Microstructure and mechanical properties of carbon nanotube reinforced cementitious composites developed using a novel dispersion technique

The authors also acknowledge Centre for Textile Science and Technology (University of Minho) and FIBRENAMICS PLATFORMfor providing required conditions for this research. Sincere thanks are also due to Mr. Pedro Samuel Leite and Mr. Carlos Jesus for their kind help in sample preparation and testing.

Influence of the hip joint modeling approaches on the kinematics of human gait

The influence of the hip joint formulation on the kinematic response of the model of human gait is investigated throughout this work. To accomplish this goal, the fundamental issues of the modeling process of a planar hip joint under the framework of multibody systems are revisited. In particular, the formulations for the ideal, dry, and lubricated revolute joints are described and utilized for the interaction of femur head inside acetabulum or the hip bone. In this process, the main kinematic and dynamic aspects of hip joints are analyzed. In a simple manner, the forces that are generated during human gait, for both dry and lubricated hip joint models, are computed in terms of the system’s state variables and subsequently introduced into the dynamics equations of motion of the multibody system as external generalized forces. Moreover, a human multibody model is considered, which incorporates the different approaches for the hip articulation, namely ideal joint, dry, and lubricated models. Finally, several computational simulations based on different approaches are performed, and the main results presented and compared to identify differences among the methodologies and procedures adopted in this work. The input conditions to the models correspond to the experimental data capture from an adult male during normal gait. In general, the obtained results in terms of positions do not differ significantly when the different hip joint models are considered. In sharp contrast, the velocity and acceleration plotted vary significantly. The effect of the hip joint modeling approach is clearly measurable and visible in terms of peaks and oscillations of the velocities and accelerations. In general, with the dry hip model, intra-joint force peaks can be observed, which can be associated with the multiple impacts between the femur head and the cup. In turn, when the lubricant is present, the system’s response tends to be smoother due to the damping effects of the synovial fluid.

Preparação de suspensões aquosas de nanopartículas de carbono para deposição em superfícies

Dissertação de mestrado integrado em Engenharia de Materiais

Protein-based nanodevices for therapeutic applications

Tese de Doutoramento em Biologia Molecular e Ambiental (área de especialização em Biologia Celular e Saúde).

Development and characterization of lipid-based nanosystems for controlled release of bioactive compounds

Tese de Doutoramento em Engenharia Química e Biológica.

Folate-targeted nanoparticles for rheumatoid arthritis therapy

Rheumatoid arthritis (RA) is the most common inflammatory rheumatic disease, affecting almost 1% of the world population. Although the cause of RA remains unknown, the complex interaction between immune mediators (cytokines and effector cells) is responsible for the joint damage that begins at the synovial membrane. Activated macrophages are critical in the pathogenesis of RA and have been shown to specifically express a receptor for the vitamin folic acid (FA), folate receptor (FR). This particular receptor allows internalization of FA-coupled cargo. In this review we will address the potential of nanoparticles as an effective drug delivery system for therapies that will directly target activated macrophages. Special attention will be given to stealth degree of the nanoparticles as a strategy to avoid clearance by macrophages of the mononuclear phagocytic system (MPS). This review summarizes the application of FA-target nanoparticles as drug delivery systems for RA and proposes prospective future directions.

Insights on the mechanical behavior of keratin fibrils

Supplementary data associated with this article can be found,in the online version, at http://dx.doi.org/10.1016/j.ijbiomac.2016.05.018.

Preparació i caracterització de materials mesoporosos en sistemes tensioactius

Estudi elaborat a partir d’una estada a la Universitat Nacional de Yokohama des de maig fins a mitjans de juny del 2006. S'ha estudiat el comportament fàssic i la preparació de sílica mesoporosa pels nous tensioactius fluorats d'estructura C8F17SO2(C3H7)N(C2H4O)nH (abreujat C8F17(EO)n. El tensioactiu C8F17(EO)n forma micel•les allargades i cristalls líquids en aigua, i per tant pot ser adequat per a la preparació de materials mesoporosos. Sílica mesoestructurada es va preparar pel mètode de precipitació per autoagregació cooperativa. Un estudi sistemàtic es va realitzar, investigant la influència de les concentracions de tensioactiu i precursor (TEOS), l’efecte del pH i de la longitud de cadena de poliòxid d’etilè. Els materials es van caracteritzar per raigs X a angle petit (SAXS), sorció de nitrògen i TEM. Els materials obtinguts presenten diàmetres de por petits i parets de por gruixudes. A més, aquests materials posseeixen altes superfícies específiques, que s’han obtingut emprant concentracions de tensioactiu petites, produint parets de por robustes sense microporositat significativa. La superfície específica es manté durant el procés de calcinació, malgrat un petit encongiment degut a l’entrecreuament de la sílica. Els materials de sílica obtinguts han mostrat ser significativament més robustos que altres materials similars descrits a la bibliografia, com la sílica MCM-41.

