Development of cellular and gene therapies for b[beta]-Thalassemia and sickle cell disease

Thèse numérisée par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal.

Polymeric nanoparticles : from microporosity and drug release kinetics to cellular interactions

Thèse numérisée par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal

Use of cellular impedance to characterize ligand functional selectivity at G protein-coupled receptors

Les récepteurs couplés aux protéines G (RCPGs) représentent la plus grande famille de cibles thérapeutiques pour le traitement d’une panoplie de pathologies humaines. Bien que plusieurs décennies de recherche aient permis de façonner nos connaissances sur ces protéines membranaires, notre compréhension des déterminants moléculaires de leur activité signalétique reste encore limitée. De ces domaines de recherche, une avancée récente a mis à jour un nouveau phénomène, appelé sélectivité fonctionnelle des ligands, qui a bouleversé les paradigmes décrivant leu fonctionnement de ces récepteurs. Ce concept émane d’observations montrant que l’activité pharmacologique de certains ligands n’est pas nécessairement conservée sur tout le répertoire signalétiques connu du récepteur et peu se restreindre à l'activation sélective d’un sous-groupe de voies de signalisation.Ce nouveau modèle pharmacologique de l'activation des RCPG ouvre de nouvelles possibilités pour la découverte de médicaments plus efficace et sûr, ciblant les RCPGs. En effet, il permet la conception de molécules modulant spécifiquement les voies signalétiques d’intérêt thérapeutique, sans engager les autres voies qui pourraient mener à des effets secondaires indésirables ou de la tolérance. Cette thèse décrit l'utilisation d'une nouvelle approche sans marquage, basée sur la mesure du changement l'impédance cellulaire. Par la mesure des changements cellulaires, comme la morphologie, l’adhésion et/ou la redistribution des macromolécules, cette approche permet de mesurer de façon simultanée l'activité de plusieurs voies de signalisation impliqués dans ces réponses. Utilisant le récepteur β2-adrénergique (β2AR) comme modèle, nous avons démontré que les variations dans l’impédance cellulaire étaient directement liées à l’activation de multiples voies de signalisation suite à la stimulation du récepteur par son ligand. L’agoniste type du β2AR, l’isoprotérénol, s’est avéré induire une réponse d’impédance dose-dépendante constituée, dans le temps, de plusieurs caractéristiques distinctes pouvant être bloquées de façon compétitive par l’antagoniste ICI118,551 Par l’utilisation d’inhibiteurs sélectifs, nous avons été en mesure de déterminer la contribution de plusieurs voies signalétiques canoniques, comme les voies dépendantes de Gs et Gi, la production d’AMPc et l’activation de ERK1/2, sur ces changements. De plus, la dissection de la réponse d’impédance a permis d’identifier une nouvelle voie de mobilisation du Ca2+ contribuant à la réponse globale des changements initiés par la stimulation du β2AR. Dans une autre étude, nous avons rapporté que la réponse calcique induite par le β2AR serait attribuable à une transactivation Gs-dépendant du récepteur purinergique P2Y11, lui-même couplé à la protéine Gq. La mesure d’impédance permettant de distinguer et de décrire une pléiade d’activités signalétiques, nous avons émis l’hypothèse que des ligands arborant des profils signalétiques différents généreraient des réponses d’impédance distinctes. Le criblage d’une librairie de ligands spécifiques au β2AR a révélé une grande variété de signatures d’impédance. Grâce au développement d’une approche computationnelle innovatrice, nous avons été en mesure de regrouper ces signatures en cinq classes de composés, un regroupement qui s’est avéré hautement corrélé avec le profil signalétique des différents ligands. Nous avons ensuite combiné le criblage de composés par impédance avec l’utilisation d’inhibiteurs sélectifs de voies signalétiques afin d’augmenter la résolution du regroupement. En évaluant l’impact d’une voie signalétique donnée sur la signature d’impédance, nous avons été en mesure de révéler une plus grande variété de textures parmi les ligands. De plus, cette méthode s’est avérée efficace pour prédire le profil signalétique d’une librairie de composés non caractérisés, ciblant le β2AR. Ces travaux ont mené à l’élaboration d’une méthode permettant d’exprimer visuellement la sélectivité fonctionnelle de ligands et ont révélé de nouvelles classes de composés pour ce récepteur. Ces nouvelles classes de composés ont ensuite été testées sur des cardiomyocytes humains, confirmant que les composés regroupés dans différentes classes produisent des effets distincts sur la contractilité de ces cellules. Globalement, ces travaux démontrent la pertinence de l’utilisation de l’impédance cellulaire pour une évaluation précise des différences fonctionnelles parmi les composés ciblant les RCPGs. En fournissant une représentation pluridimensionnelle de la signalisation émanant des RCPGs à l’aide d’un seul essai ne requérant pas de marquage, les signatures d’impédance représentent une stratégie simple et innovante pour l’évaluation de la fonctionnalité sélective des ligands. Cette méthode pourrait être d’une grande utilité dans le processus de découverte de nouveaux médicaments.

