Exercise stress testing in healthy subjects during cholinergic stimulation after a single dose of pyridostigmine

OBJETIVE: The evaluation, by exercise stress testing, of the cardiorespiratory effects of pyridostigmine (PYR), a reversible acetylcholinesterase inhibitor. METHODS: A double-blind, randomized, cross-over, placebo-controlled comparison of hemodynamic and ventilation variables of 10 healthy subjects who underwent three exercise stress tests (the first for adaptation and determination of tolerance to exercise, the other two after administration of placebo or 45mg of PYR). RESULTS: Heart rate at rest was: 68±3 vs 68±3bpm before and after placebo, respectively (P=0.38); 70±2 vs 59±2bpm, before and after pyridostigmine, respectively (P<0.01). During exercise, relative to placebo: a significantly lower heart rate after PYR at, respectively, 20% (P=0.02), 40% (P=0.03), 80% (P=0.05) and 100% (P=0.02) of peak effort was observed. No significant differences were observed in arterial blood pressure, oxygen consumption at submaximal and maximal effort, exercise duration, respiratory ratio, CO2 production, ventilation threshold, minute ventilation, and oxygen pulse. CONCLUSION: Pyridostigmine, at a dose of 45mg, decreases heart rate at rest and during exercise, with minimal side effects and without interfering with exercise tolerance and ventilation variables.

Toxicity induced by a metal mixture (Cd, Pb and Zn) in the yeast Pichia kudriavzevii: The role of oxidative stress

The present work aims to contribute for the elucidation of the role of oxidative stress in the toxicity associated with the exposure of Pichia kudriavzevii to multi-metals (Cd, Pb and Zn). Cells of the non-conventional yeast P. kudriavzevii exposed for 6 h to the action of multi-metals accumulated intracellular reactive oxygen species (ROS), evaluated through the oxidation of the probe 2,7-dichlorodihydrofluorescein diacetate. A progressive loss of membrane integrity (monitored using propidium iodide) was observed in multi-metal-treated cells. The triggering of intracellular ROS accumulation preceded the loss of membrane integrity. These results suggest that the disruption of membrane integrity can be attributed to the oxidative stress. The exposure of yeast cells to single metal showed that, under the concentrations tested, Pb was the metal responsible for the induction of the oxidative stress. Yeast cells coexposed to an antioxidant (ascorbic acid) and multi-metals did not accumulate intracellular ROS, but loss proliferation capacity. Together, the data obtained indicated that intracellular ROS accumulation contributed to metal toxicity, namely for the disruption of membrane integrity of the yeast P. kudriavzevii. It was proposed that Pb toxicity (the metal responsible for the toxic symptoms under the conditions tested) result from the combination of an ionic mechanism and the intracellular ROS accumulation.

Mother's stress, mood and emotional involvement with the infant: 3 months before and 3 months after childbirth

Adverse effects of maternal anxiety and depression are well documented, namely on the foetus/child behaviour and development, but not as much attention has been given to the mother's emotional involvement with the offspring. To study mother's prenatal and postpartum stress, mood and emotional involvement with the infant, the State-Trait Anxiety Inventory, the Edinburgh Postnatal Depression Scale and the Mother-to-Infant Bonding Scale were filled in and cortisol levels were measured, 3 months before and 3 months after childbirth, in a sample of 91 Portuguese women. From pregnancy to the postpartum period, mother's cortisol levels, anxiety and emotional involvement toward the child decrease. No significant change was observed regarding mother's depression. Mother's depression predicted a worse emotional involvement before childbirth, while mother's anxiety predicted a worse emotional involvement with the infant after childbirth. Additionally, pregnant women with a worse emotional involvement with the offspring are at risk of poorer emotional involvement with the infant and higher anxiety and depression at 3 months postpartum. It should be given more attention to mother's poor emotional involvement with the offspring during pregnancy, as it interferes with her emotional involvement with the infant and her psychological adjustment 3 months after childbirth.

Stress, cognitive appraisal, and psychological health: testing instruments for health professionals

The job of health professionals, including nurses, is considered inherently stressful (Lee & Wang, 2002; Rutledge et al., 2009), and thus it is important to improve and develop specific measures that are sensitive to the demands that health professionals face. This study analysed the psychometric properties of three instruments that focus on the professional experiences of nurses in aspects related to occupational stress, cognitive appraisal, and mental health issues. The evaluation protocol included the Stress Questionnaire for Health Professionals (SQHP; Gomes, 2014), the Cognitive Appraisal Scale (CAS; Gomes, Faria, & Gonçalves, 2013), and the General Health Questionnaire-12 (GHQ-12; Goldberg, 1972). Validity and reliability issues were considered with statistical analysis (i.e. confirmatory factor analysis, convergent validity, and composite reliability) that revealed adequate values for all of the instruments, namely, a six-factor structure for the SQHP, a five-factor structure for the CAS, and a two-factor structure for the GHQ-12. In conclusion, this study proposes three consistent instruments that may be useful for analysing nurses’ adaptation to work contexts.

