques, la diversité des parcours et les multiples répercussions sur la vie sociale démontrent l'importance de repérer et prendre en charge ces troubles alimentaires qui demeurent souvent banalisés. Dans cette perspective, la formation au dépistage, à l'évaluation et à la prise en charge des divers intervenants confrontés à ces troubles représente un enjeu majeur. .Enfin, dénoncer les pressions socioculturelles à la minceur et le dictat des régimes, promouvoir une notion de bien-être et une bonne estime de soi qui ne soient pas liées à l'apparence contribuera à prévenir les troubles alimentaires atypiques.

La place des instruments d'évaluation du risque de récidive dans la pratique de l'expertise psychiatrique pénale: l'exemple lausannois

Nous décrivons dans cet article la pratique de l'expertise psychiatrique pénale telle qu'elle est effectuée au centre d'expertises de l'Institut de psychiatrie légale du département de psychiatrie du CHUV à Lausanne. Y est notamment abordée la question de la place réservée à l'utilisation d'instruments d'évaluation du risque de récidive. Qu'ils soient actuariels ou à type de raisonnement clinique structuré, ces instruments nous paraissent pouvoir trouver à s'inscrire dans une démarche méthodologique rigoureuse, dans la mesure où celle-ci se déploie dans une perspective qui reste fondée sur la clinique.

La recherche biomédicale en Suisse : espace social, discours et pratiques

Cette étude porte sur la recherche biomédicale en Suisse dans une perspective interprétative. Elle s'intéresse à l'usage que font les acteurs scientifiques et institutionnels de la catégorie «biomédical», à la signification qu'ils en donnent et aux processus de structuration de la recherche biomédicale autour de ces enjeux de catégorisation. Nous avons formulé l'hypothèse que le «biomédical» pouvait être considéré comme un label, à savoir une stratégie discursive de positionnement des acteurs, ou pouvait constituer un champ, à savoir un espace social de recherche fortement structuré. Pour pouvoir vérifier la validité de ces hypothèses, trois perspectives analytiques ont été retenues: topographie, discours et pratiques. Dans un premier temps, nous avons établi une topographie de la recherche biomédicale en repérant les acteurs (et leur appartenance disciplinaire) et les institutions qui s'associent au terme «biomédical», que ce soit pour décrire des institutions ou des projets de recherche. Les résultats de cette analyse offrent une première approximation d'un espace de la recherche en donnant une image d'un domaine peu unifié. Ainsi, l'usage de la catégorie «biomédical» dans les projets des chercheurs n'est pas le fait des seuls médecins et biologistes, mais également de représentants d'autres disciplines. La physique, la chimie et les sciences de l'ingénieur occupent ainsi également une place très importante dans cet espace de recherche. Puis, dans une perspective discursive, nous avons analysé le «biomédical» non seulement comme un label, mais également comme un objet-frontière permettant d'articuler différentes significations, de produire du sens là où des univers de recherche pourraient s'opposer, ou à coordonner des politiques qui ne l'étaient pas. L'analyse des différentes définitions du «biomédical» nous a confirmé l'existence d'un espace social marqué par une grande diversité disciplinaire, toutefois articulé autour d'un coeur médical et, plus particulièrement, d'une application médicale (potentielle ou actuelle). De plus, il ne semble pas y avoir de profondes luttes pour l'établissement de limites claires au «biomédical». Finalement, nous avons étudié les différentes activités de la production des savoirs (carrières, financement, collaboration, publication, etc.). Cette analyse a permis de comprendre que la diversité des définitions et des significations que les acteurs attribuent à la catégorie «biomédical» a aussi un ancrage dans la matérialité des réseaux sociotechniques dans lesquels les chercheurs s'inscrivent. Ces éléments confirment l'idée d'une fragmentation et d'une hétérogénéité de l'espace de la recherche biomédicale. En dépit de cette fragmentation, nous avons également montré que différentes mesures et instruments d'action publique visant à organiser et réguler les pratiques des chercheurs sont mis en oeuvre. Néanmoins et paradoxalement, la recherche biomédicale ne constitue pas pour autant un objet de politique scientifique abordé par les autorités politiques, en tous les cas pas sous l'angle de la catégorie «biomédical». Ces différents niveaux d'analyse ont permis d'arriver à la conclusion que la catégorie «biomédical» n'est pas suffisamment institutionnalisée et que le degré d'interaction entre l'ensemble des chercheurs qui en font usage est trop faible pour que l'on puisse considérer le «biomédical» comme un espace social fortement organisé et structuré, à savoir un champ de la recherche biomédicale. Cela est principalement lié au fait que les acteurs ne partagent pas les mêmes définitions de ce qu'est (ou devrait être) le «biomédical», que leurs pratiques de recherche s'inscrivent dans des univers relativement séparés, et que cette diversité ne donne pas lieu à de fortes luttes pour l'imposition d'une définition légitime ou de normes d'excellence scientifiques dominantes. Par contre, les analyses ont permis de confirmer la validité du «biomédical» comme label, puisque les acteurs se servent de cette catégorie pour valoriser leurs pratiques de recherche et se positionner, même si d'autres notions ont émergé ces dernières années («translationnel», «biotech», «medtech», médecine personnalisée, etc.). On peut, in fine, considérer le «biomédical» comme un probable langage commun («objet-frontière») reposant tant sur la scientificisation du médical que sur la médicalisation des sciences («de base» et «techniques »), visant à améliorer les conditions de possibilité d'un dialogue fructueux entre chercheurs fondamentaux et cliniciens.