Effect of Pyridoxine on Growth, Metabolism and Cellular Activity of Macrobrachium rosenbergii

Effect of pyridoxine on growth, metabolism and cellular activity of freshwater prawn Macrobrachiuni rosenbergii was studied. Postlarvae (PL-10) of M. rosenbergii were fed with clam meat containing various concentrations of pyridoxine. After 30 days RNA and DNA of the abdominal tissues were estimated. Length, weight and RNA to DNA ratio increased significantly with increasing concentrations of pyridoxine. The effect of pyridoxine on the metabolic enzyme, malate dehydrogenase, was also studied. Vmax showed a significant decrease and the (Km) showed a significant increase in experimental groups compared to control.

Solid acid-catalyzed dehydration/Beckmann rearrangement of aldoximes: towards high atom efficiency green processes

Rare earth metal ion exchanged (La3+, Ce3+, RE3+) KFAU-Y zeolites were prepared by simple ion-exchange methods and have been characterized using different physico-chemical techniques. In this paper a novel application of solid acid catalysts in the dehydration/ Beckmann rearrangement of aldoximes; benzaldoxime and 4-methoxybenzaldoxime is reported. Dehydration/Beckmann rearrangement reactions of benzaldoxime and 4-methoxybenzaldoxime is carried out in a continuous down flow reactor at 473K. 4-Methoxybenzaldoxime gave both Beckmann rearrangement product (4-methoxyphenylformamide) and dehydration product (4-methoxybenzonitrile) in high overall yields. The difference in behavior of the aldoximes is explained in terms of electronic effects. The production of benzonitrile was near quantitative under heterogeneous reaction conditions. The optimal protocol allows nitriles to be synthesized in good yields through the dehydration of aldoximes. Time on stream studies show a fast decline in the activity of the catalyst due to neutralization of acid sites by the basic reactant and product molecules.

Dehydration of aldoximes on rare earth exchanged (La3+, Ce3+, RE3+, Sm3+) Na–Y zeolites: A facile route for the synthesis of nitriles

Rare earth exchanged Na–Y zeolites, H-mordenite, K-10 montmorillonite clay and amorphous silica-alumina were effectively employed for the continuous synthesis of nitriles. Dehydration of benzaldoxime and 4-methoxybenzaldoxime were carried out on these catalysts at 473 K. Benzonitrile (dehydration product) was obtained in near quantitative yield with benzaldoxime whereas; 4-methoxybenzaldoxime produces both Beckmann rearrangement (4-methoxyphenylformamide) as well as dehydration products (4-methoxy benzonitrile) in quantitative yields. The production of benzonitrile was near quantitative under heterogeneous reaction conditions. The optimal protocol allows nitriles to be synthesized in good yields through the dehydration of aldoximes. Time on stream (TOS) studies show decline in the activity of the catalysts due to neutralization of acid sites by the basic reactant and product molecules and water formed during the dehydration of aldoximes.

