Finte pelli in PVC: utilizzo e proprietà in mescola di plastificanti e ritardanti di fiamma ecosostenibili e non tossici

Il presente lavoro di tesi sperimentale prende in considerazione diverse possibili alternative ai plastificanti (in particolare alla famiglia degli ftalati) e ritardanti di fiamma (triossido di antimonio) ampiamente utilizzati al giorno d’oggi nella produzione di finte pelli in PVC, anticipando in questo modo possibili restrizioni future imposte dalla normativa REACH: quattro ftalati a basso peso molecolare (Benzil-ButilFtalato, Di-ButilFtalato, Di-Iso-ButilFtalato, e Di-2-Etil-EsilFtalato) sono già stati proibiti ed il triossido di antimonio è inserito nella lista delle sostanze candidate a possibili restrizioni. Le limitazioni all’uso di queste sostanze è dovuta agli effetti negativi sulla salute e sull’ambiente causati da queste sostanze: gli ftalati a basso peso molecolare possono interferire nei cicli ormonali; il triossido di antimonio è un sospetto cancerogeno, è pericoloso per inalazione ed è considerato causa di pneumoconiosi e irregolarità cardiache dei lavoratori a contatto con esso. Inoltre, l’antimonio è un inquinante persistente, bioaccumulabile e tossico (PBT). Sono stati presi in esame 21 plastificanti appartenenti a varie categorie (sebacati, adipati, trimellitati, fosfati, benzoati, …), coi quali sono state prodotte foglie di PVC plastificato. Le foglie sono state sottoposte a caratterizzazione tramite spettroscopia FT-IR ed a test sia di natura meccanica (durezza, resistenza meccanica, etc.) che focalizzati a determinare proprietà legate al loro uso finale (migrazione del plastificante, resistenza alla fiamma, stabilità termica, etc.). Tra i migliori plastificanti individuati vi sono i trimellitati ed alcuni plastificanti da fonti rinnovabili (azelati, tetravalerati). Sono state investigate singolarmente le proprietà di 5 tipologie di ritardanti di fiamma in sostituzione del triossido di antimonio (a varie percentuali di additivazione nel materiale) e di 3 miscele di ritardanti allo scopo di valutare eventuali effetti sinergici. Le foglie additivate con questi ritardanti di fiamma sono state caratterizzate tramite analisi termiche specifiche: analisi al cono calorimetro e analisi TGA accoppiata ad FT-IR, utili per la comprensione dei meccanismi di azione dei ritardanti di fiamma e della loro influenza sulla degradazione termica del PVC plastificato. Infine, le foglie sono state sottoposte ai classici test di resistenza meccanica, resistenza alla fiamma, stabilità termica, ecc. I migliori ritardanti di fiamma individuati sono: ipofosfito di calcio, sali carbossilati ed allumina triidrata, da soli o miscelati con zinco idrossistannato.

Mappatura degli habitat e degli oggetti antropici della laguna di Venezia

L’utilizzo del Multibeam Echo sounder (MBES) in ambienti di transizione poco profondi, con condizioni ambientali complesse come la laguna di Venezia, è ancora in fase di studio e i dati biologici e sedimentologici inerenti ai canali della laguna di Venezia sono attualmente scarsi e datati in letteratura. Questo studio ha lo scopo di mappare gli habitat e gli oggetti antropici di un canale della laguna di Venezia in un intervallo di profondità tra 0.3 e 20 m (Canale San Felice) analizzando i dati batimetrici e di riflettività (backscatter) acquisiti da ISMAR-Venezia nell’ambito del progetto RITMARE. A tale scopo il fondale del canale San Felice (Venezia) è stato caratterizzato dal punto di vista geomorfologico, sedimentologico e biologico; descrivendo anche l’eventuale presenza di oggetti antropici. L’ecoscandaglio utilizzato è il Kongsberg EM2040 Dual-Compact Multibeam in grado di emettere 800 beam (400 per trasduttore) ad una frequenza massima di 400kHZ e ci ha consentito di ricavare ottimi risultati, nonostante le particolari caratteristiche degli ambienti lagunari. I dati acquisiti sono stati processati tramite il software CARIS Hydrographic information processing system (Hips) & Sips, attraverso cui è possibile applicare le correzioni di marea e velocità del suono e migliorare la qualità dei dati grezzi ricavati da MBES. I dati sono stati quindi convertiti in ESRI Grid, formato compatibile con il software ArcGIS 10.2.1 (2013) che abbiamo impiegato per le interpretazioni e per la produzione delle mappe. Tecniche di ground-truthing, basate su riprese video e prelievi di sedimento (benna Van Veen 7l), sono state utilizzate per validare il backscatter, dimostrandosi molto efficaci e soddisfacenti per poter descrivere i fondali dal punto di vista biologico e del substrato e quindi degli habitat del canale lagunare. Tutte le informazioni raccolte durante questo studio sono state organizzate all’interno di un geodatabase, realizzato per i dati relativi alla laguna di Venezia.

Sviluppo dell'interfaccia per il caricamento della geometria iniziale del propellente solido di un modello balistico

Il presente lavoro di tesi, nell’ambito della simulazione balistica di razzi a propellente solido, è volto alla creazione di un’interfaccia che permetta il caricamento delle geometrie dei motori desiderati, in formato SPP, nel codice di simulazione balistica ROBOOST come richiesto da Avio Spa. In particolare saranno descritte le procedure attraverso le quali tale interfaccia è stata realizzata e verranno analizzati i passaggi mediante i quali è possibile ottenere una mesh 3D del motore a propellente solido partendo dalla sua geometria in formato SPP. Si analizzerà inoltre il processo di chiusura di una mesh estratta da una qualsiasi iterazione della simulazione al fine di potervi effettuare delle simulazioni CFD sempre su richiesta della sopracitata azienda. Infine verranno mostrati e discussi i risultati ottenuti per meglio visualizzare il lavoro svolto.

