Heat stress impairs performance and induces intestinal inflammation in broiler chickens infected with Salmonella Enteritidis

Stressful situations reduce the welfare, production indices and immune status of chickens. Salmonella spp. are a major zoonotic pathogens that annually cause over 1 billion infections worldwide. We therefore designed the current experiment to analyse the effects of 31 +/- 1 degrees C heat stress (HS) (from 35 to 41 days) on performance parameters, Salmonella invasion and small intestine integrity in broiler chickens infected with Salmonella Enteritidis. We observed that HS decreased body weight gain and feed intake. However, feed conversion was only increased when HS was combined with Salmonella Enteritidis infection. In addition, we observed an increase in serum corticosterone levels in all of the birds that were subjected to HS, showing a hypothalamus-pituitary-adrenal axis activation. Furthermore, mild acute multifocal lymphoplasmacytic enteritis, characterized by foci of heterophil infiltration in the duodenum, jejunum and ileum, was observed in the HS group. In contrast, similar but more evident enteritis was noted in the heat-stressed and Salmonella-infected group. In this group, moderate enteritis was observed in all parts of the small intestine. Lastly, we observed an increase in Salmonella counts in the spleens of the stressed and Salmonella-infected chickens. The combination of HS and Salmonella Enteritidis infection may therefore disrupt the intestinal barrier, which would allow pathogenic bacteria to migrate through the intestinal mucosa to the spleen and generate an inflammatory infiltrate in the gut, decreasing performance parameters.

The effect of low-level laser irradiation (In-Ga-Al-AsP - 660 nm) on melanoma in vitro and in vivo

Abstract Background It has been speculated that the biostimulatory effect of Low Level Laser Therapy could cause undesirable enhancement of tumor growth in neoplastic diseases. The aim of the present study is to analyze the behavior of melanoma cells (B16F10) in vitro and the in vivo development of melanoma in mice after laser irradiation. Methods We performed a controlled in vitro study on B16F10 melanoma cells to investigate cell viability and cell cycle changes by the Tripan Blue, MTT and cell quest histogram tests at 24, 48 and 72 h post irradiation. The in vivo mouse model (male Balb C, n = 21) of melanoma was used to analyze tumor volume and histological characteristics. Laser irradiation was performed three times (once a day for three consecutive days) with a 660 nm 50 mW CW laser, beam spot size 2 mm2, irradiance 2.5 W/cm2 and irradiation times of 60s (dose 150 J/cm2) and 420s (dose 1050 J/cm2) respectively. Results There were no statistically significant differences between the in vitro groups, except for an increase in the hypodiploid melanoma cells (8.48 ± 1.40% and 4.26 ± 0.60%) at 72 h post-irradiation. This cancer-protective effect was not reproduced in the in vivo experiment where outcome measures for the 150 J/cm2 dose group were not significantly different from controls. For the 1050 J/cm2 dose group, there were significant increases in tumor volume, blood vessels and cell abnormalities compared to the other groups. Conclusion LLLT Irradiation should be avoided over melanomas as the combination of high irradiance (2.5 W/cm2) and high dose (1050 J/cm2) significantly increases melanoma tumor growth in vivo.

Transcriptional effects of 1,25 dihydroxyvitamin D3 physiological and supra-physiological concentrations in breast cancer organotypic culture

Background Vitamin D transcriptional effects were linked to tumor growth control, however, the hormone targets were determined in cell cultures exposed to supra physiological concentrations of 1,25(OH)2D3 (50-100nM). Our aim was to evaluate the transcriptional effects of 1,25(OH)2D3 in a more physiological model of breast cancer, consisting of fresh tumor slices exposed to 1,25(OH)2D3 at concentrations that can be attained in vivo. Methods Tumor samples from post-menopausal breast cancer patients were sliced and cultured for 24 hours with or without 1,25(OH)2D3 0.5nM or 100nM. Gene expression was analyzed by microarray (SAM paired analysis, FDR≤0.1) or RT-qPCR (p≤0.05, Friedman/Wilcoxon test). Expression of candidate genes was then evaluated in mammary epithelial/breast cancer lineages and cancer associated fibroblasts (CAFs), exposed or not to 1,25(OH)2D3 0.5nM, using RT-qPCR, western blot or immunocytochemistry. Results 1,25(OH)2D3 0.5nM or 100nM effects were evaluated in five tumor samples by microarray and seven and 136 genes, respectively, were up-regulated. There was an enrichment of genes containing transcription factor binding sites for the vitamin D receptor (VDR) in samples exposed to 1,25(OH)2D3 near physiological concentration. Genes up-modulated by both 1,25(OH)2D3 concentrations were CYP24A1, DPP4, CA2, EFTUD1, TKTL1, KCNK3. Expression of candidate genes was subsequently evaluated in another 16 samples by RT-qPCR and up-regulation of CYP24A1, DPP4 and CA2 by 1,25(OH)2D3 was confirmed. To evaluate whether the transcripitonal targets of 1,25(OH)2D3 0.5nM were restricted to the epithelial or stromal compartments, gene expression was examined in HB4A, C5.4, SKBR3, MDA-MB231, MCF-7 lineages and CAFs, using RT-qPCR. In epithelial cells, there was a clear induction of CYP24A1, CA2, CD14 and IL1RL1. In fibroblasts, in addition to CYP24A1 induction, there was a trend towards up-regulation of CA2, IL1RL1, and DPP4. A higher protein expression of CD14 in epithelial cells and CA2 and DPP4 in CAFs exposed to 1,25(OH)2D3 0.5nM was detected. Conclusions In breast cancer specimens a short period of 1,25(OH)2D3 exposure at near physiological concentration modestly activates the hormone transcriptional pathway. Induction of CYP24A1, CA2, DPP4, IL1RL1 expression appears to reflect 1,25(OH)2D3 effects in epithelial as well as stromal cells, however, induction of CD14 expression is likely restricted to the epithelial compartment.