Stress During ACLS Courses: Is it Important for Learning Skills?

OBJECTIVE: To determine the influence of stress on teaching medical emergencies in an Advanced Cardiac Life Support (ACLS) course and to verify this influence on learning, and the efficiency of emergency care training. METHODS: Seventeen physicians signed up for an ACLS course. Their pulses were taken and blood pressure (BP) verified on the first day, before the beginning of the course, and on the second day, during the theoretical and practical test (TPT). Variations in pulse rates and BP were compared with students' test grades. Then, students answered a questionnaire of variables (QV) about the amount of sleep they had during the course, the quantity of study material and the time spent studying for the course, and a stress scale graphic. RESULTS: Seven students had a pulse variation less than 10% between the 2 periods and 10 had a 10% or more variation. Grades on TPT were, respectively, 91.4±2.4 and 87.3±5.2 (p<0.05). Six students had a BP variation less than 20 mmHg, and in 11 it varied more than 21 mmHg. Grades on the TPT were 92.3±3.3 and 86.2± 8.1, respectively (p<0.05). The QV dates did not significantly influence grades. CONCLUSION: Stress, as an isolated variable, had a negative influence on the learning process and on the efficiency of emergency training in this situation.

Fisiología de pre y post-cosecha en ajo (Allium sativum L.) en cv. Rosado, Blanco y Colorado

En base a los trabajos realizados a nivel de fisiología de pre-cosecha, se continúa con los objetivos específicos referentes a las relaciones nutricionales en lo que respecta a fertilización nitrogenada y condición del nitrógeno en el suelo. Todo ello a fin de relacionar los períodos críticos en el ciclo del cultivo sometido a diferentes tratamientos de fertilización. Se continuará con el desarrollo del Modelo de pronóstico de crecimiento y rendimiento del cultivo de ajo, extendiendo a futuro datos del cultivo a productores. Los estudios de post-cosecha han avanzado en la determinación de distintos índices de carácter bioquímico y fisiológico a fin de tomar decisiones en relación a la calidad del ajo que se consume y se exporta. El objetivo de este trabajo es: - Determinar que el período crítico para la fertilización nitrogenada es el comprendido entre el inicio del crecimiento aéreo y llenado del bulbo y depende principalmente de las condiciones edáficas.

Importancia del Ca2+ en la fisiología espermática: modulación de su actividad por progesterona y proteínas del plasma seminal. Importance of calcium in sperm physiology: its regulation by progesterone and proteins from the seminal plasma.

El objetivo general del proyecto es estudiar el efecto de la progesterona y de algunas proteínas del plasma seminal sobre la actividad del Ca2+ en diferentes procesos fisiológicos que ocurren en el espermatozoide, los cuales están estrechamente relacionados con la capacidad fertilizante de esta célula. La progesterona, principal esteroide secretado por las células del cumulus oophorus, ejerce su efecto a través de un receptor no-genómico provocando aumento en el calcio intracelular de los espermatozoides y, consecuentemente, promoviendo la capacitación, la respuesta quimiotáctica y la exocitosis acrosomal. Pese a estas observaciones, los mecanismos a través de los cuales la progesterona estimula fenómenos tan diversos en el espermatozoide son aún desconocidos. Tampoco se conoce con exactitud el papel funcional y los mecanismos de acción de algunas proteínas del plasma seminal que interaccionan y se unen a los espermatozoides, con alta especificidad, durante la eyaculación. Por lo tanto, resulta altamente interesante profundizar los estudios sobre las propiedades funcionales de las proteínas caltrin (calcium transport inhibitor) y ß-microseminoprotein (MSP) del plasma seminal de mamíferos, las cuales responden a las características mencionadas. Los estudios hasta ahora realizados han dado cuenta de que caltrin inhibe la incorporación de Ca2+ extracelular, previene la exocitosis acrosomal espontánea y promueve la unión espermatozoide-zona pelúcida. También hay datos preliminares que sugieren un efecto inhibitorio sobre la movilidad hiperactivada de los espermatozoides. Respecto a MSP, sólo se sabe que inhibe la exocitosis acrosomal espontánea y que su contenido, en el plasma seminal, guarda una relación inversa con la fertilidad. Por todo lo expuesto, se propone estudiar los mecanismos de acción de la progesterona y las proteínas caltrin y MSP sobre los procesos fisiológicos antes indicados. Para ello, se estudiarán las variaciones de Ca2+ intracelular en espermatozoides individuales sometidos a diferentes tratamientos (gradientes de progesterona, capacitación en presencia y ausencia de caltrin y/o MSP, etc.), usando video microscopía de fluorescencia y análisis computarizado de imágenes. También se examinará la influencia de estas moléculas sobre la interacción de gametas y la fertilización.

