Extração com CO2 supercrítico de óleos essenciais de Hon-sho e Ho-sho : experimentos e modelagem

Uma das tecnologias que mais avançou nas últimas décadas, como uma alternativa para as tradicionais técnicas de extração de produtos naturais, é a técnica de Extração com Fluidos Supercríticos. A extração com fluidos supercríticos destacase entre os processos industriais de extração pela qualidade dos produtos obtidos e por não causar danos ambientais quando usa dióxido de carbono (CO2) no estado supercrítico como solvente. Este trabalho teve como objetivo a realização de experimentos de extração de óleos essenciais com dióxido de carbono no estado supercrítico de folhas de duas variedades da árvore Canforeira (Cinnamomum camphor Ness & Eberm.) conhecidas como Hon-sho e Ho-sho, a fim de determinar as melhores condições operacionais de processo. Os óleos essenciais obtidos destas plantas têm importância econômica devido aos seus principais componentes: linalol e cânfora. Os melhores parâmetros de extração obtidos, quando se consideram os rendimentos de óleo essencial, foram os seguintes: vazão de CO2 = 2 mL/min, temperatura = 50°C, pressão = 90 bar e diâmetro de partícula = 0,1 mm. Outro objetivo foi a obtenção das curvas de extração: Rendimento de óleo essencial versus Tempo de extração, adequando, a partir dos dados experimentais, alguns modelos matemáticos encontrados na literatura para descrever o comportamento destas extrações. Dos modelos estudados o que melhor se adequou à extração de óleos essenciais de folhas foi o modelo proposto por Reverchon (1996), o qual proporcionou uma boa reprodutibilidade dos dados experimentais, mostrandose eficiente na representação de extração com fluidos supercríticos de óleos essenciais de Hon-sho e Ho-sho a partir de suas folhas.

Imunoquantificação da proteína S100beta em líquor, soro e tecido cerebral por um ensaio de quimioluminescência

A proteína S100β pertence a uma família de proteínas ligantes de cálcio ácidas e de baixo peso molecular, e tem sido implicada no desenvolvimento e manutenção do sistema nervoso. Esta proteína tem atividade neurotrófica e gliotrófica e está localizada principalmente no Sistema Nervoso Central em astrócitos e células de Schawnn, mas pode ser detectada em menores concentrações em outras células, como melanócitos e adipócitos. Relatos sugerem que a S100β está envolvida nos mecanismos da neuropatologia principalmente na doença de Alzheimer e Síndrome de Down, onde astrócitos reativos expressam altos níveis desta proteína. Neste trabalho foi padronizado uma técnica imunoluminométrica muito sensível (0,02 µg/L) que utiliza um anticorpo marcado com o isoluminol como molécula “tracer”. A emissão de luz na fase final da reação é diretamente proporcional a concentração de proteína S100β das amostras. Na fase inicial do trabalho utilizamos amostras biológicas (soro, LCR e tecido cerebral) de ratos e também realizamos alguns ensaios metodológicos para se avaliar a sensibilidade, especificidade e a reprodutibilidade do imunoensaio. Demonstramos que o método empregado para se coletar sangue e LCR de ratos influencia na quantificação da proteína S100β. Finalmente, utilizamos este imunoensaio em investigações clínicas. Observamos que níveis desta proteína em pacientes diagnosticados com mielopatia associada ao vírus HTLV-I estava aumentada no soro, mas não em LCR. Também quantificamos a proteína em fluído amniótico, sendo que nas gestantes com fetos diagnosticados com Síndrome de Down os níveis foram mais elevados.