Perspectives féministes en éducation

A entendre le discours ambiant d'aujourd'hui, tout serait résolu dans la question de l'éducation des filles et de l'égalité des sexes dans le domaine de l'éducation. A l'école, voilà plusieurs années que les filles ont en moyenne de meilleurs résultats scolaires que les garçons et qu'elles forment la majorité de la population estudiantine universitaire dans pratiquement toute l'Europe. En fait l'école n'est pas neutre et les institutions de formation continuent de prendre une part active, avec la famille et la culture, à la construction d'individus répondant aux rôles sexués traditionnels. Réfléchir aux pratiques qui permettraient de rendre l'éducation égalitaire reste donc un objectif à l'ordre du jour, d'autant plus que la formation scolaire et professionnelle constitue un pré-requis pour l'émancipation des femmes.

Les hybrides de la mondialisation : acteurs, objets et espaces de l'économie politique internationale.

La notion d'hybride est souvent utilisée dans les analyses consacrées au rôle croissant des acteurs non étatiques et des mécanismes informels de transformation du pouvoir dans le contexte de la mondialisation. Mais elle n'est jamais conceptualisée en tant que telle. Dans le prolongement des approches hétérodoxes en économie politique internationale, cet article pose une réflexion théorique sur le concept d'hybrides de la mondialisation. Le cadre d'analyse intègre les acteurs impliqués, les objets concernés et l'espace de compétence. Il pose l'hypothèse que les hybrides de la mondialisation investissent d'autorité des acteurs privés auparavant dépourvus d'un tel statut, portent sur un objet qui souligne les implications politiques croissantes de la science et de la technologie, se déploient dans un espace où s'emboîtent les logiques endogènes de l'État nation et celles exogènes découlant de la dynamique transnationale du capitalisme.

Étude de la fonction de GLUT8 sur un modèle de souris "knock-out"

