Melanosome transfer between melanocytes and keratinocytes

RESUMO: A pele é o maior órgão do corpo humano e a sua pigmentação é essencial para a sua coloração e proteção contra os efeitos nocivos da radiação ultravioleta (UV). A pigmentação da pele resulta essencialmente de três processos: a síntese e o armazenamento de melanina pelos melanócitos, em organelos especializados denominados melanossomas; o transporte dos melanossomas dentro dos melanócitos; e finalmente, a transferência dos melanossomas para os queratinócitos adjacentes. Nos queratinócitos, a melanina migra para a região perinuclear apical da célula para formar um escudo protetor,responsável pela proteção do DNA dos danos causados pela radiação UV. Os melanócitos estão localizados na camada basal da epiderme e contactam com 30-40 queratinócitos. Em conjunto, estas células formam a “unidade melano-epidérmica”. Apesar dos processos de síntese e transporte de melanina nos melanócitos estarem bastante bem caracterizados, os mecanismos moleculares subjacentes à transferência inter-celular de melanina são menos conhecidos e ainda controversos. Dados preliminares obtidos pelo nosso grupo, que se basearam na observação de amostras de pele humana por microscopia electrónica, indicam que a forma predominante de transferência de melanina na epiderme consiste na exocitose dos melanossomas pelos melanócitos e subsequente endocitose da melanina por queratinócitos. Para além disso sabe-se que as proteínas Rab, que controlam o tráfego membranar, estão envolvidas em várias etapas de pigmentação da pele, nomeadamente na biogénese e no transporte de melanina. Assim, dado o seu papel fundamental nestes processos, questionámo-nos sobre o seu envolvimento na transferência de melanina. Com este trabalho, propomo-nos a expandir o conhecimento atual sobre a transferência de melanina na pele, através do estudo detalhado dos seus mecanismos moleculares, identificando as proteínas Rab que regulam o processo. Pretendemos também confirmar o modelo de exo/endocitose como sendo o mecanismo principal de transferência de melanina. Primeiro, explorámos a regulação da secreção de melanina pelos melanócitos e analisámos o papel de proteínas Rab neste processo. Os resultados foram obtidos recorrendo a um método in vitro, desenvolvido previamente no laboratório, que avalia a quantidade de melanina segregada para o meio de cultura por espectrofotometria, e ainda por microscopia, contando o número de melanossomas transferidos para os queratinócitos. Através de co-culturas de melanócitos e queratinócitos, verificou-se que os queratinócitos estimulam a libertação de melanina dos melanócitos para o meio extra-celular, bem como a sua transferência para os queratinócitos. Além disso, a proteína Rab11b foi identificada como um regulador da exocitose de melanina e da sua transferência para os queratinócitos. De facto, a diminuição da expressão de Rab11b em melanócitos provocou a redução da secreção de melanina estimulada por queratinócitos, bem como da transferência desta. Em segundo lugar, para complementar o nosso estudo, centrámos a nossa investigação na internalização de melanina por queratinócitos. Especificamente, usando uma biblioteca de siRNA, explorámos o envolvimento de proteínas Rab na captação de melanina por queratinócitos. Como primeira abordagem, usámos esferas fluorescentes como substituto de melanina, avaliando os resultados por citometria de fluxo. No entanto, este método revelou-se ineficaz uma vez que a internalização destas esferas é independente do recetor PAR-2 (recetor 2 ativado por protease), que foi previamente descrito como essencial na captação de melanina por queratinócitos Posteriormente, foi desenvolvido um novo protocolo de endocitose baseado em microscopia, usando melanossomas sem a membrana envolvente (melanocores) purificados do meio de cultura de melanócitos, incluindo um programa informático especialmente desenhado para realizar uma análise semi-automatizada. Após internalização, os melanocores acumulam-se na região perinuclear dos queratinócitos, em estruturas que se assemelham ao escudo supranuclear observado na pele humana. Seguidamente, o envolvimento do recetor PAR-2 na captação de melanocores por queratinócitos foi confirmado, utilizando o novo protocolo de endocitose desenvolvido. Para além disso, a necessidade de quatro proteínas Rab foi identificada na internalização de melanocores por queratinócitos. A redução da expressão de Rab1a ou Rab5b em queratinócitos diminuiu significativamente o nível de internalização de melanocores, enquanto o silenciamento da expressão de Rab2a ou Rab14 aumentou a quantidade de melanocores internalizados por estas células. Em conclusão, os resultados apresentados corroboram as observações anteriores, obtidas em amostras de pele humana, e sugerem que o mecanismo de transferência predominante é a exocitose de melanina pelos melanócitos, induzida por queratinócitos, seguida por endocitose pelos queratinócitos. A pigmentação da pele tem implicações tanto ao nível da cosmética, como ao nível médico, relacionadas com foto-envelhecimento e com doenças pigmentares. Assim sendo, ao esclarecer quais os mecanismos moleculares que regulam a transferência de melanina na pele, este trabalho pode conduzir ao desenvolvimento de novas estratégias para modular a pigmentação da pele.----------------ABSTRACT: Skin pigmentation is achieved through the highly regulated production of the pigment melanin in specialized organelles, termed melanosomes within melanocytes. These are transported from their site of synthesis to the melanocyte periphery before being transferred to keratinocytes where melanin forms a supra-nuclear cap to protect the DNA from UVinduced damage. Together, melanocytes and keratinocytes form a functional complex, termed “epidermal-melanin unit”, that confers color and photoprotective properties to the skin. Skin pigmentation requires three processes: the biogenesis of melanin; its intracelular transport within the melanocyte to the cell periphery; and the melanin transfer to keratinocytes. The first two processes have been extensively characterized. However, despite significant advances that have been made over the past few years, the mechanisms underlying inter-cellular transfer of pigment from melanocytes to keratinocytes remain controversial.Preliminary studies from our group using electron microscopy and human skin samples found evidence for a mechanism of coupled exocytosis-endocytosis. Rab GTPases are master regulators of intracellular trafficking and have already been implicated in several steps of skin pigmentation. Thus, we proposed to explore and characterize the molecular mechanisms of melanin transfer and the role of Rab GTPases in this process. Moreover, we investigated whether the exo/endocytosis model is the main mechanism of melanin transfer. We first focused on melanin exocytosis by melanocytes. Then, we started to investigate the key regulatory Rab proteins involved in this step by establishing an in vitro tissue culture model of melanin secretion. Using co-cultures of melanocytes and keratinocytes, we found that keratinocytes stimulate melanin release and transfer. Moreover, depletion of Rab11b decreases keratinocyte-induced melanin exocytosis by melanocytes. In order to determine whether melanin exocytosis is a predominant mechanism of melanin transfer, the amount of melanin transferred to keratinocytes was then assayed in conditions where melanin exocytosis was inhibited. Indeed, Rab11b depletion resulted in a significant decrease in melanin uptake by keratinocytes. Taken together, these observations suggest that Rab11b mediates melanosome exocytosis from melanocytes and transfer to keratinocytes. To complement and extend our study, we of melanin by keratinocytes. Thus, we aimed to explore the effect of depleting Rab GTPases on melanin uptake and trafficking within keratinocytes. As a first approach, we used fluorescent microspheres as a melanin surrogate. However, the uptake of microspheres was observed to be independent of PAR-2, a receptor that is required for melanin uptakecentred our attention in the internalization of melanin by keratinocytes. Thus, we aimed to explore the effect of depleting Rab GTPases on melanin uptake and trafficking within keratinocytes. As a first approach, we used fluorescent microspheres as a melanin surrogate. However, the uptake of microspheres was observed to be independent of PAR-2, a receptor that is required for melanin uptake.Therefore, we concluded that microspheres were uptaken by keratinocytes through a different pathway than melanin. Subsequently, we developed a microscopy-based endocytosis assay using purified melanocores (melanosomes lacking the limiting membrane) from melanocytes, including a program to perform a semi-automated analysis. Melanocores are taken up by keratinocytes and accumulate in structures in the perinuclear area that resemble the physiological supranuclear cap observed in human skin. We then confirmed the involvement of PAR-2 receptor in the uptake of melanocores by keratinocytes, using the newly developed assay. Furthermore, we identified the role of four Rab GTPases on the uptake of melanocores by keratinocytes. Depletion of Rab1a and Rab5b from keratinocytes significantly reduced the uptake of melanocores, whereas Rab2a, and Rab14 silencing increased the amount the melanocores internalized by XB2 keratinocytes. In conclusion, we present evidence supporting keratinocyte-inducedmelanosome exocytosis from melanocytes, followed by endocytosis of the melanin core by keratinocytes as the predominant mechanism of melanin transfer in skin. Although advances have been made, there is a need for more effective and safer therapies directed at pigmentation disorders and also treatments for cosmetic applications. Hence, the understanding of the above mechanisms of skin pigmentation will lead to a greater appreciation of the molecular machinery underlying human skin pigmentation and could interest the pharmaceutical and cosmetic industries.

