Progetto di un circuito di condizionamento del segnale per sistemi di analisi reologica

L'elaborato riguarda il progetto di un circuito di condizionamento del segnale per sistemi di misura reologica. Il circuito è stato studiato per essere interfacciato con un sistema di misura in fase di studio all'Università di Bologna, sebbene il suo utilizzo nei sistemi di analisi nel dominio delle frequenze sia del tutto generale. Il sistema di misura esistente compie un'analisi chimico-fisica di alimenti, generalmente liquidi, in modo da caratterizzare nel dominio delle frequenze la risposta elettrica ad uno stimolo sinusoidale a frequenza variabile. In particolare, il sistema genera due segnali X(f) ed Y(f). Tuttavia, in molti casi di interesse la dinamica del segnale risulta molto piccola rispetto al range massimo del segnale. Lo scopo del circuito di condizionamento è quello di aumentare la dinamica dei segnali X(f) ed Y(f) in modo da rendere i grafici più leggibili. Tale obiettivo è stato ottenuto mediante la progettazione di un opportuno stadio di amplificazione a guadagno programmabile. Il sistema è controllato da un microcontrollore dotato di interfaccia USB con cui comunica con un PC. Le misure effettuate mostrano che il circuito progettato è in grado di amplificare correttamente la dinamica dei segnali acquisiti nel range 0-VDD.

Formulazione e messa a punto di una metodologia per il progetto di ventilatori per gallerie del vento con applicazione al "long-pipe" del laboratorio CICLoPE : analisi attraverso l'impiego di modelli matematici in MATLAB

Nell'ottica di un futuro riprogetto, totale o parziale, del ventilatore della galleria del vento del progetto CICLoPE dell'Università di Bologna, è stato messo a punto, grazie a modelli matematici di letteratura, un algoritmo per la determinazione della geometria delle pale di un fan. La procedura si basa su ipotesi di incompressibilità e assenza di vortici di estremità ed è in grado di fornire la geometria del ventilatore una volta che sono state fissate: le condizioni richieste nella sezione di test, l'efficienza del tunnel e alcune proprietà del ventilatore stesso (ad esempio tipologia di profilo aerodinamico e numero di pale). L'algoritmo è in grado di lavorare solamente con la configurazione ventilatore seguito da profili raddrizzatori, ma è in previsione un'estensione che consentirà di studiare anche la configurazione a fan controrotanti (come quella del CICLoPE). Con questo software sono state progettate numerose soluzioni diverse per studiare il legame tra rendimento e geometria del ventilatore. Inoltre sono stati individuati i parametri che permettono di ottenere una pala con rastremazione e svergolatura trascurabili, con lo scopo di abbassare i costi del manufatto. In particolare è stato dimostrato come le configurazioni con diametro della nacelle grande (superiore al 65\% del diametro della sezione di potenza) siano particolarmente adatte a fornire rendimenti alti con la minima complicatezza della pala. Per quanto riguarda l'efficienza aerodinamica del profilo, i test comparativi indicano che questo parametro influisce relativamente poco sul rendimento del macchinario ma modifica profondamente la geometria della pala. Efficienze elevate tendono, secondo lo studio, a richiedere pale estremamente rastremate e poco svergolate; questo porta a preferire l'adozione di profili mediamente efficienti ma dall'ampio intervallo operativo in termini di angolo di attacco.

Analisi statica equivalente per strutture dotate di smorzatori viscosi

L’installazione di smorzatori viscosi sulle strutture permette di dissipare l’energia che il sisma trasmette, senza provocare danni o rotture degli elementi strutturali principali. Questi dispositivi sono stati l'oggetto di numerosi lavori di ricerca dal 1980 fino ad oggi e l'efficacia nel mitigare gli effetti dell’azione sismica su strutture edilizie è stata ampiamente dimostrata. La maggior parte delle teorie scientifiche per la progettazione e l'ottimizzazione degli smorzatori si basano sofisticati algoritmi, portando talvolta a complessi procedure. L'applicazione di tali algoritmi richiede spesso competenze computazionali e di tempo eccessive. Il fine della tesi è quello di proporre un metodo pratico, cioè diretto e immediato per aiutare gli ingegneri per effettuare analisi sismiche su strutture intelaiate dotate di smorzatori viscosi e di dimensionare tali dispositivi. Tale metodo è stato l’oggetto del lavoro di ricerca scientifica trattato nell’articolo: “Equivalent Static Analyses of framed structures with added viscous dampers” di Palermo et al., 2015. Si riesce così ad estendere così il concetto di analisi statica equivalente anche per strutture dotate di smorzatori viscosi, definendo in maniera intuitiva sia le configurazioni di idealizzazione della strutture durante il sisma sia l’ idealizzazione dell’effetto del sisma sulla struttura. In questi anni di lavoro di ricerca, sono stati proposti vari metodi per il dimensionamento degli smorzatori viscosi. Tra questi, il prof. Ing. Silvestri (Silvestri et al., 2010) ha proposto un approccio progettuale diretto, chiamato "five step procedure” che mira a guidare l'ingegnere professionista, dalla scelta del target di prestazioni alle identificazioni della caratteristiche meccaniche di smorzatori viscosi trovabili in commercio. La procedura originale (Silvestri et al., 2010, Silvestri et al., 2011, Palermo et al., 2013), anche se per lo più basata su espressioni analitiche, richiede ancora lo sviluppo di analisi numeriche Time-History di modelli FEM, al fine di valutare le forze massime negli smorzatori aggiunti. Verrà spiegato e proposto un metodo semplificato (“Direct five step procedure for the dimensioning of added viscous dampers” Palermo et al., 2015) che consente ottenere direttamente, tramite una semplice formula, le forze massime degli smorzatori (spesso un parametro chiave della valutazione del costo degli smorzatori), senza eseguire simulazioni numeriche. Infine, si è applicato il metodo semplificato proposto di analisi statica equivalente per strutture equipaggiate di smorzatori viscosi ad un edificio reale.