First Report of a Newborn Rat Ventilation Model for Bronchopulmonary Dysplasia Permitting Evaluation of Long-Term Outcome

Background: Bronchopulmonary dysplasia (BPD) remains the leading cause of chronic pulmonary morbidity among preterm neonates. However, the exact pathophysiology is still unknown. Here we present the first results from a new model inteAbstracts, 25th International Workshop on Surfactant Replacement 400 Neonatology 2010;97:395-400 grating the most common risk factors for BPD (lung immaturity, inflammation, mechanical ventilation (MV), oxygen), which allows long-term outcome evaluation due to a non-traumatic intubation procedure. Objectives: To test the feasibility of a new rat model by investigating effects of MV, inflammation and oxygen applied to immature lungs after a ventilation-free interval. Methods: On day 4, 5, or 6 newborn rats were given an intraperitoneal injection of lipopolysaccharides to induce a systemic inflammation. 24 h later they were anesthetized, endotracheally intubated and ventilated for 8 h with 60% oxygen. After weaning of anesthesia and MV the newborn rats were extubated and returned to their mothers. Two days later they were killed and outcome measurements were performed (histology, quantitative RT-PCR) and compared to animals investigated directly after MV. Results: Directly after MV, histological signs of ventilator-induced lung injury were found. After 48 h, the first signs of early BPD were seen with delayed alveolar formation. Expression of inflammatory genes was only transiently increased. After 48 h genes involved in alveolarization, such as matrix metalloproteinase-9 and tropoelastin, showed a significant change of their expression. Conclusion: For the first time we can evaluate in a newborn rat model the effects of MV after a ventilation-free interval. This allows discrimination between immediate response genes and delayed changes of expression of more structural genes involved in alveolarization.

On the use of reporter bacteria for measuring availability of organic contaminants

