Expression, production, and renaturation of a functional single-chain variable antibody fragment (scFv) against human ICAM-1

Intercellular adhesion molecule-1 (ICAM-1) is an important factor in the progression of inflammatory responses in vivo. To develop a new anti-inflammatory drug to block the biological activity of ICAM-1, we produced a monoclonal antibody (Ka=4.19×10−8 M) against human ICAM-1. The anti-ICAM-1 single-chain variable antibody fragment (scFv) was expressed at a high level as inclusion bodies in Escherichia coli. We refolded the scFv (Ka=2.35×10−7 M) by ion-exchange chromatography, dialysis, and dilution. The results showed that column chromatography refolding by high-performance Q Sepharose had remarkable advantages over conventional dilution and dialysis methods. Furthermore, the anti-ICAM-1 scFv yield of about 60 mg/L was higher with this method. The purity of the final product was greater than 90%, as shown by denaturing gel electrophoresis. Enzyme-linked immunosorbent assay, cell culture, and animal experiments were used to assess the immunological properties and biological activities of the renatured scFv.

Germinação de sementes de Amburana acreana (Ducke) A. C. Sm. submetidas a diferentes condições de temperatura e de estresse hídrico

Este trabalho teve por objetivos avaliar o efeito da temperatura e do estresse hídrico na germinação das sementes e na formação de plântulas normais de Amburana acreana. Foram realizados dois ensaios. No primeiro, as sementes foram colocadas para germinar nas temperaturas de 20, 25, 30, 35 e 40°C. No segundo, as sementes foram dispostas em substrato umedecido com soluções de polietilenoglicol 6000 nos seguintes potenciais hídricos: zero (testemunha), -0,2, -0,4, -0,8, -1,0 e -1,2MPa, a 30°C. A germinação das sementes e a formação de plântulas normais foi avaliada durante 30 dias, em cinco repetições de 20 sementes, sendo consideradas germinadas aquelas que apresentaram emissão de raiz primária com no mínimo 5mm de comprimento e curvatura geotrópica positiva. Os melhores resultados, no primeiro ensaio, foram encontrados nas temperaturas de 30 e 35°C, com maiores valores de porcentagens de germinação, sendo os tratamentos onde o processo germinativo ocorreu em menor tempo. A porcentagem de germinação, no segundo ensaio, diminuiu à medida que se reduziu a disponibilidade de água no substrato, a partir de -0,4MPa, e foi nula entre -1,0 e -1,2MPa. A formação de plântulas foi reduzida já no potencial -0,2MPa, sendo totalmente inibida entre -0,4 e -0,8MPa. Conclui-se que a temperatura de 30°C é mais recomendada para a condução do teste de germinação por propiciar melhores condições para o processo germinativo, com maior porcentagem de plântulas normais e menores porcentagens de plântulas anormais e de sementes deterioradas. A redução na disponibilidade hídrica diminui a germinação das sementes e a formação de plântulas de cerejeira e os limites para germinação ocorrem na faixa de zero a -1,0MPa e, para formação de plântulas, de zero a -0,4MPa.

Accelerating food safety and quality control: The use of antibody engineering techniques in the detec-tion of low-molecular weight food contaminants

The increased awareness and evolved consumer habits have set more demanding standards for the quality and safety control of food products. The production of foodstuffs which fulfill these standards can be hampered by different low-molecular weight contaminants. Such compounds can consist of, for example residues of antibiotics in animal use or mycotoxins. The extremely small size of the compounds has hindered the development of analytical methods suitable for routine use, and the methods currently in use require expensive instrumentation and qualified personnel to operate them. There is a need for new, cost-efficient and simple assay concepts which can be used for field testing and are capable of processing large sample quantities rapidly. Immunoassays have been considered as the golden standard for such rapid on-site screening methods. The introduction of directed antibody engineering and in vitro display technologies has facilitated the development of novel antibody based methods for the detection of low-molecular weight food contaminants. The primary aim of this study was to generate and engineer antibodies against low-molecular weight compounds found in various foodstuffs. The three antigen groups selected as targets of antibody development cause food safety and quality defects in wide range of products: 1) fluoroquinolones: a family of synthetic broad-spectrum antibacterial drugs used to treat wide range of human and animal infections, 2) deoxynivalenol: type B trichothecene mycotoxin, a widely recognized problem for crops and animal feeds globally, and 3) skatole, or 3-methyindole is one of the two compounds responsible for boar taint, found in the meat of monogastric animals. This study describes the generation and engineering of antibodies with versatile binding properties against low-molecular weight food contaminants, and the consecutive development of immunoassays for the detection of the respective compounds.

