Estudo das interações in vivo entre as proteínas teloméricas LaRPA-1 e LaRbp38 usando o sistema do duplo híbrido

A leishmaniose é um conjunto de doenças infecciosas causadas por parasitas do gênero Leishmania, que afligem milhões de pessoas no mundo, tendo a cada ano dois milhões de novos casos e 70 mil mortes. As drogas utilizadas no tratamento das diferentes formas clínicas da doença apresentam alta toxicidade e baixa eficácia, além de apresentarem muitos efeitos colaterais e colaborarem com o aparecimento de parasitas e vetores resistentes. Devido a estas adversidades, o desenvolvimento de novas terapias para o tratamento desta parasitose é incentivada pela Organização Mundial da Saúde (OMS) e um maior conhecimento sobre a biologia molecular destes protozoários poderá facilitar estas descobertas. Ultimamente, os telômeros, estruturas nucleoproteícas nos terminais dos cromossomos de eucariotos, têm sido alvo intenso de estudos, que visam utilizá-los como alvo terapêutico contra tumores malignos e microrganismos patogênicos. Os telômeros geralmente se apresentam como estruturas dinâmicas onde ocorrem interações entre o DNA e proteínas, resultando na formação do complexo telomérico, que é responsável pela proteção e manutenção dos cromossomos e estabilidade do genoma, caracterizando uma função imprescindível para viabilidade celular. Componentes do complexo telomérico de Leishmania amazonensis foram identificados por ensaios bioquímicos em extratos positivos para a atividade de telomerase. Entre estes componentes identificou-se as proteínas LaRPA-1 (L. amazonensis Replication Protein A-1) e a LaRbp38 (L. amazonensis RNA binding protein) as quais mostraram habilidade de interagir com o DNA telomérico in vitro e in vivo. Mais recentemente, utilizando-se ensaios de imunoprecipitação e de captura por “pull-down” foi demonstrado que estas proteínas fazem parte de um mesmo complexo nos telômeros do parasita. Este trabalho pretende confirmar estas possíveis interações entre as proteínas teloméricas LaRPA-1 e ...

Avaliação do metabolismo oxidativo em cepas de Trypanosoma cruzi naturalmente resistentes ao benzonidazol

O agente etiológico da doença de Chagas, Trypanosoma cruzi, é responsável pela infecção de milhões de pessoas na América Latina. No momento há apenas dois fármacos disponíveis, o nifurtimox (5-nitrofurano), teve o uso descontinuado no Brasil, e o benzonidazol (2-nitroimidazole), embora ambos possuam ações limitadas, visto que dependem da fase da doença, das condições fisiológicas do hospedeiro, da suscetibilidade e variabilidade genética da cepa. Assim, a busca de novas moléculas torna-se urgente e necessária, bem como a compreensão do mecanismo de resistência aos fármacos tripanocidas. Alguns estudos relatam aumento na produção de enzimas que atuam na defesa celular, as quais, provavelmente, poderiam ser responsáveis pela resistência de certas cepas do parasita. Tais enzimas têm funções importantes na sobrevivência e crescimento dos parasitas: superóxido dismutase (SOD), uma metaloenzima que elimina radicais superóxido ao convertê-los em peróxido de hidrogênio e oxigênio molecular; old yellow enzyme (OYE), que é uma NADPH flavina oxidoredutase e pode estar envolvida na redução de substâncias tripanocidas; e, peroxiredoxina (Prx), que catalisa a redução de peróxidos. O objetivo deste projeto é avaliar a suscetibilidade de diferentes cepas ao benzonidazol, clonar, sequenciar e expressar enzimas possivelmente envolvidas na resistência a este fármaco e realizar análises morfológicas serão nos parasitos após serem expostos à substância em questão. Futuramente os anticorpos policlonais obtidos a partir das proteínas recombinantes de Prx, SOD e OYE serão empregados para avaliar o nível de expressão das mesmas em parasitas tratados e não tratados com o benzonidazol.

