991 resultados para Trypanosoma cruzi, aislamiento
Resumo:
La Enfermedad de Chagas, causada por el <i>Tripanosoma cruzi</i> es una parasitosis ampliamente difundida en los pases latinoamericanos, constituyendo una patologa con un intrincado problema bioecolgico y poltico social. Dado que existen slo dos drogas tripanocidas aprobadas por la Organizacin Mundial de la Salud (OMS) efectivas durante la fase aguda de la enfermedad (Nifrutimox, Benznidasol) y con un alto nivel de toxicidad, es que resulta de imperiosa necesidad la bsqueda de nuevos agentes teraputicos que presenten menores riesgos y mayores beneficios para el paciente, as como para la quimioprofilaxis de la sangre a transfundir en zonas alejadas de centros de salud de complejidad. Hemos demostrado que algunas fenotiazinas, derivados tricclicos y usados en la clnica psiquitrica resultan letales sobre tripomastigotes y epimastigotes de <i>T. cruzi</i>, cepa Tulahuen, produciendo disrupcin de membrana celular con liberacin del contenido citoplasmtico o disrupcin de la mitocondria del parsito con la consiguiente alteracin en la produccin de ATP y la posterior muerte del mismo. Los ensayos "in vivo" han revelado ausencia o disminucin de la parasitemia con importante sobrevida de los ratones infectados. El presente plan de trabajo tiene como objetivos: Continuar con los estudios de los efectos de derivados fenotiaznicos (Tioridazina) e iniciar el de otros compuestos (Propanolol), sobre la vitalidad del <i>T. cruzi</i> en diseos "in vitro" e "in vivo". El conocimiento de los mecanismos de accin de los compuestos sealados sobre la biologa y composicin qumica del parsito, as como sobre el husped facilitar el hallazgo de potenciales agentes teraputicos para la Enfermedad de Chagas experimental.
Resumo:
El presente proyecto propone analizar las modificaciones que produce el ayuno sobre los depsitos de lpidos en cuerpo graso de dos vectores del <i>Trypanosoma cruzi</i>: <i>Depetalogaster maximus</i> y <i>Panstrongylus megistus</i>, ambos con hbitat diferentes, el primero silvestre y el segundo tanto domiciliario como peri domiciliario. Estos resultados permitirn un mejor conocimiento de la fisiologa de estos insectos y la importancia de las reservas lipdicas como un elemento nutricional de relevancia en la concrecin del vuelo. Sin dudas contribuir al campo de la Epidemiologa Mdica, en cuanto ser posible el diseo de programas de lucha ms racionales, ya que si bien es considerada la dispersin en vuelo como un hecho importante, sus fundamentos son el producto de observaciones empricas de vuelo en laboratorio o en campo sin una adecuada fundamentacin fisiologa y bioqumica. Objetivo general: Realizar estudios en el cuerpo graso de dos especies de vectores de la Enfermedad de Chagas, pertenecientes a ecotopos diferentes: <i> Panstrongylus megistus </i> (peri domiciliario) y <i> Depetalogaster maximus </i> (silvestre) tendientes a conocer las modificaciones inducidas por el ayuno en la composicin lipdica de reserva en el rgano. Se analizarn a distintos tiempos post alimentacin triacilgliceroles, diacilgliceroles y la composicin en cidos grasos de ambas fracciones. Tambin ser analizada la transformacin en hemolinfa de la lipoforina HDLp en partculas de menor densidad, LDLp en la especie <i> P. megistus </i>, ayunados y sometidos a vuelo en laboratorio.
Resumo:
Este proyecto se propone realizar un estudio de antgenos y epitopes del <i> Trypanosoma cruzi </i> comprometidos en la evolucin de la infeccin con este protozoario. Se aprovechar la informacin obtenida anteriormente sobre proteccin y/o patognesis inducida en ratn con antgenos acdicos liberados por las formas infectivas del parsito (tripomastigotes) designados exoantgenos (Eas) u obtenidos del citosol de epimastigotes, designados FIII y FIV. A los fines de avanzar en la identificacin de epitopes comprometidos en los fenmenos estudiados, se realizarn en paralelo estudios con los antgenos mencionados y antgenos qumicamente definidos que demostraron reactividad cruzada con ellos, como cruzipana y pptidos sintticos. El esquema experimental comprende, Tema 1: El estudio de la presencia de clulas mononucleares capaces de ser estimuladas por los distintos antgenos mencionados en pacientes con enfermedad de Chagas pertenecientes a diferentes grupos clnicos. Tema 2: El anlisis, en ratones inmunizados, de la capacidad de los antgenos seleccionados para inducir respuestas inmunes humorales y celulares con efectos protectores o patognicos. Se estudiar la especificidad de los anticuerpos y clulas inducidas por la inmunizacin. Se caracterizarn las poblaciones celulares segn sus marcadores de membranas y las citoquinas liberadas en cultivo. Estudios histolgicos e inmunocitoqumicos permitirn evaluar el dao tisular y las clulas comprometidas. Tema 3: Investigar la presencia de Cruzipana entre los exoantgenos liberados por el parsito. La informacin obtenida, adems de brindar conocimientos bsicos en el tema y contribuir a la formacin de recursos humanos, informar sobre el rol de los antgenos ensayados en la inmunomodulacin hacia una respuesta protectora o patognica.