Monitoramento por imagem de ressonância magnética do crescimento tumoral no modelo C6 de glioblastoma com perspectivas de avaliação da terapia de magnetohipertemia

Objetivo: Estabelecer um padrão de crescimento tumoral (volume) em ratos Wistar submetidos ao modelo C6 de glioblastoma multiforme por meio de imagens de ressonância magnética para posterior verificação de redução de volume tumoral com a terapia de magnetohipertermia. Métodos: Para o modelo C6, utilizamos ratos Wistar, machos, jovens, pesando entre 250 e 300 g. Após anestesiados (cetamina 55 mg/kg e xilazina 11 mg/kg) foram injetadas estereotaxicamente células tumorigênicas linhagem C6 suspensas em meio de cultura (105 células em 10 µL) no córtex frontal direito (coordenadas a partir do bregma: anteroposterior = 2,0 mm; látero-lateral = 3,0 mm; profundidade = 2,5 mm) com uma seringa Hamilton. No Grupo Controle, houve a injeção do meio de cultura sem as células. Posteriormente, foram feitas imagens mediante a técnica de imagem por ressonância magnética em 14, 21 e 28 dias após a injeção em um escâner de imagem por ressonância magnética 2.0 T (Bruker BioSpec, Germany). Para o exame, os animais foram anestesiados com cetamina 55 mg/kg e xilazina 11 mg/kg. Multifatias coronais foram adquiridas utilizando uma sequência spin-echo padrão com os seguintes parâmetros: TR/TE = 4,000 ms/67,1 ms, FOV = 3,50, Matrix 192, slice thickness = 0,4 mm e slice separation = 0 mm. Resultados: A análise das imagens de ressonância magnética do tumor possibilitou a clara visualização da massa tumoral, sendo possível ainda estabelecer parâmetros de volume tumoral nos diferentes dias analisados. O volume de 14 dias após a indução do foi de 13,7 ± 2,5 mm3 . Aos 21 dias, o volume alcançado foi de 31,7 ± 6,5 mm3 e, aos 28 dias, a massa tumoral atingiu 122,1 ± 11,8 mm3 . Conclusão: Estes resultados mostraram a possiblidade de avaliação do volume tumoral no modelo C6 em ratos, o que possibilitará, no futuro, a aplicação da terapia de magnetohipertermia bem como verificação de seus resultados.

Monitoramento in vivo por imagem por ressonância magnética de células C6 de glioma marcadas com nanopartículas superparamagnéticas de óxido de ferro

OBJECTIVE: The aim of the current study was to monitor the migration of superparamagnetic iron oxide nanoparticle (SPION)-labeled C6 cells, which were used to induce glioblastoma tumor growth in an animal model, over time using magnetic resonance imaging (MRI), with the goal of aiding in tumor prognosis and therapy. METHODS: Two groups of male Wistar rats were used for the tumor induction model. In the first group (n=3), the tumors were induced via the injection of SPION-labeled C6 cells. In the second group (n=3), the tumors were induced via the injection of unlabeled C6 cells. Prussian Blue staining was performed to analyze the SPION distribution within the C6 cells in vitro. Tumor-inducing C6 cells were injected into the right frontal cortex, and subsequent tumor monitoring and SPION detection were performed using T2- and T2*-weighted MRI at a 2T field strength. In addition, cancerous tissue was histologically analyzed after performing the MRI studies. RESULTS: The in vitro qualitative evaluation demonstrated adequate distribution and satisfactory cell labeling of the SPIONs. At 14 or 21 days after C6 injection, a SPION-induced T2- and T2*-weighted MRI signal reduction was observed within the lesion located in the left frontal lobe on parasagittal topography. Moreover, histological staining of the tumor tissue with Prussian Blue revealed a broad distribution of SPIONs within the C6 cells. CONCLUSION: MRI analyses exhibit potential for monitoring the tumor growth of C6 cells efficiently labeled with SPIONs.

