Phosphorylation of CARMA1 by HPK1 is critical for NF-kappaB activation in T cells.

Activation of the NF-kappaB pathway in T cells is required for induction of an adaptive immune response. Hematopoietic progenitor kinase (HPK1) is an important proximal mediator of T-cell receptor (TCR)-induced NF-kappaB activation. Knock-down of HPK1 abrogates TCR-induced IKKbeta and NF-kappaB activation, whereas active HPK1 leads to increased IKKbeta activity in T cells. Yet, the precise molecular mechanism of this process remains elusive. Here, we show that HPK1-mediated NF-kappaB activation is dependent on the adaptor protein CARMA1. HPK1 interacts with CARMA1 in a TCR stimulation-dependent manner and phosphorylates the linker region of CARMA1. Interestingly, the putative HPK1 phosphorylation sites in CARMA1 are different from known PKC consensus sites. Mutations of residues S549, S551, and S552 in CARMA1 abrogated phosphorylation of a CARMA1-linker construct by HPK1 in vitro. In addition, CARMA1 S551A or S5549A/S551A point mutants failed to restore HPK1-mediated and TCR-mediated NF-kappaB activation and IL-2 expression in CARMA1-deficient T cells. Thus, we identify HPK1 as a kinase specific for CARMA1 and suggest HPK1-mediated phosphorylation of CARMA1 as an additional regulatory mechanism tuning the NF-kappaB response upon TCR stimulation.

In vitro negative selection of viral superantigen-reactive thymocytes by thymic dendritic cells.

Intrathymic expression of endogenous mouse mammary tumor virus (MMTV)-encoded superantigens (SAg) induces the clonal deletion of T cells bearing SAg-reactive T-cell receptor (TCR) Vbeta elements. However, the identity of the thymic antigen-presenting cells (APC) involved in the induction of SAg tolerance remains to be defined. We have analyzed the potential of dendritic cells (DC) to mediate the clonal deletion of Mtv-7-reactive TCR alphabeta P14 transgenic thymocytes in an in vitro assay. Our results show that both thymic and splenic DC induced the deletion of TCR transgenic double positive (DP) thymocytes. DC appear to be more efficient than splenic B cells as negatively selecting APC in this experimental system. Interestingly, thymic and splenic DC display a differential ability to induce CD4+ SP thymocyte proliferation. These observations suggest that thymic DC may have an important role in the induction of SAg tolerance in vivo.

Glucagon-like peptide-1 and control of insulin secretion.

Although glucose is the major regulator of insulin secretion by pancreatic beta cells, its action is modulated by several neural and hormonal stimuli. In particular, hormones secreted by intestinal endocrine cells stimulate glucose-induced insulin secretion very potently after nutrient absorption. These hormones, called gluco-incretins or insulinotropic hormones, are major regulators of postprandial glucose homeostasis. The main gluco-incretins are GIP (gastric inhibitory polypeptide or glucose-dependent insulinotropic polypeptide) and GLP-1 (glucagon-like polypeptide-1). The secretion of GIP, a 42 amino acid polypeptide secreted by duodenal K cells, is triggered by fat and glucose. GIP stimulation of insulin secretion depends on the presence of specific beta-cell receptors and requires glucose at a concentration at least equal to or higher than the normoglycaemic level of approximately 5 mM. GIP accounts for about 50% of incretin activity, and the rest may be due to GLP-1 which is produced by proteolytic processing of the preproglucagon molecule in intestinal L cells. GLP-1 is the most potent gluco-incretin characterized so far. As with GIP, its stimulatory action requires a specific membrane receptor and normal or elevated glucose concentrations. Contrary to GIP, the incretin effect of GLP-1 is maintained in non-insulin-dependent diabetic patients. This peptide or agonists of its beta-cell receptor could provide new therapeutic tools for the treatment of Type II diabetic hyperglycaemia.

Binding free energy differences in a TCR-peptide-MHC complex induced by a peptide mutation: a simulation analysis.

Recognition by the T-cell receptor (TCR) of immunogenic peptides presented by class I major histocompatibility complexes (MHCs) is the determining event in the specific cellular immune response against virus-infected cells or tumor cells. It is of great interest, therefore, to elucidate the molecular principles upon which the selectivity of a TCR is based. These principles can in turn be used to design therapeutic approaches, such as peptide-based immunotherapies of cancer. In this study, free energy simulation methods are used to analyze the binding free energy difference of a particular TCR (A6) for a wild-type peptide (Tax) and a mutant peptide (Tax P6A), both presented in HLA A2. The computed free energy difference is 2.9 kcal/mol, in good agreement with the experimental value. This makes possible the use of the simulation results for obtaining an understanding of the origin of the free energy difference which was not available from the experimental results. A free energy component analysis makes possible the decomposition of the free energy difference between the binding of the wild-type and mutant peptide into its components. Of particular interest is the fact that better solvation of the mutant peptide when bound to the MHC molecule is an important contribution to the greater affinity of the TCR for the latter. The results make possible identification of the residues of the TCR which are important for the selectivity. This provides an understanding of the molecular principles that govern the recognition. The possibility of using free energy simulations in designing peptide derivatives for cancer immunotherapy is briefly discussed.

The three main stumbling blocks for anticancer T cells.

