Studies on the reproductive physiology of the green tiger prawn Penaeus (penaeus) semisulcatus de Haan

A study of the reproductive physiology of P. (P). semisulcatus wasundertaken as this information is an essential prerequisite for brood stock development for hatchery operations, and the results are embodied in this thesis. The thesis is presented in seven chapters. The protein, lipid and carbohydrate contents of ovary were estimated for the different vitellogenic phases. The protein, lipid, carbohydrate and cholesterol contents were estimated in testes and spermatophore.The thesis present the results of induced maturation experiments by eyestalk ablation, CNS extract injection and UV rays application on immature female prawns.

Studies on the reproductive endocrinology of the penaeid prawn, Penaeus indicus H. Milne Edward

The present investigation has been carried out to understand the process and events leading to maturation of the ovary and testis in the Indian white prawn Penaeus indicus. The study includes the classification of the ovarian maturity stages based on its colour, gonadosomatic index, oocyte diameter and morphological changes in the oocyte. Further the process of oogenesis has been investigated using light and electron microscopic techniques. A histochemical study of the ovary has also been carried out to determine the sequence in which yolk substances are synthesized or sequestered in the oocytes and also to elicit the nature of the penaeid yolk material. The process of spermatogenesis and the development of the spermatophore has been studied in detail using light and electron microscopic methods. In addition a brief histochemical study on the testis was also made to understand the nature of the organic reserves in the sperm cells.

Studies on some aspects of the reproductive physiology of the female grey mullet mugil cephalus l.

Aquaculture is the dynamic pursuit of production of organisms from water a process analogous to agriculture on land. The field of aquaculture is an emerging bioindustry, based upon the culture and husbandry of economically utilizable aquatic organisms. Of late, there has been a global upsurge for aquaculture, the main reasons for which include the requirement of protein source for the increasing world population, the decision by various world nations to increase the fish yield by developing unutilized or partially utilized water bodies and depletion of natural stock which is evident in recent years due to excessive exploitation .The present study has been taken up on the reproductive physiology of the female grey mullet, M. cephalus. The thesis is presented in seven chapters. In the present study, variations in the major biochemical parameters namely, moisture, proteins, lipids, carbohydrates cholesterol, carotenoid, ash, calcium and iron in four tissues E. muscle, liver, ovary and bloodserum of cephalus have been analysed at different maturity stages.

Studies on the systematics, biology and fishery of rainbow sardines, dussumieria spp., from Indian waters

Rainbow sardines of the genus belonging to the family Dueenaieriidae. are small pelagic fishes forming a fairly good, though not abundant. seasonal fishery all along the coasts of India inhabiting the coastal waters. There have been some earlier reports on such individual aspects as their systematic, distribution, abundance. Ostecology and a few biological factors but no attempt has been made towards a comprehensive study on this group. Two species of rainbow sardines are known to occur in the Indian seas and while a knowledge about their biology would be useful from the fishery point of view. it was also thought a study of their systematic position, especially regarding the identity or the two species which had raised doubts among earlier workers would lead to a better understanding or the group as a whole. This thesis is mainly based on studies during the period from April 1969 to march 1971 with a continued investigation of fishhery aspects till December 1975. from the Gulf of manar: and the Palk Bay around mandapam area. on the south-east coast of India. Thus the work deals with the systemtics, biology and fishery of rainbow sardines of Indian seas.

Development of a cell culture system from the ovarian tissue of African catfish Clarias gariepinus

A growth medium with Leibovitz-15 L-15.as the base, supplemented with foetal bovine serum 10% vrv., fish muscle extract 10% vrv., prawn muscle extract 10% vrv., lectin concanavalin A. 0.02 mg mly1., lipopolysaccharide 0.02 mg mly1., glucose D 0.2 mg mly1., ovary extract 0.5% vrv.and prawn haemolymph 0.5%. has been formulated with 354"10 mOsm for the development and maintenance of a cell culture system from the ovarian tissue of African catfish, Clarias gariepinus. For its subculturing, a cell dissociationrextracting solution, composed of equal portions of trypsin phosphate versene glucose TPVG. containing 0.0125% wrv.trypsin and 25% vrv.non-enzymatic cell dissociation solution 1 and 2, has also been developed with which the cell culture can be passaged 15 times after which they cease to multiply and consequently perish. The cell cultures can be maintained for 12–15 days without fluid change between the passages. This is the first report of a cell culture system from the ovarian tissues of African catfish