Resumo:
Se propone un estudio en <i> Trypanosoma cruzi </i>, de aquellos procesos celulares que conducen a determinadas respuestas fisiolgicas despus de estmulos acoplados a receptores, tal como ocurre en eucariotas superiores. Debido a que dicha respuesta puede implicar cambios transitorios en la composicin lipdica y en la fosforilacin de protenas se pretende continuar con el proyecto iniciado anteriormente, para dilucidar algunos aspectos de la regulacin del ciclo del inositol fosfato. Para ello se caracterizar funcionalmente el ciclo en formas epimastigotes del parsito y se determinar el compromiso de los fosfogliceridos (especficamente los fosfonositidos) y lpidos neutros (diacilglicerol) con la respuesta celular frente a carbacol y al pptido sinttico (1-40) que posee residuos del extremo amino terminal de la alfa D-globina de pollo. Con el propsito de determinar el papel que juega el IP3 como segundo mensajero en <i> T. cruzi </i> y sus consecuencias en la seal de calcio intracelular se estudiar el origen del incremento del ion despus de los estmulos extracelulares mencionados anteriormente.
Resumo:
La enfermedad de Chagas, que afecta en Latinoamrica a unos 20 millones de personas, presenta una fase inicial aguda con niveles altos de parasitemia y a continuacin el perodo intermedio y la fase crnica con baja parasitemia que pueden durar varias dcadas. Un importante porcentaje de infectados con <i> Trypanosoma cruzi </i> desarrolla la miocardiopata chagsica, cuya fisiopatologa plantea actualmente numerosos interrogantes. (...) La dificultad en la comprensin de los mecanismos fisiopatolgicos de esta enfermedad se acrecienta con la ausencia de mtodos diagnsticos certeros. Actualmente ste se basa en la sospecha clnica-epidemiolgica y en pruebas serolgicas que slo indican la memoria inmunolgica de la exposicin al parsito. La disparidad de resultados entre los diferentes mtodos de diagnstico directo, cultivos anatomopatolgicos y hemocultivos puede deberse a que slo en una proporcin de pacientes con serologa positiva el parsito est presente o bien a que su presencia sea transitoria y peridica, o bien a la ausencia de un mtodo suficientemente sensible para detectarlo. (...) En nuestro laboratorio hemos demostrado que es posible detectar <i> T. cruzi </i> en sangre de pacientes con Chagas crnico, mediante la amplificacin de un fragmento de ADN de <i> T. cruzi </i> de 220 pb. Este fragmento es especfico de <i> T. Cruzi </i>y no produce reacciones cruzadas con ADN humano ni Leishmania. En resumen, distintos autores afirman que la presencia del parsito es un factor importante en la generacin y mantenimiento de la inflamacin miocrdica. Es posible, por lo tanto, que la deteccin de parasitemia en chagsicos crnicos, tengan o no signos de cardiopata, sirva como un dato pronstico sobre la evolucin futura de la enfermedad. En el presente proyecto nos proponemos detectar parasitemia en pacientes chagsicos serolgicamente positivos que se hallan en las etapas intermedia y crnica de la enfermedad. Este dato se correlacionar con el grado de compromiso cardiovascular para determinar su posible valor pronstico de la aparicin y evolucin de la miocardiopata chagsica. Objetivo general Determinar parasitemia en pacientes chagsicos de fase intermedia y crnicos y correlacionarlo con el grado de compromiso cardaco, en funcin del timpo de evolucin y el nmero de parsitos circulantes. Objetivos especficos 1. Identificar parasitemia en pacientes chagsicos crnicos por medio de PCR y correlacionarlo con el grado de compromiso cardaco determinado segn la clasificacin de la Sociedad Argentina de Cardiologa. 2. Cuantificar los parsitos por medio de PCR cuantitativa para establecer una posible correlacin con el tipo clnico de las miocardiopatas.
Resumo:
La invasin del <i>Trypanosoma cruzi</i> a la clula husped es un proceso de endocitosis tipo ligando-receptor que produce aumento de Ca2+ citoslico y reorganizacin de actina cortical. En trabajos anteriores se haba observado que la fosfatasa alcalina placentaria (FAP) estaba modificada en las placentas de embarazadas chagsicas con respecto a las placentas control. El <i>T.cruzi</i> secreta fosfolipasa C, y sta podra tener alguna funcin importante en la interiorizacin del parsito a la clula husped. La FAP es una enzima unida a membrana por glicosilfosfatidilinositol, y esta molcula es susceptible a la accin de la fosfolipasa C, por lo que se propone que la FAP podra estar involucrada en el proceso de interiorizacin del parsito a la clula placentaria, actuando como gatilladora de seales. Objetivo General: Determinar si la FAP y componentes del citoesqueleto del sinciciotrofoblasto de placentas humanas estn involucrados en la interiorizacin del <i>T. cruzi</i> en infecciones realizadas <i>in vitro</i>. Objetivos especficos: - Analizar la interaccin de la FAP de sinciciotrofoblasto de placentas humanas con el <i>T. cruzi</i> en el proceso de interiorizacin a clulas placentarias en un modelo de infeccin <i>in vitro</i> y estudiar la capacidad de invasividad del parsito a la clula placentaria bajo ciertas condiciones experimentales que alteran el funcionamiento normal de la FAP. - Determinar la existencia de reorganizacin del citoesqueleto de las clulas placentarias en la infeccin <i>in vitro</i> con <i>T. cruzi</i>. - Comparar los resultados obtenidos con la placenta con experiencias similares realizadas en clulas HEP/2. Metodologa: Mediante la utilizacin de un sistema <i>in vitro</i> que simule infeccin placentaria por el <i>T. cruzi</i>, se determin la participacin de la FAP en este proceso. Los estudios se realizaron entre vellosidades placentarias humanas y tripomastigotes del <i>T. cruzi</i> y entre clulas HEp2 y tripomastigotes del <i>T. cruzi</i>.
