Uniformed Services University of the Health Sciences, F. Edward Hʹebert School of Medicine.

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Annual report - National Institute of Environmental Health Sciences.

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Evaluation of the cytotoxic and cytostatic activities of medicinal plants used by Peruvian healers against cancer-related symptoms

Twelve plants used medicinally in Callejon de Huaylas, Department of Ancash, northeastern Peru were selected and screened in vitro for cytotoxic and cytostatic activities. Traditional preparations, aqueous extracts and organic extracts (methanol:dimethyl chloride) were tested against murine leukemia P388 cells using flow cytometry. Seventy-five percent or more of the traditional and aqueous extracts were cytostatic at concentrations of 1mg/ml. For organic extracts, cytostatic activity ranged from 8.3% (at 6.25 μg/ml) to 58.3% (at 100 μg/ml). Quinchamalium procumbens, Ophryosporus chilca and Baccharis genistelloides showed strong activity. Extracts of Brachyotum rostratum, Monnina salicifolia, and Orthrosanthus chimboracensis were particularly interesting, since they were cytostatic but not cytotoxic at concentrations of 0.5 mg/ml. These Andean plants merit further analysis. The high percentage of activity found among the traditional preparations suggests that the traditional medical knowledge of Callejon de Huaylas healers deserves respect and merits further research. ^

Synthesis and Biological Evaluation of Novel Folic Acid Receptor-Targeted, β-Cyclodextrin-Based Drug Complexes for Cancer Treatment

Drug targeting is an active area of research and nano-scaled drug delivery systems hold tremendous potential for the treatment of neoplasms. In this study, a novel cyclodextrin (CD)-based nanoparticle drug delivery system has been assembled and characterized for the therapy of folate receptor-positive [FR(+)] cancer. Water-soluble folic acid (FA)-conjugated CD carriers (FACDs) were successfully synthesized and their structures were confirmed by 1D/2D nuclear magnetic resonance (NMR), matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometer (MALDI-TOF-MS), high performance liquid chromatography (HPLC), Fourier transform infrared spectroscopy (FTIR), and circular dichroism. Drug complexes of adamatane (Ada) and cytotoxic doxorubicin (Dox) with FACD were readily obtained by mixed solvent precipitation. The average size of FACD-Ada-Dox was 1.5–2.5 nm. The host-guest association constant Ka was 1,639 M−1 as determined by induced circular dichroism and the hydrophilicity of the FACDs was greatly enhanced compared to unmodified CD. Cellular uptake and FR binding competitive experiments demonstrated an efficient and preferentially targeted delivery of Dox into FR-positive tumor cells and a sustained drug release profile was seen in vitro. The delivery of Dox into FR(+) cancer cells via endocytosis was observed by confocal microscopy and drug uptake of the targeted nanoparticles was 8-fold greater than that of non-targeted drug complexes. Our docking results suggest that FA, FACD and FACD-Ada-Dox could bind human hedgehog interacting protein that contains a FR domain. Mouse cardiomyocytes as well as fibroblast treated with FACD-Ada-Dox had significantly lower levels of reactive oxygen species, with increased content of glutathione and glutathione peroxidase activity, indicating a reduced potential for Dox-induced cardiotoxicity. These results indicate that the targeted drug complex possesses high drug association and sustained drug release properties with good biocompatibility and physiological stability. The novel FA-conjugated β-CD based drug complex might be promising as an anti-tumor treatment for FR(+) cancer.