Desenvolvimento de um sensor colorimétrico em papel para a deteção de bactérias eletroquimicamente ativas

Bactérias eletroquimicamente ativas possuem a capacidade de transferir eletrões extracelularmente, durante a respiração celular. Esta característica tem sido atualmente explorada para aplicação na produção de eletricidade, tratamento de águas residuais, biorremediação e em diversas áreas da biotecnologia, onde a transferência eletrónica ocorre na presença de aceitadores insolúveis (tais como, óxidos metálicos e ânodos metálicos). Contudo, o número de espécies identificadas, isoladas e caracterizadas até à data é bastante reduzido. Os métodos atualmente disponíveis para deteção de bactérias eletroquimicamente ativas são morosos, dispendiosos e complexos de operar, tornando-se necessário o desenvolvimento de outros métodos mais rápidos, simples e menos dispendiosos que auxiliem na otimização das aplicações mencionadas. O objetivo principal deste trabalho foi o desenvolvimento de um sensor colorimétrico de papel utilizando um material eletrocrómico, trióxido de tungsténio, como camada ativa para a deteção destas bactérias. Para isso, foram definidos no papel poços delimitados por barreiras hidrofóbicas, através da impressão e difusão de uma camada de cera. As várias amostras de nanopartículas de WO3, sintetizadas por um método hidrotermal assistido por micro-ondas, foram depositadas nos poços por drop casting. As nanopartículas com estrutura cristalográfica hexagonal, impregnadas no sensor de papel, foram capazes de detetar com sucesso uma bactéria eletroquimicamente ativa, Geobacter sulfurreducens, desde uma fase de crescimento bastante inicial (Abs600 nm = 0,1, correspondente a 0,07 g/L com um rácio RGB de 1,10 ± 0,040) até à fase exponencial-tardia (Abs600 nm = 0,5, correspondente a 0,33 g/L com um rácio RGB de 1,33 ± 0,005), com P <0,0001. O sensor de papel e respetivo método de deteção colorimétrico desenvolvido neste trabalho, revelou ser sensível e específico à deteção destas bactérias, de uma forma rápida, simples e pouco dispendiosa.

