Multidrug resistance protein 1 localization in lipid raft domains and prostasomes in prostate cancer cell lines

Background: One of the problems in prostate cancer (CaP) treatment is the appearance of the multidrug resistance phenotype, in which ATP-binding cassette transporters such as multidrug resistance protein 1 (MRP1) play a role. Different localizations of the transporter have been reported, some of them related to the chemoresistant phenotype. Aim: This study aimed to compare the localization of MRP1 in three prostate cell lines (normal, androgen-sensitive, and androgen-independent) in order to understand its possible role in CaP chemoresistance. Methods: MRP1 and caveolae protein markers were detected using confocal microscopy, performing colocalization techniques. Lipid raft isolation made it possible to detect these proteins by Western blot analysis. Caveolae and prostasomes were identified by electron microscopy. Results: We show that MRP1 is found in lipid raft fractions of tumor cells and that the number of caveolae increases with malignancy acquisition. MRP1 is found not only in the plasma membrane associated with lipid rafts but also in cytoplasmic accumulations colocalizing with the prostasome markers Caveolin-1 and CD59, suggesting that in CaP cells, MRP1 is localized in prostasomes. Conclusion: We hypothesize that the presence of MRP1 in prostasomes could serve as a reservoir of MRP1; thus, taking advantage of the release of their content, MRP1 could be translocated to the plasma membrane contributing to the chemoresistant phenotype. The presence of MRP1 in prostasomes could serve as a predictor of malignancy in CaP

The L-type voltage-gated calcium channel modulates microglial pro-inflammatory activity

Under pathological conditions, microglia, the resident CNS immune cells, become reactive and release pro-inflammatory cytokines and neurotoxic factors. We investigated whether this phenotypic switch includes changes in the expression of the L-type voltage-gated calcium channel (VGCC) in a rat model of N-methyl-d-aspartate-induced hippocampal neurodegeneration. Double immunohistochemistry and confocal microscopy evidenced that activated microglia express the L-type VGCC. We then analyzed whether BV2 microglia express functional L-type VGCC, and investigated the latter's role in microglial cytokine release and phagocytic capacity. Activated BV2 microglia express the CaV1.2 and CaV1.3 subunits of the L-type VGCC determined by reverse transcription-polymerase chain reaction, Western blot and immunocytochemistry. Depolarization with KCl induced a Ca2+ entry facilitated by Bay k8644 and partially blocked with nifedipine, which also reduced TNF-α and NO release by 40%. However, no nifedipine effect on BV2 microglia viability or phagocytic capacity was observed. Our results suggest that in CNS inflammatory processes, the L-type VGCC plays a specific role in the control of microglial secretory activity.

Multidrug resistance protein 1 localization in lipid raft domains and prostasomes in prostate cancer cell lines

Background: One of the problems in prostate cancer (CaP) treatment is the appearance of the multidrug resistance phenotype, in which ATP-binding cassette transporters such as multidrug resistance protein 1 (MRP1) play a role. Different localizations of the transporter have been reported, some of them related to the chemoresistant phenotype. Aim: This study aimed to compare the localization of MRP1 in three prostate cell lines (normal, androgen-sensitive, and androgen-independent) in order to understand its possible role in CaP chemoresistance. Methods: MRP1 and caveolae protein markers were detected using confocal microscopy, performing colocalization techniques. Lipid raft isolation made it possible to detect these proteins by Western blot analysis. Caveolae and prostasomes were identified by electron microscopy. Results: We show that MRP1 is found in lipid raft fractions of tumor cells and that the number of caveolae increases with malignancy acquisition. MRP1 is found not only in the plasma membrane associated with lipid rafts but also in cytoplasmic accumulations colocalizing with the prostasome markers Caveolin-1 and CD59, suggesting that in CaP cells, MRP1 is localized in prostasomes. Conclusion: We hypothesize that the presence of MRP1 in prostasomes could serve as a reservoir of MRP1; thus, taking advantage of the release of their content, MRP1 could be translocated to the plasma membrane contributing to the chemoresistant phenotype. The presence of MRP1 in prostasomes could serve as a predictor of malignancy in CaP

Multidrug resistance protein 1 localization in lipid raft domains and prostasomes in prostate cancer cell lines