Rag2-/-;gammac-/- immunodeficient mice, a new preclinical model to study antitumor approaches

Animal models have been relevant to study the molecular mechanisms of cancer and to develop new antitumor agents. Anyway, the huge divergence in mouse and human evolution made difficult the translation of the gained achievements in preclinical mouse based studies. The generation of clinically relevant murine models requires their humanization both concerning the creation of transgenic models and the generation of humanized mice in which to engraft a functional human immune system, and reproduce the physiological effects and molecular mechanisms of growth and metastasization of human tumors. In particular, the availability of genotypically stable immunodepressed mice able to accept tumor injection and allow human tumor growth and metastasization would be important to develop anti-tumor and anti-metastatic strategies. Recently, Rag2-/-;gammac-/- mice, double knockout for genes involved in lymphocyte differentiation, had been developed (CIEA, Central Institute for Experimental Animals, Kawasaki, Japan). Studies of human sarcoma metastasization in Rag2-/-; gammac-/- mice (lacking B, T and NK functionality) revealed their high metastatic efficiency and allowed the expression of human metastatic phenotypes not detectable in the conventionally used nude murine model. In vitro analysis to investigate the molecular mechanisms involved in the specific pattern of human sarcomas metastasization revealed the importance of liver-produced growth and motility factors, in particular the insulin-like growth factors (IGFs). The involvement of this growth factor was then demonstrated in vivo through inhibition of IGF signalling pathway. Due to the high growth and metastatic propensity of tumor cells, Rag2-/-;gammac-/- mice were used as model to investigate the metastatic behavior of rhabdomyosarcoma cells engineered to improve the differentiation. It has been recently shown that this immunodeficient model can be reconstituted with a human immune system through the injection of human cord blood progenitor cells. The work illustrated in this thesis revealed that the injection of different human progenitor cells (CD34+ or CD133+) showed peculiar engraftment and differentiation abilities. Experiments of cell vaccination were performed to investigate the functionality of the engrafted human immune system and the induction of specific human immune responses. Results from such experiments will allow to collect informations about human immune responses activated during cell vaccination and to define the best reconstitution and experimental conditions to create a humanized model in which to study, in a preclinical setting, immunological antitumor strategies.

Untersuchungen zur Charakterisierung der Bystander-Effekte bei einer in vivo Therapie mit Suizidgenen

Untersuchungen zur Charakterisierung der Bystander-Effekte bei einer in vivo Therapie mit Suizidgenen Bei Tumoren eines syngenen Prostatakarzinoms der Ratte (Dunning R3327 AT-1), die zuvor ex vivo mit einem Fusionsgen aus Cytosin Deaminase und Tymidinkinase (AT-1/CDglyTK) transfiziert wurden, konnte durch Kombinationsbehandlung mit Ganciclovir (GCV) und 5-Fluorocytosin (5-FC) komplette Remission und Langzeitüberleben erzielt werden. Dagegen ergaben sich bei Applikation nur einer Pro-Drug lediglich lokale Tumorkontrollraten von 83% (GCV) und 57% (5-FC). Noch geringere therapeutische Effekte einer Kombinationstherapie mit GCV und 5-FC wurden beobachtet, wenn in Anlehnung an die klinische Situation der Anteil suizidgen-tragender Zellen in den Tumoren auf < 20% abgesenkt wurde. Molekularbiologische Analysen dieser Mischtumore zeigen eine Verminderung membranständiger Connexinproteine, welche für den interzellulären Transport phosphorylierter GCV-Metabolite über Gap-junctions erforderlich sind. Pharmakodynamische Untersuchungen mittels 19F-NMR belegen eine effiziente Metabolisierung von 5-FC zu 5-Fluorouracil (5-FU) und den anschließenden Einbau der F-Nukleotide in die DNA. Dennoch sind die intrazellulären und sezernierten 5-FU Konzentrationen für eine Inaktivierung benachbarter Zellen im Sinne eines „lokalen-Bystander-Effektes“ nicht ausreichend. Bei gleichzeitiger Therapie von AT-1 und AT-1/CDglyTK Tumoren, kommt es nicht zur Regression des AT-1 Tumors und damit nicht zu einem „Distalen-Bystander-Effekt“. Dagegen führt die Induktion eines immunologischen Gedächtnisses zu deutlich verminderten Angehraten bei später injizierten AT-1 Tumoren. Die Suizidgen-Therapie ist ein erfolgversprechender Ansatz zur Behandlung maligner Erkrankungen, bei dem die lokalen und distalen Bystander-Effekte individueller Tumoren den therapeutischen Erfolg maßgeblich mitbestimmen.

Use of VEGFR-2 targeted microbubbles (BR55, Bracco imaging) for the early ultrasound evaluation of response to antiangiogenic treatment in a xenograft model of hepatocarcinoma