Natural environments are constantly challenged by the release of hydrophobic organic contaminants, which represent a threat for both the ecosystem and human health. Despite a substantial degradation by naturally occurring micro-organisms, a non negligible fraction of these pollutants tend to persist in soil and sediments due to their reduced accessibility to microbial degraders. This lack of 'bioavailability' is acknowledged as a key parameter for the natural and stimulated clean-up (bioremediation) of contaminated sites. We developed a bacterial bioreporter that responds to the presence of polyaromatic hydrocarbons (PAHs) by the production of the green fluorescent protein (GFP), based on the PAH-degrading bacterium Burkholderia sartisoli. We showed in this study that the bacterial biosensor B. sartisoli strain RP037 was faithfully reporting the degradation of naphthalene and phenanthrene (two PAHs of low molecular weight) via the production of GFP. What is more, the magnitude of GFP induction was influenced by change in the PAH flux triggered by a variety of physico-chemical parameters, such as the contact surface between the pollutant and the aqueous suspension. Further experiments permitted to test the influence of dissolved organic matter, which is an important component of natural habitats and can interact with organic pollutants. In addition, we tested the influence of two types of biosurfactants (tensio-active agents produced by living organisms) on phenanthrene's degradation by RP037. Interestingly, the surfactant's effects on the biodegradation rate appeared to depend on the type of biosurfactant and probably on the type of bacterial strain. Finally, we tagged B. sartisoli strain RP037 with a constitutively expressed mCherry fluorescent protein. The presence of mCherry allowed us to visualize the bacteria in complex samples even when GFP production was not induced. The new strain RP037-mChe embedded in a gel patch was used to detect PAH fluxes from a point source, such as a non-aqueous liquid or particles of contaminated soil. In parallel, we also developed and tested a so-called multiwell bacterial biosensor platform, which permitted the simultaneous use of four different reporter strains for the detection of major crude oil components (e.g., saturated hydrocarbons, mono- and polyaromatics) in aqueous samples. We specifically constructed the strain B. sartisoli RP007 (pPROBE-phn-luxAB) for the detection of naphthalene and phenanthrene. It was equipped with a reporter plasmid similar to the one in strain RP037, except that the gfp gene was replaced by the genes luxAB, which encoded the bacterial luciferase. The strain was implemented in the biosensor platform and detected an equivalent naphthalene concentration in oil spilled-sea water. We also cloned the gene for the transcriptional activator AlkS and the operator/promoter region of the operon alkSB1GHJ from the alkane-degrader bacterium Alcanivorax borkumensis strain SK2 in order to construct a new bacterial biosensor with higher sensitivity towards long-chain alkanes. However, the resulting strain showed no increased light emission in presence of tetradecane (C14), while it still efficiently reported low concentrations of octane (C8). RÉSUMÉ : Les écosystèmes naturels sont constamment exposés à nombre de contaminants organiques hydrophobes (COHs) d'origine industrielle, agricole ou même naturelle. Les COHs menacent à la fois l'environnement, le bien-être des espèces animales et végétales et la santé humaine, mais ils peuvent être dégradés par des micro-organismes tels que les bactéries et les champignons, qui peuvent être capables des les transformer en produits inoffensifs comme le gaz carbonique et l'eau. La biodégradation des COHs est cependant fréquemment limitée par leur pauvre disponibilité envers les organismes qui les dégradent. Ainsi, bien que la biodégradation opère partiellement, les COHs persistent dans l'environnement à de faibles concentrations qui potentiellement peuvent encore causer des effets toxiques chroniques. Puisque la plupart des COHs peuvent être métabolisés par l'activité microbienne, leur persistance a généralement pour origine des contraintes physico-chimiques plutôt que biologiques. Par exemple, leur solubilité dans l'eau très limitée réduit leur prise par des consommateurs potentiels. De plus, l'adsorption à la matière organique et la séquestration dans les micropores du sol participent à réduire leur disponibilité envers les microbes. Les processus de biodisponibilité, c'est-à-dire les processus qui gouvernent la dissolution et la prise de polluants par les organismes vivants, sont généralement perçus comme des paramètres clés pour la dépollution (bioremédiation) naturelle et stimulée des sites contaminés. Les hydrocarbures aromatiques polycycliques (HAPs) sont un modèle de COH produits par les activités aussi bien humaines que naturelles, et listés comme des contaminants chroniques de l'air, des sols et des sédiments. Ils peuvent être dégradés par un vaste nombre d'espèces bactériennes mais leur taux de biodégradation est souvent limité par les contraintes mentionnées ci-dessus. Afin de comprendre les processus de biodisponibilité pour les cellules bactériennes, nous avons décidé d'utiliser les bactéries elles-mêmes pour détecter et rapporter les flux de COH. Ceci a été réalisé par l'application d'une stratégie de conception visant à produire des bactéries `biocapteurs-rapporteurs', qui littéralement s'allument lorsqu'elles détectent un composé cible pour lequel elles ont été conçues. En premier lieu, nous nous sommes concentrés sur Burkholderia sartisoli (souche RP007), une bactérie isolée du sol et consommatrice de HAP .Cette souche a servi de base