Memory and effector T cells have the potential to counteract cancer progression, but often fail to control the disease, essentially because of three main stumbling blocks. First, clonal deletion leads to relatively low numbers or low-to-intermediate T cell receptor (TCR) affinity of self/tumor-specific T cells. Second, the poor innate immune stimulation by solid tumors is responsible for inefficient priming and boosting. Third, T cells are suppressed in the tumor microenvironment by inhibitory signals from other immune cells, stroma and tumor cells, which induces T cell exhaustion, as demonstrated in metastases of melanoma patients. State-of-the-art adoptive cell transfer and active immunotherapy can partially overcome the three stumbling blocks. The reversibility of T cell exhaustion and novel molecular insights provide the basis for further improvements of clinical immunotherapy.

Extracellular-signal-regulated kinase 5 modulates the antioxidant response by transcriptionally controlling Sirtuin 1 expression in leukemic cells.

Cancer cell metabolism differs from that of non-transformed cells in the same tissue. This specific metabolism gives tumor cells growing advantages besides the effect in increasing anabolism. One of these advantages is immune evasion mediated by a lower expression of the mayor histocompatibility complex class I molecules. The extracellular-signal-regulated kinase-5 regulates both mayor histocompatibility complex class I expression and metabolic activity. However, the mechanisms underlying are largely unknown. We show here that extracellular-signal-regulated kinase-5 regulates the transcription of the NADH(+)-dependent histone deacetylase silent mating type information regulation 2 homolog 1 (Sirtuin 1) in leukemic Jurkat T cells. This involves the activation of the transcription factor myocyte enhancer factor-2 and its binding to the sirt1 promoter. In addition, extracellular-signal-regulated kinase-5 is required for T cell receptor-induced and oxidative stress-induced full Sirtuin 1 expression. Extracellular-signal-regulated kinase-5 induces the expression of promoters containing the antioxidant response elements through a Sirtuin 1-dependent pathway. On the other hand, down modulation of extracellular-signal-regulated kinase-5 expression impairs the anti-oxidant response. Notably, the extracellular-signal-regulated kinase-5 inhibitor BIX02189 induces apoptosis in acute myeloid leukemia tumor cells without affecting T cells from healthy donors. Our results unveil a new pathway that modulates metabolism in tumor cells. This pathway represents a promising therapeutic target in cancers with deep metabolic layouts such as acute myeloid leukemia.

Identification of Rare High-Avidity, Tumor-Reactive CD8+ T Cells by Monomeric TCR-Ligand Off-Rates Measurements on Living Cells.

The avidity of the T-cell receptor (TCR) for antigenic peptides presented by the peptide-MHC (pMHC) on cells is a key parameter for cell-mediated immunity. Yet a fundamental feature of most tumor antigen-specific CD8(+) T cells is that this avidity is low. In this study, we addressed the need to identify and select tumor-specific CD8(+) T cells of highest avidity, which are of the greatest interest for adoptive cell therapy in patients with cancer. To identify these rare cells, we developed a peptide-MHC multimer technology, which uses reversible Ni(2+)-nitrilotriacetic acid histidine tags (NTAmers). NTAmers are highly stable but upon imidazole addition, they decay rapidly to pMHC monomers, allowing flow-cytometric-based measurements of monomeric TCR-pMHC dissociation rates of living CD8(+) T cells on a wide avidity spectrum. We documented strong correlations between NTAmer kinetic results and those obtained by surface plasmon resonance. Using NTAmers that were deficient for CD8 binding to pMHC, we found that CD8 itself stabilized the TCR-pMHC complex, prolonging the dissociation half-life several fold. Notably, our NTAmer technology accurately predicted the function of large panels of tumor-specific T cells that were isolated prospectively from patients with cancer. Overall, our results demonstrated that NTAmers are effective tools to isolate rare high-avidity cytotoxic T cells from patients for use in adoptive therapies for cancer treatment.

Novel therapeutic strategies targeting regulatory T cells and downstream TCR signaling in transplantation