Conformational analysis of antibody binding site using EDMA methods /

Euclidean distance matrix analysis (EDMA) methods are used to distinguish whether or not significant difference exists between conformational samples of antibody complementarity determining region (CDR) loops, isolated LI loop and LI in three-loop assembly (LI, L3 and H3) obtained from Monte Carlo simulation. After the significant difference is detected, the specific inter-Ca distance which contributes to the difference is identified using EDMA.The estimated and improved mean forms of the conformational samples of isolated LI loop and LI loop in three-loop assembly, CDR loops of antibody binding site, are described using EDMA and distance geometry (DGEOM). To the best of our knowledge, it is the first time the EDMA methods are used to analyze conformational samples of molecules obtained from Monte Carlo simulations. Therefore, validations of the EDMA methods using both positive control and negative control tests for the conformational samples of isolated LI loop and LI in three-loop assembly must be done. The EDMA-I bootstrap null hypothesis tests showed false positive results for the comparison of six samples of the isolated LI loop and true positive results for comparison of conformational samples of isolated LI loop and LI in three-loop assembly. The bootstrap confidence interval tests revealed true negative results for comparisons of six samples of the isolated LI loop, and false negative results for the conformational comparisons between isolated LI loop and LI in three-loop assembly. Different conformational sample sizes are further explored by combining the samples of isolated LI loop to increase the sample size, or by clustering the sample using self-organizing map (SOM) to narrow the conformational distribution of the samples being comparedmolecular conformations. However, there is no improvement made for both bootstrap null hypothesis and confidence interval tests. These results show that more work is required before EDMA methods can be used reliably as a method for comparison of samples obtained by Monte Carlo simulations.

Películas de SM???Ca?Fe?.?Co?.?O? (x= 0, 0.1, 0.2 y 0.3): preparación y estudio de sus propiedades sensoras en CO y propano.

Tesis (Maestría en Ciencias con orientación en Química de los Materiales) UANL, 2014.

Importance of the HSP90 molecular chaperoning pathway for antibody diversification by determining AID stability

La protéine AID (déaminase induite par l’activation) joue un rôle central dans la réponse immunitaire adaptative. En désaminant des désoxycytidines en désoxyuridines au niveau des gènes immunoglobulines, elle initie l’hypermutation somatique (SHM), la conversion génique (iGC) et la commutation isotypique (CSR). Elle est essentielle à une réponse humorale efficace en contribuant à la maturation de l’affinité des anticorps et au changement de classe isotypique. Cependant, son activité mutagénique peut être oncogénique et causer une instabilité génomique propice au développement de cancers et de maladies autoimmunes. Il est donc critique de réguler AID, en particulier ses niveaux protéiques, pour générer une réponse immunitaire efficace tout en minimisant les risques de cancer et d’autoimmunité. Un élément de régulation est le fait qu’AID transite du cytoplasme vers le noyau mais reste majoritairement cytoplasmique à l’équilibre. AID est par ailleurs plus stable dans le cytoplasme que dans le noyau, ce qui contribue à réduire sa présence à proximité de l’ADN. Le but de cette thèse était d’identifier de nouveaux partenaires et déterminants d’AID régulant sa stabilité et ses fonctions biologiques. Dans un premier temps, nous avons identifié AID comme une nouvelle protéine cliente d’HSP90. Nous avons montré qu’HSP90 interagit avec AID dans le cytoplasme, ce qui empêche la poly-ubiquitination d’AID et sa dégradation par le protéasome. En conséquence, l’inhibition d’HSP90 résulte en une diminution significative des niveaux endogènes d’AID et corrèle avec une réduction proportionnelle de ses fonctions biologiques dans la diversification des anticorps mais aussi dans l’introduction de mutations aberrantes. Dans un second temps, nous avons montré que l’étape initiale dans la stabilisation d’AID par la voie de chaperonnage d’HSP90 dépend d’HSP40 et d’HSP70. En particulier, la protéine DnaJa1, qui fait partie de la famille des protéines HSP40s, limite la stabilisation d’AID dans le cytoplasme. La farnésylation de DnaJa1 est importante pour l’interaction entre DnaJa1 et AID et moduler les niveaux de DnaJa1 ou son état de farnésylation impacte à la fois les niveaux endogènes d’AID mais aussi la diversification des anticorps. Les souris DNAJA1-/- présentent une réponse immunitaire compromise en cas d’immunisation, qui est dûe à des niveaux réduits d’AID et un défaut de commutation de classe. Dans un troisième temps, nous avons montré que la protéine AID est intrinsèquement plus instable que sesprotéines paralogues APOBEC. Nous avons identifié l’acide aspartique en seconde position d’AID ainsi qu’un motif semblable au PEST comme des modulateurs de la stabilité d’AID. La modification de ces motifs augmente la stabilité d’AID et résulte en une diversification des anticorps plus efficace. En conclusion, l’instabilité intrinsèque d’AID est un élément de régulation de la diversification des anticorps. Cette instabilité est en partie compensée dans le cytoplasme par l’action protective de la voie de chaperonnage DnaJa1-HSP90. Par ailleurs, l’utilisation d’inhibiteurs d’HSP90 ou de farnésyltransférases pourrait être un outil intéressant pour la modulation indirecte des niveaux d’AID et le traitement de lymphomes/leucémies et de maladies auto-immunes causés par AID.