Reduced Androgen Receptor Expression Accelerates the Onset of ERBB2 Induced Breast Tumors in Female Mice

Androgen receptor (AR) is commonly expressed in both the epithelium of normal mammary glands and in breast cancers. AR expression in breast cancers is independent of estrogen receptor alpha (ERα) status and is frequently associated with overexpression of the ERBB2 oncogene. AR signaling effects on breast cancer progression may depend on ERα and ERBB2 status. Up to 30% of human breast cancers are driven by overactive ERBB2 signaling and it is not clear whether AR expression affects any steps of tumor progression in this cohort of patients. To test this, we generated mammary specific Ar depleted mice (MARKO) by combining the floxed allele of Ar with the MMTV-cre transgene on an MMTV-NeuNT background and compared them to littermate MMTV-NeuNT, Arfl/+ control females. Heterozygous MARKO females displayed reduced levels of AR in mammary glands with mosaic AR expression in ductal epithelium. The loss of AR dramatically accelerated the onset of MMTV-NeuNT tumors in female MARKO mice. In this report we show that accelerated MMTV-NeuNT-dependent tumorigenesis is due specifically to the loss of AR, as hormonal levels, estrogen and progesterone receptors expression, and MMTV-NeuNT expression were similar between MARKO and control groups. MMTV-NeuNT induced tumors in both cohorts displayed distinct loss of AR in addition to ERα, PR, and the pioneer factor FOXA1. Erbb3 mRNA levels were significantly elevated in tumors in comparison to normal mammary glands. Thus the loss of AR in mouse mammary epithelium accelerates malignant transformation rather than the rate of tumorigenesis.

Reverse Engineering of Modified Genes by Bayesian Network Analysis Defines Molecular Determinants Critical to the Development of Glioblastoma

In this study we have identified key genes that are critical in development of astrocytic tumors. Meta-analysis of microarray studies which compared normal tissue to astrocytoma revealed a set of 646 differentially expressed genes in the majority of astrocytoma. Reverse engineering of these 646 genes using Bayesian network analysis produced a gene network for each grade of astrocytoma (Grade I–IV), and ‘key genes’ within each grade were identified. Genes found to be most influential to development of the highest grade of astrocytoma, Glioblastoma multiforme were: COL4A1, EGFR, BTF3, MPP2, RAB31, CDK4, CD99, ANXA2, TOP2A, and SERBP1. All of these genes were up-regulated, except MPP2 (down regulated). These 10 genes were able to predict tumor status with 96–100% confidence when using logistic regression, cross validation, and the support vector machine analysis. Markov genes interact with NFkβ, ERK, MAPK, VEGF, growth hormone and collagen to produce a network whose top biological functions are cancer, neurological disease, and cellular movement. Three of the 10 genes - EGFR, COL4A1, and CDK4, in particular, seemed to be potential ‘hubs of activity’. Modified expression of these 10 Markov Blanket genes increases lifetime risk of developing glioblastoma compared to the normal population. The glioblastoma risk estimates were dramatically increased with joint effects of 4 or more than 4 Markov Blanket genes. Joint interaction effects of 4, 5, 6, 7, 8, 9 or 10 Markov Blanket genes produced 9, 13, 20.9, 26.7, 52.8, 53.2, 78.1 or 85.9%, respectively, increase in lifetime risk of developing glioblastoma compared to normal population. In summary, it appears that modified expression of several ‘key genes’ may be required for the development of glioblastoma. Further studies are needed to validate these ‘key genes’ as useful tools for early detection and novel therapeutic options for these tumors.

Reactive Oxygen Species via Redox Signaling to PI3K/AKT Pathway Contribute to the Malignant Growth of 4-Hydroxy Estradiol-Transformed Mammary Epithelial Cells