Aim: To evaluate the early response to treatment to an antiangiogenetic drug (sorafenib) in a heterotopic murine model of hepatocellular carcinoma (HCC) using ultrasonographic molecular imaging. Material and Methods: the xenographt model was established injecting a suspension of HuH7 cells subcutaneously in 19 nude mice. When tumors reached a mean diameter of 5-10 mm, they were divided in two groups (treatment and vehicle). The treatment group received sorafenib (62 mg/kg) by daily oral gavage for 14 days. Molecular imaging was performed using contrast enhanced ultrasound (CEUS), by injecting into the mouse venous circulation a suspension of VEGFR-2 targeted microbubbles (BR55, kind gift of Bracco Swiss, Geneve, Switzerland). Video clips were acquired for 6 minutes, then microbubbles (MBs) were destroyed by a high mechanical index (MI) impulse, and another minute was recorded to evaluate residual circulating MBs. The US protocol was repeated at day 0,+2,+4,+7, and +14 from the beginning of treatment administration. Video clips were analyzed using a dedicated software (Sonotumor, Bracco Swiss) to quantify the signal of the contrast agent. Time/intensity curves were obtained and the difference of the mean MBs signal before and after high MI impulse (Differential Targeted Enhancement-dTE) was calculated. dTE represents a numeric value in arbitrary units proportional to the amount of bound MBs. At day +14 mice were euthanized and the tumors analyzed for VEGFR-2, pERK, and CD31 tissue levels using western blot analysis. Results: dTE values decreased from day 0 to day +14 both in treatment and vehicle groups, and they were statistically higher in vehicle group than in treatment group at day +2, at day +7, and at day +14. With respect to the degree of tumor volume increase, measured as growth percentage delta (GPD), treatment group was divided in two sub-groups, non-responders (GPD>350%), and responders (GPD<200%). In the same way vehicle group was divided in slow growth group (GPD<400%), and fast growth group (GPD>900%). dTE values at day 0 (immediately before treatment start) were higher in non-responders than in responders group, with statistical difference at day 2. While dTE values were higher in the fast growth group than in the slow growth group only at day 0. A significant positive correlation was found between VEGFR-2 tissue levels and dTE values, confirming that level of BR55 tissue enhancement reflects the amount of tissue VEGF receptor. Conclusions: the present findings show that, at least in murine experimental models, CEUS with BR55 is feasable and appears to be a useful tool in the prediction of tumor growth and response to sorafenib treatment in xenograft HCC.

Konditionale Expression von HER-2, H-Ras oder BXB-Raf1 in einem Maustumormodell

Es ist bekannt, dass die Überexpression eines einzigen Onkogens im Tumorgewebe einen maligneren Phänotyp zur Folge haben kann. Ein Beispiel hierfür ist die Rezeptortyrosinkinase HER-2. Besonders in Mamma- und Ovarialkarzinomen tritt häufig eine HER-2 Überexpression auf, die mit einer schlechteren Prognose für die Patientinnen einhergeht. Die HER-2 blockierende Therapie mit Trastuzumab (Herceptin®) konnte zu einer signifikanten Verbesserung der Überlebenszeit bei Patientinnen mit metastasierendem Mammakarzinom führen. Es ist deshalb von großem Interesse herauszufinden, ob ein Tumor durch gezielte Blockade eines bestimmten Onkogens sein tumorigenes Potential verlieren kann, und dadurch das Tumorwachstum zumindest zeitweise unterbunden wird. Die Frage ist also, ob ein Tumor reversibel sein kann, wenn die Expression seiner Onkogene blockiert wird. Frühere Arbeiten meiner Arbeitsgruppe haben gezeigt, dass Tumore, die konditional humanes HER-2 exprimierten, nach Ausschalten von HER-2 tatsächlich in Remission gingen, d.h. reversibel waren. Tumorgrößenabhängig konnte sogar eine vollständige Tumorremission beobachtet werden. Die vorliegende Arbeit soll nun helfen, die beobachtete Remission nach Ausschalten von HER-2 besser verstehen zu können. Von Interesse sind dabei vor allem die molekularen Mechanismen, die in dem Tumor nach Ausschalten der HER-2 Expression ablaufen. Die konditionale Expression von HER-2 wurde mit Hilfe des TET-OFF Systems in NIH3T3 Mausfibroblasten erreicht. Mit dieser Technik wurde ein Maustumormodell etabliert, das ermöglichte, die Veränderungen in den Tumoren nach Ausschalten von HER-2 zu untersuchen. Ein besonderes Augenmerk wurde dabei auf zwei der durch HER-2 vermittelten Signalwege gerichtet, den Ras-MAP Kinase Signalweg und die Aktivierung von Akt über die Phosphoinositol-3 Kinase. Beide wurden nach Ausschalten der HER-2 Expression deaktiviert. Um herausfinden zu können, welcher der beiden Wege eine wichtigere Rolle bei der Tumorremission spielt, wurden in der vorliegenden Arbeit zwei weitere Maustumormodelle zur konditionalen Expression von humanem H-Ras bzw. einer Form des humanen c-Raf-1 (BXB-Raf1) etabliert. Die Modelle funktionierten auf dieselbe Weise wie das HER-2 Maustumormodell und es wurden auch dieselben Faktoren untersucht. Ras und Raf sind Mitglieder des Ras-MAP Kinase Signalweges. Raf ist aber im Gegensatz zu HER-2 und Ras nicht in der Lage, Akt zu aktivieren. Durch Vergleich der Ergebnisse der drei Maustumormodelle war es deshalb möglich zu differenzieren, ob Einflüsse auf die Tumorentwicklung über denn Ras-MAP Kinase oder den PI3K/Akt Signalweg vermittelt wurden. Auch Ausschalten von H-Ras oder BXB-Raf1 führte zu einer raschen Tumorremission. Damit wurde erneut die Frage nach der Reversibilität eines Tumors beantwortet. Ob die Remission auf einer Induktion von Apoptose beruhte, konnte nicht endgültig geklärt werden, da es zwar nach Ausschalten von HER-2 zu einer Erhöhung der Apoptoserate kam, nicht jedoch nach Ausschalten von H-Ras oder BXB-Raf1. Aufgrund der vorhandenen Ergebnisse wird vermutet, dass es zu einer Störung des Gleichgewichtes zwischen proliferationsfördernden und apoptotischen Faktoren nach Ausschalten der Onkogene kam. Die in den Tumoren vorhandene Spontanapoptose könnte dann ausreichen, den Prozess der Tumorremission auszulösen. Die Untersuchungen haben gezeigt, dass ERK bzw. der Ras-MAP Kinase Signalweg die bedeutendere Rolle bei der Tumorremission spielte. Zum einen wurde dies belegt durch die Beobachtung, dass die Tumorverläufe von HER-2 und BXB-Raf1 nahezu identisch waren. Zum anderen kam es in allen drei Modellen zu einer Dephosphorylierung von ERK, die der Tumorremission vorausging. Akt schien dagegen keine Rolle zu spielen, da das Ausschalten der HER-2, H-Ras oder BXB-Raf1 Expression zu keiner einheitlichen Veränderung des Posphorylierungsgrades von Akt führte. Demnach ist die Blockade des Ras-MAP Kinase Signalweges, der hauptsächlich proliferationsfördernde Eigenschaften besitzt, wichtiger für die Tumorremission als die Blockade des PI3K/Akt Signalweges, der hauptsächlich anti-apoptotische Eigenschaften vermittelt.