Avec plus de 100000 transplantations d'organes solides (TOS) par année dans le monde, la transplantation d'organes reste actuellement l'un des meilleurs traitements disponibles pour de nombreuses maladies en phase terminale. Bien que les médicaments immunosuppresseurs couramment utilisés soient efficaces dans le contrôle de la réponse immune engendrant le rejet aigu d'une greffe, la survie du greffon à long terme ainsi que la présence d'effets secondaires indésirables restent un enjeu considérable en clinique. C'est pourquoi il est nécessaire de trouver de nouvelles approches thérapeutiques innovantes permettant de contrôler la réponse immunitaire et ainsi d'améliorer les résultats à long terme. L'utilisation des lymphocytes T régulateurs (Treg), suppresseurs naturels de la réponse inflammatoire, a fait l'objet de nombreuses études ces dix dernières années, et pourrait être considérée comme un moyen intéressant d'améliorer la tolérance immunologique de la greffe. Cependant, l'un des obstacles de l'utilisation des Treg comme agent thérapeutique est leur nombre insuffisant non seulement en conditions normales, mais en particulier lors d'une forte réponse immune avec expansion de cellules immunitaires alloréactives. En raison des limitations techniques connues pour l'induction des Treg ex-vivo ou in vitro, nous avons dédié la première partie du travail de thèse à la détermination de l'efficacité de l'induction des Treg in vivo grâce à l'utilisation d'un complexe protéique IL-2/JES6-1 (IL2c). Nous avons montré que l'expansion des Treg par IL2c permettait d'augmenter la survie du greffon sur un modèle murin de transplantation de peau avec mismatch entre le donneur et le receveur pour le complexe majeur d'histocompatibilité (CMH). De plus, nous avons vu qu'en combinant IL2c à une inhibition à court terme de la voie de co-stimulation CD40L-CD40 (anti-CD154/MRl, administré au moment de la transplantation) pour empêcher l'activation des lymphocytes T, il est possible d'induire une tolérance robuste à long terme. Finalement, nos résultats soulignent l'importance de cibler une voie de co-stimulation bien particulière. En effet, l'utilisation d'IL2c combinée au blocage de la co-stimulation CD28-B7.1/2 (CTLA-4 Ig) n'induit qu'une faible prolongation de la survie de la greffe et n'induit pas de tolérance. L'application chez l'humain des traitements induisant la tolérance dans des modèles expérimentaux murins ou de primates n'a malheureusement pas montré de résultats probants en recherche clinique ; une des principales raisons étant la présence de lymphocytes B et T mémoires provenant du systeme d immunité acquise. C est pourquoi nous avons testé si la combinaison d'IL2c et MR1 améliorait la survie de la greffe dans des souris pré¬sensibilisées. Nous avons trouvé qu'en présence de lymphocytes B et T mémoires alloréactifs, l'utilisation d'IL2c et MR1 permettait une amélioration de la survie de la greffe de peau des souris immunocompétentes mais comparé aux souris receveuses naïves, aucune tolérance n'a pu être induite. Toutefois, l'ajout d'un traitement anti-LFA-1 (permettant de bloquer la circulation des lymphocytes T activées) a permis d'améliorer de manière significative la survie de la greffe. Cependant, le rejet chronique, dû à la présence de lymphocytes B activés/mémoires et la production d'anticorps donneur-spécifiques, n'a pas pu être évité. Cibler l'activation des lymphocytes T est la stratégie immunothérapeutique prépondérente après une TOS. C'est pourquoi dans la deuxième partie de cette thèse nous nous sommes intéressés au système de signalisation d'un récepteur des lymphocytes T qui dépend de la paracaspase Malti en tant que nouvelle stratégie immunosuppressive pour le contrôle des lymphocytes T alloréactifs. Nous avons montré que bien que l'inhibition de la signalisation du lymphocyte T en aval de Malti induise une tolérance envers un greffon de peau avec incompatibilités antigéniques mineures, cela ne permet cependant qu'une régulation partielle de l'alloréponse contre des antigènes du CMH. Nous nous sommes aussi intéressés spécifiquement à l'activité protéolytique de Malti. L'inhibition constitutive de l'activité protéolytique de Malti chez les souris Malti-ki s'est révélée délétère pour l'induction de la tolérance car elle diminue la fonction des Treg et augmente l'alloréactivité des cellules Thl. Cependant, lors de l'utilisation d'un inhibiteur peptidique de l'activité protéase de Malti in vitro, il a été possible d'observer une atténuation de l'alloéactivité des lymphocytes T ainsi qu'un maintien de la population des Treg existants. Ces résultats nous laissent penser que des études plus poussées sur le rôle de la signalisation médiée par Malti seraient à envisager dans le domaine de la transplantation. En résumé, les résultats obtenus durant cette thèse nous ont permis d'élucider certains mécanismes immunologiques propres à de nouvelles stratégies thérapeutiques potentielles dont le but est d'induire une tolérance lors de TOS. De plus, ces résultats nous ont permis de souligner l'importance d'utiliser des modèles davantage physiologiques contenant, notamment en tenant compte des lymphocytes B et T mémoires alloréactifs. -- Organ transplantation remains the best available treatment for many forms of end-stage organ diseases, with over 100,000 solid organ transplantations (SOT) occurring worldwide eveiy year. Although the available immunosuppressive (IS) drugs are efficient in controlling acute immune activation and graft rejection, the off-target side effects as well as long-term graft and patient survival remain a challenge in the clinic. Hence, innovative therapeutic approaches are needed to improve long-term outcome across immunological barriers. Based on extensive experimental data obtained over the last decade, it is tempting to consider immunotherapy using Treg; the natural suppressors of overt inflammatory responses, in promoting transplantation tolerance. The first hurdle for the therapeutic use of Treg is their insufficient numbers in non- manipulated individuals, in particular when facing strong immune activation and expanding alloreactive effector cells. Because of the limitations associated with current protocols aiming at ex-vivo expansion or in vitro induction of Treg, the aim of the first part of this thesis was to determine the efficacy of direct in vivo expansion of Treg using the IL-2/JES6- 1 immune complex (IL2c). We found that whilst IL2c mediated Treg expansion alone allowed the prolonged graft survival of fìlli MHC-mismatched skin grafts, its combination with short-term CD40L-CD40 co-stimulation blockade (anti-CD 154/MR1) to inhibit T cell activation administered at the time of transplantation was able to achieve long-term robust tolerance. This study also highlighted the importance of combining Treg based therapies with the appropriate co-stimulation blockade as a combination of IL2c and CD28-B7.1/2 co- stimulation blockade (CTLA-4 Ig) only resulted in slight prolongation of graft survival but not tolerance. The translation of tolerance induction therapies modelled in rodents into non-human primates or into clinical trials has seldom been successful. One main reason being the presence of pre-existing memory T- and B-cells due to acquired immunity in humans versus laboratory animals. Hence, we tested whether IL2c+MRl could promote graft survival in pre-sensitized mice. We found that in the presence of alloreactive memory T- and B-cells, IL2c+MRl combination therapy could prolong MHC-mismatched skin graft survival in immunocompetent mice but tolerance was lost compared to the naïve recipients. The addition of anti-LF A-1 treatment, which prevents the trafficking of memory T cells worked synergistically to significantly further enhance graft survival. However, late rejection mediated by activated/memory B cells and persistent donor-specific alloantibodies still occurred. Immunotherapeutic strategies targeting the activation of T cells are the cornerstone in the current immunosuppressive management after SOT. Therefore, in the next part of this thesis we investigated the paracaspase Malti-dependent T-cell receptor signalling as a novel immunosuppressive strategy to control alloreactive T cells in transplantation. We observed that although the inhibition of Malti downstream T signalling lead to tolerance of a minor H- mismatch skin grafts, it was however not sufficient to regulate alloresponses against MHC mismatches and only prolonged graft survival. Furthermore, we investigated the potential of more selectively targeting the protease activity of Malti. Constitutive inhibition of Malti protease activity in Malti-ki mice was detrimental to tolerance induction as it diminished Treg function and increased Thl alloreactivity. However, when using a small peptide inhibitor of Malti proteolytic activity in vitro, we observed an attenuation of alloreactive T cells and sparing of the pre-existing Treg pool. This indicates that further investigation of the role of Malti signalling in the field of transplantation is required. Collectively, the findings of this thesis provide immunological mechanisms underlying novel therapeutic strategies for the promotion of tolerance in SOT. Moreover, we highlight the importance of testing tolerance induction therapies in more physiological models with pre-existing alloreactive memory T and B cells.