The purpose of this study was to investigate the effects of 17-β-estradiol (E2)-induced reactive oxygen species (ROS) on the induction of mammary tumorigenesis. We found that ROS-induced by repeated exposures to 4-hydroxy-estradiol (4-OH-E2), a predominant catechol metabolite of E2, caused transformation of normal human mammary epithelial MCF-10A cells with malignant growth in nude mice. This was evident from inhibition of estrogen-induced breast tumor formation in the xenograft model by both overexpression of catalase as well as by co-treatment with Ebselen. To understand how 4-OH-E2 induces this malignant phenotype through ROS, we investigated the effects of 4-OH-E2 on redox-sensitive signal transduction pathways. During the malignant transformation process we observed that 4-OH-E2 treatment increased AKT phosphorylation through PI3K activation. The PI3K-mediated phosphorylation of AKT in 4-OH-E2-treated cells was inhibited by ROS modifiers as well as by silencing of AKT expression. RNA interference of AKT markedly inhibited 4-OH-E2-induced in vitro tumor formation. The expression of cell cycle genes, cdc2, PRC1 and PCNA and one of transcription factors that control the expression of these genes – nuclear respiratory factor-1 (NRF-1) was significantly up-regulated during the 4-OH-E2-mediated malignant transformation process. The increased expression of these genes was inhibited by ROS modifiers as well as by silencing of AKT expression. These results indicate that 4-OH-E2-induced cell transformation may be mediated, in part, through redox-sensitive AKT signal transduction pathways by up-regulating the expression of cell cycle genes cdc2, PRC1 and PCNA, and the transcription factor – NRF-1. In summary, our study has demonstrated that: (i) 4-OH-E2 is one of the main estrogen metabolites that induce mammary tumorigenesis and (ii) ROS-mediated signaling leading to the activation of PI3K/AKT pathway plays an important role in the generation of 4-OH-E2-induced malignant phenotype of breast epithelial cells. In conclusion, ROS are important signaling molecules in the development of estrogen-induced malignant breast lesions.

Iowa State University : premedical and health sciences, 2005

Includes information on Premedical and Health Sciences programs available at Iowa State University.

Clustering of variables with a three-way approach for health sciences

© 2014 Cises This work is distributed with License Creative Commons Attribution-Non commercial-No derivatives 4.0 International (CC BY-BC-ND 4.0)

Lien entre l'hémostase et le développement néoplasique : rôle spécifique du facteur tissulaire et de l'inhibiteur du facteur tissulaire