Pathological changes in Fenneropenaeus indicus experimentally infected with white spot virus and virus morphogenesis

To demonstrate pathological changes due to white spot virus infection in Fenneropenaeus indicus, a batch of hatchery bred quarantined animals was experimentally infected with the virus. Organs such as gills, foregut, mid-gut, hindgut, nerve, eye, heart, ovary and integument were examined by light and electron microscopy. Histopathological analyses revealed changes hitherto not reported in F. indicus such as lesions to the internal folding of gut resulted in syncytial mass sloughed off into lumen, thickening of hepatopancreatic connective tissue with vacuolization of tubules and necrosis of rectal pads in hindgut. Virus replication was seen in the crystalline tract region of the compound eye and eosinophilic granules infiltrated from its base. In the gill arch, dilation and disintegration of median blood vessel was observed. In the nervous tissues, encapsulation and subsequent atrophy of hypertrophied nuclei of the neurosecretory cells were found. Transmission electron microscopy showed viral replication and morphogenesis in cells of infected tissue. De novo formed vesicles covered the capsid forming a bilayered envelop opened at one end inside the virogenic stroma. Circular vesicles containing nuclear material was found fused with the envelop. Subsequent thickening of the envelop resulted in the fully formed virus. In this study, a correlation was observed between the stages of viral multiplication and the corresponding pathological changes in the cells during the WSV infection. Accordingly, gill and foregut tissues were found highly infected during the onset of clinical signs itself, and are proposed to be used as the tissues for routine disease diagnosis.

A novel medium for the development of in vitro cell culture system from Penaeus monodon

Lack of a valid shrimp cell line has been hampering the progress of research on shrimp viruses. One of the reasons identified was the absence of an appropriate medium which would satisfy the requirements of the cells in vitro. We report the first attempt to formulate an exclusive shrimp cell culture medium (SCCM) based on the haemolymph components of Penaeus monodon prepared in isosmotic seawater having 27 % salinity. The SCCM is composed of 22 amino acids, 4 sugars, 6 vitamins, cholesterol, FBS, phenol red, three antibiotics, potassium dihydrogen phosphate and di-sodium hydrogen phosphate at pH 6.8–7.2. Osmolality was adjusted to 720 ± 10 mOsm kg-1 and temperature of incubation was 25 8C. The most appropriate composition was finally selected based on the extent of attachment of cells and their proliferation by visual observation. Metabolic activity of cultured cells was measured by MTT assay and compared with that in L-15 (29), modified L-15 and Grace’s insect medium, and found better performance in SCCM especially for lymphoid cells with 107 % increase in activity and 85 ± 9 days of longevity. The cells from ovary and lymphoid organs were passaged twice using the newly designed shrimp cell dissociation ‘‘cocktail’’.

Retargeting of pre-set regions on chromosome for high gene expression in mammalian cells

We have developed a system to hunt and reuse special gene integration sites that allow for high and stable gene expression. A vector, named pRGFP8, was constructed. The plasmid pRGFP8 contains a reporter gene, gfp2 and two extraneous DNA fragments. The gene gfp2 makes it possible to screen the high expression regions on the chromosome. The extraneous DNA fragments can help to create the unique loci on the chromosome and increase the gene targeting frequency by increasing the homology. After transfection into Chinese hamster ovary cells (CHO) cells, the linearized pRGFP8 can integrate into the chromosome of the host cells and form the unique sites. With FACS, 90 millions transfected cells were sorted and the cells with strongest GFP expression were isolated, and then 8 stable high expression GFP CHO cell lines were selected as candidates for the new host cell. Taking the unique site created by pRGFP8 on the chromosome in the new host cells as a targeting locus, the gfp2 gene was replaced with the gene of interest, human ifngamma, by transfecting the targeting plasmid pRIH-IFN. Then using FACS, the cells with the dimmest GFP fluorescence were selected. These cells showed they had strong abilities to produce the protein of interest, IFN-gamma. During the gene targeting experiment, we found there is positive correlation between the fluorescence density of the GFP CHO host cells and the specific production rate of IFN-gamma. This result shows that the strategy in our expression system is correct: the production of the interesting protein increases with the increase fluorescence of the GFP host cells. This system, the new host cell lines and the targeting vector, can be utilized for highly expressing the gene of interest. More importantly, by using FACS, we can fully screen all the transfected cells, which can reduce the chances of losing the best cells.