Résumé GLUT8 est la première des nouvelles isoformes des GLUT récemment identifiés. Il est fortement exprimé dans les testicules et plus faiblement dans les blastocystes, le cerveau, particulièrement au niveau de l'hippocampe, et le coeur. En conditions basales, il est retenu dans un compartiment intracellulaire. Si on l'exprime en surface cellulaire, par la mutation du motif d'internalisation dileucine, il transporte le glucose avec une bonne affinité. Dans le but d'étudier sa fonction au niveau de l'organisme, nous avons créé un modèle de knock out conditionnel, en entourant le dernier exon du gène de GLUT8 par deux sites loxP. En croisant nos souris avec une souche de souris transgénique exprimant la cre-recombinase dans les cellules de la lignée germinale, nous avons généré un modèle de souris portant la délétion totale de GLUT8 de manière constitutionnelle. Les statistiques effectuées sur les premières naissances indiquent qu'une partie des souris knock out ne survit pas, suggérant un rôle de GLUT8 au niveau du développement embryonnaire. Les souris qui ont survécu ne présentent toutefois pas d'anomalies durant la croissance et sont fertiles. Elles ont des taux de glucose et d'insuline sanguins normaux. Au niveau cérébral, la structure de l'hippocampe n'est pas modifiée par la suppression de GLUT8, cependant, les souris GLUT8-/- présentent une prolifération cellulaire augmentée dans le gyrus denté. Cette augmentation de division cellulaire pourrait être la réponse adaptée à une éventuelle augmentation de la mort cellulaire au niveau de l'hippocampe. Elles ne semblent toutefois pas présenter de défauts cognitifs majeurs dans le bassin de Morris en conditions normales. Toutefois, en conditions de jeûne, elles tendent à une meilleure mémorisation à court terme. Les études morphologiques et histologiques au niveau cardiaque n'ont pas révélé de d'hypertrophie au niveau ventriculaire. La stimulation de la contraction à l'isoprotérénol n'a pas mis en évidence de défaut d'adaptation des coeurs GLUT8-/-. Cependant l'analyse fonctionnelle par électrocardiogramme, en conditions basales, a montré une augmentation de la durée de l'onde P, suggérant un défaut dans la dépolarisation des oreillettes. Nos résultats indiquent que GLUT8 ne joue pas un rôle prédominant dans la survie et la fonction basale des souris. Il pourrait jouer un rôle plus important dans des situations stressantes pour l'organisme, comme l'hypoglycémie ou les conditions d'ischémie qui induiraient son expression à la membrane plasmique et stimuleraient le captage du glucose. Abstract GLUT8 was the first of the recently identified isoform of the GLUT family proteins. It is strongly expressed in the testis. It is also found at a lower level in the blastocyst, in heart and in the brain. Under basal conditions, it is retained in the intracellular compartment, but when the internalization motif dileucine is mutated, GLUT8 translocates to the plasma membrane and transports glucose with a relatively high affinity. To study its function in vivo, we created a conditional knock out mouse model. To do so, we targeted the last exon of the GLUT8 gene with two loxP sites. We then crossed these mice with a transgenic model expressing the cre-recombinase in the gem' line to generate a constitutional total knock out mouse. The statistics made on the first breedings showed that some of the knock out mice do not survive, suggesting a role of GLUT8 in the embryonic development. Conversely mice who survive do not show developmental defects and they are fertile with normal glucose and insulin blood levels. In the brain, the general structure of the hippocampus is not modified by the deletion of GLUT8. However, GLUT8-/- mice show an increase in the cell proliferation in the dentate gyms. This cell proliferation could be due to an increase in the cell death in the hippocampus. When tested in the morris water maze, these mice do not show any cognitive defects in the basal conditions, but they have a tendency to learn better in fasted conditions. The morphological and histological studies made at the heart level did not show any cardiac hypertrophy in the ventricles. The stimulation with isoproterenol did not show any adaptation defects in the GLUT8-/- hearts. However, the functional analysis made in basal conditions with the electrocardiogram showed an increase in the P wave length, suggesting a defect in the atrial depolarization in the knock out mice. Overall, our results show that GLUT8 does not play an important role in the basal general functions in the mice, but might play a more important role during whole organism stress. Hypoglycaemia or ischemia, for example could stimulate the GLUT8 translocation to the plasma membrane to increase specifically glucose uptake. Résumé tout public Les différentes cellules de l'organisme possèdent des propriétés particulières, qui leur permettent de maintenir les fonctions de l'organe auquel elles appartiennent. La membrane plasmique qui les délimite sélectionne les substances qui vont pénétrer à l'intérieur de la cellule et permet ainsi de maintenir un environnement interne constant. Le glucose est une source d'énergie importante pour la cellule et doit pouvoir pénétrer à l'intérieur de la cellule. Il utilise pour cela des protéines de transport qui le feront passer de part et d'autre de la membrane. Les protéines de la famille des GLUT (pour GLUcose Transporter) possèdent cette capacité. GLUT8 est un membre de la famille des GLUT identifié récemment. Il possède la capacité de transporter le glucose quand il se présente à la surface de la cellule. Il est principalement exprimé dans les testicules, dans le coeur et le cerveau et durant le développement embryonnaire. Son rôle n'est toutefois pas encore défini. Ce travail consiste à étudier la fonction de GLUT8 au niveau de l'organisme entier. Nous avons créé un modèle de souris dans lesquelles l'expression de GLUT8 a été supprimée pour mettre en évidence son importance dans le maintien de l'intégrité des fonctions du corps. Les observations effectuées sur les souris qui n'expriment plus GLUT8 nous indiquent que leurs cellules prolifèrent plus vite au niveau de l'hippocampe. L'hippocampe est une structure située dans le cerveau qui est impliquée dans les phénomènes d'apprentissage. Les souris qui ont été testées dans des tâches d'apprentissage n'ont malgré cela pas montré une amélioration de la mémorisation. Dans le coeur, la suppression de GLUT8 semble présenter un défaut quand on mesure l'activité électrique du coeur par électrocardiogramme. Toutefois, ils fonctionnent normalement et ne présentent pas de défauts morphologiques en conditions normales. Les expériences effectuées sur les modèles de souris indiquent que GLUT8 ne jouerait pas un rôle prédominant dans le fonctionnement normal du corps. Il pourrait exercer sa fonction dans des situations plus particulières comme l'hypoglycémie, où il permettrait une meilleure capacité à transporter le glucose dans les cellules.