Background: One of the problems in prostate cancer (CaP) treatment is the appearance of the multidrug resistance phenotype, in which ATP-binding cassette transporters such as multidrug resistance protein 1 (MRP1) play a role. Different localizations of the transporter have been reported, some of them related to the chemoresistant phenotype. Aim: This study aimed to compare the localization of MRP1 in three prostate cell lines (normal, androgen-sensitive, and androgen-independent) in order to understand its possible role in CaP chemoresistance. Methods: MRP1 and caveolae protein markers were detected using confocal microscopy, performing colocalization techniques. Lipid raft isolation made it possible to detect these proteins by Western blot analysis. Caveolae and prostasomes were identified by electron microscopy. Results: We show that MRP1 is found in lipid raft fractions of tumor cells and that the number of caveolae increases with malignancy acquisition. MRP1 is found not only in the plasma membrane associated with lipid rafts but also in cytoplasmic accumulations colocalizing with the prostasome markers Caveolin-1 and CD59, suggesting that in CaP cells, MRP1 is localized in prostasomes. Conclusion: We hypothesize that the presence of MRP1 in prostasomes could serve as a reservoir of MRP1; thus, taking advantage of the release of their content, MRP1 could be translocated to the plasma membrane contributing to the chemoresistant phenotype. The presence of MRP1 in prostasomes could serve as a predictor of malignancy in CaP

Detecção de Closterovirus em videira e caracterização parcial de um isolado do Grapevine leafroll-associated virus 3

O enrolamento da folha da videira (Vitis spp.) é uma doença causada por até oito vírus, Grapevine leafroll-associated virus (GLRaV) 1 a 8, sorologicamente distintos e associados ao floema de videiras infetadas. Neste trabalho, foram detectados GLRaV-1 e -3 por DAS-ELISA em 6,9 e 14,7% das amostras analisadas, respectivamente, e provenientes de duas importantes regiões vitícolas do Brasil (Serra Gaúcha e Vale do São Francisco). Os GLRaV-2, -5 e -7 não foram detectados. O GLRaV-3 também foi detectado por dot-ELISA e western blot, observando-se a provável proteína capsidial com cerca de 36 kDa. Um fragmento de 340 pb, compreendendo o terminal 3' do gene da polimerase viral de GLRaV-3, foi amplificado por PCR e seqüenciado. As seqüências de nucleotídeos e aminoácidos deduzidos deste isolado apresentaram alta homologia, 95,0 e 97,1%, respectivamente, com outro isolado de GLRaV-3 (NY1).

Effects of single and double infections with Potato virus X and Tobacco mosaic virus on disease development, plant growth, and virus accumulation in tomato

The tomato cv. Fukuju nº. 2 was used for studying the effect of single and double infections with Potato virus X (PVX) and Tobacco mosaic virus (TMV). Mixed infection resulted in a synergistic increase of disease severity, where more growth reduction was seen with simultaneous inoculations than with sequential inoculations at four-day intervals. At five and 12 days post-inoculation, the increased severity of the disease coincided with enhancement of virus accumulation in the rapidly expanding upper leaves. The PVX concentration in leaves nº 5 to 7 of doubly infected plants was three to six fold that of singly infected ones, as determined by DAS-ELISA. Mixed infection with the L strain led to higher enhancement of PVX than with the TMV-L11A strain. The concentration of TMV-L was lower in double infection and significantly higher than TMV-L11A in both singly and doubly infected plants. Analyses of the PVX ORF2 by Western blot and Northern hybridization revealed the pattern of accumulation of the 25 kDa protein and the RNAs, respectively, following those of the virion and coat protein. The strain TMV-L11A overcame the resistance gene in cv. GCR 237 (Tm-1). In the upper leaf nº. 8, the concentration of PVX was three times higher in plants with mixed infection than with L11A. The concentrations of the L and OM (TMV strains) in both singly and doubly infected plants were at very low levels, and the synergistic effect on PVX concentration and disease severity was not observed.

Detection and coat protein gene characterization of an isolate of Grapevine virus B from corky bark-affected grapevines in Southern Brazil

An isolate of Grapevine virus B (GVB), obtained by indexing Vitis labrusca and V. vinifera grapevines on the indicator LN33, was transmitted mechanically to several Nicotiana species. The virus was partially purified from N. cavicola and the coat protein estimated at 23 kDa by SDS-PAGE. In negatively stained leaf extracts of experimentally inoculated N. cavicola and N. occidentalis, flexuous particles with cross banding were observed, predominantly measuring 750-770 x 12 nm, with a modal length of 760 nm. Decoration indicated a clear, positive reaction against AS-GVB. In DAS-ELISA, GVB was detected in N. cavicola and grapevine extracts, and Western blots showed homologous and cross reaction of GVB and GVA antisera with GVB coat protein. Using specific primers for GVB, a fragment of 594 bp, comprising the coat protein gene coding for 197 amino acids, was amplified by RT-PCR with viral RNA extracted from GVB-infected N. occidentalis. The nucleotide and the deduced amino acid sequences of the coat protein gene showed high identities with Italian and Japanese isolates of GVB.