Influence of PTPN2 and pre-existing immunity on the generation of effector and memory CD8 T cells

Notre système immunitaire joue un rôle important pour la protection envers les maladies infectieuses. Au cours d'une réponse à une infection primaire, des cellules B et des cellules T spécifiques, dirigées contre le pathogène en question, sont générées et certaines d'entre elles deviennent des cellules dites mémoires. Leur fonction est de nous protéger contre une nouvelle infection avec le même pathogène, une infection secondaire. Dans certaines situations, comme c'est par exemple le cas avec la grippe, les pathogènes ne sont pas toujours complètement identiques et les cellules mémoires ne sont pas à même d'assurer leur rôle protecteur et d'empêcher une réinfection. Pourtant, on ne sait à l'heure actuelle que très peu comment une immunité acquise, mais non protectrice, influence le développement d'une réponse immunitaire ultérieure. Dans la première partie de cette thèse, nous avons étudié comment les cellules T mémoires cytotoxiques altèrent la réponse de cellules T cytotoxiques nouvellement induites. Au cours d'une réaction immunitaire dirigée contre une infection primaire, un vaste répertoire de lymphocytes T est créé, constitué de cellules T possédant divers degrés d'affinité pour le pathogène. Lors d'une infection secondaire, seules les cellules T ayant une forte affinité pour le pathogène participent à la réponse. Nous avons pu démontrer que ce phénomène de restriction du répertoire des cellules T est principalement causé par les cellules T mémoires qui sont à même de reconnaître un antigène pathogénique présent dans les deux infections. Dans un deuxième projet, nous avons étudié comment l'absence de PTPN2 influence la réponse des cellules T. Chez l'homme, une mutation dans le gène de PTPN2 est associée à des maladies auto-immunes et résulte en une activité réduite de cette phosphatase dans les lymphocytes T. Nous avons montré que la baisse d'activité de la phosphatase PTNP2 conduit à une meilleure expansion des cellules T ayant une qualité comparable à des cellules T auto-antigène spécifiques. De plus, nous avons observé que la survie de ces cellules T effectues ayant une phosphatase diminuée est nettement améliorée. Cela peut conduire à une réponse immunitaire plus efficace ou, éventuellement, à une pathologie auto-immune plus grave. En outre, nos résultats montrent qu'en manipulant l'activité de cette phosphatase, il est possible d'augmenter l'efficacité du transfert des cellules T dans un hôte receveur. Un tel transfert de cellules T est pratiqué chez des patients atteints de tumeurs. Nos travaux suggèrent que la manipulation de la phosphatase PTPN2 pourrait donc représenter une approche thérapeutique novatrice et prometteuse. -- Notre système immunitaire joue un rôle important pour la protection contre les maladies. Les cellules T CD8+ ont une importance primordiale pour le contrôle d'infections primaires causées par des virus ou bactéries, mais également contre certaines tumeurs. Par conséquent, mieux comprendre les exigences nécessaires à l'induction de bonnes réponses des cellules T CD8 pourrait nous permettre de construire des vaccins contre les pathogènes contre lesquels nous n'avons pour l'instant pas de vaccins mais aussi d'améliorer les réactions immunitaires dirigées anti-tumorales. Dans la première partie de cette thèse, nous avons étudié l'influence qu'une immunité préexistante a sur la réponse des cellules T CD8. Nous sommes souvent exposés à des pathogènes qui sont similaires mais pas identiques à ceux que nous avons rencontrés auparavant. De telles infections hétérologues ne sont pas l'objet de beaucoup d'études et certains exemples indiquent même qu'une immunité préexistante partielle peut mener à une aggravation de la maladie. Nous avons étudié le répertoire des lymphocytes T CD8 qui sont générés lors d'une rencontre avec un nouvel antigène, et ce en comparant infection primaire et secondaire. En utilisant le modèle expérimental d'infections à Listeria monocytogenes, nous avons pu montrer que lors d'une infection primaire, un répertoire diversifié comprenant des cellules T CD8 de forte et faible affinité est constitué. Au contraire, dans le cas d'une infection secondaire, le répertoire des cellules T est fortement limité et seulement les lymphocytes T de forte affinité sont impliqués dans la réponse immunitaire. Nous avons pu démontrer que ces Rangements sont provoqués par des cellules T CD8 mémoires capables de reconnaître un antigène présent dans les deux infections. Cette augmentation du seuil d'activation des cellules effectrices est majoritairement causée par les lymphocytes T CD8 mémoires non transférables. Ces observations indiquent que les vaccins visant à induire des cellules T anti-tumorales de faible affinité seraient inefficaces si le vaccin contient des épitopes contre lesquels il existe une mémoire immunologique. Les réponses immunitaires conduites par les cellules T contre les antigènes tumoraux dépendent des cellules T CD8 de faible réactivité contre les antigènes tumoraux puisque les cellules à forte réactivité sont éliminées par les mécanismes de tolérance. Nous basant sur l'existence dans la littérature de preuves indiquant que PTPN2 influence la