Resumo:
La enfermedad de Chagas Mazza, endmica en Amrica Latina, afecta a 20 millones de personas y 50.000 muertes anuales estn asociadas. La transmisin connatal de la enfermedad est relacionada con nacimientos prematuros, abortos, placentitis y con la presencia de diversas patologas del recin nacido. La actividad de la fosfatasa alcalina humana (EC 3.1.3.1) ha sido utilizada con fines diagnsticos por ms de 60 aos. Un aumento en el nivel de Fosfatasa Alcalina es observado en la segunda mitad del embarazo en funcin del tiempo de gestacin y es un ndice de la actividad placentaria. Messer demostr que una disminucin en la actividad especfica de esta enzima es un signo de disfuncin placentaria, siendo de utilidad en el diagnstico clnico de diversas patologas. Se ha demostrado disminucin de la enzima en placentas preeclmpsicas. Mediante microscopa electrnica se detect una disminucin de la actividad de la fosfatasa alcalina placentaria en el sinciciotrofoblasto en placentas de madres chagsicas. En una reproduccin de la infeccin de placenta humana <i>in vitro</i> se observa un significativo descenso de la actividad de fosfatasa alcalina en el medio de cultivo, lo cual sugiere que el <i>T. cruzi</i> producira en el plasma de la embarazada chagsica un efecto anlogo. Trabajos anteriores permiten postular que la actividad de la fosfatasa alcalina placentaria disminuye en el suero de pacientes chagsicos entre las 36 a 40 semanas de gestacin y que esta disminucin se asocia con el nacimiento de nios chagsicos. Se ha sugerido adems que la fosfatasa alcalina placentaria es un receptor de IgG y que el transporte transplacentario de la IgG de la madre al feto dependera del genotipo fetal de fosfatasa alcalina placentaria. Estos hechos permiten suponer que en la interaccin placenta- <i>T. cruzi</i> la actividad de fosfatasa alcalina placentaria jugara un rol importante pues podra condicionar segn su polimorfismo la posibilidad de una determinada incidencia de la infeccin fetal. (...) No existen estudios analticos ni sistemticos de la actividad de fosfatasa alcalina placentaria en la enfermedad de Chagas en el plasma y placenta durante el transcurso del embarazo que permitan dilucidar el rol de la enzima en la interaccin placenta-parsito-feto a travs de las formas que se le atribuyen a la enzima en condiciones normales. Teniendo en cuenta estos antecedentes, en el presente proyecto se proponen: Objetivo General Caracterizar la fosfatasa alcalina placentaria de las placentas normales cultivadas e infectadas con <i>T. cruzi</i> y del medio de cultivo en la infeccin <i>in vitro</i> con el objeto de dilucidar los posibles mecanismos de la infeccin placentaria en la enfermedad de Chagas congnita. Objetivos especficos: 1- Analizar los cambios de la actividad de fosfatasa alcalina placentaria en la placenta cultivada con <i>Trypanosoma cruzi</i> mediante anlisis enzimtico, electrofortico e inmunocitoqumico. 2- Correlacionar las modificaciones bioqumicas de la fosfatasa alcalina placentaria, mediante el anlisis de captacin de IgG, en el sistema <i>in vitro</i>. 3- Analizar las propiedades bioqumicas de la fosfatasa alcalina placentaria en vellosidades cultivadas con <i>Trypanosoma cruzi</i> y corroborarla con la actividad de la enzime en cultivo con neuraminidasa o fosfolipasa sin <i>T. cruzi</i>.