à la construction d'un circuit génétique permettant la formation de la protéine autofluorescente GFP dès que les cellules détectent le naphtalène ou le phénanthrène, deux HAP de faible masse moléculaire. En effet, nous avons pu montrer que la bactérie obtenue, la souche RP037 de B. sartisoli, produit une fluorescence GFP grandissante lors d'une exposition en culture liquide à du phénanthrène sous forme cristalline (0.5 mg par ml de milieu de culture). Nous avons découvert que pour une induction optimale il était nécessaire de fournir aux cellules une source additionnelle de carbone sous la forme d'acétate, ou sinon seul un nombre limité de cellules deviennent induites. Malgré cela, le phénanthrène a induit une réponse très hétérogène au sein de la population de cellules, avec quelques cellules pauvrement induites tandis que d'autres l'étaient très fortement. La raison de cette hétérogénéité extrême, même dans des cultures liquides mélangées, reste pour le moment incertaine. Plus important, nous avons pu montrer que l'amplitude de l'induction de GFP dépendait de paramètres physiques affectant le flux de phénanthrène aux cellules, tels que : la surface de contact entre le phénanthrène solide et la phase aqueuse ; l'ajout de surfactant ; le scellement de phénanthrène à l'intérieur de billes de polymères (Model Polymer Release System) ; la dissolution du phénanthrène dans un fluide gras immiscible à l'eau. Nous en avons conclu que la souche RP037 détecte convenablement des flux de phénantrène et nous avons proposé une relation entre le transfert de masse de phénanthrène et la production de GFP. Nous avons par la suite utilisé la souche afin d'examiner l'effet de plusieurs paramètres chimiques connus dans la littérature pour influencer la biodisponibilité des HAP. Premièrement, les acides humiques. Quelques rapports font état que la disponibilité des HAP pourrait être augmentée par la présence de matière organique dissoute. Nous avons mesuré l'induction de GFP comme fonction de l'exposition des cellules RP037 au phénanthrène ou au naphtalène en présence ou absence d'acides humiques dans la culture. Nous avons testé des concentrations d'acides humiques de 0.1 et 10 mg/L, tandis que le phénanthrène était ajouté via l'heptamethylnonane (HMN), un liquide non aqueux, ce qui au préalable avait produit le plus haut flux constant de phénanthrène aux cellules. De plus, nous avons utilisé des tests en phase gazeuse avec des concentrations d'acides humiques de 0.1, 10 et 1000 mg/L mais avec du naphtalène. Contrairement à ce que décrit la littérature, nos résultats ont indiqué que dans ces conditions l'expression de GFP en fonction de l'exposition au phénanthrène dans des cultures en croissance de la souche RP037 n'était pas modifiée par la présence d'acides humiques. D'un autre côté, le test en phase gazeuse avec du naphtalène a montré que 1000 mg/L d'acides humiques abaissent légèrement mais significativement la production de GFP dans les cellules de RP037. Nous avons conclu qu'il n'y a pas d'effet général des acides humiques sur la disponibilité des HAP pour les bactéries. Par la suite, nous nous sommes demandé si des biosurfactants modifieraient la disponibilité du phénanthrène pour les bactéries. Les surfactants sont souvent décrits dans la littérature comme des moyens d'accroître la biodisponibilité des COHs. Les surfactants sont des agents tensio-actifs qui augmentent la solubilité apparente de COH en les dissolvant à l'intérieur de micelles. Nous avons ainsi testé si des biosurfactants (des surfactants produits par des organismes vivants) peuvent être utilisé pour augmenter la biodisponibilité du phénanthrène pour la souche B. sartisoli RP037. Premièrement, nous avons tenté d'obtenir des biosurfactants produits par une autre bactérie vivant en co-culture avec les biocapteurs bactériens. Deuxièmement, nous avons utilisé des biosurfactants purifiés. La co-cultivation en présence de la bactérie productrice de lipopeptide Pseudomonas putida souche PCL1445 a augmenté l'expression de GFP induite par le phénanthrène chez B. sartisoli en comparaison des cultures simples, mais cet effet n'était pas significativement différent lorsque la souche RP037 était co-cultivée avec un mutant de P. putida ne produisant pas de lipopeptides. L'ajout de lipopeptides partiellement purifiés dans la culture de RP037 a résulté en une réduction de la tension de surface, mais n'a pas provoqué de changement dans l'expression de GFP. D'un autre côté, l'ajout d'une solution commerciale de rhamnolipides (un autre type de biosurfactants produits par Pseudomonas spp.) a facilité la dégradation du phénanthrène par la souche RP037 et induit une expression de GFP élevée dans une plus grande proportion de cellules. Nous avons ainsi conclu que les effets des biosurfactants sont mesurables à l'aide de la souche biocapteur, mais que ceux-ci sont dépendants du type de surfactant utilisé conjointement avec le phénanthrène. La question suivante que nous avons abordée était si les tests utilisant des biocapteurs peuvent être améliorés de manière à ce que les flux de HAP provenant de matériel contaminé soient détectés. Les tests en milieu liquide avec des échantillons de sol ne fournissant pas de mesures, et sachant que les concentrations de HAP dans l'eau sont en général extrêmement basses, nous avons conçu des tests de diffusion dans lesquels nous pouvons étudier l'induction par les HAPs en fonction de la distance aux cellules. Le biocapteur bactérien B. sartisoli souche RP037 a été marqué avec une seconde protéine fluorescente (mCherry), qui est constitutivement exprimée dans les cellules et leur confère une fluorescence rouge/rose. La souche résultante RP037-mChe témoigne d'une fluorescence rouge