Estudo da viabilidade da aplicação de técnicas preditivas na manutenção de reatores batelada

This study aims to analyze the feasibility of using predictive techniques like thermography, vibration analysis, eddy current, liquid penetrant, visual examination and ultrasound in equipment as batch reactors of the type used in a biodiesel production company. This study is based on: analysis of the practices of corrective and preventive maintenance commonly adopted in the company in question, the cost and time spent for such activities and the potential savings and revenue generation that can be after implementation of these techniques on the analysis of maintenance current

Comparação da sensibilidade da técnica parasitológica (OPG) e da PCR para o diagnóstico de Strongyloides venezuelensis em fezes de ratos (Rattus norvegicus) da linhagem Lewis infectados experimentalmente

Espécies do gênero Strongyloides são importantes parasitas de humanos e animais domésticos e aquelas que parasitam roedores são freqüentemente utilizadas como modelos experimentais para o estudo da estrongiloidíase. S. venezuelensis parasita ratos (Rattus norvegicus) e seu estudo tem permitido o entendimento de mecanismos imunológicos envolvidos na relação parasita–hospedeiro da estrongiloidíase humana e animal. O diagnóstico parasitológico de S. venezuelensis pode ser realizado pela detecção de ovos embrionados nas fezes, com o uso do OPG (ovos por grama de fezes), também empregado no monitoramento da infecção. Entretanto, essa técnica se mostra pouco sensível quando a carga parasitária é leve. Os métodos moleculares aumentam a sensibilidade e a especificidade das análises. A PCR tem se mostrado como uma técnica sensível e precisa na detecção de parasitas em tecidos e fezes de hospedeiros infectados. A fim de comparar a sensibilidade das técnicas de OPG e PCR em ratos Lewis infectados por S. venezuelensis, foram realizados dois protocolos no presente estudo. No Protocolo I foi comparada a sensibilidade das duas técnicas em amostras de ratos Lewis com diferentes cargas parasitárias. A PCR com o emprego par de primers descrito por Dorris et al. (2002) obteve melhores resultados que o OPG nos grupos inoculados com 40 L3, considerada como infecção leve. Entretanto, não foi verificada diferença estatística significativa entre as técnicas (P>0,05), provavelmente por terem sido utilizados poucos animais (n=10). O outro par de primers utilizado foi desenhado a partir de uma seqüência parcial do gene do rDNA de S. venezuelensis e não foi capaz de detectar a presença do DNA do helminto em nenhuma amostra desse grupo. Já nos grupos inoculados com 400 e 4000 L3, tanto a PCR com...(Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo)

Atividade in vitro do extrato hidroalcoólico da casca de Astronium fraxinifolium (Anacardiaceae) sobre trofozoítos de Giardia duodenalis

As investigações conduzidas para avaliar novas substâncias para o tratamento da giardíase justificam-se pelo fato dos medicamentos convencionais apresentarem inconvenientes relacionados à toxicidade, à resistência e aos custos. Diante disso, a busca por novas alternativas terapêuticas tem despertado grande interesse, principalmente, entre os extratos de plantas, produtos complexos com diferentes atividades biológicas e farmacológicas. Considerando que nas infecções por Giardia, a diarréia é um dos principais sintomas, tem sido crescente o interesse em se investigar o efeito de extratos de plantas com atividade antidiarréica. Com isso, o presente trabalho foi desenvolvido com o objetivo de avaliar in vitro o efeito do extrato hidroalcoólico da casca da planta Astronium fraxinifolium, espécie típica do Cerrado brasileiro e empregada na medicina popular no tratamento contra inflamações, diarréias e úlceras gástricas. Para este fim, avaliou-se a atividade sobre o crescimento e aderência de trofozoítos de cepa autóctone de Giardia duodenalis isolada e axenizada em Botucatu, São Paulo. Em todos os ensaios, 105 trofozoítos da cepa BTU-11 foram inoculados em tubos contendo 4,5ml de meio TYI-S-33 e 100μl do extrato nas concentrações de 125; 250; 375 e 500 μg/ml. Para avaliar a atividade sobre o crescimento, os parasitas foram incubados com o extrato durante 24, 48 e 72 horas a 37°C. Nos experimentos que verificaram o efeito sobre a aderência, somente os parasitas aderidos às paredes dos tubos foram incubados com o extrato, durante 24 e 48 horas a 37°C. Em cada ensaio, os trofozoítos recuperados foram contados em câmara de Neubauer e a atividade sobre... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo)

Avaliação da adição da Lactobacillus acidophilus CRL 1014 e Enterococcus faecium CRL 183 sobre a microbiota intestinal em Simulador do Ecossistema Microbiano Humano (SEMH)