Identificação e caracterização de um potyvírus isolado de Zinnia elegans

O presente trabalho teve como objetivo a identificação e caracterização de um potyvírus isolado de Zinnia elegans, na Região Noroeste do Estado de São Paulo. O potyvírus foi transmitido por inoculação mecânica e apresentou uma gama restrita de hospedeiras sendo que as espécies mais afetadas pertencem à família Asteraceae. Em SDS-PAGE, a massa molecular da proteína capsidial (CP) foi estimada em 33 kDa e, em "Western-blot", reagiu com anti-soro para o Bidens mosaic virus (BiMV). Um fragmento de aproximadamente 820 pb foi amplificado por RT/PCR, clonado e seqüenciado. O fragmento, que inclui o gene da proteína capsidial, mostrou similaridade de aminoácidos do "core" da CP variando de 55% (Tobacco vein mottling virus, TVMV) a 95% (Sunflower chlorotic mottle virus, SuCMoV) e da CP completa de 55% (TVMV) a 91% (SuCMoV). Na região N-terminal, o potyvírus de Zinnia tem uma deleção de quatro aminoácidos (posições 9 a 12 após o sítio de clivagem entre a proteína NIb e a CP) quando comparada com a seqüência do SuCMoV. A análise filogenética agrupou o potyvírus de Zinnia e o SuCMoV em um mesmo ramo em 100% das réplicas, mostrando uma relação de parentesco muito próxima entre esses dois vírus. Os resultados obtidos no presente trabalho demonstraram que o potyvírus de Zinnia e o SuCMoV são estirpes do mesmo vírus. Sugere-se o nome Sunflower chlorotic mottle virus, isolado Zinnia (SuCMoV-Zi), ao potyvírus encontrado em Z. elegans no Brasil.

Expressão em Escherichia coli da proteína capsidial do Watermelon mosaic virus e produção de anti-soro

Um anti-soro policlonal específico para Watermelon mosaic virus (WMV) foi produzido por meio da imunização de coelhos com proteína capsidial purificada, expressa in vitro em células de Escherichia coli. O gene cp foi amplificado via RT-PCR utilizando oligonucleotídeos específicos, a partir de RNA viral extraído de preparações virais concentradas. O fragmento amplificado foi clonado em pBLUESCRIPT KS+ e completamente seqüenciado para confirmação de sua identidade e integridade. Em seguida, o fragmento foi subclonado no vetor de expressão pRSET-A. Plasmídeos recombinantes foram utilizados para a expressão da proteína capsidial em E. coli BL21::DE3. A proteína foi purificada por meio de cromatografia de afinidade em coluna de Ni+-NTA, a partir de proteínas totais extraídas de E. coli. Uma vez purificada, a proteína foi quantificada e utilizada para imunização dos coelhos. O anti-soro foi testado quanto a sua especificidade e sensibilidade em testes de Western blot, DAS-ELISA, imunodifusão e ELISA indireto. Todos os testes demonstraram que o anti-soro produzido a partir da expressão in vitro da proteína capsidial é altamente específico para a detecção do WMV em extratos foliares, não tendo sido observada nenhuma reação heteróloga interespecífica.

Expression of Grapevine leafroll-associated virus 3 coat protein gene in Escherichia coli and production of polyclonal antibodies

Grapevine leafroll-associated virus 3 (GLRaV-3), the main viral species of the grapevine leafroll complex, causes yield and quality reduction in grapes (Vitis spp.). The coat protein gene was RT-PCR-amplified from total RNA extracted from infected grapevine leaves and the amplified fragment was cloned and completely sequenced. The fragment was subsequently subcloned into the pRSET-C expression vector. The recombinant plasmid was used to transform Escherichia coli BL21:DE3 and express the capsid protein. The coat protein, fused to a 6 His-tag, was purified by affinity chromatography using an Ni-NTA resin. The identity of the purified protein was confirmed by SDS-PAGE and Western blot. The in vitro-expressed protein was quantified and used for rabbit immunizations. The antiserum was shown to be sensitive and specific for the detection of GLRaV-3 in grapevine extracts in Western blot and DAS-ELISA assays, with no unspecific or heterologous reactions against other non-serologically related viruses being observed.