Intraovarian sperm storage in Helicolenus dactylopterus dactylopterus fertilitzation, crypt formation and maintenance of stored sperm

The females of the bluemouth rockfish, Helicolenus dactylopterus dactylopterus (DelaRoche, 1809), store sperm within their ovaries for periods of up to 10 months. Twenty six females with standard lengths between 152 and 257 mm and six males with standard lengths between 253 and 209 mm were caught storage crypts with stored spermatozoa and to describe their evolution over the year. After internal fertilization and once sperm reaches the ovary, a crypt forms probably by an epithelial inclusion at the base of the lamellae of one or several spermatozoa groups that are floating freely in the interlamellar space of the ovarian lumen. Stored spermatozoa have a large cytoplasm bag surrounding their heads. This bag could serve as a nutritive reservoir during the long storage period. Many desmosonal and tight junctions between the crypt cells ensure tha male sex cells are protected against the female immune system

A "Trojan horse" strategy to reverse drug-resistance in brain tumors

Los gliomas malignos representan una de las formas más agresivas de los tumores del sistema nervioso central (SNC). De acuerdo con la clasificación de los tumores cerebrales de la Organización Mundial de la Salud (OMS), los astrocitomas han sido categorizados en cuatro grados, determinados por la patología subyacente. Es así como los gliomas malignos (o de alto grado) incluyen el glioma anaplásico (grado III) así como el glioblastoma multiforme (GBM, grado IV),estos últimos los más agresivos con el peor pronóstico (1). El manejo terapéutico de los tumores del SNC se basa en la cirugía, la radioterapia y la quimioterapia, dependiendo de las características del tumor, el estadio clínico y la edad (2),(3), sin embargo ninguno de los tratamientos estándar es completamente seguro y compatible con una calidad de vida aceptable (3), (4). En general, la quimioterapia es la primera opción en los tumores diseminados, como el glioblastoma invasivo y el meduloblastoma de alto riesgo o con metástasis múltiple, pero el pronóstico en estos pacientes es muy pobre (2),(3). Solamente nuevas terapias dirigidas (2) como las terapias anti-angiogénicas (4); o terapias génicas muestran un beneficio real en grupos limitados de pacientes con defectos moleculares específicos conocidos (4). De este modo, se hace necesario el desarrollo de nuevas terapias farmacológicas para atacar los tumores cerebrales. Frente a las terapias los gliomas malignos son con frecuencia quimioresistentes, y esta resistencia parece depender de al menos dos mecanismos: en primer lugar, la pobre penetración de muchas drogas anticáncer a través de la barrera hematoencefálica (BBB: Blood Brain Barrier), la barrera del fluido sangre-cerebroespinal (BCSFB: Blood-cerebrospinal fluid barrier) y la barrera sangre-tumor (BTB: blood-tumor barrier). Dicha resistencia se debe a la interacción de la droga con varios transportadores o bombas de eflujo de droga ABC (ABC: ATP-binding cassette) que se sobre expresan en las células endoteliales o epiteliales de estas barreras. En segundo lugar, estos transportadores de eflujo de drogas ABC propios de las células tumorales confieren un fenotipo conocido como resistencia a multidrogas (MDR: multidrug resistance), el cual es característico de varios tumores sólidos. Este fenotipo también está presente en los tumores del SNC y su papel en gliomas es objeto de investigación (5). Por consiguiente el suministro de medicamentos a través de la BBB es uno de los problemas vitales en los tratamientos de terapia dirigida. Estudios recientes han demostrado que algunas moléculas pequeñas utilizadas en estas terapias son sustratos de la glicoproteína P (Pgp: P-gycoprotein), así como también de otras bombas de eflujo como las proteínas relacionadas con la resistencia a multidrogas (MRPs: multidrug resistance-related proteins (MRPs) o la proteína relacionada con cáncer de seno (BCRP: breast-cancer resistance related protein)) que no permiten que las drogas de este tipo alcancen el tumor (1). Un sustrato de Pgp y BCRP es la DOXOrubicina (DOXO), un fármaco utilizado en la terapia anti cáncer, el cual es muy eficaz para atacar las células del tumor cerebral in vitro, pero con un uso clínico limitado por la poca entrega a través de la barrera hematoencefálica (BBB) y por la resistencia