Mecanismos neurobiologicos involucrados en la sensibilizacion emocional inducida por abstinencia a drogas de abuso y estrés. Neurobiological mechanisms involved in emotional sensitization induced by withdrawal from drugs of abuse and stress.

El objetivo principal de este proyecto es estudiar los mecanismos neurobiológicos involucrados en el proceso de sensibilización emocional inducido por la abstinencia a drogas de abuso o por la exposición a un estímulo estresante de caracteristicas incontrolables. El modelo animal de sensibilización a utilizar en este proyecto es la facilitación en la formación de memoria de miedo producida por dichos tratamientos. Nuestra hipótesis sugiere que este proceso es el resultado de un mecanismo desinhibitorio de las interneuronas GABAérgicas del complejo basolateral de la amigdala. Por lo tanto se proponen los siguientes experimentos: 1) El estudio del curso temporal del efecto facilitador sobre la formación de una nueva memoria de miedo luego de la abstinencia a drogas o la exposición a un estímulo estresante (inmovilización). 2) La evaluación de la liberación"in vivo" de dopamina del complejo basolateral de la amigdala durante la adquisición y la expresión de la memoria de miedo en animales previamente expuestos a la abstinencia o al estres. 3) El estudio de la infusión local de antagonistas de receptores dopaminérgicos en el complejo basolateral de la amígdala (BLA) o en el nucleo central de la amígdala (CeA) antes del estrés sobre la adquisición y la expresión de una memoria de miedo. 4) La determinación de la actividad de ERK 1/2 y CREB en el complejo basolateral de la amigdala o en el nucleo central de la amígdala durante la adquisición y la expresión de una memoria de miedo en animales abstinentes o estresados. 5)El estudio de la infusión local de inhibidores de la MEK 1/2 en el complejo basolateral de la amigdala o en el nucleo central de la amígdala antes del estrés sobre la adquisición y la expresión de una memoria de miedo. La facilitación para generar memorias de miedo podría ser un componente crítico del síndrome de abstinencia al etanol responsable de las altas tasas de recurrencia asociadas con el alcoholismo. Por lo tanto se investigará el efecto de la evocación de la memoria de miedo sobre la autoadministración de etanol utilizando un paradigma de libre elección entre agua y soluciones de concentración creciente de etanol en animales en abstinencia al etanol. Con el objeto de investigar si las propiedades reforzantes del etanol están involucradas en el potencial aumento de la ingesta de etanol inducido por la evocación de una memoria de miedo, se evaluará el efecto reforzante de etanol utilizando el paradigma de preferencia por un contexto asociado al etanol.

Fisiología de la Transferencia Pasiva de Inmunidad en Equinos. Physiology of the Transfer of Passive Immunity in Equine.