Resumo:
Trypanosoma cruzi, agente causal del Chagas, atraviesa la barrera placentaria y produce la enfermedad congnita. Objetivo general: Analizar si el T. cruzi, agente causal del Chagas, produce alteraciones trofoblsticas de las vellosidades corinicas mediadas por xido ntrico (principal agente deletreo contra T. cruzi) y estrs oxidativo con variaciones que pudieran depender de la disponibiidad de L-arginine, sobre placentas en modelos in vitro de co-cultivos de explantos de vellosidades corinicas, de sinciciotrofoblasto aislado y de clulas derivadas del trofoblasto de placentas humanas en interaccin con distintas cepas del Trypanosoma cruzi, que pudieran dar alguna luz en la explicacin de mecanismos involucrados en la infeccin placentaria y en algunos sndromes clnicos de la transmisin congnita del Chagas. Objetivos Especficos: a) Describir alteraciones estructurales y presencia de T. cruzi en vellosidades corinicas de placentas humanas procedentes de co-cultivos con Trypanosoma cruzi in vitro (y sus respectivos controles), mediante tcnicas histolgicas y PCR analizando secuencias de ADN especficas del parsito.b) Establecer la localizacin y expresin proteica y la expresin transcripcional de las isoformas II y III de la xido Ntrico Sintasa sobre la misma poblacin muestral de (a) mediante tcnicas inmunohistoqumica, RT-PCR y semicuantificacin con software adecuado. c) Analizar la susceptibilidad a la infeccin por el T. cruzi del citotrofoblasto (CTB) y sinciciotrofoblasto (STB) placentario aislado in vitro. d) Determinar concentraciones de xido ntrico y estrs oxidativo del sinciciotrofoblasto (STB) aislado ante la infeccin por T. cruzi. e) Relacionar concentraciones de L-arginina con infeccin del trofoblasto aislado. f) Relacionar inhibiciones de la eNOS y de la arginasa con infeccin trofoblstica y xido ntrico producido.Se emplearn mtodos y tcnicas de Biologa celular y molecular, mediciones hormonales, enzimticas, proteicas, parasitarias y bioqumicas en medios sobrenadantes de cultivo, de inmuno-deteccin de epitopes proteicos en tejidos, expresin de ARN por RT-PCR, Western blot, deteccin de DNA en tejidos por PCR, Cuantificaciones morfomtricas. En general, el presente proyecto podra redundar en beneficios para un sector de la poblacin de las reas endmicas para esta enfermedad de bajos recursos econmicos, sociales y culturales, mediante la obtencin de datos que pudieran explicar algunos mecanismos de sndromes clnicos descriptos en esta patologa y que pudieran participar en la transmisin congnita de la enfermedad de Chagas.
Resumo:
Trypanosoma cruzi es un protozoo primitivo agente causal de la enfermedad de Chagas. La transmisin de esta enfermedad depende tanto del desarrollo y de la diferenciacin del microorganismo en el intestino del vector. Las diferentes formas del parsito se han adaptado a una serie de condiciones impuestas por los distintos ambientes en donde debi habitar. Esta capacidad de sobrevivir a medios externos tan variados est dada por la diversidad en las vas de transduccin de seales en el parsito. T. cruzi se multiplica y diferencia (metaciclognesis) en el recto de los triatominos. A este nivel, los parsitos se enfrentan a un incremento en la osmolaridad causado por un elevado contenido de NaCl en la orina. En nuestro laboratorio se observ que diferentes estmulos son capaces de producir incrementos en los niveles de IP3 y de Ca2+ intracelular, consecuencia de la activacin del ciclo del inositol fosfato, y activacin de fosfolipasa D (PLD) y fosfatidilinositol 3 quinasa (PI3K). En un medio carente de Na+ los epimastigotes estimulados con carbacol, mostraron una seal de calcio disminuida mientras que la acumulacin de IP3 no se modific. Adems, esta seal se increment en presencia de PMA, activador de protena quinasa C, mientras que la acumulacin de IP3 se anul completamente. Estos resultados indujeron a pensar en un mecanismo alternativo y/o paralelo a IP3 en la liberacin de Ca2+, en el cual la presencia de un intercambiador Na+/H+ favorecera la liberacin del ion desde organelas acdicas. Es conocido que la seal de calcio es requerida para la metaciclognesis, y que esta seal es independiente del Ca2+ extracelular (Lammel y col. 1996, Marchesini y col., 2002). De este modo se propone que "los epimastigotes de T. cruzi utilizan como elementos conservados a lo largo de la evolucin a los elementos del ciclo del inositol fosfato, uno de los sistemas de transduccin de seales ms antiguo, para responder a estmulos que inducen la diferenciacin del parsito". Por lo tanto, para el desarrollo de este proyecto se propone determinar la presencia de un RcIP3 en epimastigotes y conocer su compromiso en la liberacin de Ca2+ desde reservorios intracelulares. Adems, establecer si un intercambiador Na+/H+ en membrana de acidocalcisomas estara relacionado con la seal de calcio intracelular y su posible regulacin por proteina quinasa C y A (PKC y PKA, respectivamente). Por otro lado, para dilucidar la implicancia de estos mecanismos en el proceso de metaciclognesis, se propone estudiar la activacin del intercambiador Na+/H+ y la seal de calcio en condiciones de hiperosmolaridad, tal como ocurre en el recto del triatomino. Ademas, ya que el proceso de diferenciacin involucra una reorganizacin de los microtubulos del citoesqueleto se pretende estudiar el compromiso del metabolismo de fosfolpidos y tubulina en procesos que contribuyen a la induccin de la metaciclogenesis. El alcance de los objetivos mencionados ayudar a dilucidar la presencia de componentes tales como RcIP3 y el intercambiador Na+/H+ involucrados en la sealizacin del ion bivalente. Por otro lado, se espera demostrar que los isotipos de tubulina encontrados en <i>T. cruzi</i> cambien en cantidad relativa y nivel de expresin cuando los epimastigotes sean estimulados con posibles inductores de la diferenciacin. Adems, se espera observar simultneamente un aumento en la actividad de dos enzimas relacionadas con la reorganizacin de microtbulos: PI-3K y PLD. En tal caso, y para comprobar su implicancia en el proceso, se espera que la inhibicin de tales enzimas sea capaz de revertir el efecto producido por los estmulos. Como la PLC se expresa principalmente en las forma epimastigotes mas que en los tripomastigotes (forma infectiva), la seal de Ca2+ inducida por IP3 se relacionara con la capacidad del parsito para responder a ciertos cambios de pH y osmolaridad que enfrenta el microorganismo en el tracto digestivo del insecto vector.