propia de los tumores. Por otra parte las células de BBB y las células del tumor cerebral tienen también proteínas superficiales, como el receptor de la lipoproteína de baja densidad (LDLR), que podría utilizarse como blanco terapéutico en BBB y tumores cerebrales. Es asi como la importancia de este estudio se basa en la generación de estrategias terapéuticas que promuevan el paso de las drogas a través de la barrera hematoencefalica y tumoral, y a su vez, se reconozcan mecanismos celulares que induzcan el incremento en la expresión de los transportadores ABC, de manera que puedan ser utilizados como blancos terapéuticos.Este estudio demostró que el uso de una nueva estrategia basada en el “Caballo de Troya”, donde se combina la droga DOXOrubicina, la cual es introducida dentro de un liposoma, salvaguarda la droga de manera que se evita su reconocimiento por parte de los transportadores ABC tanto de la BBB como de las células del tumor. La construcción del liposoma permitió utilizar el receptor LDLR de las células asegurando la entrada a través de la BBB y hacia las células tumorales a través de un proceso de endocitosis. Este mecanismo fue asociado al uso de estatinas o drogas anticolesterol las cuales favorecieron la expresión de LDLR y disminuyeron la actividad de los transportadores ABC por nitración de los mismos, incrementando la eficiencia de nuestro Caballo de Troya. Por consiguiente demostramos que el uso de una nueva estrategia o formulación denominada ApolipoDOXO más el uso de estatinas favorece la administración de fármacos a través de la BBB, venciendo la resistencia del tumor y reduciendo los efectos colaterales dosis dependiente de la DOXOrubicina. Además esta estrategia del "Caballo de Troya", es un nuevo enfoque terapéutico que puede ser considerado como una nueva estrategia para aumentar la eficacia de diferentes fármacos en varios tumores cerebrales y garantiza una alta eficiencia incluso en un medio hipóxico,característico de las células cancerosas, donde la expresión del transportador Pgp se vió aumentada. Teniendo en cuenta la relación entre algunas vías de señalización reconocidas como moduladores de la actividad de Pgp, este estudio presenta no solo la estrategia del Caballo de Troya, sino también otra propuesta terapéutica relacionada con el uso de Temozolomide más DOXOrubicina. Esta estrategia demostró que el temozolomide logra penetrar la BBB por que interviene en la via de señalización de la Wnt/GSK3/β-catenina, la cual modula la expresión del transportador Pgp. Se demostró que el TMZ disminuye la proteína y el mRNA de Wnt3 permitiendo plantear la hipótesis de que la droga al disminuir la transcripción del gen Wnt3 en células de BBB, incrementa la activación de la vía fosforilando la β-catenina y conduciendo a disminuir la β-catenina nuclear y por tanto su unión al promotor del gen mdr1. Con base en los resultados este estudio permitió el reconocimiento de tres mecanismos básicos relacionados con la expresión de los transportadores ABC y asociados a las estrategias empleadas: el primero fue el uso de las estatinas, el cual condujo a la nitración de los transportadores disminuyendo su actividad por la via del factor de transcripción NFκB; el segundo a partir del uso del temozolomide, el cual metila el gen de Wnt3 reduciendo la actividad de la via de señalización de la la β-catenina, disminuyendo la expresión del transportador Pgp. El tercero consistió en la determinación de la relación entre el eje RhoA/RhoA quinasa como un modulador de la via (no canónica) GSK3/β-catenina. Se demostró que la proteína quinasa RhoA promovió la activación de la proteína PTB1, la cual al fosforilar a GSK3 indujo la fosforilación de la β-catenina, lo cual dio lugar a su destrucción por el proteosoma, evitando su unión al promotor del gen mdr1 y por tanto reduciendo su expresión. En conclusión las estrategias propuestas en este trabajo incrementaron la citotoxicidad de las células tumorales al aumentar la permeabilidad no solo de la barrera hematoencefálica, sino también de la propia barrera tumoral. Igualmente, la estrategia del “Caballo de Troya” podría ser útil para la terapia de otras enfermedades asociadas al sistema nervioso central. Por otra parte estos estudios indican que el reconocimiento de mecanismos asociados a la expresión de los transportadores ABC podría constituir una herramienta clave en el desarrollo de nuevas terapias anticáncer.