La popolazione di Blue Straggler Stars in due ammassi globulari della Grande Nube di Magellano

Le Blue Straggler Stars (BSS) sono la popolazione di oggetti esotici piu' comune e numerosa negli ammassi globulari. Nel diagramma colore-magnitudine le BSS definiscono una sequenza più brillante e blu del punto di turn-off della Sequenza Principale, simulando una popolazione più giovane delle stelle dell'ammasso.  Osservazioni hanno dimostrato che le BSS hanno una massa significativamente più grande (1.2-1.7 Msun) di quella delle stelle di un ammasso globulare. Per questa proprietà, la distribuzione radiale delle BSS e' un utile strumento per tracciare empiricamente lo stato di evoluzione dinamica degli ammassi stellari. Il lavoro di tesi si è concentrato sullo studio della popolazione di BSS di due ammassi globulari della Grande Nube di Magellano: NGC2257 e NGC1754. Applicando metodi di indagine già usati per sistemi stellari della Via Lattea, abbiamo derivato le eta' dinamiche di questi due sistemi e le abbiamo confrontate con stime teoriche.

Studio della formazione e della composizione di aggregati solidi indesiderati in creme di nocciole e cacao destinate alla gelateria e conservate a basse temperature

Lo scopo di questa tesi, legato ad una collaborazione di ricerca industriale, è stato quello di stabilire la natura di aggregati solidi indesiderati che si formano in creme di nocciole e cacao, quando conservate, talora accidentalmente, a basse temperature, in particolare inferiori agli 0°C. L’obiettivo è stato quello di cercare di individuare le ragioni e gli ingredienti responsabili, con più probabilità, del fenomeno per poter dare indicazioni in merito alla formulazione o alla conservazione del prodotto prima e durante la commercializzazione. Sono state campionate due partite di creme di due differenti marche presenti in commercio. Una volta verificato per quali di queste creme e in che misura avesse origine la formazione degli aggregati solidi, si è proceduto ad un loro isolamento, mediante tecniche di estrazione solido-liquido, e successiva analisi gascromatografica degli acidi grassi. Anche per gli ingredienti delle creme di nocciole e cacao si è proceduto ad un’estrazione della componente lipidica ed ad una analisi gascromatografica degli acidi grassi. I risultati ottenuti sono stati elaborati, al fine di individuare gli ingredienti o le condizioni responsabili dell'insorgenza degli aggregati solidi indesiderati. La polvere di cacao è risultata, con più probabilità, l’ingrediente della crema di nocciola e cacao responsabile della formazione degli aggregati indesiderati, e questo ha suggerito la necessità di una verifica della qualità, anche in termini di cristallizzazione, di questo ingrediente, con particolare attenzione, ovviamente, alla frazione grassa (burro di cacao). E’ stato segnalato che un processo tecnologico di produzione non adeguato (tempera), in termini di temperature raggiunte e di mescolamento della crema, cos�� come di conservazione del prodotto finale possono avere una importanza fondamentale nelle eventuali separazioni per condensazione di alcuni componenti della fase lipidica (agglomerati sferici).

Ricerca di AGN oscurati nei Chandra Deep Fields

La forma spettrale dell’X-ray background richiede l’esistenza di un grande numero di AGN mediamente oscurati, oltre alla presenza di AGN fortemente oscurati, la cui densità di colonna supera il limite Compton (Nh>10^24 cm^(-2)). A causa della loro natura, questi oggetti risultano di difficile osservazione, per cui è necessario adottare un approccio multi-banda per riuscire a rivelarli. In questo lavoro di tesi abbiamo studiato 29 sorgenti osservate nel CDF-S e 10 nel CDF-N a 0.07selezionate come probabili AGN oscurati (di cui alcuni possibili Compton Thick) all’interno di un campione più ampio di galassie con formazione stellare osservate con Herschel (lunghezza d’onda 70-500 um) e selezionate per lo studio del rapporto tra il tasso di accrescimento sul buco nero presente al centro degli AGN e il tasso di formazione stellare della galassia ospite al variare del tempo cosmico. Abbiamo analizzato gli spettri X del campione di 29+10 sorgenti utilizzando i dati Chandra relativi a 7 Ms di osservazioni nel CDF-S e a 2 Ms nel CDF-N alla ricerca di indicazioni di oscuramento (Nh>10^23, spettro piatto, riga del ferro): a seguito di questa analisi sono state individuate 9 sorgenti che presentano indicazioni di forte oscuramento. Dallo studio del rapporto tra la luminosità X (2-10 keV) e quella MIR (12.3um) dedotta dal SED-fitting, si è ottenuta una conferma della possibile presenza di forte oscuramento nelle 9 sorgenti selezionate a seguito dell’analisi spettrale. Abbiamo inoltre confrontato il tasso di formazione stellare dedotto dalla banda X (0.5-8 keV) e da quella IR (8-1000um) per identificare le sorgenti nelle quali l’emissione da AGN risulta essere dominante. A seguito di questa analisi abbiamo identificato 9 sorgenti (le stesse di cui sopra) con indicazione di forte oscuramento; di queste, 3 mostrano chiare indicazioni della presenza di un AGN Compton Thick (Nh>10^24 cm^(-2), riga del ferro intensa, basso rapporto LX/MIR).

Abitare nuovi spazi. Riqualificazione e retrofit energetico di un complesso residenziale nel peep di corticella a bologna.