Analisi della rete di teleriscaldamento di Corticella in presenza di utenze attive

Oggetto di questa tesi è lo studio di una rete di teleriscaldamento (TLR) preesistente, la rete di Corticella (Bo) ipotizzando la presenza di sottostazioni di scambio termico attive. Inizialmente sono state presentate le sottostazioni di scambio termico sia tradizionali che attive. Nelle tradizionali ci si è soffermato sul tipo di regolazione che può avvenire. Per quanto riguarda le sottostazioni di scambio termico attive son stati esaminati i 4 layout che permettono uno scambio termico bidirezionale di energia termica. E’ stato presentato il software IHENA (intelligent Heat Energy Network Analysis) creato dal dipartimento di ingegneria industriale, che ha permesso di effettuare le simulazioni sulla rete analizzata. Viene mostrato l’algoritmo di Todini-Pilati generalizzato dall’utilizzo delle equazioni di Darcy-Weisbach su cui si basa il motore di calcolo. Inoltre vengono presentati i vari input che è necessario inserire per ottenere il calcolo della rete. Dopo nozioni di base relative al teleriscaldamento attivo e la presentazione del software utilizzato si è passati alla vera e propria analisi della rete di teleriscaldamento. Sono state effettuate varie simulazioni per vedere l’andamento della rete di Corticella sia considerandola passiva (come nella realtà) che ipotizzandola attiva tramite l’inserimento di sottostazioni di scambio termico ative. Le analisi condotte riguardano i seguenti punti. a) E’ stata presentata la rete di Corticella cosi come è andando a studiare quindi il caso base. b) Sono state svolte delle analisi per vedere come si comportava la rete nel caso in cui venivano variati dei parametri operativi come i carichi termici richiesti dalle utenze. c) Sono stati valutati i percorsi più critici. d) Si è condotta un analisi sulla regolazione al variare delle temperature esterne. Dopo l'analisi del caso base sono state introdotte delle sottostazioni di scambio termico attive, prima solo una, e poi varie lungo determinati percorsi. Le valutazioni effettuate mettevano in primo piano gli andamenti della temperatura nei percorsi, la potenza termica generata dalla sorgente, la temperatura di ritorno in centrale e se si verificano delle problematiche sugli scambiatori di calore. In queste simulazioni sono stati valutati tutti e quattro gli schemi utilizzabili. Infine è stata effettuata un analisi comparativa tra le varie soluzioni studiate per poter mettere a confronto i casi. In particolare anche qui si sono voluti confrontare i valori di potenza spesa per il pompaggio, temperatura di ritorno in centrale e potenza termica offerta dalla sorgente.

Analisi della qualità locale per aumentare l'accuratezza nel riconoscimento di impronte digitali

Il riconoscimento di impronte digitali viene largamente utilizzato in molteplici ambiti, dai sistemi di sicurezza alle applicazioni forensi. La maggior parte dei sistemi automatici di riconoscimento si basa sull'estrazione e il confronto delle minuzie nelle impronte digitali, ma l’accuratezza di queste operazioni peggiora sensibilmente in presenza di impronte di scarsa qualità, fino ad arrivare anche a compromettere il riconoscimento stesso. In questo lavoro di tesi ci si è posto come obiettivo il miglioramento delle prestazioni di un algoritmo di estrazione delle minuzie, attraverso l’utilizzo di varie tecniche per l’analisi di qualità locale delle impronte digitali.

Modelli compartimentali per l'analisi di segnali ottenuti tramite DCE MRI per studi di perfusione epatica

Il presente lavoro di tesi si inserisce all'interno di uno studio dal titolo: "Strategia di posizionamento multi-step come approccio pragmatico per ridurre il rischio di encefalopatia epatica post-TIPS (shunt trans-giugulare porto-sistemico intraepatico) in pazienti cirrotici con ascite refrattaria". Il progetto di tesi si è concentrato sull'analisi dei segnali ottenuti tramite DCE MRI, con lo scopo di implementare in ambiente MatLab due modelli differenti (Dual input - Mono compartment e Dual input - Dual compartment) che descrivono la cinetica del tracciante all'interno del sistema vascolare epatico e valutare l'efficacia dei parametri di perfusione associati nella descrizione delle variazioni in termini di microcircolazione introdotte dall'inserimento del TIPS. Inizialmente si sono voluti valutare, tramite simulazione, gli effetti in termini di amplificazione del rumore e stima dei parametri perfusionali dell'approssimazione lineare nella conversione da intensità di segnale MR a concentrazione di mezzo di contrasto. Successivamente, sempre attraverso simulazioni, per entrambi i modelli considerati è stato scelto uno schema di model-fitting e quindi testata l'affidabilità in termini di accuratezza e precisione delle stime dei parametri ottenute in funzione del livello di rumore associato alle curve di intensità di segnale. Parallelamente all'implementazione dei modelli per la stima di parametri di perfusione, sono stati realizzati dei phantom con l'obiettivo di simulare il parenchima epatico prima e dopo l'arrivo del mezzo di contrasto e poter testare la sequenza utilizzata durante l'acquisizione dei dati su paziente. Infine sono stati considerati gli esami di DCE MRI effettuati su un campione di nove pazienti pre e post-TIPS, utilizzando per l'analisi dei segnali entrambi i modelli implementati in fase di simulazione e successivamente valutando le variazioni nel valori associati ai parametri di perfusione introdotte dall'inserimento del TIPS.