Il est reconnu, depuis une centaine d’années, que des désordres de la coagulation, regroupés sous le terme de coagulopathies, sont souvent associés au développement néoplasique. Pendant de nombreuses années, ces coagulopathies furent souvent reconnues comme une simple conséquence du développement du cancer. D’ailleurs, pour les cliniciens, l’apparition de ces anomalies sanguines constitue souvent le premier signe clinique d’un cancer occulte. Toutefois, l’étude approfondie du lien existant entre le système hémostatique et le cancer indique que différents facteurs hémostatiques vont interagir avec soit l’environnement tumoral ou soit la tumeur elle-même et influencer le développement du cancer. Au cours de nos travaux, nous avons porté une attention particulière à deux protéines jouant un rôle primordial dans l’hémostase. Le facteur tissulaire (TF) et l’inhibiteur du facteur tissulaire (TFPI) peuvent jouer des rôles pro- ou anti-néoplasique, et ce indépendamment de leurs fonctions hémostatiques normales. Dans le premier volet de cette thèse, nous avons étudié les propriétés antiangiogéniques de TFPI. L’angiogenèse, soit la formation de nouveaux vaisseaux sanguins à partir du réseau pré-existant, est reconnue comme étant une étape clée du développement tumoral. D’après nos travaux, le TFPI peut inhiber la formation de structures de type capillaire des cellules endothéliales (CEs) de la veine ombilicale humaine (HUVEC), et ce à une IC 50 de 5 nM, soit la concentration physiologique de l’inhibiteur. De plus, le TFPI bloque la migration des cellules endothéliales lorsque ces dernières sont stimulées par la sphingosine-1-phosphate (S1P), une molécule relâchée lors de l’activation des plaquettes sanguines. Cette inhibition de la migration cellulaire s’explique par l’effet du TFPI sur l’adhésion des CEs. En effet, TFPI inhibe la phosphorylation de deux protéines clées participant à la formation des complexes d’adhésion focales soit FAK (focal adhesion kinase) et PAX (paxilin). L’inhibition de ces deux protéines suggère qu’il y ait une réorganisation des complexes focaux, pouvant expliquer la perte d’adhérence. Finalement, des études de microscopie confocale démontrent que les cellules traitées au TFPI changent de morphologie au niveau du cytosquelette d’actine provoquant une désorganisation des structures migratoires (pseudopodes). Les effets du TFPI au niveau de la migration, de l’adhésion et de la morphologie cellulaire sont strictement spécifiques aux cellules endothéliales humaines, puisque aucun n’effet n’est observé en traitant des cellules cancéreuses de glioblastomes (GB) humains, qui sont normalement des tumeurs hautement vascularisées. En résumé, cette première étude démontre que le TFPI est un inhibiteur de l’angiogenèse. Dans le second volet de cette thèse, nous nous sommes intéressés aux différents rôles de TF, le principal activateur de la coagulation. Cette protéine est également impliquée dans le développement néoplasique et notamment celui des médulloblastomes (MB) chez l’enfant via des fonctions hémostatiques et non-hémostatiques. Nos travaux démontrent que l’expression de TF est induite par la voie de signalisation de HGF (hepatocyte growth factor) et de son récepteur Met. Cet effet de HGF/Met semble spécifique aux MB puisque HGF ne peut stimuler l’expression de TF au niveau des cellules cancéreuses de glioblastomes. TF, exprimé à la surface des cellules médulloblastiques (DAOY), est responsable de l’activité pro-thrombogénique de ces cellules, ainsi qu’un acteur important de la migration de ces cellules en réponse au facteur VIIa (FVIIa). De plus, en étudiant 18 spécimens cliniques de MB, nous avons établi un lien entre l’intensité d’expression de TF et de Met. L’importance de cette corrélation est également suggérée par l’observation que les cellules exprimant les plus forts taux de TF et de Met sont également les plus agressives en termes d’index de prolifération et de dissémination métastatiques. En résumé, ces travaux représentent le point de départ pour la mise au point de TF comme un marqueur diagnostique clinique dans les cas de tumeurs du cerveau pédiatriques. De plus, l’élucidation de la voie de signalisation moléculaire responsable de l’expression de TF permet de mieux comprendre la biologie et le fonctionnement de ces tumeurs et de relier le profil d’expression de TF aux phénotypes agressifs de la maladie. Il est reconnu que HGF peut également jouer un rôle protecteur contre l’apoptose. Dans le troisième volet de cette thèse, nous avons remarqué que cette protection est corrélée à l’expression de TF. En réduisant à néant l’expression de TF à l’aide de la technologie des ARN silencieux (siRNA), nous démontrons que HGF ne protège plus les cellules contre l’apoptose. Donc, TF médie l’activité anti-apoptotique de HGF. TF assume cette protection en inactivant la phosphorylation de p53 sur la sérine 15, empêchant ainsi la translocation de p53 au noyau. Finalement, l’expression de TF et son interaction avec le FVIIa, au niveau des cellules médulloblastiques favorise la survie de ces dernières et ce même si elles sont soumises à de fortes concentrations de médicaments couramment utilisées en cliniques. Ce troisième et dernier volet démontre l’implication de TF en tant que facteur impliqué dans la survie des cellules cancéreuses, favorisant ainsi le développement de la tumeur. Dans son ensemble, cette thèse vise à démontrer que les facteurs impliqués normalement dans des fonctions hémostatiques (TFPI et TF) peuvent contribuer à réguler le développement tumoral. Tout système physiologique et pathologique est dépendant d’un équilibre entre activateur et inhibiteur et la participation de TF et de TFPI à la régulation du développement néoplasique illustre bien cette balance délicate. Par sa contribution anti- ou pro-néoplasique le système hémostatique constitue beaucoup plus qu’une simple conséquence du cancer; il fait partie par l’action de TF des stratégies élaborées par les cellules cancéreuses pour assurer leur croissance, leur déplacement et leur survie, alors que TFPI tente de limiter la croissance tumorale en diminuant la vascularisation.