Mastocitose na infância : estudo anátomo-patológico e imuno-histoquímico

Introdução A mastocitose abrange um grupo heterogêneo de condições crônicas caracterizado pela proliferação excessiva de mastócitos nos tecidos. Os sinais e sintomas clínicos são decorrentes da distribuição anatômica dos mastócitos e do efeito funcional dos mediadores produzidos e liberados por estas células. Na infância, a doença é considerada uma condição benigna na maioria dos casos, cujo comprometimento característico é o cutâneo. As mais freqüentes manifestações na pele são os mastocitomas e a urticária pigmentosa. Lesões cutâneas bolhosas podem manifestar-se e acompanhar todas as formas de mastocitose e quando esta apresentação é a predominante, é denominada de mastocitose bolhosa. O diagnóstico de mastocitose é suspeitado clinicamente e confirmado pela histologia. A demonstração do aumento do número de mastócitos nas lesões cutâneas características se constitui no principal critério diagnóstico. Contudo, este método tem dificuldades técnicas que impedem a adequada reprodutibilidade dos achados, dificultando a elucidação de casos duvidosos e retardando seu tratamento. Considerando as propriedades imunológicas e a importância clínica dos mastócitos reveste-se de maior importância compreender o papel destas células nas doenças, sendo indispensável identificá-las e enumerá-las com acurácia nos tecidos. Objetivos Quantificar o número de mastócitos marcados com anticorpo monoclonal antitriptase, através de técnica imuno-histoquímica e análise de imagem, em biópsias cutâneas de crianças, com diagnóstico clínico de mastocitose. Descrever os achados histológicos; quantificar o número de mastócitos marcados com o anticorpo antitriptase entre as diferentes expressões clínicas da mastocitose cutânea; comparar o número de mastócitos entre os casos de mastocitose cutânea e mastocitose associada à sintomas sistêmicos e correlacionar as contagens de mastócitos entre os dois diferentes métodos (coloração por Giemsa com contagem manual e marcação com anticorpo antitriptase e análise digital). Material e Método Foram incluídas no estudo biópsias cutâneas de crianças de 0 a 14 anos, com diagnóstico clínico e histológico de mastocitose. Os casos foram classificados de acordo com a apresentação clínica cutânea em mastocitoma, urticária pigmentosa ou mastocitose bolhosa e assinalada a presença de sintomas sistêmicos associados. Os fragmentos de pele fixados em formalina e emblocados em parafina foram cortados e utilizados para diagnóstico histopatológico convencional, corados com hematoxilina-eosina e Giemsa, e para análise imuno-histoquímica com estreptavidina peroxidase marcados com anticorpo antitriptase. A densidade de mastócitos (número de células por área) foi realizada por um único observador na técnica histológica e através de um sistema de análise de imagem de vídeo no método imuno-histoquímico. Resultados Foram avaliados 33 casos de mastocitose, sendo 21 do sexo masculino. Dez casos (30,3%) apresentavam mastocitoma, 21 (63,6%) urticária pigmentosa e 2 (6,1%) mastocitose bolhosa. Todos os casos da amostra foram classificados como tendo mastocitose incipiente e em 6 (18,8%) pacientes pôde ser identificada a associação com sintomas sistêmicos. Prurido foi o sintoma mais freqüente, sendo relatado em 21 casos. Em 21 dos 33 casos foi identificada a infiltração de mastócitos na derme havendo predominância pela região perivascular (p=0,001, teste exato de Fisher). Não houve diferenças significativas entre a presença de infiltrado mastocitário e as várias formas cutâneas de mastocitose ou a mastocitose sistêmica. A presença de eosinófilos foi identificada em 15 casos (45,5%) e em 10 casos associadamente ao infiltrado perivascular de mastócitos. A densidade de mastócitos na técnica histológica, incluindo-se todos os casos, foi 50,00 células/mm2. Não houve diferença significativa das contagens entre os pacientes com mastocitoma e aqueles com urticária pigmentosa, assim como entre os pacientes com e sem sintomas sistêmicos associados aos cutâneos. A densidade de mastócitos encontrada com a técnica imuno-histoquímica e contagem por análise de imagem foi 158,85 células/mm2. Não houve diferença significativa das contagens entre os pacientes com mastocitoma e aqueles com urticária pigmentosa, assim como entre aqueles com e sem sintomas sistêmicos. Comparando-se a contagem dos mastócitos por área (densidade) entre a histologia e a imuno-histoquímica houve uma diferença significativa (p=0,0001 teste não-paramétrico de Wilcoxon). A média da diferença entre as contagens foi 199,98 células/mm2 (±365,31 DP). Também não houve semelhança, entre os dois métodos, nos grupos mastocitoma e urticária pigmentosa (p=0,005 e p=0,01, respectivamente, teste não-paramétrico de Wilcoxon). Puderam ser identificados 518% a mais de mastócitos com a técnica imunohistoquímica quando comparada com a histológica. Conclusões O presente estudo permite concluir que: 1) a localização preferencial da infiltração de mastócitos é dérmica e perivascular, não sendo possível identificar diferenças histológicas entre casos de urticária pigmentosa e mastocitoma; 2) o número de mastócitos marcados com o anticorpo monoclonal antitriptase e contados com análise digital de imagem, em biópsia de pele de crianças com diagnóstico clínico de mastocitose, foi 159 células por milímetro quadrado; 3) a densidade de mastócitos, foi semelhante entre os casos de urticária pigmentosa e mastocitoma e entre os casos com e sem sintomas sistêmicos associados nas duas diferentes técnicas empregadas; 4) o número de mastócitos por milímetro quadrado com a técnica imuno-histoquímica e a contagem através de análise de imagem foi significativamente maior quando comparada com a coloração através de Giemsa e a contagem manual, com uma diferença média entre os dois métodos de 200 células por milímetro quadrado; 5) a densidade de mastócitos com a técnica imunohistoquímica foi significativamente maior tanto nos casos com urticária pigmentosa quanto nos com mastocitoma, quando comparada com a técnica empregada rotineiramente e 6) com a técnica imuno-histoquímica e a contagem através de análise de imagem foi possível identificar 518% a mais de mastócitos quando comparada com a técnica histológica.

Alterações na via intracelular do fosfoinositol : implicações para a fisiopatologia do transtorno bipolar e mecanismo de ação do lítio