ABITARE NUOVI SPAZI tratta della riqualificazione funzionale ed energetica di un edificio residenziale situato all’interno dell’area costruita secondo il Piano per l’Edilizia Economica e Popolare di Bologna durante gli anni ’70 e ’80. Il caso studio si trova nella zona Corticella del quartiere Navile, a nord del centro storico di Bologna. Le principali criticità riscontrate a livello urbano riguardano la frammentazione degli spazi pubblici e la scarsa qualità dei percorsi ciclo-pedonali. Nelle proposte d’intervento è stata quindi prestata particolare attenzione alla qualità degli spazi e ai percorsi esterni, vere e proprie matrici per la riqualificazione del tessuto esistente. È possibile ricondurre tali obiettivi a tre punti fondamentali: liberare, ordinare, e connettere lo spazio. Passando alla scala architettonica, le principali criticità riguardano il taglio degli alloggi, l’illuminazione e le prestazioni energetiche dell’involucro edilizio. Tenendo conto delle preesistenze, l’approccio al progetto è stato quello di conservare ed adeguare, nonché di conferire all’edificio una forte identità attraverso un progetto architettonico che preveda la definizione di nuovi spazi sia all’interno che all’esterno dell’involucro edilizio esistente. Questi si manifestano sia con l’aggiunta di importanti volumetrie che si relazionano con l’edificio come dei veri e propri “parassiti”, sia con demolizioni di alcune parti che permettono all’ambiente esterno di entrare all’interno della struttura.

Abitare nuovi spazi. Riqualificazione e retrofit energetico di un complesso residenziale nel peep di corticella a bologna.

"Abitare nuovi spazi" tratta della riqualificazione funzionale ed energetica di un edificio residenziale situato all’interno dell’area costruita secondo il Piano per l’Edilizia Economica e Popolare di Bologna durante gli anni ’70 e ’80. Il caso studio si trova nella zona Corticella del quartiere Navile, a nord del centro storico di Bologna. Le principali criticità riscontrate a livello urbano riguardano la frammentazione degli spazi pubblici e la scarsa qualità dei percorsi ciclo-pedonali. Nelle proposte d’intervento è stata quindi prestata particolare attenzione alla qualità degli spazi e ai percorsi esterni, vere e proprie matrici per la riqualificazione del tessuto esistente. È possibile ricondurre tali obiettivi a tre punti fondamentali: liberare, ordinare, e connettere lo spazio. Passando alla scala architettonica, le principali criticità riguardano il taglio degli alloggi, l’illuminazione e le prestazioni energetiche dell’involucro edilizio. Tenendo conto delle preesistenze, l’approccio al progetto è stato quello di conservare ed adeguare, nonché di conferire all’edificio una forte identità attraverso un progetto architettonico che preveda la definizione di nuovi spazi sia all’interno che all’esterno dell’involucro edilizio esistente. Questi si manifestano sia con l’aggiunta di importanti volumetrie che si relazionano con l’edificio come dei veri e propri “parassiti”, sia con demolizioni di alcune parti che permettono all’ambiente esterno di entrare all’interno della struttura.

Strategie di riqualificazione urbana sostenibile della vivienda social. Linee guida per il quartiere di Casas Viejas, Santiago del Cile.

"Non possiamo permettere l'utilizzo del [tessuto] urbano come strumento per la produzione di iniquità e trasferimenti, incapaci di vedere l'importanza e la difficoltà di creare uno spazio attivo che sia equo, ecologico ed economico" (Schafran, 2014). In un contesto di emergenza ambientale globale e considerando le problematiche degli insediamenti popolari sudamericani, la presente ricerca propone l’introduzione del concetto di sostenibilità urbana come fattore di miglioramento di un quartiere della periferia del Gran Santiago. Il caso studio è interessante in quanto la politica cilena si muove in direzione di maggiore consapevolezza per i temi ambientali, pur dovendo ancora risolvere problemi di segregazione e scarsa qualità nella “vivienda social”. La presente ricerca è quindi finalizzata ad individuare una matrice composta da linee guida di sostenibilità riferite alla scala di quartiere, come strategia per rispondere ai problemi socio-residenziali, oltre alle imperanti esigenze di maggiore sostenibilità ambientale. A tale scopo è necessario fare riferimento a sistemi di valutazione adeguati: analizzando quelli utilizzati in ambito nazionale e internazionale, si ricava una matrice di 106 linee guida, 16 criteri e 3 ambiti principali di interesse. È questo lo strumento utilizzato per la diagnosi del caso studio. In base alle criticità emerse e alle necessità dell’area emergono due strategie principali su cui si articola la proposta progettuale di riqualificazione del quartiere: implementare dotazioni di servizi e aree verdi e introdurre tecnologie e misure ecofriendy, col fine di generare identità e migliorare la qualità di vita nel quartiere.

Studio mineralogico e chimico della serie della "Vena del Gesso" della cava di Monte Tondo (Borgo Rivola, Riolo Terme - RA)

Questo elaborato consiste nello studio mineralogico e chimico di una parte della successione della Vena del Gesso, coincidente con il sito estrattivo di Monte Tondo. Oltre all'inquadramento geologico della zona oggetto di studio e alcuni accenni sulle attività della cava, il presente elaborato contiene tabelle con le analisi di fluorescenza XRF per tutti i campioni prelevati, grafici dello spettro XRD per due campioni, completi di tabelle con i valori in allegato, diagrammi di correlazione per alcuni elementi, una analisi termogravimetrica ed una termodifferenziale, e i grafici con le rette di regressione per gli elementi maggiori e in tracce, con l'esclusione di certi elementi che hanno dato concentrazioni sotto il limite di rilevabilità.

