Role of insulin and insulin-like peptides in bone formation: identification of bone-specific target genes and regulatory mechanisms, and characterization of the insulin-mimetic effect of vanadium

Tese de Doutoramento em Biologia, Especialidade em Biologia Molecular, Universidade do Algarve, 2008

Mechanical cell lysis technique for plasmid recovery

Dissertação de Mestrado, Engenharia Biológica, Faculdade de Engenharia de Recursos Naturais, Universidade do Algarve, 2008

Role of the different actin genes during extrusion of capping protein mutant cells in the Drosophila wing blade epithelium

Dissertação mest., Biotecnologia, Universidade do Algarve, 2008

Estudo do efeito de contaminantes na espécie sentinela, a amêijoa Ruditapes decussatus, por intermédio da análise da expressão proteica: aplicação à monitorização do meio marinho

Tese dout., Ciências e Tecnologias do Ambiente, 2009, Universidade do Algarve

Growth conditions, omega - 3 fatty acid concentrations and gene expression of fatty acid desaturases in Portulaca oleracea leaves

Tese de dout., Ciências Biotecnológicas (Biotecnologia Vegetal), Univ. do Algarve, 2009

Desenvolvimento de vectores não virais para terapia génica

Dissertação de mest., Ciências Biomédicas, Faculdade de Ciências e Tecnologia, Univ. do Algarve, 2011

Dissection of the early steps in the assembly of the 20S proteasome in Saccharomyces cerevisiae

Tese de dout., Bioquímica (Biologia Celular e Molecular), Faculdade de Ciências e Tecnologia, Univ. do Algarve, 2010

Autophagy in hypothalamic cells: role of Neuropeptide Y

Dissertação de mest.Ciências Biomédicas. Departamento de Ciências Biomédicas e Medicina, Univ. do Algarve, 2011

Produção de bioetanol a partir de resíduos industriais de alfarroba: cinética de inibição do etanol para diferentes concentrações do nutriente limitante. Fermentação com recirculação de células livres e células imobilizadas

Dissertação de mest., Engenharia Biológica, Faculdade de Ciências e Tecnologia, Univ. do Algarve, 2012

Asma - perfil de uma patologia crónica multifactorial: processo inflamatório e abordagem farmacoterapêutica

Fundamentado numa pesquisa bibliográfica exaustiva, o presente trabalho pretende identificar os vários fenótipos da asma que afectam a população, assim como os mecanismos celulares e moleculares que conduzem ao processo de inflamação crónica e de remodelação brônquica característicos desta patologia. Hoje a terapêutica farmacológica da asma, encontra-se dirigida à prevenção de exacerbações pelo controlo da inflamação ou à reversibilidade da obstrução brônquica resultante das mesmas. Assim com a ambição de definir um tratamento mais eficiente que eventualmente leve à cura, vários imunomoduladores têm sido desenvolvidos, sobre os quais recairá alguma da atenção neste estudo. Entre Março e Setembro de 2011, foi recolhida informação bibliográfica, recorrendo a livros, artigos e bases de dados online, procurando sempre as fontes com informação mais actual e fidedigna disponível. Depois de investigados os vários intervenientes nos processos de inflamação e remodelação brônquicas e a forma como interagem entre si, avaliaram-se algumas das novas moléculas disponíveis para o tratamento da asma, actualmente em fase de ensaios clínicos. Alguns destes fármacos revelam-se promissores no tratamento de alguns fenótipos específico de asma. Considerada uma doença bastante complexa e heterogénea, é agora perceptível que a asma, não é apenas determinada por uma resposta linfocitária Th2, mas reflecte antes uma constante mudança na resposta imunitária, que compreende uma complexa rede de sinais efectores e regulatórios entre as células estruturais e diversos leucócitos. Assim a contínua busca de novos tratamentos passará pela modulação conjunta de vários mediadores, com o objectivo de alterar alguma

Effect of polyunsaturated fatty acids (PUFAs) on the proliferation and extracellular matrix mineralization and gene expression of gilthead seabream skeletal cell lines