Uma possível disfunção nos processos intracelulares de transdução de sinais pode estar implicada na fisiopatologia do transtorno bipolar (Soares and Mallinger 2000). Particularmente, a via intracelular do fosfoinositol (PI) pode ser um sitio de disfunção (Soares et al 1997b). Plaquetas, células periféricas, e amostras de cérebro pós-mortem têm sido utilizados como modelos em estudos prévios com o objetivo de investigar esta hipótese. Os achados que emergem destes estudos são consistentes com a hipótese de uma hiperatividade na via do PI na fase maníaca, que pode estar relacionada com a fase do transtorno. Nesta tese de doutoramento está descrita uma série de estudos preliminares que utilizaram um modelo plaquetário para estudar alterações da via do PI em pacientes com transtorno afetivo bipolar, e também em relação ao mecanismo de ação do carbonato de lítio. Utilizando um método para quantificação de fosfoinositois em membrana plaquetária desenvolvido pelo Professor Alan Mallinger e colaboradores na Universidade de Pittsburgh, o passo inicial envolveu o estudo da reprodutibilidade teste/reteste do mesmo, que foi documentada como estando dentro de limites aceitáveis (Soares et al 1999a). Subseqüentemente, conduzimos um estudo preliminar em pacientes bipolares já tratados com monoterapia com o lítio (Soares et al 1999b). Nestes pacientes, alem de estudarmos os níveis de fosfolipídios de membrana comparados com voluntários normais, também estudamos, em colaboração com o Professor Husseini Manji e colaboradores do National Institute of Mental Health (NIMH), EUA, os níveis de subespécies especificas de PKC em plaquetas de pacientes bipolares (Soares et al 2000a). Nossos achados principais destes estudos colaborativos sugerem uma redução dos níveis plaquetários de PIP2, concomitantemente com redução seletiva de subespécies especificas de PKC. Como um passo adicional, também estudamos os níveis de fosfoinositois de membrana em indivíduos bipolares na fase depressiva, quando não medicados, que estavam significativamente elevados comparados com voluntários normais (Soares et al 2001). Por último, conduzimos um ensaio clinico aberto com carbonato de lítio em doses terapêuticas em um grupo pequeno de pacientes bipolares, que sugeriu uma diminuição significativa dos níveis de PIP2 após o tratamento (Soares et al 2000b). Estes estudos documentam uma disfunção na via do PI em plaquetas de pacientes bipolares, possivelmente modulada pelo tratamento com o lítio, sugerindo o envolvimento desta via na fisiopatologia do transtorno e no mecanismo de ação do lítio. não se sabe se tais alterações plaquetárias refletem o que se passa nesta via em neurônios humanos in vivo, o que constitui uma limitação importante, em potencial, desta abordagem. No entanto, na falta de metodologia de neuroimagem que permita o estudo destas vias no cérebro de pacientes vivos, o modelo periférico plaquetário é de valia para se começar a fazer inferências sobre o funcionamento desta via em pacientes bipolares. Estudos futuros com amostras maiores de pacientes que possam segui-los em fases diferentes do transtorno e tentar determinar correlações entre alterações nesta via produzidas pelo lítio e os efeitos terapêuticos desta medicação serão de grande valia.

O espelho de Glatzel na avaliação da permeabilidade nasal em adultos

Introdução O espelho de Glatzel (EG) é correntemente utilizado em consultórios fonoaudiológicos para a avaliação rápida da permeabilidade nasal. O mesmo foi descrito inicialmente em 1898 por Zwaardemaker. Porém, estudos de validação inexistem na literatura. Este estudo teve por objetivos verificar a reprodutibilidade do EG e a correlação intra-sujeito entre área de condensação e percepção subjetiva de permeabilidade nasal. Material e Métodos Vinte e cinco sujeitos foram avaliados com o EG por cinco minutos consecutivos (475 medidas por sujeito); cada meia hora por quatro horas; cada dia no início da tarde, por cinco dias e toda a quinta-feira por cinco semanas consecutivas. Utilizou-se uma escala análoga visual para avaliar a percepção de respiração nos períodos de horas, dias e semanas. Resultados O coeficiente de correlação total (área direita mais esquerda) encontrado entre área de condensação e percepção subjetiva foi de r=0,04 (p=0,3761). No lado esquerdo foi de r=0,08 (p=0,0984) e no lado direito de r=0,05 (p=0,2862). Os coeficientes de variação unilaterais medianos foram menores que 15% e os totais menores que 12%, independente do intervalo de tempo entre teste e re-teste. Conclusão Não se evidenciou correlação significativa entre a percepção subjetiva e a área de condensação nasal. A variabilidade unilateral foi maior do que quando considerados os valores totais (direito mais esquerdo) e não houve diferença na variabilidade das medidas de área de condensação nasal nos diferentes momentos do tempo.

Desenvolvimento de métodos analíticos para determinação de níquel e vanádio em petróleo por espectrometria de absorção atômica em forno de grafite

Neste trabalho foram investigados diferentes métodos de preparação de amostra para a determinação de níquel e vanádio em óleo cru usando a espectrometria de absorção atômica com forno de grafite (GF AAS). Investigou-se o uso de xileno como diluente, o qual foi inadequado devido à baixa estabilidade de níquel nas soluções e resultando na contaminação do equipamento. As soluções diluídas em isobutilmetilcetona apresentaram melhor estabilidade, mas não houve reprodutibilidade das medidas com os padrões orgânicos de níquel. Melhores resultados foram obtidos com emulsões óleo-em-água, usando Triton X-100 como surfactante. Também foi estudado o uso de padrões aquosos (inorgânicos) para o preparo das emulsões. Após o estabelecimento de curvas de pirólise para padrão e amostra de óleo cru, observou-se diferença no comportamento térmico do níquel na matriz de óleo cru. Foi então realizada uma investigação usando um espectrômetro de absorção atômica com fonte contínua de alta resolução (HR-CS AAS), equipamento com elevada capacidade de correção de fundo, e constatou-se que cerca de 50 % do analito é perdido em temperaturas abaixo de 400 ºC, enquanto que o restante é termicamente estável até pelo menos 1200 ºC. A fim de resolver o problema de perda de níquel volátil, foi investigado o uso de paládio como modificador químico. Através de curvas de pirólise com e sem paládio, observou-se que a mesma perda também ocorreu para o vanádio. Após a otimização da melhor quantidade de paládio, verificou-se que foi necessária uma quantidade de 20 µg de paládio para estabilização de níquel e vanádio. A determinação de níquel e vanádio total em amostras de óleo cru foi realizada usando-se paládio como modificador químico. A especiação destes elementos foi possível através da determinação das espécies estáveis, provavelmente compostos salinos não porfirínicos de níquel e vanádio, sem a adição de paládio, e a fração de compostos voláteis (provavelmente porfirinas de níquel e vanádio) foi calculada por diferença. Estabeleceram-se as figuras de mérito obtendo-se valores de massa característica de 19 e 33 pg e limite de detecção de 43 e 113 pg para níquel e vanádio, respectivamente. Esses resultados são compatíveis com dados reportados na literatura. A exatidão deste procedimento foi verificada pela análise dos materiais de referência certificados de metais traço em óleo residual (SRM 1634c) para níquel e vanádio e o petróleo (RM 8505) somente para vanádio e também por comparação com os resultados obtidos por HR-CS AAS para várias amostras de óleo cru. A aplicação do teste estatístico t-student aos resultados de níquel e vanádio total obtidos por GF AAS e HR-CS AAS mostrou que os mesmos não são significativamente diferentes a um nível de 95% de confiança.