Spermiogenesis particularities of a sperm storage species: Helicolenus dactylopterus (Teleostei: Scorpaenidae)

A study of the spermiogenesis and spermatozoa of Helicolenus dactylopterus was conducted. Females of this species have the capacity to store sperm within their ovaries, and male gametes have a considerable cytoplasmic mass surrounding their heads to survive the long period of intraovarian sperm storage. Our observations show that early spermatids are round-shaped cells and have a spherical nucleus with diffuse chromatin. The nuclear volume decreases as a result of progressive chromatin condensation during spermiogenesis, causing the nucleus to take on a U-shape. Flagellar insertion is not central to the nucleus but consistently occurs at an oblique angle towards one side of it. The flagellum is inserted into the nuclear fossa, without subsequent nuclear rotation. In mature spermatozoa, the flagellum is adjacent to the nucleus. A comparison of the spermatozoa in the testicular lobules and those in the intraovarian storage structures suggests that the increase in volume of the cytoplasmic mass may occur in the posterior region of the testis, in the testicular duct. Spermatozoa enter the ovary in groups that reach the ovarian lumen and are surrounded by the ovarian epithelium for storage in sperm storage crypts

Anatomia macroscòpica i microscòpica de l'aparell genital femení d'Ophidion barbatum (L.) (Pisces, Ophididae)

S'ha realitzat un estudi de l'anatomia macroscòpica i microscòpica de I'ovari d'Ophidion barbatum (L.) (Pisces, Ophidiidae), utilitzant material recollit per pescadors del port de Blanes (mar català) durant el mes d'octubre de 1985. L'absència d'òrgan copulador en els mascles d'aquesta espècie i la posició de l'orifici nasal anterior, a una certa alçada respecte al llavi superior, ens permet identificar-la com una espècie ovípara, del subordre Ophidioidei, dins de l'ordre Ophidiiformes. L'ovari és únic i continuat caudalment per l'oviducte. Els nombrosos cordons intraovarics que tapien la cavitat augmenten considerablement la superfície germinal. El desenvolupament de l'ovari es correspon amb el tipus asincrònic (Marza, 1938) i la fresa repetida al llarg d'una estació reproductiva més o menys llarga és una estrategia que augmenta la fecunditat, normalment limitada pel volum corporal de la femella. Dins de l'ordre Ophidiiformes, el tipus d'ovari únic sense restes de paret mitjana sembla ser la norma entre les espècies de reproducció ovípara. Aquest fet esta en contradicció amb la teoria de Mendoza (1943) que, fora d'algunes excepcions, l'ovari únic es troba principalment en els teleostis vivípars

L'emmagatzematge intraovàric d'esperma en Helicolenus dactylopterus (Pisces: Scorpaeniformes)

El penegal, Helicolenus dactylopterus dactylopterus (Pisces: Scorpaeniformes), és una espècie que habita profunditats d'entre els 200 i 1000 m i presenta una clara distribució batimètrica en funció de la seva talla. Presenta fecundació interna i a l'interior de l'ovari conté estructures d'emmagatzematge que permeten emmagatzemar l'esperma durant períodes de temps considerablement llargs. Les cèl·lules sexuals masculines es mantenen viables gràcies a diverses substàncies nutritives que obtenen de la bossa citoplasmàtica i de l'epiteli criptal que delimita les estructures d'emmagatzematge. Aquest epiteli és també responsable de la seva protecció. Un cop els ous han assolit la maduresa, els espermatozoides són alliberats al lumen ovàric i es dóna la fertilització. És una espècie zigòpara: allibera òvuls fecundats que han estat retinguts al tracte reproductiu femení durant un curt període de temps i, per tant, els embrions són alliberats en estadis molt primerencs de desenvolupament. Així, el penegal presenta una estratègia reproductiva evidentment eficaç.