Étude de l'activité anti-cancéreuse du PCK3145, un peptide dérivé de PSP-94, sur les cancers hématologiques

Le PCK3145 est un peptide de 15 acides aminés inhibant la sécrétion de MMP-9 et démontrant une activité anti-tumorale contre le cancer de la prostate. Comme les cancers hématologiques sécrètent MMP-9, nous avons donc évalué l’effet du PCK3145 sur ces cancers. Nous avons démontré que les lignées humaines de lymphome non- Hodgkinien (LNH) SR et de myélome multiple RPMI-8226 ainsi que la lignée murine de mastocytome P815 ont une prolifération réduite suite à une exposition au PCK3145. Ce peptide diminue également la clonogénicité de ces cellules. In vivo, le PCK3145 diminue significativement la croissance des tumeurs sous-cutanées P815 comparativement au PBS (p<0.001) et aux peptides contrôles (« scrambled peptide » (p<0.05) et PCK5266 (p<0.01)). De plus, le traitement au PCK3145 diminue le nombre de métastases au niveau du foie par rapports aux contrôles (p<0.05). Les niveaux de MMP-9 dans le sang des souris traitées au PCK3145 sont similaires à ceux dans le sang des souris sans tumeur. Par contre, chez les souris recevant le PBS ou le « scrambled peptide », les niveaux de MMP-9 étaient significativement plus élevés que dans les souris sans tumeur et les souris traitées au PCK3145 (p<0.05). De surcroît, dans un modèle de xénogreffe, le PCK3145 diminue significativement la croissance des lymphomes SR par rapport au PBS (p<0.01) et au « scrambled peptide » (p<0.001). Ces résultats indiquent que le PCK3145 possède une activité anti-tumorale et pourrait représenter un agent intéressant pour le traitement de plusieurs cancers hématologiques.

Caractérisation cytogénétique et clinique des gènes de fusion impliquant MLL dans les leucémies

Le gène MLL (Mixed-Lineage Leukemia), un homologue du gène trithorax de la Drosophile, localisé à la bande chromosomique 11q23, est fréquemment réarrangé dans plusieurs types de leucémies, essentiellement suite à des translocations chromosomiques. Dans les différentes translocations chromosomiques, la partie N-terminale de MLL est fusionnée avec les séquences d’un gène partenaire. Malgré le grand nombre de partenaires de fusion rapportés, peu de fusions MLL ont été bien caractérisées sur le plan moléculaire. De plus, l’impact pronostique de plusieurs fusions moins fréquentes n’est pas bien établi. L’objectif de mon projet est de caractériser plusieurs translocations MLL qui ont été détectées dans 39 spécimens leucémiques collectés par la Banque de cellules leucémiques du Québec (www.bclq.gouv.qc.ca), et d’établir une corrélation entre les résultats de la cytogénétique et différents paramètres biologiques et cliniques des leucémies respectives. L’identification des gènes partenaires de fusion (GPF) dans notre série (30 échantillons étudiés), a révélé la fusion de MLL à un gène partenaire très récurrent dans 26 leucémies: MLLT3(AF9), AFF1(AF4), MLLT4(AF6), MLLT1(ENL), ELL; à un GPF modérément commun dans 1 leucémie : MLLT6(AF17); et à un partenaire rare de MLL dans 3 leucémies : GAS7 et AF15/CASC5 (2 cas). Nous avons poursuivi notre travail avec la caractérisation des points de cassure de deux fusions, soit MLL-ELL associée à un syndrome myéloprolifératif (une association rare), et MLL-GAS7 (une fusion rare de MLL), associée à une leucémie aiguë myéloïde. L’analyse des transcrits de fusion par RT-PCR et séquençage a révélé respectivement la fusion de l’exon 9 de MLL à l’exon 2 de ELL et des exons 7 ou 8 de MLL (deux transcrits) à l’exon 2 de GAS7. Ce travail permettra d’effectuer des études fonctionnelles et des projets de recherche translationnelle en utilisant ces spécimens de leucémies avec différents réarrangements de MLL, bien caractérisés sur le plan clinique et moléculaire.