Avaliação de um programa computacional para a medida da lordose lombar

Objetivo: métodos antropométricos que quantifiquem as curvas da coluna vertebral e a avaliação postural a fim de realizar investigações epidemiológicas sobre o papel da postura na ocorrência das dores lombares. O propósito do estudo foi avaliar acurácia e reprodutibilidade do Sistema de Avaliação Postural Digitalizado (SAPD) para medir lordose lombar comparando com raio-x. Delineamento: transversal, com amostra consecutiva. Participantes: para medida da acurácia no grupo 1 ( T12,L3,L5) n = 16 e grupo 2 (L1,L3,L5) n= 17. Na reprodutibilidade intra e inter-avaliador n= 80. Principais Medidas: marcadores externos nos processos espinhosos das vértebras T12, L1, L3 e L5. Raio-x de perfil da coluna lombar e foto digital em perfil direito. Medida da lordose lombar no raio-x com métodos de Cobb,Centróide (CLL) e Processos Espinhosos (PE) e com o SAPD. Resultados: grupo 1, correlação entre SAPD e Cobb foi 0,803 (p<0,001), entre SAPD e CLL foi 0,642 (p=0,024), entre SAPD e a medida dos PE a correlação foi 0,917, com R2 = 0,842. No grupo 2, correlação entre SAPD e Cobb foi 0,559 (p=0,020), entre SAPD e CLL de 0,325 (p=0,302), com correlação significativa somente entre SAPD e Cobb. Entre SAPD e PE a correlação foi 0,763, com R2 = 0,583. Para reprodutibilidade interavaliador a correlação foi 0,981 (p < 0,001) e para reprodutibilidade intra-avaliador de 0.978 (p < 0,001) referente às mesmas fotografias. Reprodutibilidade intraavaliador de 0.872 (p < 0.001) e 0.956 (p<0,001) para inter-avaliador referente à fotos diferentes de um mesmo indivíduo com recolocação dos marcadores sobre a pele . Considerações Finais: O SAPD mostrou-se acurado e reprodutível para a medida da lordose lombar.

Estudo de caso-controle para desenvolvimento e validação de um questionário de avaliação de abuso sexual em crianças

Objetivos: Desenvolver e validar instrumento que auxilie o pediatra a determinar a probabilidade de ocorrência do abuso sexual em crianças. Métodos: Estudo de caso-controle com 201 crianças que consultaram em ambulatórios de pediatria e locais de referência para vítimas de abuso sexual, entre março e novembro de 2004: grupo caso (com suspeita ou revelação de abuso sexual) e grupo controle (sem suspeita de abuso sexual). Aplicou-se, junto aos responsáveis, um questionário com 18 itens e cinco opções de respostas segundo a escala Likert, abordando comportamento, sintomas físicos e emocionais apresentados pelas crianças. Excluíram-se nove crianças sem controle esfincteriano e um item respondido por poucas pessoas. A validade e consistência interna dos itens foram avaliadas com obtenção de coeficientes de correlação (Pearson, Spearman e Goodman-Kruskal), coeficiente α de Cronbach e cálculo da área da curva ROC. Calculou-se, após, a razão de verossimilhança (RV) e os valores preditivo positivos (VPP) para os cinco itens do questionário que apresentaram os melhores desempenhos. Resultados: Obteve-se um questionário composto pelos cinco itens que melhor discriminaram crianças com e sem abuso sexual em dois contextos. Cada criança recebeu um escore resultante da soma das respostas com pesos de 0 a 4 (amplitude de 0 a 20), o qual, através do teorema de Bayes (RV), indicou sua probabilidade pós-teste (VPP) de abuso sexual. Conclusões: O instrumento proposto é útil por ser de fácil aplicação, auxiliando o pediatra na identificação de crianças vítimas de abuso sexual. Ele fornecerá, conforme o escore obtido, a probabilidade (VPP) de abuso sexual, orientando na conduta de cuidado à criança.

Tradução, adaptação e validação do Defensive Style Questinnaire (DSQ-40) para o português brasileiro