constitutive mais n'induit la fluorescence verte qu'en présence de naphtalène ou de phénanthrène. La présence d'un marqueur fluorescent constitutif nous permet de visualiser les biocapteurs bactériens plus facilement parmi des particules de sol. Un test de diffusion a été conçu en préparant un gel fait d'une suspension de cellules mélangées à 0.5 % d'agarose. Des bandes de gel de dimensions 0.5 x 2 cm x 1 mm ont été montées dans des chambres d'incubation et exposées à des sources de HAP (soit dissouts dans du HMN ou en tant que matériel solide, puis appliqués à une extrémité de la bande). En utilisant ce montage expérimental, le naphtalène ou le phénanthrène (dissouts dans du HMN à une concentration de 2.5 µg/µl) ont induit un gradient d'intensité de fluorescence GFP après 24 heures d'incubation, tandis que la fluorescence mCherry demeurait comparable. Un sol contaminé par des HAPs (provenant d'un ancien site de production de gaz) a induit la production de GFP à un niveau comparable à celui du naphtalène. Des biocapteurs bactériens individuels ont également détecté un flux de phénanthrène dans un gel contenant des particules de sol amendées avec 1 et 10 mg/g de phénanthrène. Ceci a montré que le test de diffusion peut être utilisé pour mesurer des flux de HAP provenant de matériel contaminé. D'un autre côté, la sensibilité est encore très basse pour plusieurs sols contaminés, et l'autofluorescence de certains échantillons rend difficile l'identification de la réponse de la GFP chez les cellules. Pour terminer, un des points majeurs de ce travail a été la production et la validation d'une plateforme multi-puits de biocapteurs bactériens, qui a permis l'emploi simultané de plusieurs souches différentes de biocapteurs pour la détection des constituants principaux du pétrole. Pour cela nous avons choisi les alcanes linéaires, les composés mono-aromatiques, les biphényls et les composés poly-aromatiques. De plus, nous avons utilisé un capteur pour la génotoxicité afin de détecter la `toxicité globale' dans des échantillons aqueux. Plusieurs efforts d'ingénierie ont été investis de manière à compléter ce set. En premier lieu, chaque souche a été équipée avec soit gfp, soit luxAB en tant que signal rapporteur. Deuxièmement, puisqu'aucune souche de biocapteur n'était disponible pour les HAP ou pour les alcanes à longues chaînes, nous avons spécifiquement construit deux nouveaux biocapteurs. L'un d'eux est également basé sur B. sartisoli RP007, que nous avons équipé avec le plasmide pPROBE-phn-luxAB pour la détection du naphtalène et du phénanthrène mais avec production de luciférase bactérienne. Un autre est un nouveau biocapteur bactérien pour les alcanes. Bien que nous possédions une souche Escherichia coli DHS α (pGEc74, pJAMA7) détectant les alcanes courts de manière satisfaisante, la présence des alcanes à longues chaînes n'était pas rapportée efficacement. Nous avons cloné le gène de l'activateur transcriptionnel A1kS ainsi que la région opérateur/promoteur de l'opéron alkSB1GHJ chez la bactérie dégradant les alcanes Alcanivorax borkumensis souche SK2, afin de construire un nouveau biocapteur bactérien bénéficiant d'une sensibilité accrue envers les alcanes à longues chaînes. Cependant, la souche résultante E. coli DHSα (pAlk3} n'a pas montré d'émission de lumière augmentée en présence de tétradécane (C14), tandis qu'elle rapportait toujours efficacement de basses concentrations d'octane (C8). De manière surprenante, l'utilisation de A. borkumensis en tant que souche hôte pour le nouveau plasmide rapporteur basé sur la GFP a totalement supprimé la sensibilité pour l'octane, tandis que la détection de tétradécane n'était pas accrue. Cet aspect devra être résolu dans de futurs travaux. Pour calibrer la plateforme de biocapteurs, nous avons simulé une fuite de pétrole en mer dans une bouteille en verre ouverte de 5L contenant 2L d'eau de mer contaminée avec 20 ml (1%) de pétrole brut. La phase aqueuse a été échantillonée à intervalles réguliers après la fuite durant une période allant jusqu'à une semaine tandis que les principaux contaminants pétroliers étaient mesurés via les biocapteurs. L'émission de bioluminescence a été mesurée de manière à déterminer la réponse des biocapteurs et une calibration intégrée faite avec des inducteurs types a servi à calculer des concentrations d'équivalents inducteurs dans l'échantillon. E. coli a été utilisée en tant que souche hôte pour la plupart des spécificités des biocapteurs, à l'exception de la détection du naphtalène et du phénanthrène pour lesquels nous avons utilisé B. sartisoli. Cette souche, cependant, peut être employée plus ou moins selon la même procédure. Il est intéressant de noter que le pétrole répandu a produit une apparition séquentielle de composés dissouts dans la phase aqueuse, ceux-ci .étant détectables par les biocapteurs. Ce profil contenait d'abord les alcanes à courtes chaînes et les BTEX (c'est-à dire benzène, toluène, éthylbenzène et xylènes), apparaissant entre des minutes et des heures après que le pétrole a été versé. Leurs concentrations aqueuses ont par la suite fortement décru dans l'eau échantillonnée après 24 heures, à cause de la volatilisation ou de la biodégradation. Après quelques jours d'incubation, ces composés sont devenus indétectables. Les HAPs, en revanche, sont apparus plus tard que les alcanes et les BTEX, et leur concentration a augmenté de pair avec un temps d'incubation prolongé. Aucun signal significatif n'a été mis en évidence avec le biocapteur pour le biphényl ou pour la génotoxicité. Ceci démontre l'utilité de ces biocapteurs, spécifiquement pour la détection des composés pétroliers, comprenant les alcanes à courtes chaînes, les BTEX et les HAPs légers.