Valutazione della coordinazione motoria negli adolescenti: Analisi quantitativa mediante sensori inerziali

Introduzione: Le capacità coordinative possono essere dedotte dalle performance del movimento e possono subire un momentaneo peggioramento in seguito ad una rapida crescita in soggetti adolescenti. Attualmente la valutazione dei test motori è di tipo qualitativo o semi-quantitativo. Obiettivi: Somministrazione di test di valutazione della coordinazione motoria a soggetti adolescenti, in versione strumentata mediante sensori inerziali ed estrazione di parametri quantitativi. Valutazione della sensibilità di tali parametri ai gruppi di performance e variazione degli stessi in seguito ad uno scatto di crescita. Metodi: Ragazzi e ragazze di primo liceo (età media 15 anni) hanno indossato tre IMUs, posizionate sul tronco e attorno alle caviglie, ed hanno eseguito tre test per la valutazione della coordinazione motoria: il test della cicogna cieca, il test dell’accovacciamento, e una prova di tandem gait. Cinque mesi dopo i ragazzi cresciuti hanno ripetuto la prova di tandem gait. Risultati: I parametri scelti sono risultati sensibili alle differenze tra i gruppi di performance per due delle tre prove proposte (il test della cicogna e l’accovacciamento). Per la prova di tandem gait non sono state riscontrate differenze significative nei valori dei parametri. Conclusione: Dai risultati preliminari è emerso come i sensori inerziali possano essere utili nel guidare l’osservatore verso una valutazione oggettiva dei test motori, in particolare grazie al sensore posizionato sul tronco. Si ritiene necessario condurre prove ulteriori per standardizzare e migliorare i metodi proposti. Per la prova di tandem gait, per la quale non sono stati ottenuti risultati significativi, si suggerisce di continuare a seguire i ragazzi nella crescita, ed eventualmente aggiungere un task cognitivo alla prova.

Analisi di paternità sulla specie Anguilla anguilla con l'utilizzo di marcatori loci microsatelliti

L’anguilla europea, Anguilla anguilla, è una specie gravemente minacciata, sia da impatti diretti legati al sovrasfruttamento della specie a tutti gli stadi del ciclo vitale, che indiretti come l’urbanizzazione costiera e la perdita di habitat lagunari. Negli ultimi 45 anni è stata documentata una riduzione del tasso di reclutamento di anguilla europea del 90%. Lo scopo di questo studio è stato approfondire le modalità riproduttive di A. anguilla per via indiretta, attraverso un’analisi di paternità. Il Centro di ricerca universitario di Cesenatico (Laboratori di Acquacoltura ed Igiene delle Produzioni Ittiche – Università di Bologna) ha avviato le prime sperimentazioni su A. anguilla, al fine di mettere a punto un protocollo di riproduzione artificiale. Nell’estate 2015 i ricercatori hanno ottenuto sette riproduzioni spontanee in ambiente controllato, da queste sono state campionate casualmente e genotipizzate circa 40 larve per ogni mandata riproduttiva e i relativi riproduttori per condurre l’analisi di paternità. In ogni riproduzione è stata utilizzata sempre e soltanto una femmina e tre o quattro maschi; le analisi genetiche, condotte utilizzando 9 loci microsatelliti, si sono focalizzate sull’individuazione dei padri e l’assegnamento di paternità è avvenuto con un livello di confidenza medio dell’89%. Dalle analisi effettuate è emerso che: 1) i maschi di questa specie, precedentemente sottoposti a stimolazioni ormonali per indurne la riproduzione e la fertilità, sono in grado di partecipare con successo a più di una riproduzione; 2) più esemplari riescono a fecondare gli ovociti di una sola femmina e sembrano stabilirsi modelli gerarchici di dominanza in quanto si è osservato generalmente che un maschio prevale sugli altri, generando da solo più del 50% della prole. Questo studio pilota rappresenta, quindi, un punto di partenza per approfondimenti futuri sulle modalità riproduttive dell’anguilla europea.

Cinematica della corsa con stampelle tramite sensori inerziali: Analisi di soggetti della Nazionale Italiana di Calcio Amputati

L’analisi del movimento umano mira alla raccolta di informazioni quantitative riguardo la meccanica del sistema muscolo-scheletrico durante l’esecuzione di un compito motorio. All’interno di questo contesto, la cinematica del passo rappresenta uno strumento d’indagine tra i più usati. Tra i diversi protocolli di analisi cinematiche si è affermato recentemente l’uso di sensori magnetico-inerziali. Il principale vantaggio di questi dispositivi rispetto alla tecnica tradizionalmente impiegata (la stereofotogrammetria) è che possono essere utilizzati al di fuori di un ambiente di laboratorio, rendendo meno vincolante la scelta del task motorio da analizzare. Lo stato dell’arte offre una molteplicità di studi basati sull’analisi del cammino e della corsa di atleti, professionisti o dilettanti, utilizzando sensori inerziali; nulla, però, è stato dedicato alla corsa con stampelle. In questo lavoro di tesi è stata dunque analizzata la corsa su stampelle di soggetti amputati (in particolare di atleti della Nazionale Italiana di Calcio Amputati). Dalla letteratura sono stati individuati tre metodi, ideati principalmente per la corsa di soggetti normodotati e in questa situazione riadattati per la corsa di soggetti con amputazione/malformazione di un arto inferiore, con i quali è stato possibile ricavare parametri temporali relativi al ciclo del passo; è stato inoltre progettato un nuovo metodo che permette di ricavare parametri temporali della corsa attraverso le fasi delle stampelle. L’elemento che contraddistingue questo studio è la presenza di un gold standard, dato da un riferimento video, con il quale sarà possibile determinare con più affidabilità quale metodo risulti più adeguato per l’analisi di questo tipo di corsa.