Immunomodulation nutritionnelle chez les patients atteints de mucoviscidose

SUMMARY Pulmonary Pulmonary disease is the primary cause of morbidity and mortality in cystic fibrosis patients (CF). Airways of CF patients are early colonized by various bacteriae, and an intense inflammatory response participates to airways destruction. Accumulation of neutrophils releasing proteolytic enzymes and free radicals induce progressive lung tissue destruction in CF. Among several inflammatory mediators implicated in this process, chemotactic factors such as leukotriene B4 (LTB4), product of arachidonic omega-6 polyunsaturated fatty acid (PUFA), plays an important role. Many anti-inflammatory therapies including corticosteroids, ibuprofen, macrolides, antioxidants and antiproteinases have been proposed in CF over the last 20 years. In complement to these various approaches, dietary supplementation with polyunsaturated fatty acids (PUFA) omega-3, known to favor the synthesis of less inflammatory leukotriene B5 (LTB5), could also represent a potential. therapy. The objective of this thesis was to assess the impact of this nutritional approach on several CF neutrophil functions. In addition, we have also examined the influence of this approach on various clinical parameters, to assess the feasibility of future studies specifically oriented towards clinical effects. To that endeavour, a high performance liquid chromatography method has been developed and validated, allowing the simultaneous determination of LTB4 and LTB5 produced by stimulated human polymorphonuclear leukocytes. This method was applied for the analysis of samples collected from CF patients taking part to a double-blind, randomized, crossover placebo-controlled clinical trial aiming at evaluating in these patients the immunomodulatary effect of a liquid supplementation enriched in omega-3 PUFA in CF. This study has shown that omega-3 PUFA are incorporated in CF neutrophil membranes and results into a modulation of leucotrienes B production, as testified by a three fold decrease in LTB4/LTB5 ratio after omega-3 PUFA supplementation. However, no clinical improvement was observed upon omega-3 supplementation, very reproducible results observed allow to be optimistic for a future larger trial focused on clinical outcomes. In conclusion, even if the results show that omega-3 PUFA are absorbed by CF patients and that the subsequent decrease in LTB4/LTB5 ratio suggests that in such conditions, neutrophils may produce less pro-inflammatory mediators, the clinical relevance of those observations remains to be demonstrated. Future multicentric studies focusing on clinical endpoints are still warranted to determine the importance of omega-3 PUFA in CF therapeutics. RÉSUMÉ Les patients atteints de mucoviscidose (patients CF) souffrent d'infections pulmonaires récurrentes. Celles-ci provoquent un afflux permanent de neutrophiles dans le poumon, neutrophiles qui libèrent des enzymes protéolytiques et des radicaux libres responsables à long terme de la destruction du tissu pulmonaire et, finalement, de l'insuffisance respiratoire, première cause de morbidité et de mortalité chez ces patients. La réponse inflammatoire ainsi induite peut être réduite par divers traitements anti-inflammatoires, tels que corticoïdes, anti-inflammatoires non stéroïdiens ou azithromycine. L'apport oral en acides gras polyinsaturés (AGPI) oméga-3 pourrait être une autre approche thérapeutique intéressante. Ces nutriments sont décrits comme possédant des propriétés anti-inflammatoires notamment en favorisant la synthèse d'eicosanoïdes pourvus d'une activité inflammatoire moindre par rapport à ceux issus d'une autre famille d'AGPI, les oméga-6. Ce travail de thèse a pour objectif premier d'évaluer l'impact de cette approche nutritionnelle sur diverses fonctions du neutrophile chez des patients CF. Cependant un intérêt de nature prospective a également été porté à certains paramètres cliniques, afin d'évaluer la faisabilité d'une future étude axée sur des effets cliniques. Pour ce faire, une méthode de chromatographie liquide à haute performance couplée à un spectromètre de masse a été développée et validée. Cette analyse devait permettre le dosage simultané de deux eicosanoïdes, le leucotriène B4 (LTB4) issu des AGPI oméga-6 et le leucotriène B5 (LTB5) issu des AGPI oméga-3. Puis, une étude clinique, double aveugle, randomisée, croisée sans période de washout, mais contrôlée avec un placebo, a été mise au point pour évaluer l'effet immunomodulateur de ces AGPI oméga-3 donnés sous la forme d'un liquide nutritif chez des patients CF. Les résultats de cette étude ont permis de démontrer l'absorption intestinale des AGPI oméga-3 par les patients. De plus, leur administration a permis de modifier la production de teucotriène B. En effet, le ratio LTB4/LTB5 a été diminué de près de trois fois sous liquide nutritif enrichi en AGPI oméga-3. Enfin aucune différence n'a pu être notée pour les paramètres cliniques; toutefois les résultats reproductibles observés permettent d'envisager qu'une future étude multicentrique axée sur des effets cliniques est faisable. En conclusion, la modification de la composition en AGPI membranaires du neutrophile observée durant cette étude laisse penser que ces nutriments sont absorbés par les patients CF. La modulation de la production en LTBs qui en découle permet d'envisager un potentiel effet anti-inflammatoire. Toutefois, la relevance clinique de ces observations restent à être démontrée. A l'heure actuelle, une étude multicentrique, focalisée sur des paramètres cliniques, est nécessaire avant de pouvoir se prononcer sur l'utilisation des AGPI oméga-3 chez les patients CF.