The aquaculture industry aims at replacing significant amounts of marine fish oil by vegetable oils in fish diet. Dietary lipids have been shown to alter the fatty acid composition of bone compartments, which would impact the local production of factors controlling bone formation. Knowledge on the mechanisms underlying the nutritional regulation of bone metabolism is however scarce in fish. Two in vitro bone-derived cell systems developed from seabream (an important species for aquaculture in the Mediterranean region) vertebra, capable of in vitro mineralization and exhibiting prechondrocyte (VSa13) and pre-osteoblast (VSa16) phenotype, were used to assess the effect of certain polyunsaturated fatty acids (PUFAs; arachidonic (AA), eicosapentaenoic (EPA) and docosahexaenoic (DHA) acids) on cell proliferation, extracellular matrix (ECM) mineralization and gene expression. While all PUFAs promoted morphological changes in both cell lines, VSa16 cell proliferation appeared to be stimulated by PUFAs in a dose dependent manner until 100M, whereas proliferation of VSa13 cells was impaired at concentrations above 10M. AA, EPA and DHA inhibited VSa13 ECM mineralization, alone and in combination, while VSa16 ECM mineralization was only inhibited by AA and EPA. DHA had the opposite effect, increasing mineralization almost by 2 fold. When EFAs were combined, DHA apparently compensated for the inhibitory effect of AA and EPA. Expression of marker genes for bone and lipid metabolisms has been investigated by qPCR and shown to be regulated in pre-osteoblasts exposed to individual PUFAs. Our results show that PUFAs are effectors of fish bone cell lines, altering cell morphology, proliferation and mineralization when added to culture medium. This work also demonstrates the suitability of our in vitro cell systems to get insights into mineralization-related effects of PUFAs in vivo and to evaluate the replacement of fish oils by vegetable oil sources in fish feeds.

Optimização da hidrólise com ácido diluído para o fraccionamento selectivo das hemiceluloses de palha de sorgo: estudo da bioconversão dos hidrolisados para produção de xilitol

O sorgo é uma potencial cultura energética com especial interesse para os climas mediterrânicos. Quer o seu suco quer a sua fracção lenhocelulósica podem ser utilizados no âmbito das biorrefinarias. O objectivo deste trabalho consistiu na optimização da hidrólise com ácido diluído da hemicelulose do sorgo e sua posterior bioconversão a xilitol. Dada a dificuldade de trabalhar o sorgo verde e a quantidade potencial de açúcares ainda presentes no sorgo seco foi feita uma pré-extracção aquosa (PEA) do sorgo biomassa, cujas condições foram optimizadas (100ºC, 45 min, razão líquido/sólido 7 g/g). Para além disso, foram também caracterizados três tipos de sorgo verde (doce, forrageiro e biomassa) relativamente ao teor e tipo de açúcares presentes no suco e licor da PEA, anteriormente optimizada. O material seco pré-tratado foi submetido a uma hidrólise com ácido diluído, tendo-se estudado a influência do tempo de operação e concentração de catalisador (H2SO4) na hidrólise da hemicelulose, a 130ºC. Os resultados foram interpretados através do factor de severidade combinado (CS), num intervalo entre 1,17-2,31. As condições óptimas correspondem a um CS de 1,98, (1,4% H2SO4 e 75 min), tendo-se recuperado na fase líquida 80% da hemiceluloses sob a forma de pentoses livres, juntamente com baixas concentrações de inibidores. O hidrolisado obtido nas condições optimizadas foi utilizado como meio de crescimento e, após concentração, como meio de cultura para a produção de xilitol pela levedura Debaryomyces hansenii CCMI 941. Como meios de inóculo foram testados o hidrolisado ácido e o licor da PEA, ambos suplementados. O último permitiu o crescimento mais rápido da levedura e a obtenção de concentrações celulares adequadas. No entanto, dado que a fase de latência no meio de produção de xilitol foi superior e, consequentemente a produtividade em xilitol inferior, optou-se pelo crescimento do inóculo em meio contendo hidrolisado. A remoção de compostos inibidores foi avaliada através da destoxificação do hidrolisado com carvão activado que permitiu uma remoção significativa de furfural, compostos fenólicos e ácido acético. No entanto, os melhores resultados da produção de xilitol foram obtidos em hidrolisado não-destoxificado e correspondem a um rendimento em xilitol e produtividade volumétrica de 0,64 g.g-1 e 0,56 g.L-1.h-1, respectivamente. Estes resultados encontram-se entre os melhores descritos na literatura para hidrolisados nãodestoxificados, mostrando assim as potencialidades deste material, da levedura e do processo desenvolvido.