Cellular and humoral factors involved in defense mechanisms of Fenneropenaeus indicus (H. Milne Edwards, 1837)

The present investigation revealed three types of circulating haemocytes in the haemolymph of F. indicus: hyalinocytes, small-granule haemocytes, and large-granule haemocytes. Intermediate stages indicate the maturing process of a single cell. The presence of enzymes such as peroxidase, phenoloxidase and acid phosphatase in the haemocytes, and the substantial production of oxygen radicals during phagocytosis show that the haemocytes are capable of mounting a fme cellular defense mechanism. The enzyme activities of the serum and the presence of agglutinins in the serum, which may act as opsonins, agglutinate foreign particles and augment phagocytosis, confirm the presence of a superior humoral immune system in F. indicus.Bacterial infection caused considerable variations in the cellular and humoral factors, such as the number of circulating cells and haemagglutinating activity, especially in the initial hours of infection. The total haemocyte count, haemagglutination titer and phenoloxidase enzyme showed significant reductions on bacterial presence and could be used as indicators of bacterial infection.The number of circulating cells showed drastic fluctuation on exposure to pollutants. Nuvan at low concentrations was able to produce changes in the haemolymph factors and in the tissue organization, which implies that the animal is under stress and is easily prone to infections. Exposure to nuvan resulted in significant variation in all of the cellular and humoral factors, especially, the total haemocyte count, percentage of small granule haemocytes, phagocytic activity and the haemagglutinating activity, which might be good indicators of pesticide pollution. Heavy metal exposure caused significant increase in total haemocyte count and reduction in phenoloxidase enzyme activity Even changes in the physio-chemical parameters, such as salinity caused fluctuations in the defense factors, indicating stress in this euryhaline species. The dietary incorporation of a commercial immunostimulant containing P-l,3 glucan resulted in stimulation of some of the humoral defense factors of F indicus, but was time dependent. The modulations, on exposure to various external factors, in the cellular and humoral factors, especially, total haemocyte count, phagocytic activity, haemagglutinating activity and the phenoloxidase and acid phosphatase enzymes suggest that these parameters could be used as indicators of the health status of F indicus, which assist in better monitoring and effective health management of this important cultured species.

Fluorescent Superparamagnetic Iron Oxide Core–Shell Nanoprobes for Multimodal Cellular Imaging

Multimodal imaging agents that combine magnetic and fluorescent imaging capabilities are desirable for the high spatial and temporal resolution. In the present work, we report the synthesis of multifunctional fluorescent ferrofluids using iron oxide as the magnetic core and rhodamine B as fluorochrome shell. The core–shell structure was designed in such a way that fluorescence quenching due to the inner magnetic core was minimized by an intermediate layer of silica. The intermediate passive layer of silica was realized by a novel method which involves the esterification reaction between the epoxy group of prehydrolysed 3-Glyidoxypropyltrimethoxysilane and the surfactant over iron oxide. The as-synthesized ferrofluids have a high saturation magnetization in the range of 62–65 emu/g and were found to emit light of wavelength 640 nm ( excitation = 446 nm). Time resolved life time decay analysis showed a bi-exponential decay pattern with an increase in the decay life time in the presence of intermediate silica layer. Cytotoxicity studies confirmed the cell viability of these materials. The in vitro MRI imaging illustrated a high contrast when these multimodal nano probes were employed and the R2 relaxivity of these ∗Author to whom correspondence should be addressed. Email: smissmis@gmail.com sample was found to be 334 mM−1s−1 which reveals its high potential as a T2 contrast enhancing agent

Characterization of the role of Drosophila JAK/STAT signalling in cellular proliferation