Freqüência de Neoplasia Intra-epitelial Cervical em Portadoras do Vírus da Imunodeficiência Humana

Objetivo: verificar a freqüência de neoplasia intra-epitelial cervical (NIC) em mulheres infectadas pelo vírus da imunodeficiência humana (HIV). Métodos: foram estudadas 99 mulheres HIV-soropositivas; o diagnóstico da infeccão pelo HIV foi realizado por meio de dois testes ELISA, complementados por teste Western blot ou de imunofluorescência indireta. Como grupo controle foram analisadas 104 mulheres que não apresentavam positividade no teste ELISA. Em ambos os grupos o rastreamento de NIC foi realizado por meio da associação de colpocitologia oncológica e colposcopia. Nos casos em que a colposcopia revelou existência de zonas de transformação anormal, o diagnóstico de NIC foi realizado mediante biopsia dirigida, complementada ou não por conização. Resultados: em 15 das 99 pacientes do grupo de estudo (15,2%) foi encontrada neoplasia intra-epitelial cervical, sendo dez casos de NIC I, um de NIC II e quatro de NIC III. Entre as 104 mulheres do grupo controle, quatro (3,8%) eram portadoras de neoplasia intra-epitelial cervical, encontrando-se um caso de NIC I e três de NIC III. Conclusão: a análise comparativa dos resultados evidenciou que a freqüência de neoplasia intra-epitelial cervical foi significantemente mais elevada entre as pacientes infectadas pelo HIV.

Avaliação da Soroprevalência dos Vírus Herpes Simples Tipos 1 e 2 em Parturientes

Objetivos: avaliar a soroprevalência da infecção causada pelo HSV-2 entre as parturientes do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto (HCFMRP-USP) e padronizar técnicas laboratoriais para atender a este propósito. Métodos: foram avaliadas 1.500 amostras de sangue de parturientes atendidas no Centro Obstétrico do Departamento de Ginecologia e Obstetrícia do HCFMRP-USP, entre 1º de janeiro e 31 de outubro de 1996. Para determinar a real prevalência da infecção por HSV-2 foi padronizada a técnica de ELISA, verificando-se que esta não apresentava especificidade suficiente para discriminar os dois tipos virais (75%), delineando a necessidade de utilizar-se técnica de maior poder discriminatório. A técnica padronizada para esta finalidade foi o Western blot, capaz de detectar a proteína viral específica do HSV-2. Resultados: a soroprevalência para infecção herpética, pelos dois tipos virais (HSV-1 e HSV-2), foi de 94,5%, utilizando a técnica de ELISA. Com o emprego da técnica de Western blot, encontrou-se a soroprevalência de 31,9% pelo HSV-2 na população avaliada, quer sintomática ou assintomática. Conclusão: verifica-se elevada prevalência do estado de portadora da infecção pelos HSV, evidenciada pelo alto índice de positividade para os anticorpos contra estes vírus. O teste ELISA não mostrou especificidade suficiente para discriminar os anticorpos anti-HSV-2 dos anti-HSV-1.

Teste rápido para diagnóstico da infecção pelo HIV em parturientes

OBJETIVOS: determinar o valor preditivo positivo de um teste rápido para anticorpos contra o HIV denominado DetermineTM (Abott) em gestantes internadas em trabalho de parto entre 1° de agosto de 2001 e 5 de outubro de 2002. MÉTODOS: foram incluídas neste estudo as parturientes que não haviam sido submetidas a exames para a detecção do HIV durante a gestação ou que não apresentavam os resultados disponíveis no momento da internação. A amostra de sangue foi colhida no momento da internação, na sala de admissão, e o teste rápido foi realizado e comparado com o padrão ouro (ELISA e Western blot). RESULTADOS: entre as 298 gestantes avaliadas, o teste rápido foi positivo em 16 pacientes (5,3%). Os resultados foram confirmados pelos testes de ELISA e Western blot em 12 pacientes (4%). Todos os exames negativos foram avaliados pelos testes ELISA e Western blot. O teste apresentou sensibilidade de 100%, especificidade de 98%, valor preditivo positivo de 75% e valor preditivo negativo de 100%. CONCLUSÕES: estes dados mostram o valor do teste rápido para a detecção de infecção por HIV em situações de emergência, como o parto, de gestantes não testadas previamente