O estudo dos mecanismos de defesa do ego tem servido como indicativo do modo típico de um indivíduo lidar com os conflitos. Os mecanismos de defesa podem ser agrupados em três fatores alocados de forma hierárquica: fatores maduros, neuróticos e imaturos. Bond desenvolveu um questionário objetivo e auto-aplicável, o Defensive Style Questionnaire – DSQ, que visa identificar os derivados conscientes dos mecanismos de defesa. O objetivo desse estudo é o de descrever o processo de tradução do Defensive Style Questionnaire (DSQ-40) versão em português e avaliar a confiabiidade, validade de conteúdo de constructo dessa versão do instrumento. Métodos: A primeira versão da escala foi apresentada para cinco indivíduos, com graus diferentes de escolaridade, que efetuaram pequenos ajustes de linguagem. Posteriormente, a escala foi apresentada para três “experts”, que avaliaram a validade de conteúdo do instrumento. A versão final foi retraduzida e apresentada para o autor do instrumento original que aceitou essa versão do DSQ-40. Posteriormente foi avaliada a confiabilidade e validade da versão em português do Defensive Style Questionnaire (DSQ-40). A amostra constitui-se de 339 indivíduos. Uma subamostra (n=75) foi avaliada também pelo MMPI, e outra subamostra (n=66) foi também avaliada pelo DFS (Escala de Funcionamento Defensivo). Resultados: Houve necessidade de pequenos ajustes no vocabulário em oito questões e modificações na linguagem em quatro questões, resultando na versão final do instrumento. A média de correlação dos “experts” com cada defesa foi de 89%, e dos fatores maduros, imaturos e neuróticos foi de 100%. A análise fatorial do instrumento forneceu uma distribuição das defesas semelhante ao instrumento original. A avaliação teste-reteste demonstrou boa correlação intraclasse em todos os fatores. O uso de defesas imaturas e neuróticas foi maior entre os pacientes que os controles (p<0,05). Houve correlação entre o nível defensivo de acordo com o DFS (p=0,006) e MMPI (p=0,004) e as defesas imaturas. Conclusões: A adaptação do DSQ-40 por diferentes indivíduos com diferentes graus de escolaridade e pelo grupo de experts possibilitou o ajuste à realidade sociocultural brasileira. Os dados do presente estudo indicam que a versão em português do DSQ-40 possui características psicométricas que permite o seu uso na nossa cultura.

Implante endoscópico no esôfago distal de polimetilmetacrilato para controle do refluxo gastrofágico : estudo experimental em modelo animal

XIXA doença do refluxo gastroesofágico (DRGE) comumente afeta o esôfago e provavelmente é a condição mais prevalente no segmento alto do trato gastrointestinal, acometendo entre 5 e 45% da população ocidental. A terapêutica atual para essa doença além de medidas gerais e dietéticas, inclui tratamento farmacológico e/ou cirurgia. Ambos podem ser eficazes, mas apresentam elevado custo financeiro. O tratamento com fármacos pode apresentar baixa aderência medicamentosa e a cirurgia tem baixa, mas não desprezível, morbidade e mortalidade. Idealmente o tratamento da DRGE deveria ser eficaz, com baixo risco e com baixo custo. Objetivos: 1. Desenvolver um modelo experimental em suínos para o estudo do Refluxo Gastroesofágico através da Pressão e do Volume de Vazão Gástricos; 2. Avaliar a eficácia do implante endoscópico de PMMA ao nível do Esfíncter Esofágico Inferior (EEI) para aumentar a Pressão de Vazão Gástrica, o Volume de Vazão Gástrico e a Pressão Basal do EEI; 3. Descrever as reações histológicas associadas ao implante de PMMA. Material e Métodos: Suínos da raça Large White, do sexo feminino com 8 semanas de vida foram estudados no experimento. Foi realizada manometria do esfíncter esofágico inferior com registro da pressão basal com cateter de perfusão com água e técnica de retirada lenta. Calculou-se, também, a extensão do EEI. Após, gastrostomia era realizada com colocação intragástrica da extremidade distal de uma sonda de Foley com três vias e um cateter de pHmetria esofágica introduzido via oral com o sensor distal posicionado 5 cm acima do bordo superior de esfíncter esofágico inferior. Iniciava-se, XXentão, a infusão contínua no estômago de uma solução de HCl a 0,02N com medida e registro simultâneos da Pressão e do Volume de Vazão Gástricos e do pH esofágico. Definiu-se a Pressão de Vazão Gástrica (PVG) e o Volume de Vazão Gástrico quando houve brusca e sustentada acidificação do esôfago distal (pH<3). Após, introduzia-se um tubo metálico (Tubo Introdutor ou TI) via oral e, em seguida, o endoscópio, seguindo ambos até o esôfago distal. Cateter de nylon com agulha calibre 16 era introduzido pelo tubo introdutor e o PMMA implantado na área correspondente ao EEI com uma pistola dosadora volumétrica que permitia a injeção de volumes prédeterminados em 3 ou 4 pontos da submucosa (total por ponto = 0,73 ml de PMMA). As medidas de PVG, VVG e pressão basal do EEI foram repetidas após 28 dias, sacrificando-se os animais e removendo-se esôfago médio e distal, junção esofagogástrica, fundo e corpo gástricos para estudo histológico. Previamente ao experimento, três projetos pilotos foram desenvolvidos. O primeiro designado como “Projeto Piloto: Refluxo Gastroesofágico por pHmetria de 24H” (RGE 24H) buscou a via de acesso transnasal para registro de pHmetria por 24 horas. No segundo, designado “Projeto Piloto: Esofagostomia”, para confirmação de refluxo gastroesofágico espontâneo em suínos da raça Large White, utilizou-se anestesia com associação de tiletamina 125 mg e zolazepam 125 mg em combinação com um sedativo, a xilazina a 2% . A pHmetria foi mantida por 24 horas. Os dados descritos por Kadirkamanathan et al. não foram reproduzidos no nosso laboratório. Optou-se então pela realização de um terceiro projeto, “Projeto Piloto: Gastrostomia” para induzir refluxo gastroesofágico através de um modelo experimental e testar a reprodutibilidade da Pressão de Vazão Gástrica. Obteve-se sucesso. Resultados: Trinta e sete animais foram estudados em 60 intervenções no Laboratório de motilidade experimental. O projeto piloto “RGE:24h” foi abandonado após perda de 5 animais pela anestesia com halotano e, solucionada esta questão, a sistemática infecção do tecido celular subcutâneo nasal, dificultando a manutenção do cateter de phmetria em outros 5 animais. No “Projeto Piloto: Esofagostomia”, em cinco animais estudados (cada animal em duas ocasiões diferentes) não se reproduziram os achados de refluxo espontâneo. No terceiro projeto “Projeto Piloto: Gastrostomia” quatro animais foram estudados em dois momentos diferentes obtendo-se sucesso e reprodutibilidade XXIdos dados. Criado o modelo experimental, quatorze suínos foram submetidos ao experimento com implante endoscópico de PMMA com os seguintes resultados: A média dos pesos com 8 semanas de idade foi 14,98 ± 2,43 e 28 dias após o implante, 20,26 ± 3,68. O ganho ponderal foi considerado normal para a espécie. A Pressão de Vazão Gástrica média no dia 1 foi 8,08 mmHg e no dia 28, 10,69mmHg (Teste t de Student: t = 2,72 gl = 13 p = 0,017). Os Volumes de Vazão Gástricos médios foram: 392,86 ml para o dia 1 e 996,71 ml no dia 28 (teste t de Student: t = 11,66 gl = 13 p< 0,001). A Pressão Basal do EEI e o comprimento do esfíncter, não apresentaram diferenças estatisticamente significativas. PMMA foi identificado como depósitos de grandes vacúolos no tecido intersticial ao exame histológico da junção esofagogástrica associado a histiócitos, plasmócitos e presença de células gigantes tipo Langhans indicando reação tecidual de corpo estranho em todos os animais. Fibrose e macrófagos com vacúolos intracelulares estiveram presentes em menor freqüência. Conclusões: 1. O modelo experimental, em suínos, desenvolvido viabilizou o estudo do Refluxo Gastroesofágico através da Pressão de Vazão Gástrica e Volume de Vazão Gástrico; 2. O implante de PMMA, no presente estudo, aumentou a Pressão de Vazão e o Volume de Vazão Gástricos, mas não a Pressão Basal do EEI, nem tampouco aumentou o seu comprimento; 3. Depósito de PMMA implantado e evidência de processo inflamatório crônico e reação tecidual de corpo estranho foi encontrada no local do implante de PMMA. Macrófagos com vacúolos intracelulares e fibrose foram encontrados com menos freqüência.