Homéostasie des histones en réponse au dommage à l’ADN et étude d’inhibiteurs de désacétylases d’importance clinique

La chromatine possède une plasticité complexe et essentielle pour répondre à différents mécanismes cellulaires fondamentaux tels la réplication, la transcription et la réparation de l’ADN. Les histones sont les constituants essentiels de la formation des nucléosomes qui assurent le bon fonctionnement cellulaire d’où l’intérêt de cette thèse d’y porter une attention particulière. Un dysfonctionnement de la chromatine est souvent associé à l’émergence du cancer. Le chapitre II de cette thèse focalise sur la répression transcriptionnelle des gènes d’histones par le complexe HIR (HIstone gene Repressor) en réponse au dommage à l'ADN chez Saccharomyces cerevisiae. Lors de dommage à l’ADN en début de phase S, les kinases du point de contrôle Mec1, Tel1 et Rad53 s’assurent de bloquer les origines tardives de réplication pour limiter le nombre de collisions potentiellement mutagéniques ou cytotoxiques entre les ADN polymérases et les lésions persistantes dans l'ADN. Lorsque la synthèse totale d’ADN est soudainement ralentie par le point de contrôle, l’accumulation d'un excès d'histones nouvellement synthétisées est néfaste pour les cellules car les histones libres se lient de manière non-spécifique aux acides nucléiques. L'un des mécanismes mis en place afin de minimiser la quantité d’histones libres consiste à réprimer la transcription des gènes d'histones lors d'une chute rapide de la synthèse d'ADN, mais les bases moléculaires de ce mécanisme étaient très mal connues. Notre étude sur la répression des gènes d’histones en réponse aux agents génotoxiques nous a permis d’identifier que les kinases du point de contrôle jouent un rôle dans la répression des gènes d’histones. Avant le début de mon projet, il était déjà connu que le complexe HIR est requis pour la répression des gènes d’histones en phase G1, G2/M et lors de dommage à l’ADN en phase S. Par contre, la régulation du complexe HIR en réponse au dommage à l'ADN n'était pas connue. Nous avons démontré par des essais de spectrométrie de masse (SM) que Rad53 régule le complexe HIR en phosphorylant directement une de ses sous-unités, Hpc2, à de multiples résidus in vivo et in vitro. La phosphorylation d’Hpc2 est essentielle pour le recrutement aux promoteurs de gènes d’histones du complexe RSC (Remodels the Structure of Chromatin) dont la présence sur les promoteurs des gènes d'histones corrèle avec leur répression. De plus, nous avons mis à jour un nouveau mécanisme de régulation du complexe HIR durant la progression normale à travers le cycle cellulaire ainsi qu'en réponse aux agents génotoxiques. En effet, durant le cycle cellulaire normal, la protéine Hpc2 est très instable durant la transition G1/S afin de permettre la transcription des gènes d’histones et la production d'un pool d'histones néo-synthétisées juste avant l'initiation de la réplication de l’ADN. Toutefois, Hpc2 n'est instable que pour une brève période de temps durant la phase S. Ces résultats suggèrent qu'Hpc2 est une protéine clef pour la régulation de l'activité du complexe HIR et la répression des gènes d’histones lors du cycle cellulaire normal ainsi qu'en réponse au dommage à l’ADN. Dans le but de poursuivre notre étude sur la régulation des histones, le chapitre III de ma thèse concerne l’analyse globale de l’acétylation des histones induite par les inhibiteurs d’histone désacétylases (HDACi) dans les cellules normales et cancéreuses. Les histones désacétylases (HDACs) sont les enzymes qui enlèvent l’acétylation sur les lysines des histones. Dans plusieurs types de cancers, les HDACs contribuent à l’oncogenèse par leur fusion aberrante avec des complexes protéiques oncogéniques. Les perturbations causées mènent souvent à un état silencieux anormal des suppresseurs de tumeurs. Les HDACs sont donc une cible de choix dans le traitement des cancers engendrés par ces protéines de fusion. Notre étude de l’effet sur l’acétylation des histones de deux inhibiteurs d'HDACs de relevance clinique, le vorinostat (SAHA) et l’entinostat (MS-275), a permis de démontrer une augmentation élevée de l’acétylation globale des histones H3 et H4, contrairement à H2A et H2B, et ce, autant chez les cellules normales que cancéreuses. Notre quantification en SM de l'acétylation des histones a révélé de façon inattendue que la stœchiométrie d'acétylation sur la lysine 56 de l’histone H3 (H3K56Ac) est de seulement 0,03% et, de manière surprenante, cette stœchiométrie n'augmente pas dans des cellules traitées avec différents HDACi. Plusieurs études de H3K56Ac chez l’humain présentes dans la littérature ont rapporté des résultats irréconciliables. Qui plus est, H3K56Ac était considéré comme un biomarqueur potentiel dans le diagnostic et pronostic de plusieurs types de cancers. C’est pourquoi nous avons porté notre attention sur la spécificité des anticorps utilisés et avons déterminé qu’une grande majorité d’anticorps utilisés dans la littérature reconnaissent d’autres sites d'acétylation de l’histone H3, notamment H3K9Ac dont la stœchiométrie d'acétylation in vivo est beaucoup plus élevée que celle d'H3K56Ac. De plus, le chapitre IV fait suite à notre étude sur l’acétylation des histones et consiste en un rapport spécial de recherche décrivant la fonction de H3K56Ac chez la levure et l’homme et comporte également une évaluation d’un anticorps supposément spécifique d'H3K56Ac en tant qu'outil diagnostic du cancer chez l’humain.