Insights into molecular and cellular events involved in normal and pathological vertebral development and fusion using zebrafish as model organism

The vertebral column and its units, the vertebrae, are fundamental features, characteristic of all vertebrates. Developmental segregation of the vertebral bodies as articulated units is an intrinsic requirement to guarantee the proper function of the spine. Whenever these units become fused either during development or postsegmentation, movement is affected in a more or less severe manner, depending on the number of vertebrae affected. Nevertheless, fusion may occur as part of regular development and as a physiological requirement, like in the tetrapod sacrum or in fish posterior vertebrae forming the urostyle. In order to meet the main objective of this PhD project, which aimed to better understand the molecular and cellular events underlying vertebral fusion under physiological and pathological conditions, a detailed characterization of the vertebral fusion occurring in zebrafish caudal fin region was conducted. This showed that fusion in the caudal fin region comprised 5 vertebral bodies, from which, only fusion between [PU1++U1] and ural2 [U2+] was still traceable during development. This involved bone deposition around the notochord sheath while fusion within the remaining vertebral bodies occur at the level of the notochord sheath, as during the early establishment of the vertebral bodies. A comparison approach between the caudal fin vertebrae and the remaining vertebral column showed conserved features such as the presence of mineralization related proteins as Osteocalcin were identified throughout the vertebral column, independently on the mineralization patterns. This unexpected presence of Osteocalcin in notochord sheath, here identified as Oc1, suggested that this gene, opposing to Oc2, generally associated with bone formation and mature osteoblast activity, is potentially associated with early mineralization events including chordacentrum formation. Nevertheless, major differences between caudal fin region and anterior vertebral bodies considering arch histology and mineralization patterns, led us to use RA as an inductive factor for vertebral fusion, allowing a direct comparison of equivalent structures under normal and fusion events. This fusion phenotype was associated with notochord sheath ectopic mineralization instead of ectopic perichordal bone formation related with increased osteoblast activity, as suggested in previous reports. Additionally, alterations in ECM content, cell adhesion and blood coagulation were discussed as potentially related with the fusion phenotype. Finally, Matrix gla protein, upregulated upon RA treatment and shown to be associated with chordacentrum mineralization sites in regular development, was further described considering its potential function in vertebral formation and pathological fusion. Therefore with this work we propose zebrafish caudal fin vertebral fusion as a potential model to study both congenital and postsegmentation fusion and we present candidate factors and genes that may be further explored in order to clarify whether we can prevent vertebral fusion.

Sistemas nanoparticulados e a vetorização de fármacos no tratamento do cancro

O cancro é hoje em dia um dos principais fatores de morbilidade e mortalidade. No ano de 2010, o National Institute of Health estimou os custos associados ao cancro em cerca de 263,8 biliões de dólares. Desta forma, a investigação nesta área continua a procurar formas de otimizar os tratamentos, aliviando o sofrimento dos doentes e reduzindo os custos associados à doença. O tratamento do cancro tem evoluído no sentido de atingir uma maior seletividade para as células tumorais. As limitações associadas à quimioterapia com apenas um fármaco conduziram ao aparecimento de novas estratégias, nas quais se combinam diferentes terapêuticas, com diferentes mecanismos de ação, levando a um efeito sinergístico. Esta estratégia permite a administração de uma menor dose de cada fármaco, diminuindo assim os efeitos adversos. No entanto, existem limitações clínicas para estas terapêuticas convencionais relacionadas com as propriedades dos transportadores das membranas celulares, a baixa biodisponibilidade e a distribuição dos fármacos junto das células tumorais. A pesquisa de novas estratégias tornou-se uma necessidade para a obtenção de uma distribuição mais efetiva e especifica dos fármacos nas células tumorais. Assim, os nanossistemas foram extensamente estudados para aumentar a eficácia dos tratamentos. A nanotecnologia, através da encapsulação dos fármacos, permitiu melhorar os parâmetros farmacocinéticos dos fármacos, tendo ainda a vantagem de se poder fazer uma vetorização para as células tumorais, tendo por base o reconhecimento de recetores.