réponse des cellules T de faible affinité, nous nous sommes intéressés à comprendre comment PTPN2 impacte les réponses des cellules T CD8 en général. Nous avons remarqué que des cellules T CD8 déficientes en PTPN2 exhibent une meilleure capacité à proliférer suite à une faible ou courte stimulation du récepteur des lymphocytes T. La phase effectrice est prolongée et la contraction retardée résultant ainsi à globalement plus de cellules effectrices. Ce phénomène est également accompagné d'une meilleure survie des cellules effectrices de différentiation terminale. Une fois transférées dans un nouvel hôte receveur, les cellules effectrices terminales KLRG1+CD127- déficientes en phosphatase PTPN2 peuvent survivre et se transformer en cellules mémoires CD127+ fonctionnelles. De façon inattendue, nous avons découvert que l'élimination de PTPN2 améliore l'efficacité du transfert et la formation des cellules mémoires ainsi que leur capacité protectrice. Manipuler l'activité de cette phosphatase apparaît donc comme une approche intéressante et prometteuse pour la thérapie cellulaire par transfert adoptif de lymphocytes T. Nos observations montrent que la manipulation d'un facteur intrinsèque, l'absence de PTPN2, peut, dans certaines circonstances, améliorer la réponse des cellules T. Une meilleure connaissance des mécanismes contrôlant la réponse des lymphocytes T CD8 pourrait donc permettre la manipulation de ces derniers et conduire à des réponses immunitaires plus vigoureuses. Si ces réponses sont déclenchées par l'utilisation de vaccins, il est nécessaire de considérer l'historique d'une exposition préalable à des agents pathogènes ou à des vaccins puisque celle-ci peut, comme nous l'avons démontré, influencer le répertoire des cellules T recrutées dans la réponse immunitaire et, par conséquent, modifier l'aptitude de notre système immunitaire à faire face à une infection. -- Our immune system plays an important role in the protection from disease. CD8 T cells are critical for the control of primary infections with most viruses and certain bacteria as well as against some tumors. Therefore, better knowledge of CD8 T cell responses might enable us to generate vaccines against pathogens for which currently no vaccines are available or to improve anti-tumor immune responses. In the first part of this thesis we addressed the issue how previously acquired immunity impacts on the response of CD8 T cells. We are often exposed to pathogens that are related but not identical to the previously encountered ones. Such heterologous infections are not well studied and there are some indications that partial pre-existing immunity may in some cases even lead to an enhancement of disease. We specifically studied the T cell repertoire of CD8 T cells that are responding to a newly encountered antigen in secondary compared to primary infections. Using the experimental model of Listeria monocytogenes infections, we showed that in primary infections a wide repertoire including high and low affinity CD8 T cells is recruited into the immune response. In contrast to this, in secondary infections, the T cell repertoire is severely restricted and only T cells of high affinity are responding. We were able to pinpoint this difference to the presence of memory CD8 T cells that recognize an antigen that is shared between the two subsequent infections. This increase in the activation threshold was most effectively mediated via non-transferable memory CD8 T cells. This would argue that vaccines targeting low affinity tumor-specific T cells would fail if the vaccine contains previously encountered CD8 T cell epitopes. T cell mediated immune responses to tumor antigen rely often on T cells which weakly react to tumor antigen as high affinity T cells are eliminated by tolerance mechanisms. Following indication in the literature that PTPN2 impacts on the response of such weakly antigen-reactive T cells, we investigated how PTPN2 impacts in general the response of CD8 T cells. We observed that CD8 T cells lacking PTPN2 show an enhanced expansion following weak or short-term T cell receptor stimulation. The effector phase is prolonged and contraction delayed thus resulting in overall more effector cells. This is accompanied by a better survival of terminal effector cells. When transferred into new recipients, KLRG1+CD127- terminal effector cells lacking PTPN2 can survive and convert into CD127+ functional memory cells. Surprisingly, we discovered that elimination of PTPN2 enhances the transfer efficacy and formation of memory cells as well as the protective capacity. Targeting PTPN2 might thus be a promising approach for adoptive T cell therapy. Our observations show how the manipulation of an intrinsic factor, the absence of PTPN2, can enhance T cell responses under certain circumstances. A better understanding of underlying mechanisms for the control of CDS T cell responses might enable the manipulation of these and allow for more powerful responses. If these responses are induced through vaccines it is imperative that the previous history of exposure to pathogens or vaccines is considered as it can, as we have shown in this thesis, influence the recruited T cell repertoire and thus possibly the ability to handle the infection.