Resumo:
Este proyecto pretende dilucidar el efecto de infeccin con Trypanosoma cruzi y dieta hipergrasa/fructosa en la gnesis de obesidad e insulino-resistencia y su impacto sobre la aterosclerosis. Esto se abordar en modelos de obesidad in vivo e in vitro, estudiando receptores de inmunidad innata, citocinas/quimiocina, adipocinas y mediadores inflamatorios que participaran en la patognesis de este proceso, focalizando en tejido graso visceral y adipositos en cultivo celular. Esta investigacin avanzara en el conocimiento de la patognesis inflamatoria de ateroesclerosis y aportara bases para sustentar nuevas estrategias teraputicas destinadas a minimizar las complicaciones cardiovasculares de la obesidad y sus co-morbilidades, entre ellas, la aterosclerosis, una enfermedad devastadora. En el modelo in vivo en ratones machos C57BL/6 salvajes tratados con streptozotocina y alimentados con una dieta hipergrasa/fructosa se inducir obesidad (IR) y DM2, para: 1- Investigar la influencia de la infeccin con Trypanosoma cruzi como un potencial factor sinrgico pro-aterognico. Se evaluar a distintos tiempos post infeccin, tejido adiposo visceral y repercusiones en aorta y corazn, por histopatologa. Se determinar el perfil de lpidos, lipoprotenas y parmetros metablicos: glucosa/insulina e ndice HOMA-IR. Asimismo, se evaluarn cidos grasos libres y protenas de fase aguda circulantes como respuesta al proceso inflamatorio. 2- Evaluar la expresin de receptores tipo Toll y scavenger (CD36) en el tejido adiposo visceral y aorta principalmente e identificar los tipos celulares que participan en las lesiones. 3- Determinar las citocinas inflamatorias: TNFalfa, IL1beta, IL12 e IL6 y la quimiocina atractante de monocitos y adipocinas (leptina y adiponectina) en plasma y mediadores inflamatorios:xido ntrico, especies reactivas del oxgeno y metaloproteasas en adipositos viscerales y aorta. Se cuantificarn molculas de adhesin intercelular ICAM-1 y VCAM-1. In vitro proponemos: 1- Investigar la influencia de infeccin con T. cruzi y cidos grasos saturados/ monoinsaturado y el efecto de LDL oxidadas/agregadas frente a LDL nativas en una lnea celular de adipositos. Se estudiar la expresin basal y post-estmulo de receptores innatos tipo Toll y CD 36. 2- Cuantificar adipocinas pro- inflamatorias y antiinflamatorias en sobrenadantes de cultivos frente a estmulos propuestos y la expresin de ICAM-1 y VCAM-1.
Resumo:
Ateroesclerosis es una enfermedad inflamatoria crnica de arterias de mediano y gran calibre, caracterizada por activacin de clulas endoteliales, reclutamiento de monocitos en la pared de los vasos y diferenciacin de macrfagos en clulas espumosas cargadas de colesterol. Adems de los factores de riesgo convencionales y mejor conocidos que predisponen a la ateroesclerosis, como la hiperlipemia, hipertensin y el hbito de fumar, recientemente se ha propuesto a las infecciones y la inflamacin como factores de riesgo a considerar en su desarrollo. Algunas infecciones bacterianas o virales pueden ejercer una accin pro-aterognica, probablemente como consecuencia de inflamacin sistmica o un efecto directo sobre la pared vascular. Sin embargo, el papel del Trypanosoma cruzi ha sido escasamente explorado. Como objetivo principal nos propusimos, estudiar la influencia de la infeccin in vivo con Trypanosoma. cruzi (parsito protozoario, agente etiolgico de la Enfermedad de Chagas ) ms una dieta rica en lpidos sobre la expresin de los receptores tipo Toll de la inmunidad innata en un modelo experimental en ratones C57BL/6 salvajes, propensos al desarrollo de ateroesclerosis. Especifcamente, nos interesa caracterizar que tipos celulares infiltran el corazn y aorta de los animales sometidos a tratamiento experimental, el perfil de citoquinas inflamatorias sricas, quimioquinas y molculas de adhesin intercelular, as como tambin establecer una correlacin con parmetros bioqumicos-clnicos y endocrinolgicos, en especial el perfil de lpidos, lipoprotenas y apolipoprotenas, marcadores de inflamacin sistmica, peso corporal, glucemia, insulina e insulino-resistencia.