Analisi Geologico-Tecnica e modellazione numerica della colata di detrito di Serraglio (Castiglione dei Pepoli)

Le colate detritiche sono manifestazioni parossistiche con trasporto impulsivo di sedimenti lungo la rete idrografica minore che presentano un elevato potere distruttivo. In questo lavoro di tesi si è cercato di descrivere inizialmente le caratteristiche tipiche delle colate di detrito, e le condizioni climatiche e geomorfologiche che tendono a favorirne l’innesco. Verranno poi analizzati, i casi relativi all’Appennino bolognese, prendendo come riferimento le colate rapide di detrito avvenute in località Serraglio (Baragazza) nei pressi del comune di Castiglione dei Pepoli. Nello specifico verrà indagato il fenomeno avvenuto il 31/01/2014, per il quale sono stati effettuati numerosi rilievi morfometrici che hanno portato ad individuare una geometria di dettaglio del canale di flusso e della nicchia di frana, per poter ricostruire i volumi di materiale mobilizzato. In contemporanea alle misure morfometriche si sono effettuate delle indagini sismiche volte a stimare lo spessore della coltre di alterazione presente all’interno del canale prima dell’evento, e a monte della nicchia di frana. Successivamente si è cercato di correlare le misure H/V con le prove MASW effettuate ,senza successo, ciò è probabilmente dovuto dalla difficoltà di indagare spessori cos�� sottili con le MASW. Perciò utilizzando le indagini H/V si è tentato di ricostruire il modello geologico – tecnico alla scala del versante. Infine si è cercato di modellizzare il fenomeno utilizzando il software Dan-W con il quale si sono testati vari modelli reologici fra i quali si sono dimostrati più realistici, in riferimento al caso in esame, il modello frizionale ed il modello di Voellmy. Per questi due modelli è stata quindi effettuata la calibrazione dei parametri, in riferimento dei quali si è visto che, con il modello di Voellmy si è ottenuto un buon valore della distanza percorsa dalla colata, ma una stima delle velocità abbastanza elevate. Il modello frizionale invece ha portato ad una buona stima degli spessori dei depositi, ma sottostimando la distanza che avrebbe potuto percorrere la colata se non avesse incontrato ostacoli.

Mortalità e incidenza di tumore in una coorte di lavoratori esposti ad asbesto nel settore della navalmeccanica. Confronti esterni, interni e caso-controllo nested

Obiettivi. Lo scopo di questo studio è di confrontare la mortalità e l’incidenza per tutte le cause, tutti i tumori, tumori specifici e per le cause non neoplastiche, in una coorte dei lavoratori impiegati nel cantiere navale di Monfalcone (GO) tra il 1974 e il 1994, con quella della popolazione generale della regione FVG e d’Italia. L’obiettivo è eseguire tali confronti considerando il livello di esposizione ad amianto, la durata di esposizione (in anni) precedente al 1985, il periodo di prima assunzione, quali principali indicatori di esposizione occupazionale ad asbesto. Obiettivo secondario è quello di contribuire alla conoscenza circa la correlazione tra esposizione ad asbesto e l’incidenza di tumori nelle principali sedi digestive. Metodi. Tramite metodo indiretto sono stati calcolati SIR (periodo 1995-2009) e SMR (periodo 1995-2012) per tumore maligno della pleura, tumore di trachea bronchi e polmone, per tutti i tumori e per malattie non neoplastiche. È stato condotto uno studio caso- controllo nested per la stima degli gli ORs rispettivamente per tumore maligno della pleura e del polmone. Sono stati applicati modelli di Poisson per la stima degli IRRs riguardanti le principali sedi digestive, utilizzando quali variabili esplicative: a) il rischio di esposizione ad asbesto legato alla mansione e b) il numero di anni di esposizione precedenti al 1985. Risultati. Nell’intera coorte (5582 uomini) gli SMR indicavano un eccesso di mortalità per tumore maligno della pleura incrementato rispettivamente di circa 7 volte (SMR= 7,03; IC95% 5,61-8,79) e di poco più di 14 volte (SMR= 14,20; IC95% 11,33-17,75) rispettivamente quando il confronto è stato fatto con la popolazione standard del FVG e dell’Italia. L’aumento della mortalità per tumore maligno della pleura risulta fortemente aumentato in tutte le stratificazioni. Gli SMR per il tumore di trachea, bronchi e polmone sono risultati essere prossimi all'unità quando le analisi sono state eseguite nell’intera coorte, mentre risultano aumentati in modo significativo rispetto alla popolazione generale quando calcolati nei soggetti a rischio medio e assunti presso i cantieri navali di Monfalcone prima del 1974 (SMR= 1,38 95%CI 1,00-1,85) e nei soggetti classificati a rischio medio e assunti nel periodo 1985-1994 (SMR= 4,88 95%CI 1,00-14,25). Analogamente, nell’intera coorte, i SIR per tumore maligno della pleura calcolati nell’intera coorte erano aumentati di oltre 7 volte (SIR= 7,65; IC95% 6,19-9,49), mentre l’incidenza del tumore di trachea bronchi e polmone non vede incrementi rispetto alla popolazione di riferimento. Coloro che hanno avuto una durata di esposizione maggiore di 30 anni prima del 1985 dimostrano un aumento dell’incidenza di tumore di trachea, bronchi e polmone (SIR=1,34 IC95% 1,00-1,77), statisticamente significativo, cos�� come per coloro che son stati classificati a rischio medio di esposizione e assunti precedentemente al 1974 (SIR=1,46 IC95% 1,06-1,95) e per coloro che sono stati classificati ad alto rischio e assunti nel periodo 1985-1994 (SIR=5,68 IC95% 1,17-16,60). Nell’intera coorte si registra un significativo aumento di incidenza di tumore dello stomaco in coloro classificati a alto rischio (SIR= 1,47 IC95% 1,05-2,00), mentre l’incidenza di tumore del pancreas vede un incremento dell’incidenza in coloro classificati a medio rischio di esposizione ad asbesto (SIR= 2,21 IC95% 1,21-3,72). Il sottogruppo le cui informazioni risultavano mancanti mostrano un incremento del SIR, borderline ma non significativo, per tumore del colon-retto (SIR= 1,29 IC95% 0,94-1,73). Emerge un significativo aumento dell’incidenza del tumore dello stomaco in coloro con un periodo di esposizione precedente al 1985 compreso tra 10 e 20 anni (SIR= 1,71 IC95% 1,12-2,49). Anche i SIR per il tumore del pancreas vedono un incremento statisticamente significativo in coloro che hanno una durata di esposizione precedente al 1985 inferiore a 10 anni e maggiore di 30: rispettivamente i SIR sono stati di 2,23 (IC95% 1,07-4,10) e 2,57 (IC95% 1,53-4,07). I risultati relativi ai confronti interni non mostrano significatività statistica. Conclusioni. I risultati indicano che nella coorte degli uomini ex- lavoratori dei cantieri navali di Monfalcone vi era un incremento forte e statisticamente significativo della mortalità e dell’incidenza di tumore maligno della pleura rispetto sia alla popolazione generale del FVG sia a quella dell’Italia. Eccessi di mortalità ed incidenza sono stati rilevati talvolta anche per il tumore di trachea, bronchi e polmone, quando le analisi sono state condotte stratificando la coorte in gruppi omogenei di rischio. Il più elevato eccesso rispetto all’atteso sia della mortalità per tumore maligno della pleura e del tumore del polmone, che dell’incidenza, si osservava nei lavoratori con mansioni a rischio medio, seguito dal gruppo con mansioni a rischio elevato. I Risultati riguardanti l’incidenza dei tumori delle principali sedi digestive ha visto nell’intera coorte un aumento significativo dei SIR per tumore dello stomaco e del pancreas, anche quando condotti per sottogruppi. Tuttavia le stime relative agli outcome diversi dal tumore maligno della pleura e del tumore del polmone devono essere interpretate con cautela. Le associazioni positive riscontrate tramite confronti interni non presentano significatività statistica.