Konditionale Modellsysteme zur Untersuchung der ERBB2-induzierten Tumorgenese

Konditionale Modellsysteme zur Untersuchung der ERBB2-induzierten Tumorgenese Die Rezeptor-Tyrosinkinase ERBB2 ist in einer Vielzahl epithelialer Tumore, wie Mamma- und Ovarialkarzinomen, überexprimiert. Diese erhöhte Expression korreliert mit aggressivem Tumorwachstum, verstärkter Metastasierung und schlechter Prognose für den Patienten. Zur genaueren Untersuchung molekularer Mechanismen, die zur Tumorentstehung infolge der ERBB2-Überexpression führen, wurden im Rahmen dieser Arbeit mit Hilfe des Tet-Systems induzierbare MCF-7 Zelllinien generiert. Diese exprimieren bei Gabe von Doxyzyklin ERBB2 bzw. die zum humanen ERBB2 homologe und durch Punktmutation onkogen aktivierte Rattenvariante NeuT. Nachdem die stringente Regulierbarkeit durch Doxyzyklin für die untersuchten Zellklone gezeigt werden konnte, stellte sich bei der Charakterisierung der Zelllinien heraus, dass die Induktion von ERBB2 erstaunlicherweise nicht zur Proliferation der Zellen, sondern zum Wachstumsarrest führt. Bei der Untersuchung verschiedener Zellzyklusregulatoren konnte dieser Zellzyklusarrest dem CDK-Inhibitor P21 zugeordnet werden, dessen Expression durch ERBB2 induziert wird. In P21-Antisense-Experimenten konnte nachgewiesen werden, dass P21 eine Schlüsselrolle beim ERBB2-induzierten Zellzyklusarrest spielt. Neben der Induktion von P21 und der daraus resultierenden Wachstumsinhibition zeigten die Zellen starke morphologische Veränderungen und waren positiv beim Nachweis der Seneszenz-assoziierten -Galaktosidase. Erstmals konnte gezeigt werden, dass die Induktion des Onkogens ERBB2 nicht zur Proliferation, sondern zur Aktivierung eines verfrühten Seneszenz-Programms führt, welches der Zelle Schutz gegen die Onkogeneinwirkung bietet. Bei der Untersuchung verschiedener Signaltransduktionskaskaden mit Inhibitormolekülen konnte die Aktivierung dieses Seneszenz-Programms der Stress-aktivierten Proteinkinase P38 zugeordnet werden. Zur Identifizierung von Genen, die für die ERBB2-induzierte Tumorgenese relevant sind, wurde die differenzielle Genexpression eines NeuT-Klons nach 8- bzw. 48-stündiger Induktion mit Doxyzyklin in einem cDNA-Array untersucht. Dabei zeigte sich eine besonders starke Induktion von Integrin 5 und Integrin 1, die zusammen den Fibronektinrezeptor bilden. Der funktionale Nachweis des Rezeptors in einem Adhäsionsassay demonstrierte ein stark erhöhtes Adhäsionsverhalten ERBB2-überexprimierender Zellen an Fibronektin. Bei der Untersuchung von Mamma-, Ovarial- und Endometriumkarzinomen konnte die Expression von ERBB2 mit der von Integrin 5 korreliert werden. Diese Ergebnisse machen Integrin 5 zu einem potenziellen neuen Tumormarker und Therapieziel in ERBB2-überexprimierenden Tumoren. Ein weiteres interessantes Gen, das sich im Array durch ERBB2 überexprimiert zeigte, war die Matrix-Metalloproteinase MMP-9. In einem Zymografieassay konnte die erhöhte Gelatinaseaktivität von MMP-9 in Dox-induzierten Zellen nachgewiesen werden. Der Einsatz verschiedener Signaltransduktionsinhibitoren ergab, dass auch die ERBB2-induzierte Expression von MMP-9 über die Aktivierung von P38 läuft. Bei der Suche nach weiteren MMPs, die für die ERBB2-induzierte Tumorgenese relevant sein könnten, wurde MMP-13 untersucht. Erstmals konnte gezeigt werden, dass diese Matrix-Metalloproteinase von ERBB2 induziert wird. Dieser interessante Befund wurde auch in einem anderen Zellmodell in NIH3T3 Mausfibroblasten verifiziert. Durch ihre Matrix-degradierenden Eigenschaften sind MMPs potente „Werkzeuge“ für Tumorzellen und stellen ein wichtiges Ziel zur Unterbindung der Invasion und Metastasierung dieser Zellen dar. Neben den Zellkulturarbeiten wurden im Rahmen dieser Dissertation transgene Responder-Mäuse generiert, die NeuT unter Kontrolle eines Tet-responsiven Promotors exprimieren. Von vier transgenen Gründerlinien zeigten zwei eine unerwünschte, basale NeuT-Expression, für die beiden anderen Linien konnte sowohl in MEF-Assays, als auch nach Kreuzung mit rtTA- bzw. tTA-Effektor-Mäusen eine Dox-abhängige Regulation des Transgens gezeigt werden. Die Tiere dieser Linien sollen in Zukunft mit Effektor-Mäusen gepaart werden, die den rtTA bzw. tTA spezifisch in für die ERBB2-Tumorgenese relevanten Geweben, wie Ovarial- oder Lungenepithelzellen, exprimieren. So können individuelle Tumormodelle für die verschiedenen epithelialen Tumore, bei denen die Überexpression von ERBB2 von Bedeutung ist, entwickelt und untersucht werden.