Definição e execução de computações dinâmicas numa linguagem de programação orientada-a-serviços

Os serviços inicialmente idealizados para o mundo dos negócios, têm actualmente um espectro de utilização muito mais lato, facilitando assim a incorporação de software do exterior, sob a representação de serviço, por parte das aplicações. Os principais contribuidores para a emergente utilização de serviços são a proliferação dos dispositivos móveis, a crescente popularidade da computação da nuvem e a ubiquidade da Internet. Apesar deste estado da arte, a abstracção dos serviços continua, maioritariamente, a ser relegada para a camada do middleware. Consequentemente, este confinamento obstem o programador de ter privilégios para interagir com os serviços ao nível da linguagem. A inexistência deste nível de abstracção dificulta o deployment de aplicações dinâmicas. Como medida para tal, o objectivo do nosso trabalho é garantir suporte ao dinamismo e deployment de arquitecturas orientadas a serviços. Com esse propósito, vamos endereçar os problemas de incorporação dos serviços acessíveis pela Web e permitir operações de reconfiguração dos mesmos, nomeadamente, a ligação dinâmica, substituição do fornecedor de serviços e a gestão dinâmica de conjuntos de fornecedores de serviços.

A utilização de uma rede neural artificial para previsão da incidência da malária no município de Cantá, estado de Roraima

INTRODUÇÃO: A malária é uma doença endêmica na Amazônia Legal Brasileira, apresentando riscos diferentes para cada região. O Município de Cantá, no Estado de Roraima, apresentou para todo o período estudado, um dos maiores índices parasitários anuais do Brasil, com valor sempre maior que 50. O presente estudo visa à utilização de uma rede neural artificial para previsão da incidência da malária nesse município, a fim de auxiliar os coordenadores de saúde no planejamento e gestão dos recursos. MÉTODOS: Os dados foram coletados no site do Ministério da Saúde, SIVEP - Malária entre 2003 e 2009. Estruturou-se uma rede neural artificial com três neurônios na camada de entrada, duas camadas intermediárias e uma camada de saída com um neurônio. A função de ativação foi à sigmoide. No treinamento, utilizou-se o método backpropagation, com taxa de aprendizado de 0,05 e momentum 0,01. O critério de parada foi atingir 20.000 ciclos ou uma meta de 0,001. Os dados de 2003 a 2008 foram utilizados para treinamento e validação. Comparam-se os resultados com os de um modelo de regressão logística. RESULTADOS: Os resultados para todos os períodos previstos mostraram-se que as redes neurais artificiais obtiveram um menor erro quadrático médio e erro absoluto quando comparado com o modelo de regressão para o ano de 2009. CONCLUSÕES: A rede neural artificial se mostrou adequada para um sistema de previsão de malária no município estudado, determinando com pequenos erros absolutos os valores preditivos, quando comparados ao modelo de regressão logística e aos valores reais.

Desenvolvimento de um sensor de ibuprofeno em meio aquoso

A proteção dos recursos hídricos tem uma enorme importância ecológica, sendo a água um recurso indispensável à Vida e fundamental para o bem-estar de uma sociedade. Para isso, muitos dos poluentes que afetam a qualidade deste recurso natural são detetados e eliminados nas estações de tratamento de águas residuais. Porém, o impacto dos Produtos Farmacêuticos e de Cuidado Pessoal (PPCPs), usados à escala global, carece ainda da atenção necessária, dado que os meios técnicos atualmente disponíveis para detetar estes produtos são dispendiosos ou insuficientes. Dentro daquela classe de produtos, destaca-se o Ibuprofeno, uma vez que este composto, sendo lipossolúvel, tem a capacidade para se acumular nas gorduras dos seres vivos e, por conseguinte, persistir no meio-ambiente com efeitos nocivos. Para além desse facto, por diferentes vias de reação, o Ibuprofeno tem potencial para gerar produtos de carácter semelhante. No entanto, pouco esforços têm sido feitos no sentido de o detetar. Assim, pretendeu-se com este projeto desenvolver metodologias com vista à deteção de muito baixas concentrações (entre o nano e o picoMolar) daquele composto em meio aquoso. Foi utilizada a tecnologia de Língua Eletrónica por Espectroscopia de Impedância e, para tentar melhorar a sensibilidade do sensor à molécula-alvo, foram utilizados filmes finos à base de nanotubos de carbono e de diferentes polieletrólitos, preparados pela técnica de Camada-sobre-Camada (LbL, do inglês Layer-by-Layer). A caracterização destes filmes foi feita pela técnica Espectrofotometria na faixa dos Ultravioleta e Visível. Para além da análise de diferentes concentrações de Ibuprofeno, foram ainda analisadas soluções de Cloreto de Sódio, com o intuito de perceber se o sensor é versátil na deteção de outro tipo de compostos, sendo, então, o sal um composto barato e relevante neste âmbito, uma vez que a água na Natureza apresenta sempre alguma salinidade. O trabalho compreendeu ainda o desenvolvimento de um programa informático para automatizar o processo de aquisição dos dados espectrais de impedância, recolhidos pelo analisador HAMEG Programmable LCR Bridge HM8118, o que foi feito com sucesso. Posteriormente, os dados foram tratados pelo procedimento estatístico de Análise de Componentes Principais, que permitiu discriminar espacialmente e sequencialmente as diferentes concentrações dos compostos analisados.