Resumo:
La enfermedad de Chagas, causada por Trypanosoma cruzi, constituye la principal miocarditis infecciosa a nivel mundial. Crecientes evidencias revelan que la respuesta inmune innata tendra un rol determinante en la fisiopatologa de las enfermedades cardiovasculares. La inmunidad innata es la primera lnea de defensa, no especfica, preprogramada para combatir agentes infecciosos. Este sistema censa la presencia de antgenos extraos a travs de los receptores tipo toll (TLR) produciendo citoquinas y activando mecanismos microbicidas. Sin embargo, los TLRs tambin se hayan distribuidos en las clulas parenquimales no inmunes, jugando un importante rol tanto en la defensa como en la homeostasis de cada tejido. Durante la etapa aguda de la infeccin, el T. cruzi invade y se replica dentro de una amplia variedad de clulas y tejidos. Pero posteriormente, los parsitos son efectivamente eliminados de la mayora de los tejidos persistiendo durante toda la vida en las clulas del msculo cardaco y esqueltico de los pacientes infectados. Debido a que el mantenimiento de la clula cardaca infectada es crtica para la patognesis de la enfermedad, los mecanismos que participan en la sobrevida de los cardiomiocitos estn siendo foco de nuestro estudio. Hemos demostrado, que la infeccin ejerce efectos antiapoptticos sobre clulas cardacas aisladas. Nuestra hiptesis es que la inmunidad innata cardaca estara involucrada en el mantenimiento de la sobrevida de los miocitos as como en la defensa contra el parsito. Objetivo general: determinar la participacin de la respuesta inmune innata cardaca en el desarrollo de la enfermedad de Chagas experimental murina. Objetivos especficos: 1) Analizar el compromiso de TLRs en la respuesta anti-apopttica y de autofagia de cardiomiocitos aislados de ratones salvajes y de ratones deficientes en TLR4, TLR2 y en MyD88, molcula adaptadora de la sealizacin por TLRs, sometidos a la infeccin con el parsito. 2) Determinar la importancia de la actividad cisten proteasa parasitaria en el grado de infectividad y la sobrevida de cultivos primarios de ratones salvajes infectados con parsitos transgnicos que poseen disminuda o nula actividad cisten proteasa. 3) Establecer la cintica de expresin de TLR2/TLR6, TLR4 y TLR9, factores antiapoptticos (Bcl-2, Bcl-xL, etc.), dao cardaco y la carga parasitaria en el tejido cardaco de ratones infectados salvajes y/o deficientes antes mencionados. Materiales y Mtodos: Los animales sern infectados i.p. con 5x103 parsitos y se determinar la cintica de expresin de los mediadores mencionados por western blot e inmunofluorescencia, la carga parasitaria ser determinada por qRT-PCR. Como controles se procesarn animales inyectados con solucin salina. En cultivos primarios de cardiomiocitos de ratones neonatos salvajes y deficientes infectados se estudiar la carga parasitaria, la activacin de los mecanismos microbicidas (produccin de xido ntrico, metabolitos reactivos del oxgeno y del nitrgeno, ciclooxigenasa, etc.), produccin de citoquinas y expresin de molculas anti-apoptticas (Bcl-2, Bcl-xL, Bax, etc.). Se explorar la tasa de apoptosis en cultivos deprivados de suero. La autofagia se analizar por microscopia electrnica. Cultivos controles sern mantenidos en medio o tratados con ligandos de los diferentes TLRs. Resultados preliminares sugieren que tanto TLR2 como Bcl-2 se incrementan en tejido cardaco infectado. Esto nos lleva a profundizar en los mecanismos observados en cultivos y estudiarlos en un modelo in vivo, analizando la posible importancia que tiene la inmunidad innata cardaca en el control del establecimiento de la infeccin. La comprensin de los mecanismos que mantienen la sobrevida de los cardiomiocitos y su respuesta a la infeccin es importante ya que el conocimiento de las bases moleculares es fundamental para el desarrollo de nuevos agentes quimioteraputicos. Chagas disease is endemic in Central and South America and causes the most common myocarditis worldwide. We have previously reported that the cardiotrophic parasite Trypanosoma cruzi, its etiological agent, protects cardiomyocytes against apoptosis induced by growth factor deprivation activating the PI3K/Akt and MEK1/ERK signaling pathways. Recent studies have shown that local innate immunity plays a key role in initiating and coordinating homeostatic as well as defense responses in the heart. One of the mechanisms by which the innate immune system senses the presence of foreign antigens is through TLRs. The stimulation of these receptors leads to the activation and nuclear translocation of NF-kB transcription factor and the production of cytokines. Proinflammatory cytokines, in turn, appear to play a central role in the orchestration and timing of the intrinsic cardiac stress response providing, under different situations, instantaneous anti-apoptotic cytoprotective signals, which allow tissue repair and/or remodeling. The aim of the present project is to study the cardiomyocyte innate immune responses to T. cruzi infection and its role in target cell protection from apoptosis. Specific objectives: 1) Study the mechanism triggered by TLR in the anti-apoptotic response and parasite load of infected cardiomyocyte primary cultures from wild type and mice deficient in TLR2, TLR4 or MyD88. 2) Determine the effect of parasite cisten protease activity on primary cultures from wild type mice. 3) Determine the TLR signaling-involvement in parasite load and survival indicators in deficient mice. Preliminary results showed us that cardiac-TLR2 may be involved in the anti-apoptotic effect elicited by the parasite and prompted us to establish the mechanisms triggered by the innate immunity that mediate parasite persistence within the host cell.