Applicazione della spettrometria di massa MALDI-TOF in microbiologia clinica

Riassunto La spettrometria di massa (MS) nata negli anni ’70 trova oggi, grazie alla tecnologia Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization-Time of Flight (MALDI-TOF), importanti applicazioni in diversi settori: biotecnologico (per la caratterizzazione ed il controllo di qualità di proteine ricombinanti ed altre macromolecole), medico–clinico (per la diagnosi di laboratorio di malattie e per lo sviluppo di nuovi trattamenti terapeutici mirati), alimentare ed ambientale. Negli ultimi anni, questa tecnologia è diventata un potente strumento anche per la diagnosi di laboratorio in microbiologia clinica, rivoluzionando il flusso di lavoro per una rapida identificazione di batteri e funghi, sostituendo l’identificazione fenotipica convenzionale basata su saggi biochimici. Attualmente mediante MALDI-TOF MS sono possibili due diversi approcci per la caratterizzazione dei microrganismi: (1) confronto degli spettri (“mass spectra”) con banche dati contenenti profili di riferimento (“database fingerprints���) e (2) “matching” di bio-marcatori con banche dati proteomiche (“proteome database”). Recentemente, la tecnologia MALDI-TOF, oltre alla sua applicazione classica nell’identificazione di microrganismi, è stata utilizzata per individuare, indirettamente, meccanismi di resistenza agli antibiotici. Primo scopo di questo studio è stato verificare e dimostrare l’efficacia identificativa della metodica MALDI-TOF MS mediante approccio di comparazione degli spettri di differenti microrganismi di interesse medico per i quali l’identificazione risultava impossibile a causa della completa assenza o presenza limitata, di spettri di riferimento all’interno della banca dati commerciale associata allo strumento. In particolare, tale scopo è stato raggiunto per i batteri appartenenti a spirochete del genere Borrelia e Leptospira, a miceti filamentosi (dermatofiti) e protozoi (Trichomonas vaginalis). Secondo scopo di questo studio è stato valutare il secondo approccio identificativo basato sulla ricerca di specifici marcatori per differenziare parassiti intestinali di interesse medico per i quali non è disponibile una banca dati commerciale di riferimento e la sua creazione risulterebbe particolarmente difficile e complessa, a causa della complessità del materiale biologico di partenza analizzato e del terreno di coltura nei quali questi protozoi sono isolati. Terzo ed ultimo scopo di questo studio è stata la valutazione dell’applicabilità della spettrometria di massa con tecnologia MALDI-TOF per lo studio delle resistenze batteriche ai carbapenemi. In particolare, è stato messo a punto un saggio di idrolisi dei carbapenemi rilevata mediante MALDI-TOF MS in grado di determinare indirettamente la produzione di carbapenemasi in Enterobacteriaceae. L’efficacia identificativa della metodica MALDI-TOF mediante l’approccio di comparazione degli spettri è stata dimostrata in primo luogo per batteri appartenenti al genere Borrelia. La banca dati commerciale dello strumento MALDI-TOF MS in uso presso il nostro laboratorio includeva solo 3 spettri di riferimento appartenenti alle specie B. burgdorferi ss, B. spielmani e B. garinii. L’implementazione del “database” con specie diverse da quelle già presenti ha permesso di colmare le lacune identificative dovute alla mancanza di spettri di riferimento di alcune tra le specie di Borrelia più diffuse in Europa (B. afzelii) e nel mondo (come ad esempio B. hermsii, e B. japonica). Inoltre l’implementazione con spettri derivanti da ceppi di riferimento di specie già presenti nel “database” ha ulteriormente migliorato l’efficacia identificativa del sistema. Come atteso, il ceppo di isolamento clinico di B. lusitaniae (specie non presente nel “database”) è stato identificato solo a livello di genere corroborando, grazie all’assenza di mis-identificazione, la robustezza della “nuova” banca dati. I risultati ottenuti analizzando i profili proteici di ceppi di Borrelia spp. di isolamento clinico, dopo integrazione del “database” commerciale, indicano che la tecnologia MALDI-TOF potrebbe essere utilizzata come rapida, economica ed affidabile alternativa ai metodi attualmente utilizzati per identificare ceppi appartenenti a questo genere. Analogamente, per il genere Leptospira dopo la creazione ex-novo della banca dati “home-made”, costruita con i 20 spettri derivati dai 20 ceppi di riferimento utilizzati, è stata ottenuta una corretta identificazione a livello di specie degli stessi ceppi ri-analizzati in un esperimento indipendente condotto in doppio cieco. Il dendrogramma costruito con i 20 MSP-Spectra implementati nella banca dati è formato da due rami principali: il primo formato dalla specie non patogena L. biflexa e dalla specie a patogenicità intermedia L. fainei ed il secondo che raggruppa insieme le specie patogene L. interrogans, L. kirschneri, L. noguchii e L. borgpetersenii. Il secondo gruppo è ulteriormente suddiviso in due rami, contenenti rispettivamente L. borgpetersenii in uno e L. interrogans, L. kirschneri e L. noguchii nell’altro. Quest’ultimo, a sua volta, è suddiviso in due rami ulteriori: il primo comprendente la sola specie L. noguchii, il secondo le specie L. interrogans e L. kirshneri non separabili tra loro. Inoltre, il dendrogramma costruito con gli MSP-Spectra dei ceppi appartenenti ai generi Borrelia e Leptospira acquisiti in questo studio, e appartenenti al genere Brachyspira (implementati in un lavoro precedentemente condotto) mostra tre gruppi principali separati tra loro, uno per ogni genere, escludendo possibili mis-identificazioni tra i 3 differenti generi di spirochete. Un’analisi più approfondita dei profili proteici ottenuti dall’analisi ha mostrato piccole differenze per ceppi della stessa specie probabilmente dovute ai diversi pattern proteici dei distinti sierotipi, come confermato dalla successiva analisi statistica, che ha evidenziato picchi sierotipo-specifici. È stato, infatti, possibile