Avaliação do desempenho hidráulico de agregados reciclados de escórias de aciaria e RCD à água e ao lixiviado de RSU e sua comparação com basalto e calcário

As atuais políticas de gestão de resíduos estão mais focadas na reciclagem e na reutilização dos resíduos do que na sua eliminação em aterros de resíduos. Nos casos em que o resíduo não é perigoso para o ambiente, não existe nenhuma razão para que esse material não seja utilizado em obras de construção e de engenharia civil, desde que garanta um desempenho equivalente, no mínimo, ao dos materiais naturais. De forma a contribuir para a valorização dos resíduos, estudou-se o comportamento hidráulico de um Agregado Siderúrgico Inerte para a Construção (ASIC), proveniente de escórias de aciaria de Forno de Arco Elétrico (FAE), e de um agregado reciclado de betão, proveniente de resíduos de construção e demolição (RCD), à água de abastecimento público e a um lixiviado recolhido num aterro de resíduos sólidos urbanos (RSU). Pretendeu-se avaliar a viabilidade técnica da sua aplicação em estruturas de drenagem de obras geotécnicas e infraestruturas de transporte, em particular na camada de drenagem e recolha dos lixiviados dos aterros de resíduos. Efetuaram-se ensaios de permeabilidade sobre duas frações granulométricas diferentes: areia (0,25-2mm) e “brita” (2-20mm), considerando que no nosso país é habitual aquela camada ser composta por um nível de areia, com 0,2m de espessura, sobre um nível de brita, com 0,3m espessura. Seguindo o procedimento adotado para o estudo dos dois agregados reciclados, também se ensaiaram dois agregados naturais, basalto e calcário, utilizados como materiais de referência.

Ligação pavimentos/paredes de edifícios antigos. Ensaios e verificações de projeto

Esta dissertação foi desenvolvida no Departamento de Engenharia Civil (DEC) da Faculdade de Ciências e Tecnologia (FCT) da Universidade Nova de Lisboa (UNL). Tem como objetivo estudar o comportamento da ligação pavimento/parede de edifícios antigos. Primeiramente, foi realizada uma pesquisa bibliográfica sobre alvenaria de pedra, pavimentos de madeira e ligações pavimento/parede em alvenarias antigas. De seguida, foram analisados alguns trabalhos de investigação relacionados com o tema da presente dissertação, sobre alvenarias de pedra, pavimentos de madeira e respetivas ligações. A parte experimental desta dissertação foi desenvolvida no laboratório de estruturas do DEC da FCT da UNL. Teve como objetivo estudar a simulação de duas ligações pavimento/parede: uma, entre um pavimento e o murete de alvenaria de pedra sem reforço; e, outra, entre um pavimento e um murete de alvenaria de pedra reforçado com uma camada de microbetão e rede metálica. Posteriormente aos ensaios de simulação da ligação, foram efetuados ensaios de compressão axial nos dois muretes. A seguir foi determinada a profundidade de carbonatação. A partir dos resultados obtidos foi estudado o mecanismo de ferrolho para alvenaria de pedra e feita a verificação das tensões nos dois muretes. Os resultados obtidos nesta dissertação foram comparados com os resultados de trabalhos anteriormente realizados por outros autores, em especial, com a dissertação anterior a esta (Martins, 2014), a qual deu origem à presente linha de investigação. Uma das principais conclusões do estudo mostrou que, as ligações pavimento/parede realizadas no murete de alvenaria reforçado com lâmina de microbetão resistiu aproximadamente o dobro da resistência que as ligações realizadas no murete de alvenaria não reforçado.

Caracterização de filmes poliméricos para conversão de energia solar em energia eléctrica

Os polímeros são materiais de grande interesse científico e tecnológico já que podem ser utilizados no desenvolvimento de dispositivos para aplicação em electrónica e fotónica. Tendo em conta a sua aplicação em dispositivos de conversão de energia solar em energia eléctrica, o estudo das propriedades eléctricas e ópticas de filmes destes materiais, quando irradiados por radiação ultravioleta e visível, é fundamental. Neste trabalho caracterizaram-se as propriedades eléctricas e ópticas de filmes finos obtidos pelas técnicas de derramamento e de camada-por-camada (Layer-by-Layer (LbL)) obtidos a partir do poli(cloreto de xilideno tetrahidrotiofeno) (PTHT) que após aquecimento é convertido em poli(p-fenileno vinileno) (PPV). Assim, e através da técnica de derramamento, foram preparados filmes sobre suportes sólidos com eléctrodos interdigitais de forma a proceder à medição da condutividade em modo de corrente alternada (AC), isto é, à medição da resistência e da capacidade em função da frequência. Verificou-se, portanto, que a presença de luz leva à formação de portadores de carga, ou seja, na presença de luminosidade os filmes apresentam uma menor capacitância e resistência, para além de degradar o material. Esta degradação foi verificada, também, a partir da espectrofotometria de Ultravioleta-Visível (UV-Vis) e de infravermelho (IV). Medições de condutividade de volume, isto é, colocando os filmes entre eléctrodos paralelos de funções de trabalho diferentes, permitiram traçar as curvas características e verificar que os dispositivos obtidos se comportam como díodos. Recorreu-se, também, a técnicas de espectrofotometria de ultravioleta do vácuo (VUV) e UV-Vis para caracterizar filmes LbL obtidos a partir do PTHT e de um polieletrólito comum o poli(estireno sulfonado) (PSS) antes e após aquecimento. Os espectros obtidos, após análise dos picos, mostram que a técnica de VUV é a técnica indicada para analisar a conversão do PTHT em PPV. Este trabalho permitiu concluir que as propriedades eléctricas e ópticas destes filmes, estão dependentes da presença de luminosidade, de oxigénio e da humidade relativa pelo que dispositivos obtidos a partir deste polímero devem ser, sempre, encapsulados.