Titulação de vacinas contra o sorotipo 3 do vírus da doença de marek por pcr em tempo real

A Doença de Marek é uma enfermidade linfoproliferativa das aves, causada por um alfaherpesvírus e caracterizada pela infiltração de células em nervos periféricos, gônadas, íris, vísceras, músculos e pele. Desde 1970, vacinas atenuadas têm sido utilizadas como ferramenta principal no controle da doença. Esse trabalho descreve a implantação da Reação em Cadeia da Polimerase em Tempo Real (qPCR) para a titulação de vacinas contra o vírus da doença de Marek do sorotipo 3, herpesvírus dos perus (HVT). A qPCR foi comparada com a técnica tradicional de titulação, baseada no cultivo celular de fibroblastos de embrião de galinha. Foram avaliadas três vacinas vivas (congeladas, cepa FC126) provenientes de distintos fabricantes. A técnica molecular apresentou alta correlação entre os valores de threshold cycle (CT) e respectivas diluições das vacinas (R2 = 0,99), indicando que, dentro desta faixa linear testada (102 a 104 PFU/dose), a qPCR foi capaz de quantificar as vacinas disponíveis no mercado. A reprodutibilidade da titulação em cultivo celular e qPCR foi avaliada pela realização dos testes em três dias distintos a partir de ampolas de um mesmo lote da vacina. Os títulos obtidos por ambos os métodos demonstraram alta reprodutibilidade e coerência com o fornecido pelo fabricante. Caracterizou-se também a proporção de vírus livres e associados às células, onde foi observado que, pelo menos, 90% dos vírus encontravamse na forma associada. Este trabalho indicou que a qPCR é reprodutível, rápida e menos trabalhosa do que a titulação em cultivo celular tradicionalmente utilizada.

Comparação de dois métodos experimentais de estenose subglótica em modelo animal : infiltração de NaOH 23% e eletrocoagulação

Introdução: Estenose subglótica (ESG) é definida como o estreitamento da porção inferior da laringe. De etiologia congênita ou adquirida, ela é a segunda causa de estridor e a segunda causa de indicação de traqueostomia na criança. As dificuldades encontradas no manejo da estenose subglótica, principalmente na população pediátrica, justificam o desenvolvimento de modelos experimentais de fácil reprodutibilidade, poucas complicações e baixo custo. O objetivo deste estudo foi comparar dois métodos de indução experimental de estenose subglótica.Material e métodos: No período de janeiro a dezembro de 2003, vinte cães foram selecionados de forma aleatória, e colocados por sorteio em dois grupos: Gp I (n=9) de eletrocoagulação e Gp II (n=11) de infiltração de NaOH 23 %. No Gp I foi realizada eletrocoagulação com auto-interrupção, aplicada em um ponto nos quatro quadrantes da cartilagem cricóide; no Gp II infiltração de 0,2 ml de NaOH 23 % na camada submucosa das porções anterior e posterior da cartilagem cricóide. A cada semana foi feita endoscopia e aferição do calibre da região subglótica por tubos endotraqueais, e nova aplicação de eletrocoagulação ou infiltração NaOH 23 % realizada quando não havia evidência de estenose subglótica. Os animais foram sacrificados após 21 dias da aplicação; aqueles que apresentaram sofrimento respiratório foram sacrificados antes. Resultados : Um animal do Gp I morreu 14 dias após a aplicação, durante o transporte; dois animais do Gp II morreram: um por fístula traqueoesofágica após 7 dias, e outro de causa indeterminada após 5 dias. Estenose subglótica significativa (acima de 51% de obstrução) foi observada em 67% dos animais do Gp I e 64% do Gp II (p=0,99). A mediana de tempo para o surgimento de estenose significativa foi de 21 dias em ambos os grupos, necessitando em média de 2 a 3 aplicações. O tempo necessário para a realização dos procedimentos foi significativamente menor (p<0,01) no Gp I (média 6,36 minutos) do que no Gp II (média de 14,88 minutos). Conclusão : Os dois modelos experimentais de estenose subglótica estudados em cães demonstraram ser efetivos no desenvolvimento de estenose subglótica significativa: ambos métodos estudados ocasionaram estenose no mesmo período de tempo e com mesmo número de aplicações. Entretanto, a eletrocoagulação foi o método de mais rápida execução.