A study of the translational regulation exerted by some neuroactive substances on the expression of the monocarboxylate transporter MCT2 in cultured cortical neurons

Summary of the thesis Glucose has been considered the major, if not the exclusive, energy substrate for the brain. But under certain conditions other substrates, namely monocarboxylates (lactate, pyruvate, and ketone bodies), can contribute significantly to satisfy brain energy demands. These monocarboxylates need to be transported across the blood brain barrier as well as out of astrocytes into the extracellular space and taken up into neurons. It has been shown that monocarboxylates are transported by a family of proton-linked transporters called monocarboxylate transporters (MCTs). In the central nervous system, MCT2 is the predominant neuronal form and little is known about the regulation of its expression. The neurotransmitter noradrenaline (NA) was shown previously to enhance the expression of MCT2 in cultured cortical neurons via a translational mechanism. Here, we demonstrate that two other substances, namely, insulin and IGF-1 enhance MCT2 protein expression in cultured mouse cortical neurons in a time- and concentrationdependent manner without affecting MCT2 mRNA levels. This result confirmed that MCT2 protein expression is translationally regulated and extend the observation to different types of neuroactive substances. Then we sought to determine by which signaling pathway(s) NA, insulin and IGF-1 can induce MCT2 protein expression. First, we observed by Western blot that all three substances cause activation of the MAP kinase ERK as well as the kinase Akt via their phosphorylation. Moreover, the mTOR/S6K pathway which is known to play an important role in translation initiation regulation was also strongly stimulated by all three substances. Second, we sought to determine the implication of these signaling pathways on the NA-, insulin- and IGF-1-induced enhancement of MCT2 protein expression and used specific inhibitors of these signaling pathways. We observed that the Pia kinase and mTOR inhibitors LY294002 and rapamycin respectively, strongly prevent the enhancement. of MCT2 expression caused by either NA, insulin ar IGF-1. In contrast, the MEK inhibitor PD98059 and the p38 MAP kinase inhibitor SB202190 had only a slight effect on the enhancement of MCT2 expression in all three cases. These results suggest that NA, insulin and IGF-1 regulate MCT2 protein expression by a common mechanism most likely involving the Akt/PKB pathway and translational activation via mTOR. In conclusion, considering the roles of NA, insulin and IGF-1 in synaptic plasticity, the tight translational regulation of MCT2 expression by these substances may represent a common mechanism through which supply of potentiated synapses with nonglucose energy substrates can be adapted to the level of activity. Résumé du travail de thèse Le glucose représente le substrat énergétique majeur pour le cerveau. Cependant, dans certaines conditions physiologiques ou pathologiques, le cerveau a la capacité d'utiliser des substrats énergétiques appartenant à la classe des monocarboxylates (lactate, pyruvate et corps cétoniques) afin de satisfaire ses besoins énergétiques. Ces monocarboxylates doivent être transportés à travers la barrière hématoencéphalique mais aussi hors des astrocytes vers l'espace extracellulaire puis re-captés par les neurones. Leur transport est assuré par une famille de transporteurs spécifiques, protons-dépendants, appelés transporteurs aux monocarboxylates (MCTs). Dans le système nerveux central, les neurones expriment principalement l'isoforme MCT2 mais peu d'informations sont disponibles concernant la régulation de son expression. Il a été montré que le neurotransmetteur noradrénaline (NA) augmente l'expression de MCT2 dans les cultures de neurones corticaux de souris par le biais d'un mécanisme de régulation traductionnel. La présente étude nous a permis de démontrer que deux autres substances, l'insuline et 17GF-1, induisent une augmentation de la protéine MCT2 dans ces mêmes cultures selon un décours temporel et une gamme de concentrations particulière. Etonnamment, aucun changement n'a été observé concernant les niveaux d'ARNm de MCT2. Ce résultat .confirme que la protéine MCT2 est régulée de manière traductionnelle et révèle que différentes substances neuro-actives peuvent réguler l'expression de MCT2. Compte tenu de ces observations, nous avons voulu