Resumo:
Trypanosoma cruzi es el agente causal de la enfermedad de Chagas, un problema de salud importante en Amrica Latina, as como tambin en Amrica Central, ya que causa infeccin crnica afectando a millones de personas [1]. Durante esta enfermedad se han descripto varias alteraciones de la respuesta inmune, entre ellas una severa inmunosupresin durante la etapa aguda de la infeccin, tanto en humanos como en ratones. Clulas T provenientes de ratones infectados activadas in vitro, muestran reduccin en la respuesta proliferativa a mitgenos, caracterstica de un estado de inmunosupresin [2-4]. La falla del sistema inmune durante estadios tempranos de la infeccin probablemente colabore con la diseminacin y el establecimiento del parsito. Un gran nmero de estudios se han focalizado en la identificacin de mecanismos moleculares responsables del fenmeno de inmunosupresin, entre los mecanismos citados se ha demostrado presencia de clulas supresoras [5-9], factores inmunosupresores presentes en el parsito [2, 3, 10-13], produccin excesiva de xido ntrico [14], disminuida produccin de IL-2 y reducida expresin del receptor de IL2 en clulas de bazo de animales infectados [9, 15-17]. Muchos de estos mecanismos han sido exhaustivamente investigados, sin embargo no est del todo claro si existen mecanismos adicionales involucrados en la inmunosupresin de la clula T. Adicionalmente, en los ltimos aos nuevas molculas que median la regulacin negativa de la clula T, entre las cuales estn PD-1/PD1-L [18], arginasa [19] y E3 ubiquitina ligasas [20-22], han sido reportadas durante inmunosupresin en diversas infecciones. Trypanosoma cruzi, the etiological agent of Chagas disease, is parasite causing chronic infections in human and other mammalian species. There is an important immunosupresion during the acute phase of the infection that contribute to the dissemination and installation of the parasite. Several studies have been focused on identifying the mechanisms involved in the immunosupresion; however it is not clear if there are additional mechanisms implicated. In addition, during the last years new molecules involved in the negative T cell regulation such as PD-1/PD1-L pathway and E3 ubiquitin ligases (E3-Ub-Lig) have been reported. It has been demonstrated, that E3-Ub-Lig control the amount and localization of intracellular signal mediators, limiting T cell activation. Moreover, these mechanisms mediate the immunosupresion observed during several infections leading to the persistence of the pathogen in the host. In this project the role of E3-Ub-Lig on the T cell immunosupresion and hipo-response mechanisms observed during T. cruzi infection will be studied. On the other hand, it has been reported that some pathogens release proteins with E3-Ub-Lig activity modifying the ubiquitination process to promote their survival and replication in the host. Recently, a protein with E3-Ub-Lig activity was identified in T. cruzi, however its target molecule has not been discovered yet. Therefore, one of the aims of this project consists on studying different potential target molecules for this novel E3-Ub-Lig. In addition, during the last years, important progress has been done about the biological rol of PD-1/PD1-L pathway on the regulation of the immune response in several infections. However, it is not well known how PD-1/PD1-L pathway transduces signals at intracelular level to block T cell response. Because of this, it is interesting to study if there is any relation between the PD-1/PD1-L pathway and E3-Ub-Lig on the mechanism of T cell immunosupression during T. cruzi infection.