Rilevazione di eventi geo-localizzati sulla piattaforma Twitter: Una valutazione sperimentale

I Social Network sono una fonte di informazioni di natura spontanea, non guidata, provviste di posizione spaziale e prodotte in tempo reale. Il Social Sensing si basa sull'idea che gruppi di persone possano fornire informazioni, su eventi che accadono nelle loro vicinanze, simili a quelle ottenibili da sensori. La letteratura in merito all’utilizzo dei Social Media per il rilevamento di eventi catastrofici mostra una struttura comune: acquisizione, filtraggio e classificazione dei dati. La piattaforma usata, nella maggior parte dei lavori e da noi, è Twitter. Proponiamo un sistema di rilevamento di eventi per l’Emilia Romagna, tramite l’analisi di tweet geolocalizzati. Per l’acquisizione dei dati abbiamo utilizzato le Twitter API. Abbiamo effettuato due passaggi per il filtraggio dei tweet. Primo, selezione degli account di provenienza dei tweet, se non sono personali è improbabile che siano usati per dare informazioni e non vanno tenuti in considerazione. Secondo, il contenuto dei tweet, vengono scartati se presentano termini scurrili, parole come “buon giorno” e un numero di tag, riferiti ad altri utenti, superiore a quattro. La rilevazione di un valore anomalo rispetto all'insieme delle osservazioni che stiamo considerando (outlier), è il primo indice di un evento eccezionale. Per l’analisi siamo ricorsi all’outlier detection come indice di rilevamento di un evento. Fatta questa prima analisi si controlla che ci sia un effettivo picco di tweet in una zona della regione. Durante il periodo di attività non sono accaduti eventi straordinari, abbiamo quindi simulato un avvenimento per testare l'efficacia del nostro sistema. La maggior difficoltà è che i dati geolocalizzati sono in numero molto esiguo, è quindi difficile l'identificazione dei picchi. Per migliorare il sistema si propone: il passaggio a streaming dei tweet e un aumento della velocità di filtraggio; la automatizzazione dei filtri; l'implementazione di un modulo finale che operi a livello del testo.

Analisi sperimentale e numerica del comportamento delle connessioni per strutture in XLAM

La tesi ha lo scopo di determinare una correlazione tra lo spostamento laterale e la riduzione di resistenza a trazione per le connessioni di tipo holdown per pareti in legno massiccio XLam. Per raggiungere questo obiettivo è stata condotta un’indagine sperimentale, nella quale sono state eseguite prove cicliche a trazione in controllo di spostamento assiale, con imposizione di uno spostamento a taglio iniziale. Sono state eseguite inoltre prove monotone combinate, caratterizzate da contemporaneo spostamento a taglio e assiale legati da rapporto diverso per ogni tipologia di prova. Si è ricavata una legge di danno che correla lo spostamento laterale alla riduzione di resistenza assiale: per scorrimenti entro 15 mm il danno è contenuto (10%), ma arrivando a 30-45mm la riduzione di resistenza è del 20%. Mettendo insieme invece le monotone ottenute variando il suddetto rapporto di velocità si è definito un dominio di resistenza. La seconda parte verte sulla modellazione numerica in OpenSEES delle connessioni come molle di un materiale isteretico, tarate sulla base delle curve sperimentali cicliche ottenute. Queste sono state poi utilizzate per la modellazione di una parete a molle disaccoppiate, che considera solo la resistenza a trazione per hold-down e a taglio per angolari (sottostima resistenza reale). Una seconda modellazione a molle accoppiate considera la resistenza in entrambe le direzioni: questo sovrastima la resistenza globale reale, poiché non tiene conto della contemporanea applicazione del carico nelle due direzioni. E’ stata quindi applicata la suddetta legge di danno attraverso un procedimento iterativo che in base agli spostamenti laterali riduce la resistenza assiale e riesegue l’analisi con i parametri corretti, per rivalutare spostamenti e resistenze: la progettazione attuale sovradimensiona gli angolari, il collasso della struttura avviene per rottura non bilanciata, con hold-down plasticizzati e angolari in campo elastico (meccanismo di rocking).

Analisi acustica di una finestra forata: modellazione numerica mediante COMSOL multiphysics

“Immaginate di potervi rilassare a casa in una giornata d’estate tenendo le finestre aperte per lasciare passare la brezza ma senza essere disturbati dai rumori della città, oggi è possibile”. Quello che voglio fare attraverso questa tesi è di studiare la fattibilità per la realizzazione di una finestra che permetta il passaggio dell’aria ma non dei rumori. L’idea di questa particolare finestra silenziosa mi è stata fornita dallo studio fatto dal professor Sang-Hoon Kim del Mokpo National University maritime e dal professor Seong-Hyun Lee del Korea Institute of Machinery and Materials in Corea del Sud. Essi hanno utilizzato i metamateriali acustici per risolvere il problema dell’inquinamento sonoro in città. Queste finestre hanno il vantaggio di tenere i rumori fuori dalla nostra abitazione ma permettere il passaggio dell’aria attraverso dei fori aventi dimensioni e posizioni adeguate da garantire questo particolare fenomeno. I principi su cui si basano queste finestre sono: la diffrazione e i risonatori di Helmholtz, che analizzeremo nel dettaglio nei capitoli 1 e 2 di questa tesi. Dopo aver analizzato i due principi attraverso simulazione fatte mediante il programma COMSOL multiphysics, sono passata all’analisi della finestra vera e propria: ovvero alla realizzazione delle dimensioni adeguate dei risonatori di Helmholtz utilizzati, alle dimensioni dei rispettivi fori d’ingresso e alla combinazione di questi risonatori per ricavare la miglior finestra silenziosa, che trattenesse al suo esterno il maggior numero di dB.