Der Janus Kinase / signal transducer and activator of transcription (JAK/STAT) Signal- transduktionsweg wird für viele Entwicklungsvorgänge benötigt und spielt eine zentrale Rolle bei der Hämatopoese und bei der Immunantwort. Obwohl der JAK/STAT-Signalweg in den vergangenen Jahren Gegenstand intensiver Forschung war, erschwert die Redundanz des Signalwegs bei Wirbeltieren genetische Untersuchungen zur Identifizierung derjenigen Mechanismen, die den JAK/STAT-Signalweg regulieren. Der JAK/STAT-Signaltransduktionsweg ist evolutionär konserviert und ebenfalls bei der Taufliege Drosophila melanogaster vorhanden. Im Gegensatz zu Wirbeltieren ist der Signaltransduktionsweg von Drosophila weniger redundant und beinhaltet folgende Hauptkomponenten: den Liganden Unpaired (Upd), den Transmembranrezeptor Domeless (Dome), die einzige JAK-Tyrosinkinase Hopscotch (hop), sowie den Transkriptionsfaktor STAT92E. In der vorliegenden Arbeit wird die Rolle des JAK/STAT-Signalwegs bei der zellulären Proliferation mithilfe der Modellsysteme der Flügel- und der Augen-Imaginalscheiben von Drosophila charakterisiert. "Loss-of-function"- und "Gain-of-function"-Experimente zur Verminderung beziehungs-weise Erhöhung der Signalaktivität zeigten, dass der JAK/STAT-Signalweg eine Rolle bei der zellulären Proliferation der Flügel-Imaginalscheiben spielte, ohne die Zellgröße oder Apoptose zu verändern. Bei der Flügelentwicklung während des zweiten und des frühen dritten Larvalstadiums war die Aktivität des JAK/STAT-Signalwegs sowohl notwendig für die zelluläre Proliferation als auch hinreichend, um Überproliferation anzutreiben. Allerdings änderte sich während der späten dritten Larvalstadien die JAK/STAT-Signalaktivität, sodass endogene STAT92E-Mengen einen anti-proliferativen Effekt im gleichen Gewebe aufwiesen. Weiterhin reichte die ektopische Aktivierung des JAK/STAT-Signalwegs zu diesem späten Entwicklungszeitpunkt aus, um die Mitose zu inhibieren und die Zellen in der Phase G2 des Zellzyklus zu arretieren. Diese Ergebnisse legen den Schluss nahe, dass der JAK/STAT-Signalweg sowohl pro-proliferativ in frühen Flügelscheiben als auch anti-proliferativ zu späten Stadien der Flügelscheiben-Entwicklung wirken kann. Dieser späte anti-proliferative Effekt wurde durch einen nicht-kanonischen Mechanismus der STAT92E-Aktivierung vermittelt, da späte hop defiziente Zellverbände im Vergleich zu Wildtyp-Zellen keine Veränderungen im Ausmaß der zellulären Proliferation aufwiesen. Ferner konnte gezeigt werden, dass eine während der Larvalstadien exprimierte dominant-negative und im N-Terminus deletierte Form von STAT92E (?NSTAT92E) nicht für den anti-proliferativen Effekt verantwortlich ist. Diese Tatsache ist ein weiteres Indiz dafür, dass das vollständige STAT92E den späten anti-proliferativen Effekt verursacht. Um Modulatoren für die von JAK/STAT vermittelte zelluläre Proliferation zu identifieren, wurde ein P-Element-basierter genetischer Interaktions-Screen in einem sensibilisierten genetischen Hintergrund durchgeführt. Insgesamt wurden dazu 2267 unabhängige P-Element-Insertionen auf ihre Wechselwirkung mit der JAK/STAT-Signalaktivität untersucht und 24 interagierende Loci identifiziert. Diese Kandidaten können in folgende Gruppen eingeordnet werden: Zellzyklusproteine, Transkriptionsfaktoren, DNA und RNA bindende Proteine, ein Mikro-RNA-Gen, Komponenten anderer Signaltransduktionswege und Zelladhäsionsproteine. In den meisten Fällen wurden mehrere Allele der interagierenden Kandidatengene getestet. 18 Kandidatengene mit übereinstimmend interagierenden Allelen wurden dann zur weiteren Analyse ausgewählt. Von diesen 18 Kandidaten-Loci wurden 7 mögliche JAK/STAT-Signalwegskomponenten und 6 neue Zielgene des Signalwegs gefunden. Zusammenfassend wurde das Verständnis um STAT92E verbessert. Dieses Protein hat die gleiche Funktion wie das STAT3-Protein der Wirbeltiere und treibt die zelluläre Proliferation voran. Analog zu STAT1 hat STAT92E aber auch einen anti-proliferativen Effekt. Ferner wurden 24 mögliche Modulatoren der JAK/STAT-Signalaktivität identifiziert. Die Charakterisierung dieser Wechselwirkungen eröffnet vielversprechende Wege zu dem Verständnis, wie JAK/STAT die zelluläre Proliferation reguliert und könnte bei der Entwicklung von neuartigen therapeutischen Targets zur Behandlung von Krebskrankheiten und Entwicklungsstörungen beitragen.