Os micro-organismos probióticos são utilizados em vários produtos alimentícios ou em suplementos alimentares. Simuladores intestinais representam uma opção de realização de estudos com a microbiota intestinal. O simulador do ecossistema microbiano humano (SEMH) consiste em uma sucessão de cinco reatores conectados que representam as diferentes partes do trato gastrointestinal humano com seus respectivos valores de pH, tempo de residência e capacidade volumétrica. O SEMH foi utilizado para estudar o efeito do Enterococcus faecium CRL 183 e do Lactobacillus acidophilus CRL 1014 sobre a microbiota intestinal nativa. Inicialmente, o inóculo preparado com fezes humanas foi introduzido nos três reatores, responsáveis por simular o cólon ascendente, transverso e descendente. Após duas semanas de estabilização foi adicionado, diariamente, durante quatro semanas, E. faecium CRL 183 e L. acidophilus CRL 1014 contendo 108 UFC/mL nos três compartimentos que simulam o cólon ascendente, transverso e descendente. Após as quatro semanas de tratamento o sistema permaneceu durante duas semanas sem adição de probióticos. Durante todo o experimento, foi realizado semanalmente a composição da microbiota intestinal baseada na enumeração de bactérias aeróbias e anaeróbias totais, Enterococcus spp., Lactobacillus spp., Bifidobacterium spp., Enterobactérias e Clostridium spp. Semanalmente, também, foram realizadas análises de ácidos graxos de cadeia curta (acetato, butirato e propionato) e amônia. Através da análise microbiológica observou-se alterações significativas na composição da microbiota do SEMH no decorrer do período do experimento. Alterações significativas também foram observadas na concentração de amônia e de AGCC, podendo assim observar a influência da inoculação de probióticos na microbiota nativa e os metabólitos produzidos por ela

Correlações fisiológicas da carga parasitária em Rhinella icteriucus (Anura: marinus)

A presença de parasitas, que podem afetar inúmeros aspectos da biologia de seus hospedeiros, possivelmente levando a uma queda em seu desempenho. Entretanto, ao longo do estabelecimento da associação parasita-hospedeiro, alterações na fisiologia e morfologia deste último podem representar mecanismos compensatórios para os danos causados pelos parasitas. Sendo assim, carga parasitária deve ser um importante determinante do valor adaptativo (fitness) do hospedeiro. O objetivo do presente trabalho foi estabelecer possíveis correlações entre carga parasitária, massas de diversos órgãos e desempenho locomotor no sapo-cururu, Rhinella ictericus (Anura: Bufonidae). O desempenho locomotor dos indivíduos capturados de R. ictericus foi medido através do uso de uma pista circular de madeira. Durante um período de 10 minutos, os animais foram forçados a manter desempenho locomotor constante e a distância total percorrida foi corrigida para o comprimento rostro-cloacal. Depois das medidas de desempenho locomotor, os órgãos internos foram dissecados, tendo seus parasitas contabilizados. As massas de todos os órgãos escalaram positivamente com a massa corpórea. O número de parasitas nos pulmões e o índice corpóreo também se mostraram positivamente relacionados à variação em massa corpórea. Indivíduos com maior carga parasitária intestinal foram também aqueles que apresentaram um maior número total de parasitas, sugerindo a existência de variação individual na susceptibilidade a diferentes parasitas. O desempenho locomotor foi negativamente associado à carga parasitária total, demonstrando um efeito deletério causado pelos parasitas ao hospedeiro em um aspecto crucial de sua história de vida. Hospedeiros com maior carga parasitária pulmonar apresentaram maior massa intestinal e renal, sugerindo possíveis mecanismos compensatórios dos possíveis danos causados pelos parasitas

Atualidades sobre a doença de Chagas, com ênfase nas possíveis causas da cardiomiopatia crônica