Experimental approaches in the targeting of photodynamic therapeutics

RÉSUMÉ : Chez l'homme, le manque de sélectivité des agents thérapeutiques représente souvent une limitation pour le traitement des maladies. Le ciblage de ces agents pour un tissu défini pourrait augmenter leur sélectivité et ainsi diminuer les effets secondaires en comparaison d'agents qui s'accumuleraient dans tout le corps. Cela pourrait aussi améliorer l'efficacité des traitements en permettant d'avoir une concentration localisée plus importante. Le ciblage d'agents thérapeutiques est un champ de recherche très actif. Les stratégies sont généralement basées sur les différences entre cellules normales et malades. Ces différences peuvent porter soit sur l'expression des molécules à leurs surfaces comme des récepteurs ou des transporteurs, soit sur les activités enzymatiques exprimées. Le traitement thérapeutique choisi ici est la thérapie photodynamique et est déjà utilisé pour le traitement de certains cancers. Cette thérapie repose sur l'utilisation de molécules qui réagissent à la lumière, les photosensibilisants. Elles absorbent l'énergie lumineuse et réagissent avec l'oxygène pour former des radicaux toxiques pour les cellules. Les photosensibilisants utilisés ici sont de deux natures : (i) soit ils sont tétrapyroliques (comme les porphyrines et chlorines), c'est à dire qu'ils sont directement activables par la lumière ; (ii) soit ce sont des prodrogues de photosensibilisants comme l'acide 5aminolévulinique (ALA) qui est transformé dans la cellule en protoporphyrine IX photosensibilisante. Dans le but d'augmenter la sélectivité des photosensibilisants, nous avons utilisé deux stratégies différentes : (i) le photosensibilisant est modifié par le greffage d'un agent de ciblage ; (ii) le photosensibilisant est incorporé dans des structures moléculaires de quelques centaines de nanomètres. Les sucres et l'acide folique sont des agents de ciblage largement établis et ont été utilisés ici car leurs récepteurs sont surexprimés à la surface de nombreuses cellules malades. Ainsi, des dérivés sucres ou acide folique de l'ALA ont été synthétisés et évalués in vitro sur de nombreuses lignées cellulaires cancéreuses. La stratégie utilisant l'acide folique est apparue incompatible avec l'utilisation de l'ALA puisque aucune photosensibilité n'a été induite par le composé. La stratégie utilisant les sucres a, par ailleurs, provoquée de bonnes photosensibilités mais pas d'augmentation de sélectivité. En parallèle, la combinaison entre les propriétés anticancéreuses des complexes métalliques au ruthénium avec les propriétés photosensibilisantes des porphyrines, a été évaluée. En effet, les thérapies combinées ont émergé il y a une dizaine d'années et représentent aujourd'hui de bonnes alternatives aux monothérapies classiques. Des ruthenium(I1)-arènes complexés avec la tetrapyridylporphyrine ont ainsi présenté de bonnes cytotoxicités et de bonnes phototoxicités pour des cellules de mélanomes. Des porphyrines ont aussi été compléxées avec des noyaux de diruthénium et ce type de dérivé a présenté de bonnes phototoxicités et une bonne sélectivité pour les cellules cancéreuses de l'appareil reproducteur féminin. L'incorporation de photosensibilisants tétrapyroliques a finalement été effectuée en utilisant des nanoparticules (NP) biocompatibles composées de chitosan et de hyaluronate. L'effet de ces NP a été évalué pour le traitement de la polyarthrite rhumatoïde (PR). Les NP ont d'abord été testées in vitro avec des macrophages de souris et les résultats ont mis en évidence de bonnes sélectivités et photosensibilités pour ces cellules. In vivo chez un modèle marin de la PR, l'utilisation de ces NP a révélé un plus grand temps de résidence des NP dans le genou de la souris en comparaison du temps obtenu avec le photosensibilisant seul. Le traitement par PDT a aussi démontré une bonne efficacité par ailleurs égale à celle obtenue avec les corticoïdes utilisés en clinique. Pour finir, les NP ont aussi démontré une bonne efficacité sur les myelomonocytes phagocytaires humains et sur les cellules contenues dans le liquide synovial de patients présentant une PR. Tous ces résultats suggèrent que les deux stratégies de ciblage peuvent être efficaces pour les agents thérapeutiques. Afm d'obtenir de bons résultats, il est toutefois nécessaire de réaliser une analyse minutieuse de la cible et du mode d'action de l'agent thérapeutique. Concernant les perspectives, la combinaison des deux stratégies c'est à dire incorporer des agents thérapeutiques dans des nanostructures porteuses d'agents de ciblage, représente probablement une solution très prometteuse. SUMMARY : In humans, the lack of selectivity of drugs and their high effective concentrations often represent limitations for the treatment of diseases. Targeting the therapeutical agents to a defined tissue could enhance their selectivity and then diminish their side effects when compared to drugs that accumulate in the entire body and could also improve treatment efûciency by allowing a localized high concentration of the agents. Targeting therapeutics to defined cells in human pathologies is a main challenge and a very active field of research. Strategies are generally based on the different behaviors and patterns of expression of diseased cells compared to normal cells such as receptors, proteases or trans-membrane carriers. The therapeutic treatment chosen here is the photodynamic therapy and is already used in the treatment of many cancers. This therapy relies on the administration of a photosensitizer (PS) which will under light, react with oxygen and induce formation of reactive oxygen species which are toxic for cells. The PSs used here are either tetrapyrolic (i. e. porphyries and chlorins) or prodrugs of PS (5-aminolevulinic acid precursor of the endogenous protoporphyrin Imo. In order to improve PS internalization and selectivity, we have used two different strategies: the modification of the PSs with diseased cell-targeting agents as well as their encapsulation into nanostructures. Sugars and folic acid are well established as targeting entities for diseased cells and were used here since their transporters are overexpressed on the surface of many cancer cells. Therefore sugar- and folic acid-derivatives of 5-aminolevulinic acid (ALA) were synthesized and evaluated in vitro in several cancer cell lines. The folic acid strategy appeared to be incompatible with ALA since no photosensitivity was induced while the strategy with sugars induced good photosensitivites but no increase of selectivity. Alternatively, the feasibility of combining the antineoplastic properties of ruthenium complexes with the porphyrin's photosensitizing properties, was evaluated since combined therapies have emerged as good alternatives to classical treatments. Tetrapyridylporphyrins complexed to ruthenium (I17 arenes presented good cytotoxicities and good phototoxicities toward melanoma cells. Porphyries were also complexed to diruthenium cores and this type of compound presented good phototoxicities and good selectivity for female reproductive cancer cells. The encapsulation of tetrapyrolic PSs was finally investigated using biocompatible nanogels composed of chitosan and hyaluronate. The behavior of these nanoparticles was evaluated for the treatment of rheumatoid arthritis (RA). They were first tested in vitro in mouse macrophages and results revealed good selectivities and phototoxicities toward these cells. In vivo in mice model of RA, the use of such nanoparticles instead of free PS showed longer time of residence in mice knees. Photodynamic protocols also demonstrated good efficiency of the treatment comparable to the corticoid injection used in the clinic. Finally our system was also efficient in human cells using phagocytic myelomonocytes or using cells of synovial fluids taken from patients with RA. Altogether, these results revealed that both strategies of modification or encapsulation of drugs can be successful in the targeting of diseased cells. However, a careful analysis of the target and of the mode of action of the drug, are needed in order to obtain good results. Looking ahead to the future, the combination of the two strategies (i.e. drugs loaded into nanostructures bearing the targeting agents) would represent probably the best solution.