Variabilidade dos testes de adequação da diálise peritoneal ambulatorial contínua

Os testes de adequação da diálise peritoneal ambulatorial contínua – (CAPD) e a determinação das características de transporte de solutos pela membrana peritoneal são muito importantes para a prescrição e avaliação da dose de diálise, assim como para a individualização da prescrição. Esses testes fornecem informações objetivas e permitem uma monitorização da dose de diálise oferecida para o paciente. Neste estudo, foi avaliada a variabilidade e reprodutibilidade dos testes de adequação da CAPD − depuração fracional de uréia (KT/V) e depuração de creatinina total semanal (D cr total semanal), assim como, a taxa de catabolismo protéico (PCR) – e do teste de equilíbrio peritoneal (PET), em pacientes em programa regular de CAPD nos ambulatórios de Nefrologia do Hospital de Clínicas de Porto Alegre e do Hospital Universitário de Santa Maria. Foram incluídos 24 pacientes e efetuadas três avaliações consecutivas, com realização dos testes de adequação da diálise e do teste de equilíbrio peritoneal em cada avaliação. O intervalo entre a avaliação I e II foi de 43,3 ± 23,4 dias e entre a avaliação II e III foi de 66,2 ± 42,8 dias. Em cada avaliação foram coletados dialisado e urina de 24 horas para dosagem de creatinina e uréia. Amostra de sangue foi coletada no final da coleta de 24 horas para dosagem de uréia e creatinina. Foi medido o volume de dialisado e de urina de 24 horas. No final da coleta de 24 horas foi realizado o teste de equilíbrio peritoneal (PET), com uma solução de diálise com concentração de 2,5% e com duração de quatro horas. Com esses resultados, foi possível calcular cada teste e realizar a análise estatística. Na avaliação I , os testes de adequação da CAPD apresentaram médias de KT/V de 2,15 ± 0,44; D cr total semanal de 66,8 ± 14,5 litros/semana; PCR de 55,5 ± 16,0 g/dia e PCRn de 1,04 ± 0,21 g/kg/dia. Na avaliação II, os testes apresentaram médias de KT/V de 2,11 ± 0,39; D cr total semanal de 65,3 ± 13,3 litros/semana; PCR de 55,0 ± 14,6 g/dia e PCRn de 1,03 ± 0,23 g/kg/dia. Na avaliação III, as médias foram: para o KT/V, 2,18 ± 0,35; para Dcr total semanal, 63,0 ± 11,4 litros/semana; para PCR, 55,2 ± 16,7 g/dia e para PCRn, 1,05 ± 0,25 g/kg/dia. A comparação entre as médias foi feita pelo teste de análise de variância e comparações múltiplas. Não houve diferença estatisticamente significativa entre as três avaliações consecutivas. A variabilidade dos testes de adequação da CAPD foi analisada através do coeficiente de variação, a concordância de cada teste, em cada avaliação, foi feita pelo teste de concordância de kappa e a associação, pelo teste do Qui-Quadrado. O KT/V apresentou coeficiente de variação média (CV%) de 9,78%; a D cr total semanal teve coeficiente de variação média de 8,84%; a PCR apresentou CV% médio de 7,74% e a PCRn teve CV% médio de 7,09%. Esses testes mostraram uma fraca a média concordância e não mostraram associação entre as três avaliações. Os componentes do teste de equilíbrio peritoneal apresentaram os seguintes coeficientes de variação: relação glicose dialisado T4/T0 de 20,2%; relação creatinina dialisado T4/creatinina plasmática T4 de 14,1%; e volume drenado na quarta hora de 5,0%. Não houve diferença estatisticamente significativa entre as três avaliações consecutivas. A relação da glicose apresentou a maior variabilidade, seguida pela relação da creatinina e pelo volume de dialisado drenado na quarta hora. O teste de equilíbrio peritoneal não foi reproduzível. Em apenas 20% dos testes, foi possível classificar os pacientes quanto às características de transporte peritoneal, considerando os três critérios, nas três avaliações. Em 80% dos testes, a classificação foi feita por dois critérios coincidentes ou pela relação dialisado plasmática da creatinina. Na classificação final, a maioria dos testes de equilíbrio peritoneal foram médio alto e médio baixo transportadores. Os resultados mostram que os testes de adequação da CAPD e o PET não apresentam diferença estatisticamente significativa entre as três avaliações consecutivas. A variabilidade dos testes de adequação da diálise foi de 8 a 10%. A função renal residual apresentou variabilidade muito mais elevada que a depuração peritoneal. Os testes de adequação da CAPD também apresentam fraca a boa concordância, considerando as três avaliações. Essa variabilidade pode ser clinicamente significativa e deve ser considerada na avaliação e prescrição dos pacientes em CAPD.