El reconocimiento temprano de anormalidades en la transferencia pasiva de inmunidad en equinos es importante para un manejo satisfactorio de los potrillos. La placenta de la yegua, epiteliocorial, no permite el pasaje de inmunoglobulinas.(Igs). La ingesta de calostro es vital ya que provee las Igs necesarias para alcanzar una concentración sérica de IgG mayor a 800 mg por ciento. Se considerara falla parcial con niveles de IgG entre 400 y 800 mgpor ciento; y total con niveles menores a 400 mg por ciento. La absorción de las Igs es máxima hasta 8 hs después del nacimiento y disminuye hasta hacerse nula a las 24 hs posparto. Los objetivos son: a) estudiar la cinética de la transferencia pasiva de Igs determinando la concentración de IgG sérica en potrillos en el primer trimestre de vida. b) relacionar la concentración de IgG del suero y calostro de la yegua con la concentración sérica de IgG en el potrillo. c) Relacionar en calostro la concentración de inmunoglobulina G con la densidad específica y la determinación semicuantitativa de inmunoglobulina G. d) Relacionar en el suero del potrillo a las 18 - 24 hs posparto la concentración de inmunoglobulina G con la densidad específica y la determinación semicuantitativa de inmunoglobulina G. Material y método: Diseño de estudio: de cohorte, observacional, descriptivo. Animales: 70 yeguas y 70 potrillos de raza Puro Polo. Calostros: 70 muestras Toma de muestras: Yeguas: se tomará una muestra de sangre en el periparto y una muestra de calostro posparto, antes del calostrado del potrillo. Potrillos: se tomarán muestras de sangre seriadas: al nacimiento (precalostrado), 6 hs posparto, 12 hs, 18 hs y 24 hs posparto y a los 21, 60 y 90 días posparto. Determinación de IgG (Suero y calostro): a) Técnica de inmunodifusión radial simple, los resultados se expresará en mg por ciento, en muestras seriadas en intervalos de tiempo preestablecidos. b)Refractometría (con refractómetro Modelo RHC-200/ATC- Arcano). c) Test de gluteralehído, Inmuno -G test. Análisis estadístico: Comparaciones de medias con prueba t apareada o de diferencia de medias, Se considera p significativa < 0,05. Se realizará un análisis de componentes principales. Se correlacionará la concentración de Ig G de suero y calostro de la yegua con la concentración en suero de potrillo. Con los resultados de este trabajo se determinarán los valores de inmunoglobulina en las yeguas y potrillos y su comportamiento en el tiempo, y se validará la sensibilidad y especificidad de las técnicas diagnósticas utilizadas. Los resultados permitirán obtener conocimientos para un manejo racional, desde la perspectiva inmunológica, de los potrillos, al establecer mediante técnicas cuantitativas y semicuantitativas los niveles de Igs séricos alcanzados, favoreciendo un diagnóstico precoz de inmunodeficiencia por fracaso de la transferencia de anticuerpos que pondría en riesgo la vida del potrillo.

Fisiología de la transferencia pasiva de anticuerpos en cabras.

La importancia de la protección inmunológica conferida por el calostro se basa en la transferencia pasiva de anticuerpos. La placenta de la cabra, sindesmocorial, no permite el pasaje de inmunoglobulinas (Igs). La ingesta de calostro es vital ya que provee las Igs necesarias para disminuir el riesgo de infección y septicemia y mejorar la calidad de vida del recién nacido. Los objetivos: a) Estudiar la cinética de la transferencia pasiva de Igs determinando la concentración de IgG sérica en cabritos. b) Relacionar la concentración de IgG del suero y calostro de la cabra con la concentración sérica de IgG en el cabrito. c) Relacionar en calostro la concentración de inmunoglobulina G con la determinación semicuantitativa de inmunoglobulina G. d) Relacionar en el suero del cabrito a las 18 - 24 hs posparto la concentración de inmunoglobulina G con la la determinación semicuantitativa de inmunoglobulina G. e) determinar los niveles de anticuerpos específicos en calostro de hembras vacunadas con respecto a hembras no vacunadas. Material y método: Diseño de estudio: de cohorte, observacional y experimental, descriptivo. Animales: 25 cabras y 40 cabritos de raza Anglo Nubian. Toma de muestras: Cabras no vacunadas (CNV): muestra de sangre en el periparto y de calostro posparto. Cabras vacunadas (CV): a los 90 días de gestación se vacunarán con toxoide tetanico. se tomará muestra de sangre en el periparto y de calostro postparto. Cabritos: sangre seriadas: al nacimiento (precalostrado), 6 hs, 12 hs, 18 hs y 24 hs posparto y a los 21, 60, 90, 120 y 150 días. Determinación de IgG (Suero y calostro): a) Técnica de inmunodifusión radial simple, los resultados se expresarán en mg%. b) Test de gluteraldehído. c)Test de ELISA para Acs específicos Análisis estadístico: Comparaciones de medias con prueba t apareada o de diferencia de medias, (p < 0,05). Se realizará un análisis de componentes principales. Se correlacionará la concentración de Ig G de suero y calostro de la cabra con la concentración en suero del cabrito y los valores de Acs específicos entre CV vs CNV en sangre y calostro, se comparara niveles de Acs específicos séricos en cabritos de CV vs CNV Con los resultados de este trabajo se determinarán los valores de inmunoglobulina en las cabras y cabritos y su comportamiento en el tiempo, y la producción y transferencia de Acs específicos. Se validará la sensibilidad y especificidad de las técnicas diagnósticas utilizadas. Los resultados permitirán obtener conocimientos para un manejo racional, desde la perspectiva inmunologica, de los cabritos, al establecer mediante técnicas cuantitativas y semicuantitativas los niveles de Igs séricas y Acs específicos, favoreciendo un diagnóstico precoz de inmunodeficiencia por fracaso de la transferencia de anticuerpos que pondría en riesgo la vida del cabrito.