déterminer par quelle(s) voie(s) de signalisation la NA, l'insuline et l'IGF-1 exercent leur effet sur l'expression de MCT2. Dans un premier temps, nous avons pu observer par Western blot que ces trois substances activent la MAP kinase ERK ainsi que la kinase Akt via leur phasphorylation. De plus, la voie mTOR/S6K, connue pour son implication dans la régulation de l'initiation de la traduction est aussi fortement activée par ces trois substances. Dans un second temps, nous avons voulu déterminer I implication de chacune de ces voies de signalisation dans l'augmentation de l'expression de la protéine MCT2 observée après stimulation à la NA, à l'insuline et à l'IGF-1. Pour ce faire, nous avons utilisé des inhibiteurs spécifiques de chacune de ces voies. (Vous avons observé que les inhibiteurs des voies PI3 kinase et mTOR (LY294002 et rapamycin respectivement), prévenaient fortement l'augmentation de l'expression de MCT2 induite par la NA, l'insuline ou (IGF-1. A l'inverse, les inhibitions de la MAP kinase .kinase MEK ainsi que de la MAP kinase p38 (par l'utilisation des inhibiteurs spécifiques PD98059 et SB202190 respectivement) n'ont eu qu'un léger effet dans ces mêmes conditions. Ces résultats suggèrent que la NA, 'l'insuline et I~GF-1 régulent l'expression de la protéine MCT2 par un mécanisme commun impliquant probablement la voie Akt/PKB et l'activation de la traduction via mTOR. En conclusion, considérant l'implication de la NA, de l'insuline et de I`IGF-1 dans la plasticité synaptique, le contrôle traductionnel étroit exercé par ces substances sur l'expression de MCT2 pourrait être un moyen d'alimenter en substrats énergétiques autres que le glucose les synapses activées et également d'adapter l'approvisionnement en substrats énergétiques au niveau d'activité. Résumé « grand public » Le cerveau est un organe qui réalise des tâches complexes nécessitant un apport important en énergie. La principale source d'énergie du cerveau est le glucose. Bien que le cerveau ne représente que 2% de la masse corporelle, il consomme à lui seul plus de 25% du glucose et 20% de l'oxygène provenant de la circulation sanguine. La nécessité d'un tel apport en énergie réside dans la nature -même du fonctionnement des milliards de neurones qui utilisent des signaux électriques et chimiques pour communiquer entre eux. Hormis l'utilisation massive du glucose comme source d'énergie, le cerveau est capable de consommer d'autres substrats énergétiques dans certaines conditions physiologiques ou pathologiques. Les monocarboxylates (lactate, pyruvate et corps cétoniques) font partie de ces autres sources d'énergie. Contrairement au glucose, les monocarboxylates ne diffusent pas facilement de la circulation sanguine vers les neurones. Afin de pouvoir être consommés par les neurones, ils doivent être transportés par un système adapté. Ce sont des transporteurs appelés transporteurs aux monocarboxylates ou MCT qui permettent le passage de ces substrats énergétiques du sang vers les neurones. Le but de ce travail de thèse a été de comprendre comment est régulée l'expression de MCT2, l'un de ces transporteurs exprimé spécifiquement à la surface des neurones. Cette étude nous a permis de mettre en évidence que le neurotransmetteur noradrénaline ainsi que les hormones insuline et IGF-1 (insulinlike growth factor-1) sont capables d'induire une augmentation d'expression de MCT2 à la surface des neurones en culture. Nous avons ensuite voulu déterminer par quels mécanismes de signalisation ces substances agissent sur l'expression de MCT2. Nous avons pu observer que la surexpression de la protéine MCT2 est due à une augmentation d'activité traductionnelle (la traduction étant une des étapes qui permet la synthèse des protéines) induite par le biais d'une voie de signalisation particulière. En conclusion, lorsque la noradrénaline, l'insuline ou 17GF-1 agissent sur les neurones, la traduction de la protéine MCT2 est activée et on observe une augmentation de l'expression de MCT2. Ce mécanisme pourrait permettre d'augmenter l'apport énergétique au niveau des neurones en augmentant le nombre de transporteurs pour les substrats énergétiques que sont les monocarboxylates. D'un point de vue physiologique, cette régulation d'expression pourrait jouer un rôle primordial dans des situations d'apprentissage et de mémorisation. Sur le plan pathologique, cela pourrait permettre de prévenir les dommages causes aux neurones dans certains cas d'atteintes cérébrales.