Extração e estudo das proteínas da goma da alfarroba com vista à sua clarificação

O objectivo primordial deste trabalho foi efectuar a extracao e o estudo das proteinas da Goma da Alfarroba ou Locust Bean Gum (LBG) com vista a sua clarificacao e purificacao. Para atingir este objectivo em primeiro lugar estudou-se o teor de etanol que se deveria utilizar numa suspensao aquosa de LBG, uma vez que a LBG e um polissacarido que hidrata facilmente com agua e consequentemente origina solucoes altamente viscosas que impossibilitam a realizacao de tecnicas de extracao de proteinas. Para isso estudou-se o comportamento da LBG em suspensoes aquosas com 10% (p/v) de LBG e diferentes concentracoes de etanol, designadamente 10% (v/v), 20% (v/v), 30% (v/v) e 40% (v/v). Com este estudo concluiu-se que seria necessario utilizar uma concentracao de 40% (v/v) de etanol a 96% em cada suspensao de LBG a 10% (p/v) para conseguir evitar a sua hidratacao excessiva. Assim, todas as extracoes neste trabalho foram realizadas de acordo com estas condicoes. Posteriormente com vista a extracao das proteinas da LBG testaram-se diferentes tratamentos, designadamente tratamentos alcalinos, acidos e com detergentes. Segundo a bibliografia consultada para os tratamentos alcalinos, realizaram-se estas extracoes com hidroxido de sodio (NaOH) com concentracoes de 0,025 M, 0,05M, 0,1M e 0,2M. Estes tratamentos foram iniciados com uma concentracao de NaOH a 0,2M, contudo apos analise dos resultados verificou-se que esta originou uma LBG com uma coloracao mais amarela do que a LBG bruta (inicial) apresentava. Sendo a ideia final a clarificacao da goma este nao foi um resultado desejavel e como tal testaram-se concentracoes inferiores de NaOH, acima referidas. No final concluiu-se que todas estas extracoes efetuadas com NaOH originavam uma LBG mais amarela do que a LBG bruta e que assim este nao seria o tratamento mais adequado para o objectivo pretendido. Como tal prosseguiram-se os estudos com um tratamento acido, que atraves de consulta bibliografica se iniciou com acido sulfurico (H2SO4). O tratamento acido iniciou-se com uma concentracao de H2SO4 de 0,1M, testando-se posteriormente tambem uma extracao com H2SO4 com concentracao de 0,05M. No final destas extracoes verificou-se que a LBG obtida em ambas apresentava uma coloracao mais clara do que a LBG bruta, o que representava, numa primeira analise, um bom resultado. Por fim efectuaram-se extracoes solido-liquido com diferentes detergentes, designadamente com Tween 20, Tween 40, Tween 60, Tween 65, Tween 80, Tween 85, Triton X-100, Triton X-114 e SDS todos a uma concentracao de 0,1% (v/v) a excepcao do Tween 65 em que foi utilizada uma concentracao de 0,1% (p/v), porque a temperatura ambiente este detergente e solido. No final destas extracoes concluiu-se que na maioria dos casos a LBG apresentava uma coloracao mais clara do que a LBG bruta. Para quantificar as proteinas extraidas atraves de cada um dos tratamentos acima mencionados utilizaram-se dois metodos, o metodo de Bradford para quantificar as proteinas presentes nos sobrenadantes das extracoes e o metodo de Kjeldahl para quantificar as proteinas ainda presentes na LBG apos as extracoes. Analisando os resultados obtidos por estes metodos concluiu-se que a extracao efetuada com Tween 80, em que se efectuou uma lavagem adicional a LBG durante a filtracao com uma solucao de agua destilada e etanol a 40% (v/v), foi a que apresentou melhores resultados. Assim, foi com esta amostra proteica que se prosseguiram os estudos as proteinas. Para realizar os estudos as proteinas extraidas efectuou-se uma eletroforese em SDS-PAGE (sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis) com o intuito de verificar o estado da amostra. Analisando os geles obtidos constatou-se que a amostra se encontrava em boas condicoes. Deste modo realizou-se uma eletroforese bidimensional (2 – D) das proteinas extraidas da LBG. Nesta tecnica, como se desconheciam que tipo de proteinas se encontravam presentes na amostra utilizou-se uma banda de pH para a Focagem Isoelectrica (1a Dimensao) entre 3 e 10 e a separacao por Peso Molecular (2a Dimensao) foi efetuada em SDS-PAGE. Analisando os geles obtidos concluiu-se que a maioria das proteinas presentes nesta amostra apresentam pontos isoelectricos na gama de pH entre 5 e 6 e tem pesos moleculares entre 40 e 60 kDa. Pode-se entao concluir que o objectivo deste trabalho foi apenas parcialmente atingido uma vez que se conseguiu extrair e estudar algumas das caracteristicas das proteinas presentes na LBG, mas nao se alcancou a sua clarificacao.