mediante la creazione di un modello statistico dedicato ottenere un “pattern” di picchi discriminanti in grado di differenziare a livello di sierotipo sia i ceppi di L. interrogans sia i ceppi di L. borgpetersenii saggiati, rispettivamente. Tuttavia, non possiamo concludere che i picchi discriminanti da noi riportati siano universalmente in grado di identificare il sierotipo dei ceppi di L. interrogans ed L. borgpetersenii; i picchi trovati, infatti, sono il risultato di un’analisi condotta su uno specifico pannello di sierotipi. È stato quindi dimostrato che attuando piccoli cambiamenti nei parametri standardizzati come l’utilizzo di un modello statistico e di un programma dedicato applicato nella routine diagnostica è possibile utilizzare la spettrometria di massa MALDI-TOF per una rapida ed economica identificazione anche a livello di sierotipo. Questo può significativamente migliorare gli approcci correntemente utilizzati per monitorare l’insorgenza di focolai epidemici e per la sorveglianza degli agenti patogeni. Analogamente a quanto dimostrato per Borrelia e Leptospira, l’implementazione della banca dati dello spettrometro di massa con spettri di riferimento di miceti filamentosi (dermatofiti) si è rilevata di particolare importanza non solo per l’identificazione di tutte le specie circolanti nella nostra area ma anche per l’identificazione di specie la cui frequenza nel nostro Paese è in aumento a causa dei flussi migratori dalla zone endemiche (M. audouinii, T. violaceum e T. sudanense). Inoltre, l’aggiornamento del “database” ha consentito di superare la mis-identificazione dei ceppi appartenenti al complesso T. mentagrophytes (T. interdigitale e T. mentagrophytes) con T. tonsurans, riscontrata prima dell’implementazione della banca dati commerciale. Il dendrogramma ottenuto dai 24 spettri implementati appartenenti a 13 specie di dermatofiti ha rivelato raggruppamenti che riflettono quelli costruiti su base filogenetica. Sulla base dei risultati ottenuti mediante sequenziamento della porzione della regione ITS del genoma fungino non è stato possibile distinguere T. interdigitale e T. mentagrophytes, conseguentemente anche gli spettri di queste due specie presentavano picchi dello stesso peso molecoalre. Da sottolineare che il dendrogramma costruito con i 12 profili proteici già inclusi nel database commerciale e con i 24 inseriti nel nuovo database non riproduce l’albero filogenetico per alcune specie del genere Tricophyton: gli spettri MSP già presenti nel database e quelli aggiunti delle specie T. interdigitale e T. mentagrophytes raggruppano separatamente. Questo potrebbe spiegare le mis-identificazioni di T. interdigitale e T. mentagrophytes con T. tonsurans ottenute prima dell’implementazione del database. L’efficacia del sistema identificativo MALDI-TOF è stata anche dimostrata per microrganismi diversi da batteri e funghi per i quali la metodica originale è stata sviluppata. Sebbene tale sistema identificativo sia stato applicato con successo a Trichomonas vaginalis è stato necessario apportare modifiche nei parametri standard previsti per l’identificazione di batteri e funghi. Le interferenze riscontrate tra i profili proteici ottenuti per i due terreni utilizzati per la coltura di questo protozoo e per i ceppi di T. vaginalis hanno, infatti, reso necessario l’utilizzo di nuovi parametri per la creazione degli spettri di riferimento (MSP-Spectra). L’importanza dello sviluppo del nuovo metodo risiede nel fatto che è possibile identificare sulla base del profilo proteico (e non sulla base di singoli marcatori) microorganismi cresciuti su terreni complessi che potrebbero presentare picchi nell'intervallo di peso molecolare utilizzato a scopo identificativo: metaboliti, pigmenti e nutrienti presenti nel terreno possono interferire con il processo di cristallizzazione e portare ad un basso punteggio identificativo. Per T. vaginalis, in particolare, la “sottrazione” di picchi dovuti a molecole riconducibili al terreno di crescita utilizzato, è stata ottenuta escludendo dall'identificazione l'intervallo di peso molecolare compreso tra 3-6 kDa, permettendo la corretta identificazione di ceppi di isolamento clinico sulla base del profilo proteico. Tuttavia, l’elevata concentrazione di parassita richiesta (105 trofozoiti/ml) per una corretta identificazione, difficilmente ottenibile in vivo, ha impedito l’identificazione di ceppi di T. vaginalis direttamente in campioni clinici. L’approccio identificativo mediante individuazione di specifici marcatori proteici (secondo approccio identificativo) è stato provato ed adottato in questo studio per l’identificazione e la differenziazione di ceppi di Entamoeba histolytica (ameba patogena) ed Entamoeba dispar (ameba non patogena), specie morfologiacamente identiche e distinguibili solo mediante saggi molecolari (PCR) aventi come bersaglio il DNA-18S, che codifica per l’RNA della subunità ribosomiale minore. Lo sviluppo di tale applicazione ha consentito di superare l’impossibilità della creazione di una banca dati dedicata, a causa della complessità del materiale fecale di partenza e del terreno di coltura impiagato per l’isolamento, e di identificare 5 picchi proteici in grado di differenziare E. histolytica da E. dispar. In particolare, l’analisi statistica ha mostrato 2 picchi specifici per E. histolytica e 3 picchi specifici per E. dispar. L’assenza dei 5 picchi discriminanti trovati per E. histolytica e E. dispar nei profili dei 3 differenti terreni di coltura utilizzati in questo studio (terreno axenico LYI-S-2 e terreno di Robinson con e senza E. coli) permettono di considerare questi picchi buoni marcatori in grado di differenziare le due specie. La corrispondenza dei picchi con il PM di due specifiche proteine di E. histolytica depositate in letteratura (Amoebapore A e un “unknown putative protein” di E. histolytica ceppo di riferimento HM-1:IMSS-A) conferma la specificità dei picchi di E. histolytica identificati mediante analisi MALDI-TOF MS. Lo stesso riscontro