Nanoparticle reactivity toward dithiothreitol

Hazard determination of nanoparticles (NP) is challenging and should be based on a predictive and pragmatic tier approach. The biological effects of NP appear to be related not only to surface/size but also to their ability to generate free radicals/oxidants. We propose that the measurement of this property by acellular assays could be helpful for NP toxicity screening. This study investigated the effect of dispersing conditions on the oxidative capacity of a small selection of carbonaceous NP toward dithiothreitol (DTT). Increasing surfactant concentration decreased the DTT reactivity on these studied particles. Afterward, a panel of NP were studied under constant conditions. Classification of the NP panel based on their DTT reactivity was found to be dependent on the metric used (mass or surface) but not on the surfactant type. The DTT assay may be useful for an initial evaluation of the hazardousness of manufactured or unintentionally produced NP. However, the predictive potential of such a test towards biological effects still needs to be evaluated. [Authors]

Apoptosis as a target for gene therapy in rheumatoid arthritis

Rheumatoid arthritis (RA) is characterized by chronic inflammation of the synovial joints resulting from hyperplasia of synovial fibroblasts and infiltration of lymphocytes, macrophages and plasma cells, all of which manifest signs of activation. All these cells proliferate abnormally, invade bone and cartilage, produce an elevated amount of pro-inflammatory cytokines, metalloproteinases and trigger osteoclast formation and activation. Some of the pathophysiological consequences of the disease may be explained by the inadequate apoptosis, which may promote the survival of autoreactive T cells, macrophages or synovial fibroblasts. Although RA does not result from single genetic mutations, elucidation of the molecular mechanisms implicated in joint destruction has revealed novel targets for gene therapy. Gene transfer strategies include inhibition of pro-inflammatory cytokines, blockade of cartilage-degrading metalloproteinases, inhibition of synovial cell activation and manipulation of the Th1-Th2 cytokine balance. Recent findings have iluminated the idea that induction of apoptosis in the rheumatoid joint can be also used to gain therapeutic advantage in the disease. In the present review we will discuss different strategies used for gene transfer in RA and chronic inflammation. Particularly, we will highlight the importance of programmed cell death as a novel target for gene therapy using endogenous biological mediators, such as galectin-1, a beta-galactoside-binding protein that induces apoptosis of activated T cells and immature thymocytes.