Antibody Based Diagnostic for Detection Of Vibrios and their Biological Control using Antagonistic Bacteria in Macrobrachium Rosenbergii Larval Rearing Systems

The main objective of the work undertaken here was to develop an appropriate microbial technology to protect the larvae of M.rosenbergii in hatchery from vibriosis. This technology precisely is consisted of a rapid detection system of vibrios and effective antagonistic probiotics for the management of vibrios. The present work was undertaken with the realizations that to stabilize the production process of commercial hatcheries an appropriate, comprehensive and fool proof technology is required primarily for the rapid detection of Vibrio and subsequently for its management. Nine species of Vibrio have been found to be associated with larvae of M. rosenbergii in hatchery. Haemolytic assay of the Vibrio and Aeromonas on prawn blood agar showed that all isolates of V. alginolyticus and Aeromonas sp., from moribund, necrotized larve were haemolytic and the isolates of V.cholerae, V.splendidus II, V.proteolyticus and V.fluvialis from the larvae obtained from apparently healthy larval rearing systems were non-haemolytic. Hydrolytic enzymes such as lipase, chitinase and gelatinase were widespread amongst the Vibrio and Aeromonas isolates. Dominance of V.alginolyticus among the isolates from necrotic larvae and the failure in isolating them from rearing water strongly suggest that they infect larvae and multiply in the larval body and cause mortality in the hatchery. The observation suggested that the isolate V. alginolyticus was a pathogen to the larvae of M.rosenbergii. To sum up, through this work, nine species of Vibrio and genus Aeromonas associated with M.rosenbergii larval rearing systems could be isolated and segregated based on the haemolytic activity and the antibodies (PA bs) for use in diagnosis or epidemiological studies could be produced, based on a virulent culture of V.alginolyticus. This could possibly replace the conventional biochemical tests for identification. As prophylaxis to vibriosis, four isolates of Micrococcus spp. and an isolate of Pseudomonas sp. could be obtained which could possibly be used as antagonistic probiotics in the larval rearing system of M.rosenbergii.

Microwave Dielectric Resonator Based on Ba[(Bi0.2 D3+0.3)Nb0.5]O3(D3+=Y,Pr,Sm,Gd,Dy,Er)

Dielectric resonator ceramics with composition formula Ba[(D3+0.3 Bi0.2)Nb0.5]O3,where D3+=Y,Pr,Sm,Gd,Dy and Er,were prepared by the conventional ceramic preparation route

Preparation, Characterization, and Microwave Properties of RETiNbO6 (RE = Ce, Pr, Nd, Sm, Eu, Gd, Tb, Dy, Y, and Yb) Dielectric Ceramics

Microwave ceramic dielectric resonators (DRs) based on RETiNbO6 (RE = Ce, Pr, Nd, Sm, Eu, Gd, Tb, Dy, Y, and Yb) have been prepared using the conventional solid -state ceramic route. The DR samples are characterized using XRD and SEM methods. The microwave dielectric properties are measured using resonant methods and a net work analyzer . The ceramics based on Ce, Pr, Nd, and Sin have dielectric constants in the range 32-54 and positive coefficient of thermal variation of resonant frequency (r,). The ceramics based on Gd, Tb, Dy, Y. and Yb have dielectric constants in the range 19-22 and negative Tf