L'oviparisme en la família Scorpaenidae (Pisces: Scorpaeniformes)

En aquest treball de tesi doctoral es descriu l'estructura gonadal, gametogènesi i cicle anual de Scorpaena porcus, S. scrofa i S. elongata per tal d'aprofundir en el coneixement dels diferents graus d'especialització dins l'oviparisme en peixos. Es pretén fer èmfasi en aquells trets inusuals que difereixen del què s'ha descrit fins ara per la majoria de les espècies ovípares de teleostis, i relacionar-los amb l'estratègia reproductiva de les espècies que els presenten El mostreig s'ha dut a terme de forma intensiva entre l'any 2000 i 2002, tot i que s'ha continuat recol·lectant mostres fins a l'agost de 2004, amb més o menys freqüència segons la necessitat. En total s'han obtingut 258 exemplars de S. porcus, 119 de S. scrofa i 46 de S. elongata. S'ha pogut veure com S. porcus, S. scrofa i S. elongata són espècies ovípares ovulípares especialitzades, ja que la seva estructura ovàrica presenta tot una sèrie de trets molt particulars i poc comuns a la resta de peixos ovípars estudiats fins ara: posició central del raquis musculo-connectiu que es troba envoltat completament pel lumen i la paret ovàrica; presència de peduncles en oòcits en fase de creixement secundari; escassetat i mida petita dels alvèols corticals; poc gruix de la zona radiata; i secreció d'una massa gelatinosa que engloba els ous en el moment de la posta. Totes aquestes característiques també s'han observat en Scorpaena notata, suggerint que l'especialització de l'oviparisme ovulípar es dóna en tot el gènere Scorpaena. L'estructura testicular i l'espermatogènesi d'aquestes espècies també és força particular. Per una banda els testicles són del tipus lobular no-restringit, tot i que presenten algunes característiques com la ordenació parcial dels cists segons l'estadi de maduració de les cèl·lules germinals que contenen i l'absència de lumen central, que actualment només s'ha observat en testicles del tipus lobular restringit de les espècies de la sèrie Aterinomorpha. Per l'altre banda, l'espermatogènesi és del tipus semicística, és a dir, els cists s'obren abans d'acabar tot el procés i les cèl·lules germinals s'acaben de desenvolupar a la llum del lòbul fins a espermatozoides. La posta d'aquestes espècies és múltipla i constisteix en una massa gelatinosa d'ous pelàgica, que en el cas de S. porcus s'alliberen entre els mesos de juny i agost, i en S. scrofa, a partir del mes de juliol. S'ha relacionat la presència d'aquesta massa amb un aparellament mascle-femella, de manera que el mascle alliberaria l'esperma directament sobre la massa d'ous, assegurant així la fartilització total dels mateixos.

Developmental programming: Deficits in reproductive hormone dynamics and ovulatory outcomes in prenatal, testosterone-treated sheep

Prenatal testosterone excess leads to neuroendocrine, ovarian, and metabolic disruptions, culminating in reproductive phenotypes mimicking that of women with polycystic ovary syndrome (PCOS). The objective of this study was to determine the consequences of prenatal testosterone treatment on periovulatory hormonal dynamics and ovulatory outcomes. To generate prenatal testosterone-treated females, pregnant sheep were injected intramuscularly (days 30-90 of gestation, term = 147 days) with 100 mg of testosterone-propionate in cottonseed oil semi-weekly. Female offspring born to untreated control females and prenatal testosterone-treated females were then studied during their first two breeding seasons. Sheep were given two injections of prostaglandin F-2alpha 11 days apart, and blood samples were collected at 2-h intervals for 120 h, 10-min intervals for 8 h during the luteal phase (first breeding season only), and daily for an additional 15 days to characterize changes in reproductive hormonal dynamics. During the first breeding season, prenatal testosterone-treated females manifested disruptions in the timing and magnitude of primary gonadotropin surges, luteal defects, and reduced responsiveness to progesterone negative feedback. Disruptions in the periovulatory sequence of events during the second breeding season included: 1) delayed but increased preovulatory estradiol rise, 2) delayed and severely reduced primary gonadotropin surge in prenatal testosterone-treated females having an LH surge, 3) tendency for an amplified secondary FSH surge and a shift in the relative balance of FSH regulatory proteins, and 4) luteal responses that ranged from normal to anovulatory. These outcomes are likely to be of relevance to developmental origin of infertility disorders and suggest that differences in fetal exposure or fetal susceptibility to testosterone may account for the variability in reproductive phenotypes.