Caracterização de filmes poliméricos para conversão de energia solar em energia eléctrica

Os polímeros são materiais de grande interesse científico e tecnológico já que podem ser utilizados no desenvolvimento de dispositivos para aplicação em electrónica e fotónica. Tendo em conta a sua aplicação em dispositivos de conversão de energia solar em energia eléctrica, o estudo das propriedades eléctricas e ópticas de filmes destes materiais, quando irradiados por radiação ultravioleta e visível, é fundamental. Neste trabalho caracterizaram-se as propriedades eléctricas e ópticas de filmes finos obtidos pelas técnicas de derramamento e de camada-por-camada (Layer-by-Layer (LbL)) obtidos a partir do poli(cloreto de xilideno tetrahidrotiofeno) (PTHT) que após aquecimento é convertido em poli(p-fenileno vinileno) (PPV). Assim, e através da técnica de derramamento, foram preparados filmes sobre suportes sólidos com eléctrodos interdigitais de forma a proceder à medição da condutividade em modo de corrente alternada (AC), isto é, à medição da resistência e da capacidade em função da frequência. Verificou-se, portanto, que a presença de luz leva à formação de portadores de carga, ou seja, na presença de luminosidade os filmes apresentam uma menor capacitância e resistência, para além de degradar o material. Esta degradação foi verificada, também, a partir da espectrofotometria de Ultravioleta-Visível (UV-Vis) e de infravermelho (IV). Medições de condutividade de volume, isto é, colocando os filmes entre eléctrodos paralelos de funções de trabalho diferentes, permitiram traçar as curvas características e verificar que os dispositivos obtidos se comportam como díodos. Recorreu-se, também, a técnicas de espectrofotometria de ultravioleta do vácuo (VUV) e UV-Vis para caracterizar filmes LbL obtidos a partir do PTHT e de um polieletrólito comum o poli(estireno sulfonado) (PSS) antes e após aquecimento. Os espectros obtidos, após análise dos picos, mostram que a técnica de VUV é a técnica indicada para analisar a conversão do PTHT em PPV. Este trabalho permitiu concluir que as propriedades eléctricas e ópticas destes filmes, estão dependentes da presença de luminosidade, de oxigénio e da humidade relativa pelo que dispositivos obtidos a partir deste polímero devem ser, sempre, encapsulados.

Análise dos mecanismos de capilaridade em corpos porosos

Na sua grande maioria os materiais correntes de construção são porosos e, como tal, susceptíveis à ascensão capilar. Um dos principais elementos expostos a este fenómeno são as paredes de alvenaria que, dado o seu contacto directo com o solo, levam a que a ascensão capilar se processe de forma intermitente em função das estações do ano e do nível freático dos terrenos. Na sua constituição, têm maioritariamente pedra ou tijolo ligados por uma argamassa, podendo ou não ter uma camada de enchimento que separa dois panos de alvenaria. Dada a heterogeneidade destes elementos, o fenómeno desenrolar-se-á de uma forma diferenciada entre diferentes materiais e a zona que os separa (interface), em especial devido à grande diferença de porometria dos materiais. Para além deste ponto, o fluxo pode ser interrompido ou alterado por um elemento que constitui a parede, alternando a forma como a humidade absorvida. No âmbito deste trabalho, recolheram-se amostras de materiais utilizados nas paredes de alvenaria em Portugal, nomeadamente o calcário, o granito e o tijolo bem como materiais granulares que fazem o enchimento entre dois panos de alvenaria. Para conhecer a estrutura porosa dos materiais ensaiados, realizaram-se ensaios de porometria com recurso ao porosimetro de mercúrio e foi feita a caracterização dos materiais com base no método gravimétrico que combinados com os ensaios de absorção capilar em diferentes disposições, o que permitiu conhecer de que forma a combinação de materiais com diferentes gamas de poros afecta o comportamento capilar. Foi, ainda, realizada uma análise da ascensão capilar em amostras com diferentes teores de água iniciais. A conjunção de todos os resultados permitiu constatar que o tipo de interface entre corpos porosos não tem influência na ascenção capilar e que variações na absorção capilar a partir desta zona são resultado da diferença de porometrias sendo as condicionantes apresentadas na presente dissertação.

Sentir e narrar o sagrado: em torno da sacralização do(s) espaço(s) aquático(s) e terrestre(s) no Egipto Antigo

O objectivo primordial da presente dissertação caracteriza-se por uma aproximação epistemológica à seguinte pergunta: como sacralizavam os antigos Egípcios o espaço em que identitariamente se inscreviam e reconheciam? Assim, a nossa temática central será a da sacralização do espaço, em contexto civilizacional nilótico, mais concretamente, do(s) espaço(s) aquático(s) e terrestre(s). Entenderemos o conceito de "espaço" em sentido lato, referindo-nos às superfícies aquáticas e à camada telúrica egípcia e não a um espaço concreto, como a "casa" ou o "templo". Trata-se assim, de compreender a forma como o colectivo humano egípcio foi sentindo e narrando o seu espaço sagrado, pelo que a realidade espacial será abordada, essencialmente, na sua capacidade construtora da identidade de um povo.

Primary cilia and the regulation of hedgehog signaling: link to cardiac development