Resumo:
La infeccin de mamferos con el T. cruzi resulta en diferentes alteraciones inmunolgicas que permiten la persistencia crnica del parsito y destruccin inflamatoria progresiva del tejido cardiaco, nervioso y heptico. Los mecanismos responsables de la patologa de la enfermedad de Chagas han sido materia de intensa investigacin habindose propuesto que el dao producido en esta enfermedad puede ser consecuencia de la respuesta inflamatoria del individuo infectado y/o de una accin directa del parsito sobre los tejidos del hospedador. El propsito del presente proyecto es estudiar comparativamente, en dos cepas de ratones con diferente susceptibilidad a la infeccin y desarrollo de patologa, la participacin y los mecanismos efectores de las clulas supresoras mieloides (CSM) y las celulas T regulatorias inducidas por la infeccin experimental con Trypanosoma cruzi en el control de la infeccin con este protozoario y en el desarrollo de la patologa heptica siendo los objetivos especificos desarrolar: - Investigar la generacin y/o reclutamiento de clulas de CSM en bazo e hgado de ratones infectados con Trypanosoma cruzi y su contribucin a la desigual susceptibilidad a la infeccin y respuesta inmune desarrollada en las cepas de ratones BALB/c y C57BL/6; - Investigar la capacidad de las CSM inducidas por la infeccin con T. cruzi en bazo e hgado de ratones de ambas cepas para suprimir la respuesta de clulas T in vitro e indagar sobre los mecanismos de supresin utilizados; - Investigar la generacin y/o reclutamiento de clulas Treg durante la infeccin experimental con Trypanosoma cruzi, su participacin en la desigual susceptibilidad a la infeccin y respuesta inmune desarrollada en ambas cepas de ratones y los mecanismos de supresin utilizados. - Analizar en tejido heptico o leucocitos infiltrantes la presencia de COX2, PGE2, MMP2 y 9, IL1b, IL6, IDO, IL10 y GM-CSF capaces de inducir la expansin de las CSM; - Dilucidar si la administracin del ligando para TLR2 (Pam3CyS) previo a la infeccin de ratones C57BL/6 (en los cuales se detecta un menor nmero de CSM) es capaz de modular la respuesta inflamatoria y el dao heptico a travs de la induccin de CSM y/o T reg en hgado y bazo. La comprension de los eventos celulares y moleculares que regulan la produccin de citoquinas pro- y anti-inflamatorias y otros mediadores, as como el papel de los receptores de la inmunidad innata durante la infeccin con T. cruzi contribuir a responder interrogantes que son claves para el diseo de nuevas estrategias de intervencin inmune tendientes a preservar los mecanismos de defensa del husped. Two nonexclusive mechanisms have been proposed to explain the Chagass disease pathology: 1) The pathology of the disease seems to be consequence of the inflammatory response triggered for the parasite; or 2) The damage is produced by the parasite direct effect. Recently, we reported that TLR2, TLR4 and TLR9 (innate immune response receptors) are differentially modulated in injured livers from BALB/c (lesser liver pathology) and C57BL/6 (elevated liver pathology) mice during Trypanosoma cruzi infection. The aim of our proposal is the study of role of Myeloid-Derived Suppressor Cells (MDSC) and regulatory T cells in the control of T. cruzi infection and the infection-associated pathology. Our specific aims are: -To study the induction or recruitment of MDSC in splenn and liver of BALB/c and C57BL/6 mice and their relationship with the differential susceptibility and immune response observed in these both mice strains; - To determine the ability and the mechanisms used by the T. cruzi-induced MDSC to suppress the T cell proliferative response; -To study the induction or recruitment of Treg in liver of BALB/c and C57BL/6 mice and their relationship with the differential susceptibility and immune response observed in these both mice strains; -To analize in liver tissue or tissue infiltrating lymphocytes the activation of COX2, PGE2, MMP2 y 9, IL1b, IL6, IDO, IL10 y GM-CSF known to promote the development of MDSC; -To determine whether the treatment with Pam3CyS (TLR2 ligand) is able to modulate the liver inflammatory respose and damage througth the induction of MDSC or Treg.
Resumo:
En el modelo experimental in vivo en ratones C57BL/6 wild type tratados con streptozotocina y alimentados con una dieta grasa/fructosa se inducir obesidad (IR) y DM2, con el propsito de: 1-Investigar la influencia de la infeccin con Trypanosoma cruzi como un potencial factor sinrgico pro-aterognico. Se evaluar a distintos tiempos post infeccin, el tejido adiposo visceral y las repercusiones en aorta y corazn principalmente, por estudios histopatolgicos. En plasma, se determinar el perfil de lpidos, lipoprotenas y otros parmetros metablicos: glucosa e insulina, estos ltimos para calcular el ndice HOMA-IR, que refleje el grado de insulino- resistencia. Asimismo, se evaluarn cidos grasos libres y protenas de fase aguda circulantes como respuesta al proceso inflamatorio. 2- Evaluar la expresin de receptores tipo Toll (TLR 2, 4 y 9) y scavenger clase B (CD36) en el tejido adiposo visceral y aorta principalmente e identificar los tipos celulares que participan en las lesiones vasculares (macrfagos -M-, granulocitos y linfocitos T). 3- Determinar las citocinas inflamatorias: TNF, IL1-, IL12, IL18, IFN e IL6 y la quimiocina atractante de monocitos (CCL2; MCP-1) y adipocinas (leptina, resistina y adiponectina) en plasma y otros mediadores inflamatorios como xido ntrico, especies reactivas del oxgeno (ROS) y metaloproteasas (MMPs) en tejido adiposo visceral y aorta. Se cuantificarn adems las molculas de adhesin intercelular ICAM-1 y VCAM-1, involucradas en otros modelos de obesidad e insulino-resistencia. En el modelo in vitro 1- Investigar la influencia de la infeccin con T. cruzi y cidos grasos saturados y monoinsaturado (C18, oleico) y el efecto de las lipoprotenas de baja densidad (LDL) oxidadas y agregadas frente a LDL nativas (control) en una lnea celular de adipositos. Se estudiar la expresin basal y post-estmulo de los receptores innatos tipo Toll y CD 36. 2- Cuantificar las adipocinas pro- inflamatorias (leptina, resistina y MCP-1)y adiponectina (antiinflamatoria) en el sobrenadante de cultivos frente a los estmulos propuestos y la expresin de las molculas de adhesin ICAM-1 y VCAM-1.