Desenvolvimento de um novo método de pré-concentração em linha em eletroforese capilar através de gradientes térmicos

Nos últimos dez anos, milhares de trabalhos foram publicados somente no desenvolvimento da técnica de eletroforese capilar (CE) e suas aplicações em ciências biológicas, química e em outras áreas. Apesar disto, muitos tópicos de pesquisa básica da CE ainda continuam sendo desenvolvidos. Algumas vantagens da CE sobre as demais técnicas de separação são marcantes, tais como: possibilidade de automação, rapidez na obtenção dos resultados e alto poder de resolução. A pequena quantidade de amostra que é necessária para uma análise é uma característica muito interessante no estudo de sistemas biológicos, sendo que normalmente são injetados no capilar, volumes de 5 a 50 nl de amostra. Por outro lado, esta reduzida quantidade de amostra utilizada, a pequena janela de detecção e as baixas concentrações dos analitos nas amostras biológicas, são fatores que desafiam os pesquisadores nesta área. Para contornar este problema diversos métodos de pré-concentração de amostra foram desenvolvidos. Neste trabalho, foi desenvolvido um método inédito de pré-concentração de amostras através de gradientes térmicos em CE. O princípio do método é concentrar o analito quando ele passa de uma zona de alta temperatura para uma zona de baixa temperatura. Um modelo teórico foi desenvolvido para auxiliar o planejamento experimental no que diz respeito à determinação das condições em que a corrida deve ser realizada (pH, tipo de tampão, temperatura) para aplicar a compressão térmica em um analito. Foi utilizado L-Lisina derivatizada com naftaleno 2,3-dicarboxialdeído (Lys/NDA) como analito modelo. Uma diferença de temperatura de 58 °C entre as duas zonas térmicas foi suficiente para comprimir em 2,5 vezes a banda da Lys/NDA em um tampão de baixo coeficiente térmico com o pH ajustado para 8,7. O método de compressão de banda por gradientes térmicos proposto neste trabalho é uma nova opção para aumentar a sensibilidade e a resolução em CE. Ao contrário dos métodos clássicos de pré-concentração, esse novo método pode ser aplicado em amostras tanto com alta ou baixa condutividade iônica, comprimir bandas de analitos aniônicos ou catiônicos e ser aplicado em corridas em solução livre ou não. Além disso, considerando que o controle de temperatura seja realizado de maneira automatizada, pode apresentar altas taxas de reprodutibilidade, além de ser de simples e de fácil aplicação, podendo ser empregado em análises de rotina. Diferentes LEDs (Light Emitting Diode) foram testado em detector por fluorescência induzida por LED. Além disso, um novo sistema de aquisição de dados e tratamento de sinal utilizando a placa de som de um PC (Personal Computer) e um amplificador Lock-in emulado por software foi montado e comparado com um sistema de aquisição de dados convencional. O equipamento de CE utilizado neste trabalho com esses componentes, apresentou uma elevada sensibilidade, na faixa de 0,5 à 1 fmol para os peptídeos e aminoácidos testados e foi superior ao sistema convencional em vários aspectos como: sensibilidade de detecção, faixa linear de detecção em concentração do analito, facilidade de operação e custo do sistema.

Avaliação das variáveis analíticas dos métodos de determinação do teor de taninos totais baseados na formação de complexos com substâncias protéicas e derivados da polivinilpirrolidona

O presente trabalho objetivou estudar as principais variáveis analíticas associadas aos métodos espectrofotométricos de quantificação do teor de taninos utilizando caseína e pó-de-pele, os reagentes de Folin-Denis e Folin-Ciocalteu, bem como a avaliação de diferentes tipos de PVPP (Divergan® F, Divergan® RS, Kollidon® CL e PVPP-P6755) na substituição dos substratos protéicos. Para tanto, dois métodos de análise, um espectrofotométrico e outro por CLAE foram desenvolvidos, utilizando os polifenóis catequina, ácido tânico, ácido gálico e pirogalol como substâncias de referência e rutina como flavonóide modelo. Para maiores inferências uma solução extrativa de folhas secas de Psidium guajava L também foi quantificada. A análise comparativa assinalou o uso vantajoso do reagente de Folin-Ciocalteu, em relação ao reagente de Folin-Denis. Em termos de reprodutibilidade, a caseína grau técnico (GT) mostrou-se superior à caseína purificada, embora essa última possua maior afinidade pelos polifenóis testados. Contudo, as análises por UV-VIS e por CLAE em comprimentos de onda de 280m e 352 nm, demonstraram que tanto a caseína GT quanto o pó-de-pele não são seletivos para complexar taninos, de acordo com as normas do ICH. Tanto o pó-de-pele quanto a caseína GT foram capazes de complexar polifenóis e rutina de maneira inespecífica. Isso foi evidenciado quando misturas de um único polifenol e rutina ou a fração flavonoídica de P. guajava foram testadas. A capacidade de complexação de polifenóis e rutina por parte da PVPP foi avaliada por UV-VIS, DSC e CLAE. Os melhores resultados foram observados para PVPP-P6755, no entanto com restrições. De maneira similar a caseína GT e pó-depele a PVPP-P6755 foram capazes de complexar de maneira inespecífica rutina e outros flavonóides do extrato de P. guajava. Uma validação plena para o caso específico de folhas de P. guajava é questionável. No entanto, o método baseado na utilização de PVPP mostrou-se passível de padronização utilizando 500,0 mg de pó de droga, 2,0 mL de reagente de Folin-Ciocalteu, tempo de leitura 30 min após adição desse reagente e quantificação em 760 nm. Sob essas condições, a análise comparativa demonstrou que 50,0 mg de PVPP foram, em termos analíticos, equivalentes a 100,0 mg de pó-de-pele ou a 750 mg de caseína GT.