A molecular and cellular analysis of the circadian system of the cockroach Rhyparobia (Leucophaea) maderae

Circadiane Schrittmacher koordinieren die täglichen Rhythmen in Physiologie und Verhalten in lebenden Organismen. Die Madeira Schabe Rhyparobia maderae (Synonym: Leucophaea maderae) ist ein gut etabliertes Modell, um die neuronalen Mechanismen der circadianen Rhythmen bei Insekten zu studieren. Die akzessorische Medulla (AME) in den optischen Loben des Gehirns wurde als das circadiane Schrittmacherzentrum der Madeira Schabe identifiziert, das circadiane Rhythmen in der Laufaktivität steuert. Über die Neurotransmitter der Eingangswege in das circadiane System der Madeira Schabe ist noch nicht viel bekannt. Das Hauptziel dieser Arbeit war es, mögliche Eingangssignale in die innere Uhr der Madeira Schabe zu bestimmen. An primären Zellkulturen von AME-Neuronen wurden Calcium-Imaging Experimente durchgeführt, um die Neurotransmitter-abhängigen Veränderungen in der intrazellulären Calcium-Konzentration zu messen. Darüber hinaus wurde die Signalkaskade des Neuropeptids Pigment Dispersing Factor (PDF), dem wichtigsten Kopplungsfaktor in circadianen Schrittmachern von Insekten, in Calcium-Imaging und Förster-Resonanzenergietransfer (FRET) Experimenten untersucht. Acetylcholin (ACh) erhöht die intrazelluläre Calcium-Konzentration in der Mehrzahl der circadianen Schrittmacherneurone der Madeiraschabe. Applikation von GABA, Serotonin und Octopamin erhöhten oder reduzierten die intrazelluläre Calcium-Konzentration in den AME-Neuronen, während Histamin und Glutamat die intrazelluläre Calcium-Konzentration ausschließlich reduzierten. Pharmakologische Experimente zeigten, dass die AME-Neurone ACh über ionotrope nikotinische ACh-Rezeptoren detektierten, während GABA über ionotrope GABAA-Rezeptoren und metabotrope GABAB-Rezeptoren detektiert wurde. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die circadiane Aktivität der Schabe durch verschiedene Eingänge, einschließlich ACh, GABA, Glutamat, Histamin, Octopamin und Serotonin, moduliert wird. Bei den FRET Studien wurde ein Proteinkinase A (PKA)-basierter FRET Sensor zur Detektion von cyclischem AMP (cAMP) verwendet. Es wurde gezeigt, dass PDF über Adenylylcyclase-abhängige und -unabhängige Signalwege wirken kann. Zusätzlich wurden Laufrad-Assays durchgeführt, um Phasenverschiebungen im Rhythmus der circadianen Laufaktivität zu detektieren, nachdem der Neurotransmitter Histamin zu verschiedenen circadianen Zeiten injiziert wurde. Histamin-Injektionen durch die Komplexaugen der Schabe ergaben eine biphasische Phasenantwortkurve (phase response curve) mit Phasenverzögerungen in der Laufaktivität am späten subjektiven Tag und am Beginn der subjektiven Nacht und Phasenbeschleunigungen in der späten subjektiven Nacht. Schließlich wurde eine extrazelluläre Ableittechnik an lebenden Schaben etabliert, die gleichzeitige Langzeit-Ableitungen von der AME, des Komplexauges (Elektroretinogramm = ERG), und der Beinmuskulatur (Elektromyogramm = EMG) für mehrere Tage ermöglichte. Diese Methode bietet einen Ausgangspunkt für weitere elektrophysiologische Untersuchungen des circadianen Systems der Schabe, in denen Substanzen (z.B. Neurotransmitter und Neuropeptide) analysiert werden können, die einen Einfluss auf den circadianen Rhythmus in der Laufaktivität haben