Ruolo di Clusterina nella progressione del tumore prostatico

Clusterina (CLU) è una proteina ubiquitaria, presente nella maggior parte dei fluidi corporei e implicata in svariati processi fisiologici. Dalla sua scoperta fino ad oggi, CLU è risultata essere una proteina enigmatica, la cui funzione non è ancora stata compresa appieno. Il gene codifica per 3 varianti trascrizionali identificate nel database NCBI con i codici: NM_001831 (CLU 1 in questo lavoro di tesi), NR_038335 (CLU 2 in questo lavoro di tesi) e NR_045494 (CLU 3 in questo lavoro di tesi). Tutte le varianti sono trascritte come pre-mRNA contenenti 9 esoni e 8 introni e si differenziano per l’esone 1, la cui sequenza è unica e caratteristica di ogni variante. Sebbene in NCBI sia annotato che le varianti CLU 2 e CLU 3 non sono codificanti, tramite analisi bioinformatica è stato predetto che da tutti e tre i trascritti possono generarsi proteine di differente lunghezza e localizzazione cellulare. Tra tutte le forme proteiche ipotizzate, l’unica a essere stata isolata e sequenziata è quella tradotta dall’AUG presente sull’esone 2 che dà origine a una proteina di 449 aminoacidi. Il processo di maturazione prevede la formazione di un precursore citoplasmatico (psCLU) che subisce modificazioni post-traduzionali tra cui formazione di ponti disolfuro, glicosilazioni, taglio in due catene denominate β e α prima di essere secreta come eterodimero βα (sCLU) nell’ambiente extracellulare, dove esercita la sua funzione di chaperone ATP-indipendente. Oltre alla forma extracellulare, è possibile osservare una forma intracellulare con localizzazione citosolica la cui funzione non è stata ancora completamente chiarita. Questo lavoro di tesi si è prefissato lo scopo di incrementare le conoscenze in merito ai trascritti CLU 1 e CLU 2 e alla loro regolazione, oltre ad approfondire il ruolo della forma citosolica della proteina in relazione al signaling di NF-kB che svolge un ruolo importante nel processo di sviluppo e metastatizzazione del tumore. Nella prima parte, uno screening di differenti linee cellulari, quali cellule epiteliali di prostata e di mammella, sia normali sia tumorali, fibroblasti di origine polmonare e linfociti di tumore non-Hodgkin, ha permesso di caratterizzare i trascritti CLU 1 e CLU 2. Dall’analisi è emerso che la sequenza di CLU 1 è più corta al 5’ rispetto a quella depositata in NCBI con l’identificativo NM_001831 e il primo AUG disponibile per l’inizio della traduzione è localizzato sull’esone 2. È stato dimostrato che CLU 2, al contrario di quanto riportato in NCBI, è tradotto in proteina a partire dall’AUG presente sull’esone 2, allo stesso modo in cui viene tradotto CLU 1. Inoltre, è stato osservato che i livelli d’espressione dei trascritti variano notevolmente tra le diverse linee cellulari e nelle cellule epiteliali CLU 2 è espressa sempre a bassi livelli. In queste cellule, l’espressione di CLU 2 è silenziata per via epigenetica e la somministrazione di farmaci capaci di rendere la cromatina più accessibile, quali tricostatina A e 5-aza-2’-deossicitidina, è in grado di incrementarne l’espressione. Nella seconda parte, un’analisi bioinformatica seguita da saggi di attività in vitro in cellule epiteliali prostatiche trattate con farmaci epigenetici, hanno permesso di identificare, per la prima volta in uomo, una seconda regione regolatrice denominata P2, capace di controllare l’espressione di CLU 2. Rispetto a P1, il classico promotore di CLU già ampiamente studiato da altri gruppi di ricerca, P2 è un promotore debole, privo di TATA box, che nelle cellule epiteliali prostatiche è silente in condizioni basali e la cui attività incrementa in seguito alla somministrazione di farmaci epigenetici capaci di alterare le modificazioni post-traduzionali delle code istoniche nell’intorno di P2. Ne consegue un rilassamento della cromatina e un successivo aumento di trascrizione di CLU 2. La presenza di un’isola CpG differentemente metilata nell’intorno di P1 spiegherebbe, almeno in parte, i differenti livelli di espressione di CLU che si osservano tra le diverse linee cellulari. Nella terza parte, l’analisi del pathway di NF-kB in un modello sperimentale di tumore prostatico in cui CLU è stata silenziata o sovraespressa, ha permesso di capire come la forma citosolica di CLU abbia un ruolo inibitorio nei confronti dell’attività del fattore trascrizionale NF-kB. CLU inibisce la fosforilazione e l’attivazione di p65, il membro più rappresentativo della famiglia NF-kB, con conseguente riduzione della trascrizione di alcuni geni da esso regolati e coinvolti nel rimodellamento della matrice extracellulare, quali l’urochinasi attivatrice del plasminogeno, la catepsina B e la metallo proteinasi 9. È stato dimostrato che tale inibizione non è dovuta a un’interazione fisica diretta tra CLU e p65, per cui si suppone che CLU interagisca con uno dei componenti più a monte della via di segnalazione responsabile della fosforilazione ed attivazione di p65.