Synthese, Radioiodierung und Evaluierung von neuen MGMT-Inhibitoren und ihren Glucose-Konjugaten

Eine häufige Art der Chemotherapie ist die Behandlung von Tumoren mit alkylierenden oder chloralkylierenden Zytostatika, die eine Alkylierung von Guanin in der DNA verursachen. Daraus resultieren eine Blockierung der DNA-Synthese und ein Rückgang im Tumorwachstum. Das Enzym O6-Methylguanin-DNA-methyltransferase (MGMT) ist in der Lage, solche Schäden zu reparieren. Da MGMT auch in verschiedenen Tumorarten exprimiert wird, eine Tatsache, die therapeutische Effekte verringern könnte, wird zur Zeit die Gabe von Inhibitoren der MGMT, wie O6-Benzylguanin, vor der eigentlichen Chemotherapie untersucht. Um möglicher Weise die Selektivität dieser Verbindungen für Tumor- vs. gesundem Gewebe und auch die in vivo-Eigenschaften zu verbessern, wurden glycosylierte Inhibitoren vorgeschlagen. Für eine Entwicklung neuer MGMT-Inhibitoren wäre es hilfreich, die in vivo Bioverteilung in Tier und Mensch durch eine Markierung mit geeigneten Isotopen verfolgen zu können. Im Moment existiert keine Möglichkeit, den MGMT-Status eines Tumors nicht-invasiv zu visualisieren. Diese Information kann sehr wichtig für die Planung einer Chemotherapie mit alkylierenden oder chloralkylierenden Zytostatika sein. Mit Methoden wie der Positronen-Emissions-Tomographie (PET) oder der Einzel-Photonen-Emissions-Tomographie (SPECT) ist eine nicht-invasive Quantifizierung von biochemischen Prozessen prinzipiell möglich. Hierfür wurden verschiedenen MGMT-Inhibitoren bereits mit Isotopen wie Fluor-18, Kohlenstoff-11 un Iod-131 markiert, aber sie waren aus unterschiedlichen Gründen nicht geeignet. Das Ziel dieser Arbeit war die Entwicklung von neuen O6-derivatisierten Guaninen, die über einen C8-Spacer an der N9-Position des Guanins mit einer Glucose-Einheit konjugiert werden sollten, geeigneten Markierungsvorläufern und Radioiodierungs-Methoden. Durch Wahl eines geeigneten Radioiodisotops für die Markierung des Restes an der O6-Position des Guanins kann die ex vivo-Bioverteilung dieser Verbindungen in tumortragenden Nacktmäusen (Iod-131) und die Untersuchung der in vivo-Verteilung (Iod-123) durchgeführt werden. Daher wurden O6-(5-Iodothenyl)- (ITG) und O6-(3-Iodbenzyl)guanin-Derivate (IBG) sowie ihre Glucose-Konjugate ITGG und IBGG synthetisiert. Von diesen inaktiven Standard-Verbindungen wurden die IC50-Werte zur MGMT bestimmt. Da sie alle im nM-Bereich lagen, schienen die Verbindungen für weitere Untersuchungen geeignet zu sein. Die Radiomarkierung der Inhibitoren mit Iod-131 bzw. Iod-123 wurde durch Umsetzung der Trialkyl-stannylierten Markierungsvorläufer mit der Chloramin T-Methode in mittleren (Iod-123) bis hohen (Iod-131) radiochemischen Ausbeuten und mit hohen radiochemischen Reinheiten durchgeführt. Mit den 131I-iodierten Verbindungen wurde die spezifische Bindung zur MGMT nachgewiesen, eine Eigenschaft, die essentiell für eine weitere Verwendung dieser Derivate ist. Sie wurden auch zur Bestimmung der ex vivo-Tumor- und Organverteilung in tumortragenden Nacktmäusen (MEX(+), MEX(-), Glioblastom) verwendet. In allen Fällen war die Tumoraufnahme der nicht-konjugierten Guanin-Derivate höher als die der entsprechenden Glucose-Konjugate. Das Tumor-Blut-Verhältnis, das sehr wichtig für einen potentiellen Einsatz der Verbindungen als Tracer des MGMT-Status eines Tumors ist, variierte abhängig von der Kinetik. Zu allen Zeitpunkten war die in vivo-Deiodierung der Glucose-Konjugate deutlich geringer als die von ITG oder IBG. Unter Verwendung von [131I]IBG und [131I]IBGG wurde die Biodistribution nach Inhibition der Natrium-abhängigen Glucose-Transporter, die zumindests teilweise für die Aufnahme der MGMT-Inhibitoren in Zellen verantwortlich sind, durch Phloretin untersucht. Einen Unterschied in der Tumoraufnahme zwischen den mit Phloretin behandelten und den unbehandelten Mäusen konnte nicht beobachtet werden, wahrscheinlich weil die Akkumulation im Tumor generell niedrig war. Mit den 123I-iodierten Verbindungen [123I]IBG und [123I]IBGG wurden in vivo-Scans an tumortragenden Nacktmäusen (MEX(+), MEX(-)) mit einer Kleintier-SPECT-Kamera durchgeführt. In beiden Fällen wurde eine geringe Akkumulation in den Tumoren im Vergleich zu anderen Organen beobachtet, was die ex vivo-Biodistributionsdaten bestätigte.