RESUMO: As células eucarióticas evoluíram um sistema de sinalização complexo que lhes permite responder aos sinais extracelulares e intracelulares. Desta forma, as vias de sinalização são essenciais para a sobrevivência da célula e do organismo, uma vez que regulam processos fundamentais, tais como o desenvolvimento, o crescimento, a imunidade, e a homeostase dos tecidos. A via de transdução de sinal Hedgehog (Hh) envolve o receptor Patched1 (Ptch1), que tem um efeito inibidor sobre a proteína Smoothened (Smo) na ausência dos seus ligandos, as proteínas Sonic hedgehog (Shh). Estas proteínas são reguladores fundamentais do desenvolvimento embrionário, como ilustrado pelas malformações drásticas observadas em embriões humanos e de murganho com perturbações da transdução de sinal da via Hh e que incluem polidactilia, defeitos craniofaciais e malformações ósseas. Igualmente importantes são as consequências da ativação inapropriada da via de sinalização Hh na formação de tumores. Curiosamente, os componentes desta via localizam-se nos cílios primários. Além disso, demonstrou-se que esta localização é crucial para a sinalização através da via Hh. Na presença dos ligandos, Ptch1 é internalizado e destinado a degradação ou sequestrado num compartimento da célula de onde não pode desempenhar o seu papel inibitório. A proteína Arl13b é uma pequena GTPase pertencente à família Arf/Arl da superfamília Ras de pequenas GTPases e foi implicada no síndrome de Joubert, uma ciliopatia caracterizada por ataxia congénita cerebelar, hipotonia, atrso mental e cardiopatia congénita. Murganhos deficientes para Arl13b, chamado hennin (hnn) morrem morrem prematuramente ao dia 13,5 de gestação (E13,5) e exibem anomalias morfológicas nos cílios que levam à interrupção da sinalização Hh. Além disso, a Arl13b está diretamente envolvida na regulação da via Hh, controlando a localização de vários componentes desta via nos cílios primários. Neste trabalho, mostramos que a Arl13b se localiza em circular dorsal ruffles (CDRs), que são estruturas de actina envolvidas em macropinocitose e internalização de recetores, e que regula a sua formação. Além disso, aprofundámos o conhecimento do processo de ativação da via de sinalização Hh, mostrando que as CDRs sequestram seletivamente e internalizam o recetor Ptch1. As CDRs formam-se minutos após ativação da via por ligandos Shh ou pelo agonista de Smo SAG e continuam a ser formadas a partir daí, sugerindo uma indução contínua da reorganização do citoesqueleto de actina quando a via está ativada. Observámos ainda que a inibição da formação de CDRs através do silenciamento de WAVE1, uma proteína necessária para a formação destas estruturas, resulta na diminuição da ativação da via de sinalização Hh. Além disso, o bloqueio da macropinocitose, que se segue ao fecho das CDRs, através do silenciamento de uma proteína necessária para a cisão de macropinossomas, nomeadamente a proteína BARS, tem um efeito semelhante. Estes resultados sugerem que as CDRs e a macropinocitose são necessárias para a ativação da via de sinalização Hh e indicam que esta via de internalização controla os níveis de sinal Hh. Durante o desenvolvimento, as células proliferativas dependem do cílio primário para a transdução de várias vias de sinalização. A via Hh induz a diferenciação do músculo cardíaco. Por conseguinte, os murganhos deficientes na via de sinalização Hh exibem uma variedade de defeitos de lateralidade, incluindo alteração do looping do coração, como pode ser visto em murganhos deficientes para Arl13b. Por conseguinte, investigámos o papel da Arl13b no desenvolvimento do coração. Mostramos que a Arl13b é altamente expressa no coração de embriões de murganho e de murganhos adultos ao nível do mRNA e da proteína. Além disso, o perfil de distribuição da Arl13b no coração segue o dos cílios primários, que são essenciais para o desenvolvimento cardíaco. Corações de murganhos hnn no estadio E12,5 mostram um canal átrio-ventricular aberto, espessamento da camada compacta ventricular e aumento do índice mitótico no ventrículo esquerdo. Além disso, um atraso de 1 a 2 dias no desenvolvimento é observado em corações de murganhos hnn, quando comparados com controlos selvagens no estadio E13,5. Assim, estes resultados sugerem que a Arl13b é necessária para o desenvolvimento embrionário do coração e que defeitos cardíacos podem contribuir para a letalidade embrionária de murganhos hnn. Em suma, foi estabelecido um novo mecanismo para a regulação dos níveis de superfície do recetor Ptch1, que envolve a remodelação do citoesqueleto de actina e a formação de CDRs após a ativação da via de sinalização Hh. Este mecanismo permite um feedback negativo que evita a repressão excessiva da via através da remoção de Ptch1 da superfície da célula. Além disso, determinou-se que uma mutação de perda de função na Arl13b causa defeitos cardíacos durante o desenvolvimento, possivelmente relacionados com a associação dos defeitos em cílios primários e na sinalização Hh, existentes em murganhos deficientes para Arl13b. A via de sinalização Hh tem tido um papel central entre as vias de sinalização, uma vez que a sua regulação é crucial para o funcionamento apropriada da célula. Assim, a descoberta de um novo mecanismo de tráfego através de macropinocitose e CDRs que controla a ativação e repressão da via de sinalização Hh traz novas perspetivas de como esta via pode ser regulada e pode ainda conduzir à identificação de novos alvos e estratégias terapêuticas. --------------------ABSTRACT: Eukaryotic cells have evolved a complex signaling system that allows them to respond to extracellular and intracellular cues. Signaling pathways are essential for cell and organism survival, since they regulate fundamental processes such as development, growth, immunity, and tissue homeostasis. The Hedgehog (Hh) pathway of signal transduction involves the receptor Patched1 (Ptch1), which has an inhibitory effect on Smoothened (Smo) in the absence of its ligands, the Sonic hedgehog (Shh) proteins. These proteins are fundamental regulators of embryonic development, as illustrated by the dramatic malformations seen in human and mouse embryos with perturbed Hh signal transduction that include polydactyly, craniofacial defects and skeletal malformations. Equally important are the consequences of inappropriate activation of the Hh signaling response in tumor formation. Interestingly, the components of this pathway localize to primary cilia. Moreover, it has been shown that this localization is crucial for Hh signaling. However, in the presence of the ligands, Ptch1 is internalized and destined for degradation or sequestered in a cell compartment where it no longer can play its inhibitory role. ADP-ribosylation factor-like (Arl) 13b, a small GTPase belonging to Arf/Arl family of the Ras superfamily of small GTPases has been implicated in Joubert syndrome, a ciliopathy characterized by congenital cerebellar ataxia, hypotonia, intellectual disability and congenital heart disease. Arl13b-deficient mice, called hennin (hnn) die at embryonic day 13.5 (E13.5) and display morphological abnormalities in primary cilia that lead to the disruption of Hh signaling. Furthermore, Arl13b is directly involved in the regulation of Hh signaling by controlling the localization of several components of this pathway to primary cilia. Here, we show that Arl13b localizes to and regulates the formation of circular dorsal rufles (CDRs), which are actin-basedstructures known to be involved in macropinocytosis and receptor internalization. Additionally, we extended the knowledge of the Hh signaling activation process by showing that CDRs selectively sequester and internalize Ptch1 receptors. CDRs are formed minutes after Hh activation by Shh ligands or the Smo agonist SAG and keep being formed thereafter, suggesting a continuous induction of actin reorganization when the pathway is switched on. Importantly, we observed that disruption of CDRs by silencing WAVE1, a protein required for CDR formation, results in down-regulation of Hh signaling activation. Moreover, the blockade of macropinocytosis, which follows CDR closure, through silencing of a protein necessary for the fission of macropinosomes, namely BARS has a similar effect. These results suggest that CDRs and macropinocytosis are necessary for activation of Hh signaling and indicate that this pathway of internalization controls Hh signal levels. During development, proliferating cells rely on the primary cilium for the transduction of several signaling pathways. Hh induces the differentiation of cardiac muscle. Accordingly, Hh-deficient mice display a variety of laterality defects, including alteration of heart looping, as seen in Arl13b-deficient mice. Therefore, we investigated the role of Arl13b in heart development. We show that Arl13b is highly expressed in the heart of both embryonic and adult mice at mRNA and protein levels. Also, Arl13b localization profile mimics that of primary cilia, which have been shown to be essential to early heart development. E12.5 hnn hearts show an open atrioventricular channel, increased thickening of the ventricular compact layer and increased mitotic index in the left ventricle. Moreover, a delay of 1 to 2 days in development is observed in hnn hearts, when compared to wild-type controls at E13.5. Hence, these results suggest that Arl13b is necessary for embryonic heart development and that cardiac defects might contribute to the embryonic lethality of hnn mice. Altogether, we established a novel mechanism for the regulation of Ptch1 surface levels, involving cytoskeleton remodeling and CDR formation upon Hh signaling activation. This mechanism allows a negative feedback loop that prevents excessive repression of the pathway by removing Ptch1 from the cell surface. Additionally, we determined that the Arl13b loss-offunction mutation causes cardiac defects during development, possibly related to the associated ciliary and Hh signaling defects found in Arl13b-deficient mice. Hh signaling has taken a center stage among the signaling pathways since its regulation is crucial for the appropriate output and function of the cell. Hence, the finding of a novel trafficking mechanism through CDRs and macropinocytosis that controls Hh signaling activation and repression brings new insights to how this pathway can be regulated and can lead to the discovery of novel therapeutic targets and strategies.