Regulation of lymphocyte response in vitro and in vivo

CD4+ T helper (Th) cells have an important role in the defence against diverse pathogens. Th cells can differentiate into several functionally distinct subtypes including Th1 and Th2 cells. Th1 cells are important for eradicating intracellular pathogens, whereas Th2 cells pro¬tect our body against extracellular parasites. However if uncontrolled, Th cells can mediate immunopathology such as asthma or allergies, but inappropriate Th response can also lead to autoimmune diseases such as multiple sclerosis or type 1 diabetes. Deeper knowledge of the regulation of the lymphocyte response both in vitro and in vivo is important for un¬derstanding the pathogenesis of immune-mediated diseases and microbe-host interactions. In the work presented in this thesis, the first goal was to elucidate the role of novel factors, PIM kinases and c-FLIP in the regulation of human Th cell differentiation. The oncogenic serine-threonine kinases of the PIM family were shown to be preferentially expressed in Th1 cells and in addition, by using RNA interference, they were also shown to be positive regulators of Th1 differentiation. The PIM depletion experiments suggest that PIM kinases promote the expression of the hallmark cytokine of Th1 cells, IFNγ, and influence the IL12/STAT4 pathway during the early Th1 cell differentiation. In addition to cytokine and T cell receptor (TCR) induced pathways, caspase activity has been shown to regulate Th cell proliferation. In the work presented in this thesis, the two isoforms of the caspase regulator protein, c-FLIP, were shown to be differentially ex¬pressed in Th1 and Th2 cells. Both of the isoforms were up-regulated in response to TCR activation, but the expression of the short isoform was selectively induced by IL4, the Th2 inducing cytokine. Furthermore, the c-FLIP isoforms had distinct and opposite roles during the early differentiation of Th1 and Th2 cells. The knockdown of the long isoform of c-FLIP led to the induction of Th1 marker genes, such as IFNγ and TBET, whereas the depletion of c-FLIP short down-regulated Th2 marker genes IL-4 and GATA3. The third goal was to elucidate the gene expression profiles characterizing the T- and B-lymphocyte responses in vivo during experimental infection by intracellular bacte¬rium Chlamydia pneumoniae. Previously, it has been shown that CD8+ and CD4+ T cells are important for the protection against Chlamydia pneumoniae. In this study, the analysis revealed up-regulation of interferon induced genes during recurrent infection underlining the importance of IFNγ secreted by Th1 and CD8+ T cells in the protection against this pathogen. Taken together, in this study novel regulators of Th cell differ¬entiation were discovered and in addition the gene expression profiles of lymphocytes induced by Chlamydia pneumoniae infection were characterized.

Lack of evidence for superantigen activity of Toxoplasma gondii towards human T cells

Toxoplasma gondii is an obligatory intracellular parasite whose life cycle may include man as an intermediate host. More than 500 million people are infected with this parasite worldwide. It has been previously reported that T. gondii contains a superantigen activity. The purpose of the present study was to determine if the putative superantigen activity of T. gondii would manifest towards human T cells. Peripheral blood mononuclear cells (PBMC) from individuals with no previous contact with the parasite were evaluated for proliferation as well as specific Vß expansion after exposure to Toxoplasma antigens. Likewise, PBMC from individuals with the congenital infection were evaluated for putative Vß family deletions in their T cell repertoire. We also evaluated, over a period of one year, the PBMC proliferation pattern in response to Toxoplasma antigens in patients with recently acquired infection. Some degree of proliferation in response to T. gondii was observed in the PBMC from individuals never exposed to the parasite, accompanied by specific Vß expansion, suggesting a superantigen effect. However, we found no specific deletion of Vß (or Valpha) families in the blood of congenitally infected individuals. Furthermore, PBMC from recently infected individuals followed up over a period of one year did not present a reduction of the Vß families that were originally expanded in response to the parasite antigens. Taken together, our data suggest that T. gondii does not have a strong superantigen activity on human T cells.

Viral membrane fusion: is glycoprotein G of rhabdoviruses a representative of a new class of viral fusion proteins?