Mécanisme d’action du PBI-1402 impliqué dans l’expansion des progéniteurs érythroïdes humains et murins

Une des complications importantes d’un traitement intensif de chimio/radio-thérapie est l’aplasie de la moelle osseuse qui peut persister longtemps même après une greffe de cellules souches. Le PBI-1402 est un petit lipide qui a été associé à la diminution de l’apoptose des neutrophiles induite par des agents cytotoxiques. Nos travaux ont démontré que la culture in vitro de progéniteurs hématopoiétiques humains en présence de PBI-1402 induit une augmentation significative du nombre de progéniteurs érythroides (PEryth) (p<0,05). En évaluant la sensibilité des PEryth à l’érythropoietine (Epo), nous avons démontré que le PBI-1402 n’a pas d’effet sensibilisateur et que les cellules répondent de façon similaire aux cellules contrôles. De plus, la combinaison de l’Epo et du « stem cell factor » avec le PBI-1402 permet de prolonger et d’augmenter l’activation d’ERK1/2 (p<0,05), un important signal mitogène. Cet effet est associé à une inhibition de l’activation de la phosphatase MKP-1 dans les cellules exposées au PBI-1402. Nous démontrons aussi la capacité du PBI-1402 à amplifier la prolifération des PEryth et sa capacité à réduire la durée et l’intensité de l’anémie dans un modèle in vivo murin. Des souris ayant reçu une dose létale d’irradiation et subi une transplantation syngénique de moelle osseuse, ont été traitées oralement avec le PBI-1402 pendant 14 jours. Ces souris démontrent une réduction significative de l’anémie post-transplantation versus les souris contrôle (p<0,05). De plus, la moelle osseuse des souris traitées au PBI-1402 présente un nombre de BFU-E et CFU-E plus élevé comparativement au contrôle. Ces résultats démontrent donc le potentiel du PBI-1402 à réduire l’anémie post-transplantation et accélérer la reconstitution érythroïde.

Implications d'AXIN2 et de l'instabilité microsatellite dans le développement des tumeurs du cortex-surrénalien

Les lésions tumorales cortico-surrénaliennes sont majoritairement des adénomes bénins et très rarement des carcinomes. Les altérations génétiques impliquées dans le développement des tumeurs cortico-surrénaliennes sporadiques, plus particulièrement au stade malin, demeurent à ce jour très peu connues. Lors de travaux récents menant à l’identification d’altérations génétiques de β-CATÉNINE nous avons constaté que plusieurs tumeurs présentaient une accumulation nucléo/cytoplasmique de la protéine β-CATÉNINE sans toutefois contenir de mutations pour ce gène. Nous avons donc émis l’hypothèse que, comme pour d’autres types de cancers, d’autres composants de la voie de signalisation Wnt/β-CATÉNINE, tel qu’AXIN2, pourrait être impliqués dans le développement des tumeurs du cortex surrénalien. De plus, plusieurs aberrations dans l’expression d’AXIN2 et de β-CATÉNINE sont associées à des tumeurs présentant de l’instabilité microsatellite dans d’autres types de cancer, notamment le cancer gastrique et colorectal. Nous avons donc étudié une cohorte de 30 adénomes, 6 carcinomes, 5 AIMAH, 3 hyperplasies ACTH-dépendante et 5 PPNAD ainsi que les lignées cellulaires de carcinomes cortico-surrénaliens humains H295R et SW13. Une étude préliminaire du statut MSI a également été réalisée sur 10 tumeurs contenant une mutation pour AXIN2 et/ou β-CATÉNINE. Nous avons trouvé des mutations d’AXIN2 dans 7% des adénomes (2/30) et 17% des carcinomes (1/6) cortico-surrénaliens. L’analyse fonctionnelle des mutations par immunohistochimie, analyse western blot et analyse de RT-PCR en temps réel a révélé une diminution de l’expression d’AXIN2 associée à cette mutation. L’analyse préliminaire MSI a démontré 1 échantillon AIMAH MSI-H, c’est-à-dire instable pour le locus BAT-25 et BAT-26 et 3 autres adénomes sécrétant de l’aldostérone instables seulement pour le locus BAT-26. Ainsi, ces travaux permirent d’identifier une nouvelle altération génétique associée au développement des tumeurs du cortex surrénalien en plus de rapporter pour la première fois la présence de MSI-H dans ce type de tumeurs.