Arthritis is linked to local and systemic activation of coagulation and fibrinolysis pathways.

BACKGROUND: Activation of coagulation and fibrinolysis play a role in the pathophysiology of experimental arthritis. Objective: To determine the extent of activation of the coagulation and fibrinolytic pathways in different joint diseases in humans and to ascertain the factors that may influence fibrin deposition within the joint. METHODS: Plasma from normal subjects (controls, n= 21) and plasma and synovial fluid samples from patients with rheumatoid arthritis (RA; n = 64), osteoarthritis (OA; n = 29), spondyloarthropathy (SpA; n = 22) and crystal arthritis (CA; n = 25) were analyzed for the levels of TF (tissue factor) and tissue factor pathway inhibitor (TFPI) activities, thrombin-antithrombin III (TAT) complexes, and F1 + 2 (thrombin fragment), fibrin d-dimer and thrombin-activated fibrinolysis inhibitor (TAFI) antigenic levels. The measurements were analyzed by pairwise correlation with each other as well as with standard parameters of inflammation [C-reactive protein (CRP), joint leukocyte count]. Inter-group comparisons were performed to look for disease-specific differences. RESULTS: Compared with healthy controls, patients with joint diseases had higher levels of TAT, F1 + 2 and d-dimers in their plasma. In the synovial fluid, TF activity, TAT, d-dimers, and TAFI were significantly higher in inflammatory arthritides than in OA. The levels were highest in RA patients. In the plasma, TF activity was correlated with TAT and d-dimer levels with CRP, TFPI, and TAT. In the synovial fluid, TF activity correlated with plasma CRP levels, synovial fluid leukocyte count, and synovial TAT and TAFI levels. In addition, synovial d-dimers correlated with CRP, and synovial TAFI levels were correlated with synovial F1 + 2 and TAT. CONCLUSIONS: Activation of the coagulation and fibrinolytic cascades in the joint and in the circulation is evident in both inflammatory and degenerative joint diseases. Within the joint, inflammatory mechanisms leading to TF-mediated activation of the coagulation pathway and subsequent fibrin deposition is the most likely explanation for the observed findings. In the plasma, the link between inflammation (CRP increase) and TF activation is weak, and a non-TF-mediated mechanism of coagulation activation could explain these findings. RA is characterized by significantly higher levels of TAT in the synovial fluid and plasma than other arthritides. Although fibrinolytic activity is linked to inflammation, the increased amounts of TAFI in the joint, particularly in RA, may explain why fibrin formation is so prominent in this condition compared with other joint diseases.

Escherichia coli variants in periprosthetic joint infection: diagnostic challenges with sessile bacteria and sonication.

The diagnostic yield of prosthetic joint-associated infection is hampered by the phenotypic change of bacteria into a sessile and resistant form, also called biofilm. With sonication, adherent bacteria can be dislodged from the prosthesis. Species identification may be difficult because of their variations in phenotypic appearance and biochemical reaction. We have studied the phenotypic, genotypic, and biochemical properties of Escherichia coli variants isolated from a periprosthetic joint infection. The strains were collected from synovial fluid, periprosthetic tissue, and fluid from the explanted and sonicated prosthesis. Isolates from synovial fluid revealed a normal phenotype, whereas a few variants from periprosthetic tissue and all isolates from sonication fluid showed different morphological features (including small-colony variants). All isolates from sonication fluid were beta-galactosidase negative and nonmotile; most were indole negative. Because of further variations in biochemical properties, species identification was false or not possible in 50% of the isolates included in this study. In contrast to normal phenotypes, variants were resistant to aminoglycosides. Typing of the isolates using pulsed-field gel electrophoresis yielded nonidentical banding patterns, but all strains were assigned to the same clonal origin when compared with 207 unrelated E. coli isolates. The bacteria were repeatedly passaged on culture media and reanalyzed. Thereafter, most variants reverted to normal phenotype and regained their motility and certain biochemical properties. In addition, some variants displayed aminoglycoside susceptibility after reversion. Sonication of an explanted prosthesis allows insight into the lifestyle of bacteria in biofilms. Since sonication fluid also reveals dislodged sessile forms, species identification of such variants may be misleading.