New molecular approaches to control rhabdomyosarcoma onset and metastasis in preclinical systems

Rhabdomyosarcoma is the most common soft tissue sarcoma of childhood. The aim of this study was to identify molecular events involved in rhabdomyosarcoma onset for the development of new therapeutic approaches against specific molecular targets. BALB-p53neu mice develop pelvic rhabdomyosarcoma and combines the activation of HER-2/neu oncogene with the inactivation of an allele of p53 oncosuppressor gene. Gene expression profiling led to the identification of genes potentially involved in rhabdomyosarcoma genesis and therefore of candidate targets. The pattern of expression of p53, HER-2/neu, CDKN2A/p19ARF and IGF-2 suggested that these alterations might be involved in gender-, site- and strain-specific development of rhabdomyosarcoma. Other genes such as CDKN1A/p21 might be involved. The role of IGF-2, CDKN2A/p19ARF and CDKN1A/p21 in tumor growth was investigated with siRNA in murine rhabdomyosarcoma cells. Silencing of p19ARF and p21 induced inhibition of growth and of migration ability, indicating a possible pro-tumor and pro-metastatic role in rhabdomyosarcoma in absence of p53. In addition the autocrine IGF-2/IGF-1R loop found in early phases of cancer progression strengthens its key role in sustaining rhabdomyosarcoma growth. As rhabdomyosarcoma displays defective myogenic differentiation, a therapeutic approach aimed at enhancing myogenic differentiation of rhabdomyosarcoma cells. Forced expression of myogenin was able to restore myogenic differentiation, significantly reduced cell motility and impaired tumor growth and metastatic spread. IL-4 treatment increased rhabdomyosarcoma cell growth, decreased myogenin expression and promoted migration of cells lacking myogenin. Another approach was based on small kinase inhibitors. Agents specifically targeting members of the HER family (Lapatinib), of the IGF system (NVP-AEW541) or downstream signal transducers (NVP-BEZ235) were investigated in vitro in human rhabdomyosarcoma cell lines as therapeutic anti-tumor and anti-metastatic tools. The major effects were obtained with NVP-BEZ235 treatment that was able to strongly inhibit cell growth in vitro and showed anti-metastatic effects in vivo.

Valutazione preclinica di nuovi potenziali bersagli terapeutici per la cura del medulloblastoma.