Previsão de produção de energia eléctrica através de fontes de energia renováveis

Com o passar do tempo, a aposta em energias renováveis tem vindo a aumentar. De forma a prever o que se irá produzir com os sistemas de energias renováveis, é necessário desenvolver modelos preditivos, específicos para cada situação. No Departamento de Engenharia Electrotécnica (DEE) da Faculdade de Ciências e Tecnologia (FCT) encontra-se um sistema fotovoltaico e um sistema eólico em funcionamento, e assim de forma a ter uma estimativa da produção de energia de ambos os sistemas, propôs-se nesta dissertação desenvolver um modelo de previsão de produção de energia eléctrica para os sistemas fotovoltaico e eólico. Para desenvolver o modelo preditivo pretendido, em primeiro lugar recolheram-se os dados meteorológicos e de produção de energia no ano 2013 e realizou-se um processamento desses mesmos dados, com a linguagem de programação Java, uma vez que não se encontravam na melhor forma para serem analisados e utilizados para construção do modelo. Após realizado o processamento, como os dados do ano de 2014 existentes não eram suficientes para testar o modelo depois de ser desenvolvido, geraram-se dados meteorológicos para 2014 tendo em consideração os dados de 2013. Para os dados de energia produzida, criaram-se superfícies de aproximação a partir dos dados de 2013, e utilizando os dados meteorológicos gerados para 2014 obteve-se uma aproximação da energia produzida. Tendo todos os dados necessários para a construção do modelo e posteriormente para o testar, iniciouse o pré-processamento dos dados com recurso a filtros e à Análise em Componentes Principais. Por fim, construíram-se duas estruturas diferentes de Redes Neuronais Artificiais de modo a verificar qual se adequa melhor aos sistemas existentes. Para validar o modelo construído com base em redes neuronais testou-se o modelo com os dados de 2014, diferentes dos utilizados na sua construção. Com os resultados obtidos concluiu-se que o filtro mais adequado para o pré-processamento é o filtro Savitzky-Golay e a estrutura do modelo mais indicada para o pretendido será a Rede Neuronal Artificial (RNA) com apenas uma camada intermédia.