FISIOLOGÍA REPRODUCTIVA DE Chinchilla lanigera: CARACTERIZACIÓN DEL CICLO SEXUAL DE LA HEMBRA Y REGULACIÓN EXÓGENA DEL EJE HIPOTÁLAMO-HIPÓFISO-GONADAL.”

La chinchilla es un roedor autóctono de Sudamérica que ha sido domesticado y seleccionado genéticamente debido a la fineza y valor de su piel, la más cotizada en el mercado peletero mundial. La situación coyuntural tanto a nivel mundial como nacional ha dispuesto circunstancias muy favorables para la expansión de esta actividad especialmente en nuestro país, en función de un costo de producción bajo en pesos, con una demanda mundial creciente y con firmes precios en dólares o euros. En base a estas condiciones y a la alta calidad de las pieles producidas en nuestro país, Argentina se proyecta como uno de los mayores productores mundiales de pieles de chinchillas. Sin embargo, no se ha desarrollado aún una zootecnia acorde con las necesidades locales de producción. Lo que es más, la aplicación de técnicas que permitan maximizar y optimizar la productividad de los establecimientos de cría (como las técnicas de reproducción asistida) aún no ha sido concretada debido a la falta a nivel mundial de información en lo que respecta a las bases de la fisiología de la reproducción de esta especie. Un área de vacancia fundamental es la referente a la fisiología del eje hipotálamo-hipófiso-gonadal de la hembra. Con esto en mente, el objetivo general del presente proyecto es estudiar en Chinchilla lanigera doméstica los procesos fisiológicos que regulan el ciclo sexual natural de la hembra y evaluar la eficacia de diferentes sustancias activadoras del eje hipotálamo-hipófiso-gonadal para el control exógeno del mismo. La identificación de factores relevantes de la fisiología reproductiva en la chinchilla doméstica, es de vital importancia para establecer las bases para la aplicación de técnicas de reproducción asistida y herramientas de manejo que permitan incrementar la eficacia reproductiva y acelerar el mejoramiento genético del plantel animal. Paralelamente, el desarrollo de estas técnicas en la chinchilla doméstica como modelo experimental permitirá la transferencia de conocimientos para el desarrollo de programas de cría ex situ de la especie silvestre y la conservación del recurso natural, actualmente en peligro de extinción (CITES I). Así, el presente proyecto tendría un doble impacto y se generarán conocimientos no disponibles al presente para la comunidad científica ni para los criadores de chinchilla. Este estudio por lo tanto, está relacionado con áreas de investigación de gran interés en la actualidad como la conservación de la biodiversidad, la ecología reproductiva, la biotecnología y el mejoramiento de programas de cría de especies no tradicionales de interés económico. Constituye además un proyecto cuyos resultados podrán ser rápidamente transferibles.