Enveloped viruses always gain entry into the cytoplasm by fusion of their lipid envelope with a cell membrane. Some enveloped viruses fuse directly with the host cell plasma membrane after virus binding to the cell receptor. Other enveloped viruses enter the cells by the endocytic pathway, and fusion depends on the acidification of the endosomal compartment. In both cases, virus-induced membrane fusion is triggered by conformational changes in viral envelope glycoproteins. Two different classes of viral fusion proteins have been described on the basis of their molecular architecture. Several structural data permitted the elucidation of the mechanisms of membrane fusion mediated by class I and class II fusion proteins. In this article, we review a number of results obtained by our laboratory and by others that suggest that the mechanisms involved in rhabdovirus fusion are different from those used by the two well-studied classes of viral glycoproteins. We focus our discussion on the electrostatic nature of virus binding and interaction with membranes, especially through phosphatidylserine, and on the reversibility of the conformational changes of the rhabdovirus glycoprotein involved in fusion. Taken together, these data suggest the existence of a third class of fusion proteins and support the idea that new insights should emerge from studies of membrane fusion mediated by the G protein of rhabdoviruses. In particular, the elucidation of the three-dimensional structure of the G protein or even of the fusion peptide at different pH's might provide valuable information for understanding the fusion mechanism of this new class of fusion proteins.

Proteomic inventory of myocardial proteins from patients with chronic Chagas' cardiomyopathy

Chronic Chagas' disease cardiomyopathy (CCC) is an often fatal outcome of Trypanosoma cruzi infection, with a poorer prognosis than other cardiomyopathies. CCC is refractory to heart failure treatments, and is the major indication of heart transplantation in Latin America. A diffuse myocarditis, plus intense myocardial hypertrophy, damage and fibrosis, in the presence of very few T. cruzi forms, are the histopathological hallmarks of CCC. To gain a better understanding of the pathophysiology of CCC, we analyzed the protein profile in the affected CCC myocardium. Homogenates from left ventricular myocardial samples of end-stage CCC hearts explanted during heart transplantation were subjected to two-dimensional electrophoresis with Coomassie blue staining; protein identification was performed by MALDI-ToF mass spectrometry and peptide mass fingerprinting. The identification of selected proteins was confirmed by immunoblotting. We demonstrated that 246 proteins matched in gels from two CCC patients. They corresponded to 112 distinct proteins. Along with structural/contractile and metabolism proteins, we also identified proteins involved in apoptosis (caspase 8, caspase 2), immune system (T cell receptor ß chain, granzyme A, HLA class I) and stress processes (heat shock proteins, superoxide dismutases, and other oxidative stress proteins). Proteins involved in cell signaling and transcriptional factors were also identified. The identification of caspases and oxidative stress proteins suggests the occurrence of active apoptosis and significant oxidative stress in CCC myocardium. These results generated an inventory of myocardial proteins in CCC that should contribute to the generation of hypothesis-driven experiments designed on the basis of the classes of proteins identified here.

Étude des voies d’apprêtement des antigènes viraux menant à la présentation antigénique par les CMH de classe I

Le contrôle immunitaire des infections virales est effectué, en grande partie, par les lymphocytes T CD8+ cytotoxiques. Pour y parvenir, les lymphocytes T CD8+ doivent être en mesure de reconnaître les cellules infectées et de les éliminer. Cette reconnaissance des cellules infectées s’effectue par l’interaction du récepteur T (TCR) des lymphocytes T CD8+ et des peptides viraux associés au complexe majeur d’histocompatibilité (CMH) de classe I à la surface des cellules hôtes. Cette interaction constitue l’élément déclencheur permettant l’élimination de la cellule infectée. On comprend donc toute l’importance des mécanismes cellulaires menant à la génération des peptides antigéniques à partir des protéines virales produites au cours d’une infection. La vision traditionnelle de cet apprêtement protéique menant à la présentation d’antigènes par les molécules du CMH propose deux voies cataboliques distinctes. En effet, il est largement admis que les antigènes endogènes sont apprêtés par la voie dite ‘‘classique’’ de présentation antigénique par les CMH de classe I. Cette voie implique la dégradation des antigènes intracellulaires par le protéasome dans le cytoplasme, le transport des peptides résultant de cette dégradation à l’intérieur du réticulum endoplasmique, leur chargement sur les molécules du CMH de classe I et finalement le transport des complexes peptide-CMH à la surface de la cellule où ils pourront activer les lymphocytes T CD8+. Dans la seconde voie impliquant des antigènes exogènes, le dogme veut que ceux-ci soient apprêtés par les protéases du compartiment endovacuolaire. Les peptides ainsi générés sont directement chargés sur les molécules de CMH de classe II à l’intérieur de ce compartiment. Par la suite, des mécanismes de recyclage vésiculaire assurent le transport des complexes peptide-CMH de classe II à la surface de la cellule afin de stimuler les lymphocytes T CD4+. Cependant, cette stricte ségrégation des voies d’apprêtement antigénique a été durement éprouvée par la capacité des cellules présentatrices d’antigènes à effectuer l’apprêtement d’antigènes exogènes et permettre leur présentation sur des molécules de CMH de classe I. De plus, l’identification récente de peptides d’origine intracellulaire associés à des molécules de CMH de classe II a clairement indiqué la présence d’interactions entre les deux voies d’apprêtement antigénique permettant de transgresser le dogme préalablement établi. L’objectif du travail présenté ici était de caractériser les voies d’apprêtement antigénique menant à la présentation d’antigènes viraux par les molécules du CMH de classe I lors d’une infection par le virus de l’Herpès simplex de type I (HSV-1). Dans les résultats rapportés ici, nous décrivons une nouvelle voie d’apprêtement antigénique résultant de la formation d’autophagosomes dans les cellules infectées. Cette nouvelle voie permet le transfert d’antigènes viraux vers un compartiment vacuolaire dégradatif dans la phase tardive de l’infection par le virus HSV-1. Cette mise en branle d’une seconde voie d’apprêtement antigénique permet d’augmenter le niveau de présentation de la glycoprotéine B (gB) virale utilisée comme modèle dans cette étude. De plus, nos résultats décrivent la formation d’une nouvelle forme d’autophagosomes dérivés de l’enveloppe nucléaire en réponse à l’infection par le virus HSV-1. Ces nouveaux autophagosomes permettent le transfert d’antigènes viraux vers un compartiment vacuolaire lytique, action également assurée par les autophagosomes dits classiques. Dans la deuxième partie du travail présenté ici, nous utilisons l’infection par le virus HSV-1 et la production de la gB qui en résulte pour étudier le trafic membranaire permettant le transfert de la gB vers un compartiment vacuolaire dégradatif. Nos résultats mettent en valeur l’importance du réticulum endoplasmique, et des compartiments autophagiques qui en dérivent, dans ces mécanismes de transfert antigénique permettant d’amplifier la présentation antigénique de la protéine virale gB sur des CMH de classe I via une voie vacuolaire. L’ensemble de nos résultats démontrent également une étroite collaboration entre la voie classique de présentation antigénique par les CMH de classe I et la voie vacuolaire soulignant, encore une fois, la présence d’interaction entre les deux voies.