A Organização Mundial de Saúde estima que existem cerca de 10 milhões de infectados pelo Trypanosoma cruzi, 30% dos infectados cronicamente desenvolvem alterações cardíacas, e 10% digestivas e neurológicas. O T. cruzi é um protozoário cinetoplástida flagelado agente etiológico da tripanossomíase americana, popularmente conhecida como a Doença de Chagas, uma antropozoonose conhecida na América Latina. Pelo menos 40 espécies de triatomíneos – conhecido por barbeiros – carregam o protozoário. O gênero Triatoma representa o principal vetor da Doença de Chagas e são adaptados a climas secos de ambientes rurais da América do Sul e Central. Outras formas de infecção podem ocorrer por transfusão de sangue, transplantes, via oral, e transmissão vertical. Há duas fases que caracterizam a infecção pelo T. cruzi: a fase aguda, apresentando um período de incubação de uma semana a um mês, que geralmente é assintomática. Já a fase crônica é mais polêmica e divide a opinião dos pesquisadores, mas basicamente mostra-se como uma cardiomiopatia chagásica, ou uma dilatação no trato digestivo e ainda pode causar lesões no sistema nervoso parassimpático e simpático. Entre essas duas fases ocorre um período indeterminado em que não há nenhuma manifestação clínica da doença. Existem teorias que explicam a patogenicidade das lesões da doença: uma postula que as lesões características da Chagas são referentes à ruptura das células parasitadas e subsequente inflamação. Outra é a teoria da autoimunidade, em que o próprio sistema imune do indivíduo rejeita as células livres de parasitas causando as lesões características da doença. Há evidências substanciais que comprovem a participação das respostas imunes nas lesões miocárdicas, mas como o parasito consegue desencadear estas respostas imunes, ainda não está esclarecido... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo)

Helmintofauna de duas espécies de anfíbios, Haddadus binotatus (Anura: Craugastoridae) e Ischnocnema guentheri (Anura: Brachycephalidae), da Mata Atlântica, no município de São Luiz do Paraitinga, São Paulo, Brasil

The Brazilian Atlantic Forest harbors a rich biodiversity with more than four hundred of amphibian species and many of these are endemic in this environment. This high rate of restricted endemism associated with global decline of amphibian diversity and density make it an important priority for the conservation of this ecosystem and to warrant intensive monitoring amphibian populations. Considering the importance that the parasites have on the ecology of their hosts, parasitic infections become a considerable factor in conservation biology. To expand the knowledge of this area, 23 specimens of Haddadus binotatus (Anura: Craugastoridae) and 36 Ischnocnema guentheri (Anura: Brachycephalidae) were collected from Santa Virginia, São Luiz do Paraitinga, São Paulo, between January and February 2010, to study their helminth parasites. Twelve helminth taxa were diagnosed and six of them were common to both hosts. The higher prevalence (P = 96%), mean abundance (MA = 11.7 ± 1.6) and mean intensity of infection (MII = 12.3 ± 1.6) were presented by H. binotatus compared to I. guentheri (P = 67%, MA = 2.4 ± 0.5, MII = 3.6 ± 0.6). Nematode species were found in different stages (cysts, larvae and adults) and acanthocephalans were found in both anurans. However, cestode species was found only in I. guentheri. Differences in parasitism of two species of frogs have been attributed to different sizes and micro-habitats of animals that allow different diets and contact with different helminth species. All helminths found have not been reported H. binotatus and also three new species records were noticed for I. guentheri

Platinosomíase em felinos domésticos: um diferencial para obstrução biliar

The platinosomiase is a disease the hepatobiliary system of domestic felines being caused by trematode Platynosomum fastosum. The life cycle of the parasite includes the presence of three intermediate hosts (snails, terrestrial isopodes, lizards or frogs). The cat is considered definitive host of the parasite and acquires the infection eating a vertebrate intermediate host containing metacercariae. The adult parasites generally inhabit the liver, gallbladder and bile ducts of cats. The severity of clinical manifestations depends mainly on the number of flukes in the biliary tract. Many animals are asymptomatic or exhibit nonspecific clinical manifestations such as anorexia, lethargy, weight loss, vomiting and diarrhea. In large infestations can occur biliary obstruction resulting in jaundice, cirrhosis, hepatitis cholangiohepatitis and even death. The definitive diagnosis is accomplished through by the detection of fluke eggs in feces or through laparotomy and liver biopsy. Treatment should be based on the use of anthelmintic for the elimination of the parasite and supportive therapy for the animal. Prevention is difficult due to predatory nature of the cat. The control can be accomplished through periodic fecal examinations

Clonagem, expressão e purificação de três mutantes truncados da proteína LaRPA-1 de Leishmania amazonensis