Construction and analysis of a new conditional ferritin H knockout mouse strain/

Résumé Le fer joue un rôle important dans la plupart des fonctions biologiques mais sa présence excessive provoque la production de molécules réactives d'oxygène (ROS) qui peuvent contribuer à diverses maladies. La protéine de stockage du fer, la ferritine H, capte l'excès en fer et le stocke sous forme non-toxique, ce qui empêche des dommages potentiels. La délétion de la ferritine H dans des souris knock-out a été essayée antérieurement, mais ces souris mouraient au stade précoce du développement embryonnaire. Pour étudier l'importance du fer, et en particulier son stockage dans la ferritine, et pour pouvoir mieux comprendre les fonctions de la ferritine H, nous avons créé un modèle de souris knock-out conditionnelles de la ferritine H, selon le système classique de Cre-LoxP. Le premier exon et la région du promoteur du gène de la ferritine H ont été entourés de sites loxP. La mortalité embryonnaire provoquée par la délétion constitutive du gène de la ferritine H a été confirmée en croisant nos souris avec des souris exprimant nestin-Cre1. En croisant nos souris avec des souris transgéniques Mx-Cre, nous avons observé que l'induction de Cre par injection de polyI-polyC provoque la délétion presque complète de la ferritine H dans le foie (> 99%) et la rate (> 88%). Ces tissus ont également perdu une grande partie de leur réserve de fer. Cette observation apporte pour la première fois la preuve in vivo que la ferritine H est indispensable pour le stockage du fer, que les fonctions de la ferritine H et de la ferritine L ne sont pas équivalentes, et que la ferritine L ne peut pas assumer seule la fonction de stockage du fer. Dans le foie des souris knock-out, l'expression de l'ARN messager de l'hepcidine a été induite après 10 jours. En même temps, l'expression de l'ARN messager des gènes codant pour des protéines de l'absorption de fer (DMT1, ferroportin, Dcytb1 et hephaestin) a été réprimée mais dans le duodénum seulement. L'expression d'hepcidine est inversément corrélée avec celle des gènes liés à l'absorption de fer. Cette observation corrobore des études antérieures. Mais, en plus, elle montre également que cette répression se produit seulement dans l'intestin. Nous pouvons ainsi tirer la conclusion suivante : ou bien l'hepcidine a un récepteur spécifique dans le duodénum ou bien les gènes liés à l'absorption de fer dans le duodénum ont un facteur spécifique de transcription sensible à l'hepcidine. Aucune répression de DMT1 et de ferroportin n'a été observée dans les macrophages de la rate après l'induction d'hepcidine. La délétion de ferritine H a entraîné une augmentation du taux de mortalité des cellules hépatiques, ainsi que des altérations dans l'architecture normale du tissu de la rate. Vu par l'immunohistologie, le nombre de lymphocytes B et T était réduit dans la rate, tendant à démontrer que la ferritine H et l'homéostase du fer jouent un rôle dans l'immunité. En conclusion, le modèle de souris knock-out conditionnelles de la ferritine H nous fournit un outil précieux pour l'étude in vivo du rôle joué par la ferritine dans l'homéostase du fer, dans les dommages créés par les ROS, ainsi que dans l'apoptose et l'immunité. Summary Iron plays an important role in most biological functions. However, excess of iron results in production of reactive oxygen species (ROS) which could substantially contribute to pathology of various diseases. Ferritin H scavenges excess of iron and stores it in non-toxic form and potentially prevents the damage. Fenitin H targeting in mice has been attempted before, however, straight knockout was lethal in early embryonic stage. To study the role of iron and its storage protein ferritin and to further elucidate ferritin H functions, we aimed at creating a conditional ferritin H knockout mouse model by classical Cre-LoxP system. First exon along with promoter region of the ferritin H gene was foxed. Embryonic lethality of the constitutive ferritin H deletion was confirmed by crossing the foxed mice with mice expressing nestin Cre-1 as transgene. Almost complete deletion was observed in liver (> 99%) and spleen (>88%) upon induction of Cre by injecting polyI-polyC in Fth Lox/Lox; MxCre mice. These tissues also lost substantial fraction of their iron stores. This provides first in vivo evidence that ferritin H is required for iron storage, ferritin H and L functions are not redundant and that ferritin L cannot perform iron storage function alone. Hepcidin mRNA expression was induced after 10 days in the livers of deleted mice and, simultaneously, mRNA expression of iron absorption related genes (DMT 1, ferroportin, Dcytb1 and hephaestin) was repressed in duodenum only. Hepcidin expression is inversely correlated with that of duodenal iron absorption related genes. This is in agreement with previous studies. However, we also show that this repression happens only in intestine. This leads to the conclusion that either hepcidin has a specific receptor in duodenum or the iron absorption related genes have duodenum specific transcription factor that is responsive to hepcidin. No repression of DMT1 and ferroportin was observed in spleen macrophages upon hepcidin induction. Ferritin H deletion showed increased cell death in liver and disruption of normal architecture of spleen. B lymphocytes were reduced in spleen on immunohistology which point towards a role of ferritin H and iron homeostasis in immunity. In conclusion, ferritin H conditional knockout mouse model provides us with an invaluable tool to study the in vivo role of ferritin H in iron homeostasis, ROS mediated damage, apoptosis and immunity.