Il medulloblastoma (MB) è il tumore più comune del sistema nervoso centrale. Attualmente si riesce a curare solo il 50-60% dei pazienti che tuttavia presentano gravi effetti collaterali dovuti alle cure molto aggressive. Una recente classificazione molecolare ha ridistribuito le varianti più comuni di MB in quattro distinti gruppi. In particolare, il gruppo SHH e D sono caratterizzati da un’ alta espressione di MYCN ed associati a prognosi sfavorevole. MYCN è coinvolto nella regolazione della proliferazione cellulare, differenziazione, apoptosi, angiogenesi e metastasi. L’obiettivo di questo lavoro è la valutazione dell’attività antitumorale di oligonucleotidi diretti contro MYCN, sia in vitro su diverse linee cellulari di MB che in vivo in modelli murini xenograft ortotopici di MB. I risultati hanno dimostrato un’ottima inibizione della crescita in linee cellulari di MB, accompagnata da una riduzione della trascrizione genica e dei livelli proteici di MYCN. Inoltre, sono stati confermati tramite RT-PCR alcuni dei geni trovati significativamente variati nell’esperimento di microarray , dopo il trattamento. Molto interessanti sono stati geni quali BIRC5, che risulta down regolato mentre il gene p21 risulta up regolato in tutte le linee cellulari di MB utilizzate. Inoltre, sono stati generati modelli murini di MB utilizzando cellule precedentemente trasfettate per esprimere il gene della luciferasi e valutarne così la crescita tumorale tramite imaging bioluminescente in vivo (BLI), al fine di poter testare l’attività antitumorale data dagli oligonucleotidi. I risultati hanno dimostrato una buona risposta al trattamento come rilevato dalla tecnica di BLI. I dati preliminari prodotti, dimostrano che MYCN potrebbe esser un buon target per la terapia del MB nei casi in cui è overespresso. In particolare, una sua inibizione potrebbe presentare effetti indesiderati moderati in quanto è poco espresso dopo la nascita.

Modulation of hypoxia-inducible factors as a therapeutic target for multiple myeloma

Hypoxia-inducible factor-1 alpha (HIF-1α) plays a critical role in survival and is associated with poor prognosis in solid tumors. The role of HIF-1α in multiple myeloma is not completely known. In the present study, we explored the effect of EZN2968, an locked nucleic acid antisense oligonucleotide against HIF-1α, as a molecular target in MM. A panel of MM cell lines and primary samples from MM patients were cultured in vitro in the presence of EZN2968 . Under normoxia culture condition, HIF-1α mRNA and protein expression was detectable in all MM cell lines and in CD138+ cells from newly diagnosed MM patients samples. Significant up-regulation of HIF-1α protein expression was observed after incubation with IL6 or IGF-I, confirming that HIF-1α can be further induced by biological stimuli. EZN2968 efficiently induces a selective and stable down-modulation of HIF-1α and decreased the secretion of VEGF released by MM cell. Treatment with EZN2968 gave rise to a progressive accumulation of cells in the S and subG0 phase. The analysis of p21, a cyclin-dependent kinase inhibitors controlling cell cycle check point, shows upregulation of protein levels. These results suggest that HIF-1α inhibition is sufficient for cell cycle arrest in normoxia, and for inducing an apoptotic pathways.. In the presence of bone marrow microenvironment, HIF-1α inhibition blocks MAPK kinase pathway and secretion of pro-surviaval cytokines ( IL6,VEGF,IL8) In this study we provide evidence that HIF-1α, even in the absence of hypoxia signal, is expressed in MM plasma cells and further inducible by bone marrow milieu stimuli; moreover its inhibition is sufficient to induce a permanent cell cycle arrest. Our data support the hypothesis that HIF-1α inhibition may suppress tumor growth by preventing proliferation of plasma cells through p21 activation and blocking pro-survival stimuli from bone marrow microenvironment.

Respiratory chain complex I dysfunction in tumorigenesis

Diseases due to mutations in mitochondrial DNA probably represent the most common form of metabolic disorders, including cancer, as highlighted in the last years. Approximately 300 mtDNA alterations have been identified as the genetic cause of mitochondrial diseases and one-third of these alterations are located in the coding genes for OXPHOS proteins. Despite progress in identification of their molecular mechanisms, little has been done with regard to the therapy. Recently, a particular gene therapy approach, namely allotopic expression, has been proposed and optimized, although the results obtained are rather controversial. In fact, this approach consists in synthesis of a wild-type version of mutated OXPHOS protein in the cytosolic compartment and in its import into mitochondria, but the available evidence is based only on the partial phenotype rescue and not on the demonstration of effective incorporation of the functional protein into respiratory complexes. In the present study, we took advantage of a previously analyzed cell model bearing the m.3571insC mutation in MTND1 gene for the ND1 subunit of respiratory chain complex I. This frame-shift mutation induces in fact translation of a truncated ND1 protein then degraded, causing complex I disassembly, and for this reason not in competition with that allotopically expressed. We show here that allotopic ND1 protein is correctly imported into mitochondria and incorporated in complex I, promoting its proper assembly and rescue of its function. This result allowed us to further confirm what we have previously demonstrated about the role of complex I in tumorigenesis process. Injection of the allotopic clone in nude mice showed indeed that the rescue of complex I assembly and function increases tumor growth, inducing stabilization of HIF1α, the master regulator of tumoral progression, and consequently its downstream gene expression activation.