Análise do comportamento higrotérmico em regime variável de paredes sujeitas à acção da chuva incidente

A crise económica e social que assola Portugal desde 2008 e o aumento da exigência do nível de qualidade de vida dos utilizadores dos imóveis deram origem a um aumento de investimento na área de reabilitação de edifícios. A informação recolhida a partir dos Censos de 2011 mostra que existem cerca de dois milhões de imóveis, correspondentes a 34% do parque habitacional nacional, que necessitam de recuperação. Este facto ilustra bem a importância da aposta na reabilitação de edifícios no mercado português. A presente dissertação procura dar resposta a algumas das questões levantadas pela reabilitação de edifícios, nomeadamente em edifícios com paredes de tijolo maciço, através da análise higrotérmica de várias soluções construtivas que têm como camada de suporte o tijolo maciço, recorrendo ao programa WUFI® 4.2 - PRO. O WUFI® 4.2 - PRO foi um programa construído pelo Fraunhofer Institute for Building Physics que permite simular o transporte simultâneo de calor e de humidade unidimensional em elementos construtivos com várias camadas. Em primeiro lugar estudou-se o elemento construtivo com face à vista de modo a averiguar a influência da camada de tijolo maciço, seguindo-se uma análise à influência da espessura desta camada. Em segundo lugar analisou-se a influência do reboco exterior, interior e em ambas as faces na camada de tijolo maciço, tendo este estudo incluído argamassa de cal, de cal e cimento, e de cimento. Em terceiro lugar são analisadas as alterações que uma reabilitação térmica pelo interior ou pelo exterior impõem numa parede de tijolo maciço. Por último quantificou-se a diferença entre o coeficiente de transmissão térmica calculado em regime permanente e em regime variável, tendo esta análise sido efectuada para todos os elementos construtivos simulados na presente dissertação. O estudo desenvolvido permitiu corroborar o facto de que a chuva incidente é a principal responsável pelo transporte de humidade no interior do elemento construtivo, e que a quantidade de chuva incidente absorvida pela superfície exterior do elemento influencia tanto o fluxo de difusão como o fluxo capilar. As análises efectuadas permitiram clarificar a importância da camada de reboco. O reboco exterior diminui a quantidade de humidade na camada de tijolo maciço, enquanto o reboco interior implica um aumento. A aplicação de reboco em ambas as faces implica uma quantidade de humidade na camada de tijolo superior à aplicação apenas de reboco exterior. Dos rebocos analisados o único que não implica um aumento da quantidade de humidade é o reboco de cimento. Conclui-se que na aplicação de isolamento pelo exterior o reboco aplicado nas faces da camada de suporte não influencia de forma significativa o comportamento do elemento construtivo. No entanto, o mesmo não pode ser afirmado para a aplicação de isolamento pelo interior, já que o reboco exterior é principal responsável pela quantidade de humidade no elemento construtivo.

Sensores “em movimento"

A domótica e a Internet das Coisas (Internet of Things – IoT) são dois conceitos que estão a ter bastante impacto na sociedade e a mudar o seu quotidiano, pelo que o utilizador é mais exigente na utilização dos seus equipamentos, pretendendo, que sejam mais simples e eficazes. A IoT é também muito utilizada na vertente da qualidade de vida (verificação da qualidade do ar, temperatura etc.) pelo que é necessário a utilização de uma rede de sensores de forma que toda a informação recolhida seja disponibilizada ao utilizador. Os sensores estão ligados a nós da rede de forma a recolherem informação. Essa rede pode ser constituída por diferentes topologias, sendo que a mais usual é a rede em Malha, pois no caso de um dos nós deixar de funcionar, a mensagem é enviada através de outros nós até chegar ao nó principal. O passo seguinte consiste em enviar toda essa informação para a Cloud, sendo que, nas soluções existentes, é necessário que o utilizador tenha um ponto fixo (gateway) com acesso à internet. Quando não é possível internet por cabo, a solução é a utilização de redes sem fios ou a utilização de, por exemplo, um cartão 3G/4G que implica o pagamento de taxas às operadoras móveis. Estas soluções implicam, na sua grande maioria uma instalação elétrica para alimentação dos nós dos sensores. O grande problema surge quando o utilizador não possui nenhum acesso à Internet (no local onde são instalados os sensores), ou no caso de não existência de nenhuma instalação elétrica para alimentação dos nós dos sensores. A solução proposta nesta dissertação consiste na utilização de um telemóvel, de um utilizador aleatório, como gateway. Assim, um utilizador comum pode ligar os seus sensores onde for necessário. Esses sensores são configurados Over-The-Air através de uma camada de aplicação do dispositivo de comunicação, como por exemplo, o Synapse. Após configuração, os sensores estão prontos a recolher toda a informação e enviá-la através da rede até ao nó principal. O nó principal é constituído pelo dispositivo de comunicação referido anteriormente, ligado a um microcontrolador (Arduino, por exemplo) que tem agregado um leitor de cartões SD e um dispositivo Bluetooth (BLE). Toda a informação recolhida pelos sensores é guardada no cartão SD até que um utilizador, com um telemóvel (Smartphone Android com a aplicação desenvolvida instalada) com o Bluetooth ligado, se aproxime do nó principal. Assim que a ligação é aceite e estabelecida, a aplicação envia a data mais recente de um sensor específico presente na sua base de dados na Cloud para o Arduino, permitindo que este apague os dados mais antigos presentes no cartão e envie, como resposta para o telemóvel, a informação mais antiga recolhida pelo sensor, atualizando assim a informação. A aplicação deste conceito pode ser útil quando não existe nenhuma ligação à internet ou quando um utilizador, por exemplo uma entidade responsável pelo meio ambiente e que seja necessário inserir sensores numa floresta, para prevenção de fogos. Assim os nós vão enviar toda a informação recolhida através da sua rede. Posteriormente, cabe ao utilizador escolher um sítio estratégico, onde saiba que irão passar indivíduos com alguma frequência, de modo a que estes recebam essa informação para o seu telemóvel.