non è stato possibile per i picchi di E. dispar in quanto nessuna proteina del PM di interesse è presente in GenBank. Tuttavia, va ricordato che non tutte le proteine E. dispar sono state ad oggi caratterizzate e depositate in letteratura. I 5 marcatori hanno permesso di differenziare 12 dei 13 ceppi isolati da campioni di feci e cresciuti in terreno di Robinson confermando i risultati ottenuti mediante saggio di Real-Time PCR. Per un solo ceppo di isolamento clinico di E. histolytica l’identificazione, confermata mediante sequenziamento della porzione 18S-rDNA, non è stata ottenuta mediante sistema MALDI-TOF MS in quanto non sono stati trovati né i picchi corrispondenti a E. histolytica né i picchi corrispondenti a E. dispar. Per questo ceppo è possibile ipotizzare la presenza di mutazioni geno/fenotipiche a livello delle proteine individuate come marcatori specifici per E. histolytica. Per confermare questa ipotesi sarebbe necessario analizzare un numero maggiore di ceppi di isolamento clinico con analogo profilo proteico. L’analisi condotta a diversi tempi di incubazione del campione di feci positivo per E. histolytica ed E. dipar ha mostrato il ritrovamento dei 5 picchi discriminanti solo dopo 12 ore dall’inoculo del campione nel terreno iniziale di Robinson. Questo risultato suggerisce la possibile applicazione del sistema MALDI-TOF MS per identificare ceppi di isolamento clinico di E. histolytica ed E. dipar nonostante la presenza di materiale fecale che materialmente può disturbare e rendere difficile l’interpretazione dello spettro ottenuto mediante analisi MALDI-TOF MS. Infine in questo studio è stata valutata l’applicabilità della tecnologia MALDI-TOF MS come saggio fenotipico rapido per la determinazione di ceppi produttori di carbapenemasi, verificando l'avvenuta idrolisi del meropenem (carbapeneme di riferimento utilizzato in questo studio) a contatto con i ceppi di riferimento e ceppi di isolamento clinico potenzialmente produttori di carbapenemasi dopo la messa a punto di un protocollo analitico dedicato. Il saggio di idrolisi del meropenem mediante MALDI-TOF MS ha dimostrato la presenza o l’assenza indiretta di carbapenemasi nei 3 ceppi di riferimento e nei 1219 (1185 Enterobacteriaceae e 34 non-Enterobacteriaceae) ceppi di isolamento clinico inclusi nello studio. Nessuna interferenza è stata riscontrata per i ceppi di Enterobacteriaceae variamente resistenti ai tre carbapenemi ma risultati non produttori di carbapenemasi mediante i saggi fenotipici comunemente impiegati nella diagnostica routinaria di laboratorio: nessuna idrolisi del farmaco è stata infatti osservata al saggio di idrolisi mediante MALDI-TOF MS. In un solo caso (ceppo di K. pneumoniae N°1135) è stato ottenuto un profilo anomalo in quanto presenti sia i picchi del farmaco intatto che quelli del farmaco idrolizzato. Per questo ceppo resistente ai tre carbapenemi saggiati, negativo ai saggi fenotipici per la presenza di carbapenemasi, è stata dimostrata la presenza del gene blaKPC mediante Real-Time PCR. Per questo ceppo si può ipotizzare la presenza di mutazioni a carico del gene blaKPC che sebbene non interferiscano con il suo rilevamento mediante PCR (Real-Time PCR positiva), potrebbero condizionare l’attività della proteina prodotta (Saggio di Hodge modificato e Test di Sinergia negativi) riducendone la funzionalità come dimostrato, mediante analisi MALDI-TOF MS, dalla presenza dei picchi relativi sia all’idrolisi del farmaco sia dei picchi relativi al farmaco intatto. Questa ipotesi dovrebbe essere confermata mediante sequenziamento del gene blaKPC e successiva analisi strutturale della sequenza amminoacidica deducibile. L’utilizzo della tecnologia MALDI-TOF MS per la verifica dell’avvenuta idrolisi del maropenem è risultato un saggio fenotipico indiretto in grado di distinguere, al pari del test di Hodge modificato impiegato comunemente nella routine diagnostica in microbiologia, un ceppo produttore di carbapenemasi da un ceppo non produttore sia per scopi diagnostici che per la sorveglianza epidemiologica. L’impiego del MALDI-TOF MS ha mostrato, infatti, diversi vantaggi rispetto ai metodi convenzionali (Saggio di Hodge modificato e Test di Sinergia) impiegati nella routine diagnostica di laboratorio i quali richiedono personale esperto per l’interpretazione del risultato e lunghi tempi di esecuzione e di conseguenza di refertazione. La semplicità e la facilità richieste per la preparazione dei campioni e l’immediata acquisizione dei dati rendono questa tecnica un metodo accurato e rapido. Inoltre, il metodo risulta conveniente dal punto di vista economico, con un costo totale stimato di 1,00 euro per ceppo analizzato. Tutte queste considerazioni pongono questa metodologia in posizione centrale in ambito microbiologico anche nel caso del rilevamento di ceppi produttori di carbapenemasi. Indipendentemente dall’approccio identificativo utilizzato, comparato con i metodi convenzionali il MALDI-TOF MS conferisce in molti casi un guadagno in termini di tempo di lavoro tecnico (procedura pre-analititca per la preparazione dei campioni) e di tempo di ottenimento dei risultati (procedura analitica automatizzata). Questo risparmio di tempo si accentua quando sono analizzati in contemporanea un maggior numero di isolati. Inoltre, la semplicità e la facilità richieste per la preparazione dei campioni e l’immediata acquisizione dei dati rendono questo un metodo di identificazione accurato e rapido risultando più conveniente anche dal punto di vista economico, con un costo totale di 0,50 euro (materiale consumabile) per ceppo analizzato. I risultati ottenuti dimostrano che la spettrometria di massa MALDI-TOF sta diventando uno strumento importante in microbiologia clinica e sperimentale, data l’elevata efficacia identificativa, grazie alla disponibilità sia di nuove banche dati commerciali sia di aggiornamenti delle stesse da parte di diversi utenti, e la possibilità di rilevare con successo anche se in modo indiretto le antibiotico-resistenze.