Fisiología de la transferencia pasiva de anticuerpos en cabras

La importancia de la protección inmunológica conferida por el calostro se basa en la transferencia pasiva de anticuerpos. La placenta de la cabra, sindesmocorial, no permite el pasaje de inmunoglobulinas (Igs). La ingesta de calostro es vital ya que provee las Igs necesarias para disminuir el riesgo de infección y septicemia y mejorar la calidad de vida del recién nacido. Los objetivos: a) Estudiar la cinética de la transferencia pasiva de Igs determinando la concentración de IgG sérica en cabritos. b) Relacionar la concentración de IgG del suero y calostro de la cabra con la concentración sérica de IgG en el cabrito. c) Relacionar en calostro la concentración de inmunoglobulina G con la determinación semicuantitativa de inmunoglobulina G. d) Relacionar en el suero del cabrito a las 18 – 24 hs posparto la concentración de inmunoglobulina G con la la determinación semicuantitativa de inmunoglobulina G. e)determinación de los niveles de anticuerpos específicos en calostro de hembras vacunadas con respecto a hembras no vacunadas Material y método: Diseño de estudio: de cohorte, observacional y experimental, descriptivo. Animales: 25 cabras y 40 cabritos de raza Anglo Nubian. Toma de muestras: Cabras no vacunadas (CNV): muestra de sangre en el periparto y de calostro posparto. Cabras vacunadas (CV): a los 90 días de gestación se vacunaran con toxoide tetanico. se tomará muestra de sangre en el periparto y de calostro postparto. Cabritos: sangre seriadas: al nacimiento (precalostrado), 6 hs, 12 hs, 18 hs y 24 hs posparto y a los 21, 60, 90, 120 y 150 días. Determinación de IgG (Suero y calostro): a) Técnica de inmunodifusión radial simple, los resultados se expresarán en mg%. b) Test de gluteraldehído. c)Test de ELISA para Acs específicos Análisis estadístico: Comparaciones de medias con prueba t apareada o de diferencia de medias, (p < 0,05). Se realizará un análisis de componentes principales. Se correlacionará la concentración de Ig G de suero y calostro de la cabra con la concentración en suero del cabrito y los valores de Acs específicos entre CV vs CNV en sangre y calostro, se comparara niveles de Acs específicos séricos en cabritos de CV vs CNV Con los resultados de este trabajo se determinarán los valores de inmunoglobulina en las cabras y cabritos y su comportamiento en el tiempo, y la producción y transferencia de Acs específicos. Se validará la sensibilidad y especificidad de las técnicas diagnósticas utilizadas. Los resultados permitirán obtener conocimientos para un manejo racional, desde la perspectiva inmunologica, de los cabritos, al establecer mediante técnicas cuantitativas y semicuantitativas los niveles de Igs séricas y Acs específicos, favoreciendo un diagnóstico precoz de inmunodeficiencia por fracaso de la transferencia de anticuerpos que pondría en riesgo la vida del cabrito.

Mecanismo de interacción, calcio dependiente, entre Calcineurina y PERK, involucrado en el Estrés de Retículo Endoplásmico. Ca2+ -dependent mechanism of interaction between Calcineurin and PERK involved in Endoplasmic Reticulum Stress.