Infecção pelo vírus linfotrópico de células T humanas e transmissão vertical em gestantes de estado da Região Centro-Oeste do Brasil

OBJETIVOS: avaliar a prevalência, características epidemiológicas (idade e procedência) e a taxa de transmissão vertical da infecção pelo HTLV I/II em gestantes submetidas à triagem pré-natal de acordo com o Programa de Proteção à Gestante do Estado de Mato Grosso do Sul. MÉTODOS: estudo descritivo transversal que incluiu 32.512 gestantes submetidas à triagem pré-natal no período de novembro de 2002 a outubro de 2003. Todas as gestantes da amostra foram submetidas aos testes sorológicos pelo método ELISA para o diagnóstico da infecção pelo HTLV, sendo os casos positivos confirmados pelos métodos Western blot e/ou PCR. O diagnóstico neonatal de infecção congênita foi realizado pela pesquisa de anticorpos anti-HTLV I/II confirmados por Western blot e PCR. A relação entre as variáveis (idade e procedência) foi avaliada pelo teste do chi2, em tabelas de dupla entrada, considerando p<0,05 para rejeição das hipóteses de nulidade (não existência da associação entre a idade materna e infecção pelo HTLV I/II e associação entre procedência e positividade para a infecção pelo HTLV I/II.). RESULTADOS: encontrou-se prevalência de 0,1% de gestantes infectadas pelo HTLV I/II (37) dentre as 32.512 pacientes triadas. A média de idade das gestantes infectadas pelo HTLV foi de 25,4±6,4 anos, sendo que houve predomínio de pacientes procedentes do interior do estado (78,4%). Não houve associação da idade com faixa etária materna e procedência. Apenas 8 (21,6% da amostra) recém-nascidos foram avaliados quanto à presença da infecção congênita pelo HTLV I/II, todos com infecção congênita confirmada. Apenas 1 recém-nascido (9%) recebeu amamentação natural. CONCLUSÕES: a prevalência da infecção pelo HTLV I/II em gestantes sul-matogrossenses foi menor que os valores encontrados em estudos com gestantes de países endêmicos. No entanto, esteve próximo às taxas encontradas em países considerados não endêmicos e em alguns estudos brasileiros. A transmissão vertical ocorreu em 100% da amostra avaliada, mesmo a amamentação sendo proscrita. Verificou-se a necessidade de aprimorar o seguimento das gestantes e seus recém-nascidos no estado, uma vez que a minoria dos recém-nascidos foram investigados quanto à ocorrência de transmissão vertical do HTLV.

Expressão dos protooncogenes c-fos, c-myc e c-jun em miométrio normal e mioma humanos

OBJETIVO: Comparar a expressão gênica (mRNA) e protéica dos protooncogenes c-fos, c-myc e c-jun em miométrio normal e mioma humanos. MÉTODOS: Foi realizado um estudo do tipo caso-controle. O material foi coletado de 12 pacientes submetidas a histerectomia no Hospital de Clínicas de Porto Alegre. A expressão do mRNA específico para c-myc, c-fos, c-jun e beta-microglobulina foi avaliada pela técnica de RT-PCR, utilizando primers específicos para cada gene. A expressão protéica destes protooncogenes foi avaliada através de Western blot com anticorpos específicos. RESULTADOS: Não houve diferença significativa para expressão gênica desses protooncogenes entre miométrio normal e mioma (c-myc: 0,87 ± 0,08 vs 0,87 ± 0,08, p = 0,952; c-fos: 1,10 ± 0,17 vs 1,01 ± 0,11, p = 0,21; c-jun: 1,03 ± 0,12 vs 0,96 ± 0,09, p = 0,168, respectivamente). Não houve diferença significativa para expressão protéica desses protooncogenes entre miométrio normal e mioma (c-myc: 1,36 ± 0,48 vs 1,53 ± 0,29, p = 0,569; c-fos: 8,85 ± 5,5 vs 6,56 ± 4,22, p = 0,434; e c-jun: 6,47 ± 3,04 vs 5,42 ± 2,03, p = 0,266, respectivamente). CONCLUSÃO: A expressão gênica (transcrição) e a expressão protéica (tradução) dos protooncogenes c-myc, c-fos e c-jun em mioma e miométrio normal são semelhantes.