Applicazione della spettrometria di massa MALDI-TOF in microbiologia clinica

Riassunto La spettrometria di massa (MS) nata negli anni ’70 trova oggi, grazie alla tecnologia Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization-Time of Flight (MALDI-TOF), importanti applicazioni in diversi settori: biotecnologico (per la caratterizzazione ed il controllo di qualità di proteine ricombinanti ed altre macromolecole), medico–clinico (per la diagnosi di laboratorio di malattie e per lo sviluppo di nuovi trattamenti terapeutici mirati), alimentare ed ambientale. Negli ultimi anni, questa tecnologia è diventata un potente strumento anche per la diagnosi di laboratorio in microbiologia clinica, rivoluzionando il flusso di lavoro per una rapida identificazione di batteri e funghi, sostituendo l’identificazione fenotipica convenzionale basata su saggi biochimici. Attualmente mediante MALDI-TOF MS sono possibili due diversi approcci per la caratterizzazione dei microrganismi: (1) confronto degli spettri (“mass spectra”) con banche dati contenenti profili di riferimento (“database fingerprints”) e (2) “matching” di bio-marcatori con banche dati proteomiche (“proteome database”). Recentemente, la tecnologia MALDI-TOF, oltre alla sua applicazione classica nell’identificazione di microrganismi, è stata utilizzata per individuare, indirettamente, meccanismi di resistenza agli antibiotici. Primo scopo di questo studio è stato verificare e dimostrare l’efficacia identificativa della metodica MALDI-TOF MS mediante approccio di comparazione degli spettri di differenti microrganismi di interesse medico per i quali l’identificazione risultava impossibile a causa della completa assenza o presenza limitata, di spettri di riferimento all’interno della banca dati commerciale associata allo strumento. In particolare, tale scopo è stato raggiunto per i batteri appartenenti a spirochete del genere Borrelia e Leptospira, a miceti filamentosi (dermatofiti) e protozoi (Trichomonas vaginalis). Secondo scopo di questo studio è stato valutare il secondo approccio identificativo basato sulla ricerca di specifici marcatori per differenziare parassiti intestinali di interesse medico per i quali non è disponibile una banca dati commerciale di riferimento e la sua creazione risulterebbe particolarmente difficile e complessa, a causa della complessità del materiale biologico di partenza analizzato e del terreno di coltura nei quali questi protozoi sono isolati. Terzo ed ultimo scopo di questo studio è stata la valutazione dell’applicabilità della spettrometria di massa con tecnologia MALDI-TOF per lo studio delle resistenze batteriche ai carbapenemi. In particolare, è stato messo a punto un saggio di idrolisi dei carbapenemi rilevata mediante MALDI-TOF MS in grado di determinare indirettamente la produzione di carbapenemasi in Enterobacteriaceae. L’efficacia identificativa della metodica MALDI-TOF mediante l’approccio di comparazione degli spettri è stata dimostrata in primo luogo per batteri appartenenti al genere Borrelia. La banca dati commerciale dello strumento MALDI-TOF MS in uso presso il nostro laboratorio includeva solo 3 spettri di riferimento appartenenti alle specie B. burgdorferi ss, B. spielmani e B. garinii. L’implementazione del “database” con specie diverse da quelle già presenti ha permesso di colmare le lacune identificative dovute alla mancanza di spettri di riferimento di alcune tra le specie di Borrelia più diffuse in Europa (B. afzelii) e nel mondo (come ad esempio B. hermsii, e B. japonica). Inoltre l’implementazione con spettri derivanti da ceppi di riferimento di specie già presenti nel “database” ha ulteriormente migliorato l’efficacia identificativa del sistema. Come atteso, il ceppo di isolamento clinico di B. lusitaniae (specie non presente nel “database”) è stato identificato solo a livello di genere corroborando, grazie all’assenza di mis-identificazione, la robustezza della “nuova” banca dati. I risultati ottenuti analizzando i profili proteici di ceppi di Borrelia spp. di isolamento clinico, dopo integrazione del “database” commerciale, indicano che la tecnologia MALDI-TOF potrebbe essere utilizzata come rapida, economica ed affidabile alternativa ai metodi attualmente utilizzati per identificare ceppi appartenenti a questo genere. Analogamente, per il genere Leptospira dopo la creazione ex-novo della banca dati “home-made”, costruita con i 20 spettri derivati dai 20 ceppi di riferimento utilizzati, è stata ottenuta una corretta identificazione a livello di specie degli stessi ceppi ri-analizzati in un esperimento indipendente condotto in doppio cieco. Il dendrogramma costruito con i 20 MSP-Spectra implementati nella banca dati è formato da due rami principali: il primo formato dalla specie non patogena L. biflexa e dalla specie a patogenicità intermedia L. fainei ed il secondo che raggruppa insieme le specie patogene L. interrogans, L. kirschneri, L. noguchii e L. borgpetersenii. Il secondo gruppo è ulteriormente suddiviso in due rami, contenenti rispettivamente L. borgpetersenii in uno e L. interrogans, L. kirschneri e L. noguchii nell’altro. Quest’ultimo, a sua volta, è suddiviso in due rami ulteriori: il primo comprendente la sola specie L. noguchii, il secondo le specie L. interrogans e L. kirshneri non separabili tra loro. Inoltre, il dendrogramma costruito con gli MSP-Spectra dei ceppi appartenenti ai generi Borrelia e Leptospira acquisiti in questo studio, e appartenenti al genere Brachyspira (implementati in un lavoro precedentemente condotto) mostra tre gruppi principali separati tra loro, uno per ogni genere, escludendo possibili mis-identificazioni tra i 3 differenti generi di spirochete. Un’analisi più approfondita dei profili proteici ottenuti dall’analisi ha mostrato piccole differenze per ceppi della stessa specie probabilmente dovute ai diversi pattern proteici dei distinti sierotipi, come confermato dalla successiva analisi statistica, che ha evidenziato picchi sierotipo-specifici. È stato, infatti, possibile mediante la creazione di un modello statistico dedicato ottenere un “pattern” di picchi discriminanti in grado di differenziare a livello di sierotipo sia i ceppi di L. interrogans sia i ceppi di L. borgpetersenii saggiati, rispettivamente. Tuttavia, non possiamo concludere che i picchi discriminanti da noi riportati siano universalmente in grado di identificare il sierotipo dei ceppi di L. interrogans ed L. borgpetersenii; i picchi trovati, infatti, sono il risultato di un’analisi condotta su uno specifico pannello di sierotipi. È stato quindi dimostrato che attuando piccoli cambiamenti nei parametri standardizzati come l’utilizzo di un modello statistico e di un programma dedicato applicato nella routine diagnostica è possibile utilizzare la spettrometria di massa MALDI-TOF per una rapida ed economica identificazione anche a livello di sierotipo. Questo può significativamente migliorare gli approcci correntemente utilizzati per monitorare l’insorgenza di focolai epidemici e per la sorveglianza degli agenti patogeni. Analogamente a quanto dimostrato per Borrelia e Leptospira, l’implementazione della banca dati dello spettrometro di massa con spettri di riferimento di miceti filamentosi (dermatofiti) si è rilevata di particolare importanza non solo per l’identificazione di tutte le specie circolanti nella nostra area ma anche per l’identificazione di specie la cui frequenza nel nostro Paese è in aumento a causa dei flussi migratori dalla zone endemiche (M. audouinii, T. violaceum e T. sudanense). Inoltre, l’aggiornamento del “database” ha consentito di superare la mis-identificazione dei ceppi appartenenti al complesso T. mentagrophytes (T. interdigitale e T. mentagrophytes) con T. tonsurans, riscontrata prima dell’implementazione della banca dati commerciale. Il dendrogramma ottenuto dai 24 spettri implementati appartenenti a 13 specie di dermatofiti ha rivelato raggruppamenti che riflettono quelli costruiti su base filogenetica. Sulla base dei risultati ottenuti mediante sequenziamento della porzione della regione ITS del genoma fungino non è stato possibile distinguere T. interdigitale e T. mentagrophytes, conseguentemente anche gli spettri di queste due specie presentavano picchi dello stesso peso molecoalre. Da sottolineare che il dendrogramma costruito con i 12 profili proteici già inclusi nel database commerciale e con i 24 inseriti nel nuovo database non riproduce l’albero filogenetico per alcune specie del genere Tricophyton: gli spettri MSP già presenti nel database e quelli aggiunti delle specie T. interdigitale e T. mentagrophytes raggruppano separatamente. Questo potrebbe spiegare le mis-identificazioni di T. interdigitale e T. mentagrophytes con T. tonsurans ottenute prima dell’implementazione del database. L’efficacia del sistema identificativo MALDI-TOF è stata anche dimostrata per microrganismi diversi da batteri e funghi per i quali la metodica originale è stata sviluppata. Sebbene tale sistema identificativo sia stato applicato con successo a