El Estrés de Retículo Endoplásmico (RE) es inducido por la acumulación de proteínas sin plegar en el lumen de la organela. Esto se puede observar en diversas situaciones fisio-patológicas como durante una infección viral o en proceso isquémico. Además, contribuye a la base molecular de numerosas enfermedades ya sea índole metabólico (Fibrosis quística o Diabetes Miellitus) o neurodegenerativas como mal de Alzheimer o Parkinson (Mutat Res, 2005, 569). Para restablecer la homeostasis en la organela se activa una señal de transducción (UPR), cuya respuesta inmediata es la atenuación de la síntesis de proteína debido a la fosforilación de subunidad alpha del factor eucariótico de iniciación de translación (eIF2α) vía PERK. Esta es una proteína de membrana de RE que detecta estrés. Bajo condiciones normales, PERK está inactiva debido a la asociación de su dominio luminar con la chaperona BIP (Nat Cell Biol, 2000, 2: 326). Frente a una situación de estrés, la chaperona se disocia causando desinhibición. Recientemente, (Plos One 5: e11925) se observó, bajo condiciones de estrés, un aumento de Ca2+ citosólico y un rápido incremento de la expresión de calcineurina (CN), una fosfatasa citosólica dependiente de calcio, heterodimérica formada por una subunidad catalítica (CN-A) y una regulatoria (CN-B). Además, CN interacciona, sin intermediarios, con el dominio citosólico de PERK favoreciendo su trans-autofosforilación. Resultados preliminares indican que, astrocitos CNAβ-/- exhibieron, en condiciones basales, un mayor número de células muertas y de niveles de eIF2α fosforilado que los astrocitos CNAα-/-. Hipótesis: CNAβ/B interacciona con PERK cuando el Ca2+ citosólico esta incrementado luego de haberse inducido Estrés de RE, lo cual promueve dimerización y auto-fosforilación de la quinasa, acentuándose así la fosforilación de eIF2α e inhibición de la síntesis de proteínas. Esta activación citosólica de PERK colaboraría con la ya descrita, desinhibición luminal llevada cabo por BIP. Cuando el Ca2+ citosólico retorna a los niveles basales, PERK fosforila a CN, reduciendo su afinidad de unión y disociándose el complejo CN/PERK. Objetivo general: Definir las condiciones por las cuales CN interacciona con PERK y regula la fosforilación de eIF2α e inhibición de la síntesis de proteína. Objetivos específicos: I-Estudiar la diferencia de afinidades y dependencia de Ca2+, de las dos isoformas de CN (α y β) en su asociación con PERK. Además verificar la posible participación de la subunidad B de CN en esta interacción. II-Determinar si la auto-fosforilación de PERK es diferencialmente regulada por las dos isoformas de CN. III-Discernir la relación del estado de fosforilación de CN con su unión a PERK. IV-Determinar efectos fisiológicos de la interacción de CN-PERK durante la respuesta de Estrés de RE. Para llevar a cabo este proyecto se realizarán experimentos de biología molecular, interacción proteína-proteína, ensayos de fosforilación in vitro y un perfil de polisoma con astrocitos CNAβ-/- , CNA-/- y astrocitos controles. Se espera encontrar una mayor afinidad de unión a PERK de la isoforma β de CN y en condiciones donde la concentración de Ca2+ sea del orden micromolar e imite niveles del ión durante un estrés. Con respecto al estado de fosforilación de CN, debido a los resultados preliminares, donde solo se la encontró fosforilada en condiciones basales, se piensa que CN podría interactuar con mayor afinidad con PERK cuando CN se encuentre desfosforilada. Por último, se espera encontrar un aumento de eIF2α fosforilado y una acentuación de la atenuación de la síntesis de proteína como consecuencia de la mayor activación de PERK por su asociación con la isoforma β de CN en astrocitos donde el Estrés de RE se indujo por privación de oxigeno y glucosa. Estos experimentos permitirán avanzar en el estudio de una nueva función citoprotectora de CN recientemente descrita por nuestro grupo de trabajo y sus implicancias en un modelo de isquemia. The accumulation of unfolded proteins into the Endoplasmic Reticulum (ER) activates a signal transduction cascade called Unfolding Protein Response (UPR), which attempts to restore homeostasis in the organelle. (PKR)-like-ER kinase (PERK) is an early stress response transmembrane protein that is generally inactive due to its association with the chaperone BIP. During ER stress, BIP is tritrated by the unfolded protein, leading PERK activation and phosphorylation of eukaryotic initiation factor-2 alpha (eIF2alpha), which attenuates protein síntesis. If ER damage is too great and homeostasis is not restored within a certain period of time, an apoptotic response is elicited. We recently demonstrated a cytosolic Ca2+ increase in Xenopus oocytes after induce ER stress. Moreover, calcineurin A/B, a an heterotrimeric Ca2+ dependent phosphatases (CN-A/B), associates with PERK increasing its auto-phosphorylation and significantly enhancing cell viability. Preliminary results suggest that, CN-Aβ-/- knockout astrocytes exhibit a significant higher eIF2α phosphorylated level compared to CN-Aα-/- astrocytes. Our working hypothesis establishes that: CN binds to PERK when cytosolic Ca2+ is initially increased by ER stress, promoting dimerization and autophosphorylation, which leads to phosphorylation of elF2α and subsequently attenuation of protein translation. When cytosolic Ca2+ returns to resting levels, PERK phosphorylates CN, reducing its binding affinity so that the CN/PERK complex dissociates. The goal of this project is to determine the conditions by which CN binding to PERK attenuates protein translation during the ER stress response and subsequently, to determine how the interaction of CN with PERK is terminated when stress is removed. To perform this project is planed to do molecular biology experiments, pull down assays, in vitro phosphorylations and assess overall mRNA translation efficiency doing a polisome profile.

Evaluación del efecto del láser y magnetoterapia en miopatía experimental valorando biomarcadores de estrés oxidativo, histomorfometría y actividad enzimática mitocondrial. Evaluation of the effect of laser and magnetic therapy in experimental myopathy assessing oxidative stress biomarkers, histomorphometry and mitochondrial enzyme activity