Valutazione del Beta Carba test per il rapido rilevamento di enterobatteri produttori di carbapenemasi (CPE)

L’antibiotico resistenza negli enterobatteri produttori di carbapenemasi (CPE) rappresenta una problematica emergente in sanità pubblica, dato che le opzioni alternative per il trattamento di pazienti infetti sono limitate. L’andamento epidemiologico di CPE a livello globale appare ad oggi molto variegato con differenze significative tra paesi. In Italia la diffusione di K. pneumoniae produttrice di KPC è endemica ed è stimata essere un terzo (32,9%) delle infezioni invasive (sangue e liquor) da K. pneumoniae. Pertanto, diventa indispensabile implementare gli studi di farmaco-resistenza per valutare e ridurre il potenziale di crescita di tali microrganismi. Questo studio presenta come fine la valutazione del Beta Carba test, metodo cromogeno, per il rapido rilevamento di CPE in confronto con il metodo standard di riferimento. Lo studio è stato svolto presso l’U.O. Microbiologia AUSL della Romagna ed è di natura retrospettiva, di tipo esclusivamente qualitativo. Sono stati analizzati 412 campioni completamente anonimizzati: 50 emocolture, 250 urine e 112 tamponi rettali di sorveglianza. La valutazione del test è stata condotta sia direttamente a partire dalle matrici biologiche (emocolture e urinocolture positive) che dalle colonie isolate di CPE da tamponi rettali di sorveglianza, urine o emocolture. I risultati sperimentali ottenuti in vitro con il β Carba, mostrano una totale concordanza con i metodi sia fenotipici che genotipici utilizzati come riferimento: sono state ottenute sensibilità e specificità del 100%. Inoltre, a favore del test si inserisce il parametro fondamentale della rapidità, consentendo quindi una celere rilevazione di CPE direttamente su campioni clinici con un tempo di risposta piuttosto veloce e affidabile pari a 15-30 minuti. In definitiva, grazie alla performance dimostrata in vitro, il test può rappresentare un valido strumento per arginare e limitare lo spreading di CPE, svolgendo un buon ruolo nella gestione dei pazienti infetti.

Archivio italiano di anatomia e di embriologia.

"Organo della Società Italiana di Anatomia."