Étude de l’implication de la force du signal transmis par le récepteur des cellules T dans le développement et la survie des lymphocytes T mémoires

Suite à la rencontre d’un antigène (Ag) présenté à la surface des cellules présentatrice de l’Ag (CPA), les lymphocytes T naïfs, ayant un récepteur des cellules T (RCT) spécifique de l’Ag, vont proliférer et se différencier en LT effecteurs (1). Suite à l’élimination de l’Ag la majorité des LTe vont mourir par apoptose alors que les restants vont se différencier en LT mémoire (LTm) protégeant l’organisme à long terme. Les mécanismes qui permettent la différenciation des LTe en LTm sont encore inconnus. Pour comprendre comment les LTm CD8+ sont générés à partir des LTe, nous avons émis l’hypothèse que la densité de l’Ag présenté par les CPA peut avoir un impact sur la sélection des LT CD8+ répondant l’Ag à se différencier en LTm. De manière intéressante, nos résultats montrent qu’une immunisation avec des cellules dendritiques (DCs) exprimant un haut niveau de complexe CMH/peptide à sa surface permet le développement de LTm. À l’inverse, le développement des LTm est fortement réduit (10-20X) lorsque les souris sont immunisées avec des DCs exprimant un niveau faible de complexes CMH/peptide à leur surface. De plus, la quantité d’Ag n’a aucune influence ni sur l’expansion des LT CD8+ ni sur l’acquisition de leurs fonctions effectrices, mais affecte de manière critique la génération des LTm. Nos résultats suggèrent que le nombre de RCT engagé lors de la reconnaissance de l’Ag est important pour la formation des LTm. Pour cela nous avons observé par vidéo-microscopie le temps d’interaction entre des LTn et des DCs. Nos résultats montrent que le temps et la qualité de l’interaction sont dépendants de la densité d’Ag présenté par les DCs. Effectivement, nous observons une diminution dans le pourcentage de LT faisant une interaction prolongée avec les DCs quand le niveau d’Ag est faible. De plus, nous observons des variations de l’expression des facteurs de transcription clefs impliqués dans la différenciation des LTm tels qu’Eomes, Bcl-6 et Blimp-1. Par ailleurs, la densité d’Ag fait varier l’expression du Neuron-derived orphan nuclear receptor 1 (Nor-1). Nor-1 est impliqué dans la conversion de Bcl-2 en molécule pro-apoptotique et contribue à la mort par apoptose des LTe pendant la phase de contraction. Notre modèle propose que la densité de l’épitope contrôle la génération des CD8+ LTm. Une meilleure compréhension des mécanismes impliqués dans la génération des LTm permettra le développement de meilleures stratégies pour la génération de vaccin. Dans un second temps, nous avons évalué le rôle du signal RCT dans l’homéostasie des LTm. Pour ce faire, nous avons utilisé un modèle de souris transgénique pour le RCT dont son expression peut être modulée par un traitement à la tétracycline. Ce système nous a permis d’abolir l’expression du RCT à la surface des LTm. De manière intéressante, en absence de RCT exprimé, les LTm CD8+ peuvent survivre à long terme dans l’organisme et rester fonctionnels. De plus, une sous population des LTm CD4+ a la capacité de survivre sans RCT exprimé dans un hôte lymphopénique alors que l’autre sous population nécessite l’expression du RCT.