Apatite-Polymer Composite Particles for Controlled Delivery of BMP-2: In Vitro Release and Cellular Response

Bone morphogenetic protein-2 (BMP-2) has the ability to induce osteoblast differentiation of undifferentiated cells, resulting in the healing of skeletal defects when delivered with a suitable carrier. We have applied a versatile delivery platform comprising a novel composite of two biomaterials with proven track records – apatite and poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) – to the delivery of BMP-2. Sustained release of this growth factor was tuned with variables that affect polymer degradation and/or apatite dissolution, such as polymer molecular weight, polymer composition, apatite loading, and apatite particle size. The effect of released BMP-2 on C3H10T1/2 murine pluripotent mesenchymal cells was assessed by tracking the expression of osteoblastic makers, alkaline phosphatase (ALP) and osteocalcin. Release media collected over 100 days induced elevated ALP activity in C3H10T1/2 cells. The expression of osteocalcin was also upregulated significantly. These results demonstrated the potential of apatite-PLGA composite particles for releasing protein in bioactive form over extended periods of time.

Estabilització del color de la fracció cel·lular de sang de porc deshidratada per atomització

L’ús de colorants alimentaris pot ser controvertit, ja que la seva presència s’associa amb problemes provocats pel seu consum a llarg termini, o perquè es tem que siguin emprats per dissimular deficiències en la qualitat del producte. Aquesta preocupació és una tendència creixent entre els consumidors i ha portat a moltes empreses del sector alimentari a revisar la formulació dels seus productes i substituir, sempre que sigui econòmica i tecnològicament possible, els colorants artificials per colorants naturals. L’hemoglobina procedent de la sang dels escorxadors industrials podria ser una font important de colorant vermell natural degut a les grans quantitats generades diàriament. A més, s' evitaria que anés a parar a les aigües residuals. El seu ús com a colorant vermell natural queda supeditada al fet de trobar alguna substància o sistema capaç de protegir-la de l’oxidació durant el procés de deshidratació i el posterior període d’emmagatzematge ja que l’hemoglobina és poc estable i es poden produir canvis en el seu color. Inicialment l’hemoglobina presenta un color vermell brillant. La seva desoxigenació comporta un canvi a color porpra. I l’oxidació del ferro confereix a la molècula un indesitjable color marró. En l’estudi que aquí es presenta es pretén estabilitzar el color de l’hemoglobina de sang porcina tant durant la seva deshidratació per atomització com durant l’emmagatzematge a temperatura ambient de la pols obtinguda afegint al concentrat d’hemoglobina, prèviament a la deshidratació, combinacions de diferents substàncies que puguin actuar de manera complementària en l’estabilització del ferro hèmic enfront la seva oxidació. L’objectiu d’aquest treball és determinar si la seva combinació amb agents antioxidants comporta una millora en l’estabilització de la forma reduïda de l’hemoglobina tant durant la deshidratació per atomització com durant l’emmagatzematge de la pols a temperatura ambient

Cellular signals of cisplatin ototoxicity

Three separate theories of inhibiting cisplatin-induced apoptosis were investigated utilizing different cellular mechanisms. Specifically, the copper transport cycle, TRPV1, and the JNK pathway were inhibited and immunohistochemistry was performed to determine levels of apoptosis. All three resulted in statistically significant effects; increasing CuSO4 levels resulted in increased apoptosis, and inhibiting TRPV1