The processing limits the presentation of the melanoma-associated antigen Melan-A in vitro and in vivo

SUMMARY Both proteasomes and additional proteases play an essential role in the generation of most antigenic peptides presented by MHC class I molecules. Therefore, it is of major importance to characterize the mechanisms leading to the production of correct antigenic peptides to improve the design of vaccines. As a model determinant we used the melanoma-associated protein Melan-A, which contains the immunodominant CTL-epitope Melan-A26/27-35/HLA-A*0201 and against which a high frequency of T lymphocytes has been detected in many melanoma patients. In a first part, we have studied the effects of antigen processing on the induction of a specific T cell response in vivo. Our results have shown that the immunoproteasome, expressed in most cells after exposure to Interferon-γ (IFN-γ) and constitutively in some specialized cells such as dendritic cells, does not efficiently process the HLA¬A2-restricted peptide Melan-A26-35. We have produced recombinant lentiviral vectors (rec. 1v) and vaccinia virus (rec. vv) encoding either preprocessed Melan-A26-35(A27L) peptide or full-length Melan-A(A27L). The immunization of HLA-A2/Kb mice with thoses viruses indicates that immunoproteasomes negatively affect the induction of anti-Melan-A T cell responses in animals immunized with vectors coding for the full- length protein. This negative effect was abrogated in HLA-A2/Kb LMP2-/- mice, lacking the immunoproteasomes. Therefore, we can conclude that the expression of immunoproteasomes limits the induction of the anti-Melan-A T cell response. In a second part, we show that the in vitro degradation of a Melan-A26/27-35 precursor by the proteasomes produces both the final antigenic peptide and N-terminally extended intermediates. When human melanoma cells expressing the corresponding fragments were exposed to specific CTL, those expressing the minimal antigenic sequence were recognized more efficiently than those expressing the N-terminally extended intermediates. We demonstrated that the N-terminally extended intermediates were inefficiently trimmed by cytosolic proteases. These results imply that both proteasomes and post-proteasomal peptidases influence the availability of antigenic peptides and that the efficiency of presentation may be affected by conditions that alter the ratio between fully and partially processed proteasomal products. RESUME Le protéasome ainsi que d'autres protéases jouent un rôle essentiel dans l'apprêtement de la plupart des peptides antigéniques présentés par les molécules de MHC classe I. Il est donc particulièrement important de connaître les mécanismes menant à la production du peptide antigénique correct afin de pouvoir mieux définir de futurs vaccins. Nous avons utilisé la protéine associée au mélanome, Melan-A, contenant un épitope immunodominant Melan-A26/27-35/HLA-A*0201 contre lequel une fréquence élevée de lymphocytes T a été detectée dans plusieurs patients atteints de mélanome. Dans une première partie, nous avons étudié les effets de l'apprêtement du peptide antigéniques Melan-A26-35 sur l'induction de cellules T spécifiques dans la souris. Nos résultats ont démontré que l'immunoprotéasome, exprimé dans la plupart des cellules après exposition à de l'IFN-γ et exprimé constitutivement dans certaines cellules spécialisées, telles les cellules dendritiques, n'apprête pas efficacement le peptide antigénique Melan-A26-35 restreint par HLA-A2 in vitro. Nous avons produit des vecteurs lentiviraux recombinants ainsi que des virus vaccinia codant pour le peptide antigénique Melan-A26-35(A27L) et pour la protéine entière Melan-A(A27L). L'immunisation de souris HLA-A2/Kb avec ces virus démontre que l'immunoprotéasome affecte négativement l'induction d'une réponse T contre Melan¬-A dans les souris immunisées avec des virus contenant la séquence de la protéine entière. Cet effet négatif est complètement aboli dans les souris HLA-A2/Kb LMP2-/- qui n'expriment pas l'immunoprotéasome. Deuxièmement, nous avons demontré que la dégradation d'un peptide précurseur contenant Melan-A26/27-35 par le protéasome produit à la fois le peptide antigénique ainsi que des peptides rallongés à leurs extrémités N-terminales. Lorsque ces fragments sont exprimés dans des cellules humaines et exposés à des cellules T cytotoxiques (CTL), celles qui expriment le peptide antigénique final sont reconnus plus efficacement que celles exprimant les peptides rallongés en N-terminus. Nous avons démontré que les peptides rallongés en N-terminus ne sont pas apprêtés efficacement par les peptidases du cytosol. L'inefficacité de l'apprêtement des peptides rallongés dans le cytosol offre un certain avantage pour les peptides directement produits par le protéasome. Ces résultats impliquent donc que le protéasome ainsi que les peptidases post-proteasomales influencent l'accessibilité des peptides antigéniques.