Trichomonas vaginalis è stato necessario apportare modifiche nei parametri standard previsti per l’identificazione di batteri e funghi. Le interferenze riscontrate tra i profili proteici ottenuti per i due terreni utilizzati per la coltura di questo protozoo e per i ceppi di T. vaginalis hanno, infatti, reso necessario l’utilizzo di nuovi parametri per la creazione degli spettri di riferimento (MSP-Spectra). L’importanza dello sviluppo del nuovo metodo risiede nel fatto che è possibile identificare sulla base del profilo proteico (e non sulla base di singoli marcatori) microorganismi cresciuti su terreni complessi che potrebbero presentare picchi nell'intervallo di peso molecolare utilizzato a scopo identificativo: metaboliti, pigmenti e nutrienti presenti nel terreno possono interferire con il processo di cristallizzazione e portare ad un basso punteggio identificativo. Per T. vaginalis, in particolare, la “sottrazione” di picchi dovuti a molecole riconducibili al terreno di crescita utilizzato, è stata ottenuta escludendo dall'identificazione l'intervallo di peso molecolare compreso tra 3-6 kDa, permettendo la corretta identificazione di ceppi di isolamento clinico sulla base del profilo proteico. Tuttavia, l’elevata concentrazione di parassita richiesta (105 trofozoiti/ml) per una corretta identificazione, difficilmente ottenibile in vivo, ha impedito l’identificazione di ceppi di T. vaginalis direttamente in campioni clinici. L’approccio identificativo mediante individuazione di specifici marcatori proteici (secondo approccio identificativo) è stato provato ed adottato in questo studio per l’identificazione e la differenziazione di ceppi di Entamoeba histolytica (ameba patogena) ed Entamoeba dispar (ameba non patogena), specie morfologiacamente identiche e distinguibili solo mediante saggi molecolari (PCR) aventi come bersaglio il DNA-18S, che codifica per l’RNA della subunità ribosomiale minore. Lo sviluppo di tale applicazione ha consentito di superare l’impossibilità della creazione di una banca dati dedicata, a causa della complessità del materiale fecale di partenza e del terreno di coltura impiagato per l’isolamento, e di identificare 5 picchi proteici in grado di differenziare E. histolytica da E. dispar. In particolare, l’analisi statistica ha mostrato 2 picchi specifici per E. histolytica e 3 picchi specifici per E. dispar. L’assenza dei 5 picchi discriminanti trovati per E. histolytica e E. dispar nei profili dei 3 differenti terreni di coltura utilizzati in questo studio (terreno axenico LYI-S-2 e terreno di Robinson con e senza E. coli) permettono di considerare questi picchi buoni marcatori in grado di differenziare le due specie. La corrispondenza dei picchi con il PM di due specifiche proteine di E. histolytica depositate in letteratura (Amoebapore A e un “unknown putative protein” di E. histolytica ceppo di riferimento HM-1:IMSS-A) conferma la specificità dei picchi di E. histolytica identificati mediante analisi MALDI-TOF MS. Lo stesso riscontro non è stato possibile per i picchi di E. dispar in quanto nessuna proteina del PM di interesse è presente in GenBank. Tuttavia, va ricordato che non tutte le proteine E. dispar sono state ad oggi caratterizzate e depositate in letteratura. I 5 marcatori hanno permesso di differenziare 12 dei 13 ceppi isolati da campioni di feci e cresciuti in terreno di Robinson confermando i risultati ottenuti mediante saggio di Real-Time PCR. Per un solo ceppo di isolamento clinico di E. histolytica l’identificazione, confermata mediante sequenziamento della porzione 18S-rDNA, non è stata ottenuta mediante sistema MALDI-TOF MS in quanto non sono stati trovati né i picchi corrispondenti a E. histolytica né i picchi corrispondenti a E. dispar. Per questo ceppo è possibile ipotizzare la presenza di mutazioni geno/fenotipiche a livello delle proteine individuate come marcatori specifici per E. histolytica. Per confermare questa ipotesi sarebbe necessario analizzare un numero maggiore di ceppi di isolamento clinico con analogo profilo proteico. L’analisi condotta a diversi tempi di incubazione del campione di feci positivo per E. histolytica ed E. dipar ha mostrato il ritrovamento dei 5 picchi discriminanti solo dopo 12 ore dall’inoculo del campione nel terreno iniziale di Robinson. Questo risultato suggerisce la possibile applicazione del sistema MALDI-TOF MS per identificare ceppi di isolamento clinico di E. histolytica ed E. dipar nonostante la presenza di materiale fecale che materialmente può disturbare e rendere difficile l’interpretazione dello spettro ottenuto mediante analisi MALDI-TOF MS. Infine in questo studio è stata valutata l’applicabilità della tecnologia MALDI-TOF MS come saggio fenotipico rapido per la determinazione di ceppi produttori di carbapenemasi, verificando l'avvenuta idrolisi del meropenem (carbapeneme di riferimento utilizzato in questo studio) a contatto con i ceppi di riferimento e ceppi di isolamento clinico potenzialmente produttori di carbapenemasi dopo la messa a punto di un protocollo analitico dedicato. Il saggio di idrolisi del meropenem mediante MALDI-TOF MS ha dimostrato la presenza o l’assenza indiretta di carbapenemasi nei 3 ceppi di riferimento e nei 1219 (1185 Enterobacteriaceae e 34 non-Enterobacteriaceae) ceppi di isolamento clinico inclusi nello studio. Nessuna interferenza è stata riscontrata per i ceppi di Enterobacteriaceae variamente resistenti ai tre carbapenemi ma risultati non produttori di carbapenemasi mediante i saggi fenotipici comunemente impiegati nella diagnostica routinaria di laboratorio: nessuna idrolisi del farmaco è stata infatti osservata al saggio di idrolisi mediante MALDI-TOF MS. In un solo caso (ceppo di K. pneumoniae N°1135) è stato ottenuto un profilo anomalo in quanto presenti sia i picchi del farmaco intatto che quelli del farmaco idrolizzato. Per questo ceppo resistente ai tre carbapenemi saggiati, negativo ai saggi fenotipici per la presenza di carbapenemasi, è stata dimostrata la presenza del gene blaKPC mediante Real-Time PCR. Per questo ceppo si può ipotizzare la presenza di mutazioni a carico del gene blaKPC che sebbene non interferiscano con il suo rilevamento mediante PCR (Real-Time PCR positiva), potrebbero condizionare l’attività della proteina prodotta (Saggio di Hodge modificato e Test di Sinergia negativi) riducendone la funzionalità come dimostrato, mediante analisi MALDI-TOF MS, dalla presenza dei picchi relativi sia all’idrolisi del farmaco sia dei picchi relativi al farmaco intatto. Questa ipotesi dovrebbe essere confermata mediante sequenziamento del gene blaKPC e successiva analisi strutturale della sequenza amminoacidica deducibile. L’utilizzo della tecnologia MALDI-TOF MS per la verifica dell’avvenuta idrolisi del maropenem è risultato un saggio fenotipico indiretto in grado di distinguere, al pari del test di Hodge modificato impiegato comunemente nella routine diagnostica in microbiologia, un ceppo produttore di carbapenemasi da un ceppo non produttore sia per scopi diagnostici che per la sorveglianza epidemiologica. L’impiego del MALDI-TOF MS ha mostrato, infatti, diversi vantaggi rispetto ai metodi convenzionali (Saggio di Hodge modificato e Test di Sinergia) impiegati nella routine diagnostica di laboratorio i quali richiedono personale esperto per l’interpretazione del risultato e lunghi tempi di esecuzione e di conseguenza di refertazione. La semplicità e la facilità richieste per la preparazione dei campioni e l’immediata acquisizione dei dati rendono questa tecnica un metodo accurato e rapido. Inoltre, il metodo risulta conveniente dal punto di vista economico, con un costo totale stimato di 1,00 euro per ceppo analizzato. Tutte queste considerazioni pongono questa metodologia in posizione centrale in ambito microbiologico anche nel caso del rilevamento di ceppi produttori di carbapenemasi. Indipendentemente dall’approccio identificativo utilizzato, comparato con i metodi convenzionali il MALDI-TOF MS conferisce in molti casi un guadagno in termini di tempo di lavoro tecnico (procedura pre-analititca per la preparazione dei campioni) e di tempo di ottenimento dei risultati (procedura analitica automatizzata). Questo risparmio di tempo si accentua quando sono analizzati in contemporanea un maggior numero di isolati. Inoltre, la semplicità e la facilità richieste per la preparazione dei campioni e l’immediata acquisizione dei dati rendono questo un metodo di identificazione accurato e rapido risultando più conveniente anche dal punto di vista economico, con un costo totale di 0,50 euro (materiale consumabile) per ceppo analizzato. I risultati ottenuti dimostrano che la spettrometria di massa MALDI-TOF sta diventando uno strumento importante in microbiologia clinica e sperimentale, data l’elevata efficacia identificativa, grazie alla disponibilità sia di nuove banche dati commerciali sia di aggiornamenti delle stesse da parte di diversi utenti, e la possibilità di rilevare con successo anche se in modo indiretto le antibiotico-resistenze.