El láser de baja y media energía y la magnetoterapia son utilizados en desórdenes osteomioarticulares por sus efectos analgésico, antiinflamatorio y trófico, entre los más destacados. Sin embargo, son insuficientes las investigaciones sobre su mecanismo de acción y antecedentes científicos que avalen sus efectos. Es por ello, que la determinación de acontecimientos celulares y moleculares que ocurren durante la interacción de estos tipos de energía con el sistema muscular, sería relevante para el conocimiento y optimización de tales terapias en las ciencias biomédicas. En las miopatías inflamatorias idiopáticas, se encuentra afectada la estructura, morfología y bioquímica del tejido muscular. La energía que éste requiere para el normal funcionamiento es generada en la mitocondria. Esta organela también es la responsable de la generación de especies oxidantes provocando estrés oxidativo y el inicio de los procesos de apoptosis. Por lo antes dicho, consideramos que la determinación de los biomarcadores inflamatorios asociados a estrés oxidativo, realizando el análisis histomorfométrico ultraestructural y valorando la actividad de los complejos enzimáticos mitocondriales, permitiría una evaluación de la acción terapéutica del láser y la magnetoterapia en un modelo experimental de miopatía. Para ello se propone evaluar el efecto de la magnetoterapia y del láser de baja energía (He-Ne y As.Ga) en miopatía experimental determinando indicadores inflamatorios asociados a estrés oxidativo, análisis histomorfométrico y valoración de la actividad enzimática mitocondrial. Específicamente: -Determinar indicadores inflamatorios y de estrés oxidativo: Oxido Nítrico, Grupos carbonilos, L-citrulina, Fibrinógeno, Superóxido dismutasa, Glutation peroxidasa y Catalasa por espectrofotometría. -Identificar los cambios anatomopatológicos del músculo esquelético por microscopía óptica (MO): cuantificación del infiltrado inflamatorio; MO de alta resolución (MOAR) y por microscopía electrónica: histomorfometría de la ultraestructura miofibrilar y mitocondrial. -Valorar las actividades enzimáticas de la citrato sintasa y de los complejos: I (NADH-ubiquinona reductasa), II (succinato-ubiquinona-reductasa) III (ubiquinona-citocromo c-reductasa) y IV (citocromo c-oxidasa); en mitocondrias de tejido muscular por espectrofotometría. -Evaluar la actividad apoptótica en las fibras musculares de los diferentes grupos por ténica de T.U.N.E.L. Las mediciones mitocondriales (por ME) y de infiltrado inflamatorio (por MO) se realizarán en un total de 5 fotos de aumentos similares en forma aleatoria por grupo estudiado (n=10). Los cambios estructurales observados se analizarán en el programa Axiovision 4.8, para cuantificar el área total ocupada, número total y grado de alteración de las mitocondrias y el porcentaje de infiltrado inflamatorio determinando el grado de inflamación. Los resultados de los datos cuantitativos se analizarán aplicando ANAVA (test de Fisher para comparaciones múltiples); y para los datos categóricos se utilizará Chi cuadrado (test de Pearson), estableciéndose un nivel de significación de p < 0.05 para todos los casos. Importancia del Proyecto: La salud y el bienestar del hombre son los logros perseguidos por las ciencias de la salud. La obtención de terapias curativas o paliativas con un mínimo de efectos colaterales para el enfermo se incluye en estos logros. Por esto y todo lo anteriormente expuesto es que consideramos de gran importancia poder esclarecer desde las ciencias básicas los efectos celulares y moleculares en modelos experimentales la acción de la terapia con láser y magnetoterapia para una aplicación clínica con base científica en todas las áreas de las Ciencias Médicas. In the idiopathic inflammatory myopathies, is affected the structure, morphology and biochemistry of muscle tissue. The mitochondria is responsible for the generation of oxidizing species leading to oxidative stress and the beginning of the process of apoptosis. As said before, we consider the determination of inflammatory biomarkers related to oxidative stress, by ultrastructural morphometric analysis and assessing the activity of mitochondrial enzyme complexes, permit an evaluation of the therapeutic action of laser and magnetic therapy in an experimental model myopathy. We propose to evaluate the effect of the treatment identifying indicators in experimental inflammatory myopathy associated with oxidative stress, histomorphometric analysis and assessment of mitochondrial enzyme activity. Specifically -determining: Nitric oxide, carbonyl groups, L-citrulline, fibrinogen, superoxide dismutase, glutathione peroxidase and catalase by spectrophotometry. -Identify the pathological changes in skeletal muscle by optical microscopy (OM): quantification of the inflammatory infiltrate, OM high resolution (MOAR) and electron microscopy, histomorphometry of myofibrillar and mitochondrial ultrastructure. -Evaluate the enzymatic activity of citrate synthase and complexes: I, II, III and IV in mitochondria muscle tissue by spectrophotometry. -Evaluate apoptotic activity in muscle fibers by TUNEL technique of Mitochondrial measurements and inflammatory infiltration (by OM) was performed in a total of 5 photos of similar increases in random by the study group (n = 10). The structural changes observed are discussed in the program Axiovision 4.8, to quantify number, degree of alteration of mitochondria and the percentage of inflammatory infiltrate determining the degree of inflammation. The results of the quantitative data were analyzed using ANOVA (Fisher test), and categorical data with Chi-square (Pearson test), establishing a significance level of p <0.05.