Proposta di sottotitolaggio e analisi di un episodio della serie Galavant

L’elaborato presenta la proposta di sottotitolaggio e la relativa analisi dell’episodio pilota della serie televisiva Galavant. Questa commedia musicale presenta molte sfide dal punto di vista traduttivo, data la presenza di innumerevoli canzoni. Per la traduzione di quest’ultime, si è scelto di renderle in italiano come se dovessero essere cantate in un possibile doppiaggio nostrano, rispettando dunque la loro struttura originale. L’elaborato si sviluppa in tre capitoli. Nel primo, viene presentata la traduzione audiovisiva, con particolare attenzione alla tecnica del sottotitolaggio, agli aspetti tecnici e alle restrizioni a cui devono sottostare i sottotitoli, con un’ultima parte dedicata alla traduzione delle canzoni. Il secondo capitolo è incentrato sull’introduzione della serie e dell’episodio scelto per l’analisi, con una breve descrizione del particolare umorismo da cui è caratterizzata. Il terzo capitolo è dedicato al commento alla traduzione, con una presentazione dei problemi riscontrati durante la stesura dei sottotitoli e delle soluzioni trovate. Infine, in appendice si può trovare la tabella in cui sono elencati tutti i sottotitoli, con la loro versione inglese e italiana e i relativi tempi di entrata e di uscita.