A leishmaniose é uma doença que atinge milhões de pessoas no mundo e, de acordo com a FUNASA, está se espalhando por todas as regiões do Brasil. O tratamento desta zoonose é ineficaz, pois os fármacos utilizados apresentam muitos efeitos colaterais e colaboram com o aparecimento de parasitas e vetores resistentes. Portanto um maior conhecimento sobre a biologia molecular destes protozoários poderá facilitar o descobrimento de novas terapias e desenvolvimento de drogas antiparasitárias. O complexo telomérico é formado pela interação de DNA com proteínas, sendo que estas últimas podem também interagir entre si. A proteína RPA de eucariotos compreende um complexo trimérico subdividido em três subunidades. Este cumpre independentemente ou juntamente com outras proteínas diversas funções vitais para a célula, entre elas, auxiliar na manutenção dos telômeros e ajudar a recrutar a telomerase. Além disso, ela parece ser um dos principais componentes do complexo de proteínas que interagem com o terminal simples fita telomérico de protozoários tripanosomatídeos. Curiosamente, em Leishmania spp., as subunidades 2 e 3, ao contrário da subunidade 1 da RPA, não fazem parte do complexo telomérico. Portanto a LaRPA-1 pode apresentar comportamentos peculiares quando comparada a RPA dos outros eucariotos, e se tornar um importante alvo ao se estudar a biologia molecular do parasita. Este trabalho tem como objetivo clonar, expressar e purificar os três diferentes mutantes truncados da proteína LaRPA-1 para, futuramente, utilizar-se estas proteínas recombinantes como ligantes em ensaios de interação proteína:proteína, visando mapear possíveis sítios ou domínios na proteína LaRPA-1.O gene que codifica LaRPA-1 já encontrava-se clonado e sequenciado no laboratório de Telômeros da UNESP de Botucatu....(Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo)

Aspectos Ecológicos da Helmintofauna de Pinguins-de-Magalhães, Spheniscus magellanicus (Aves: Spheniscidae), procedentes do Litoral Norte do Estado de São Paulo

Com o intuito de investigar se estudos parasitológicos podem ser utilizados como ferramenta para a conservação de espécies, principalmente migratórias, este trabalho analisa a helmintofauna de Spheniscus magellanicus através de parâmetros ecológicos populacionais e da comunidade parasitária, relacionando-os com diversos aspectos de vida da espécie hospedeira. O estudo foi realizado com 237 espécimes de S. magellanicus procedentes das praias do litoral Norte de São Paulo (23°46’S, 45°57’O) ao Sul do Rio de Janeiro (23°02’S, 44°13’O). A helmintofauna desta ave incluiu o nematódeo Contracaecum pelagicum (espécie core), encontrado em estômago, o digenético Cardiocephaloides physalis e o cestódeo Tetrabothrius lutzi, ambos (espécies satélites) coletados na porção inicial do intestino delgado. Comparações utilizando o índice de diversidade de Shannon mostraram que a comunidade de parasitas em filhotes durante o período migratório é menos diversa que na estação reprodutiva. Os resultados obtidos permitem inferir que estudos parasitológicos em pingüins, assim como em outros animais migratórios, podem fornecer informações importantes a respeito da espécie durante a época em que permanecem pelágicas, tornando-se uma ferramenta útil na aquisição de informações dificilmente obtidas por outros meios, favorecendo a conservação da espécie

Clonagem, Expressão e Purificação da Proteína Telomérica LaTRF em sistema bacteriano (pMAL)

As proteínas da família TRF2 (“TTAGGG repeat-binding factor 2”) fazem parte de complexos multiprotéicos responsáveis pela manutenção dos telômeros de alguns eucariotos. Elas apresentam domínios funcionais que a caracterizam como proteínas que interagem com DNA telomérico na forma de dupla fita. São eles, o domínio de interação com o DNA do tipo Myb-like, localizado na porção C-terminal, um domínio acídico N-terminal e um domínio de homodimerização TRFH (“TRF homology domain for homodimerization”). A proteína TRF2 também está envolvida na formação de estruturas teloméricas terminais denominadas “t-loops”. O intuito deste projeto é a clonagem, expressão em vetor bacteriano (pMAL) e a purificação de uma proteína homóloga as proteínas teloméricas TRFs humana em parasitas do gênero Leishmania, especificamente a espécie Leishmania amazonensis (LaTRF). Primeiramente foram desenhados iniciadores (primers) utilizados para a amplificação da sequência LaTRF por PCR. O(s) produto(s) de amplificação foram clonados em vetores de clonagem para produtos de PCR e sequenciados para análise. Uma vez obtida a seqüência da LaTRF, o inserto contendo o gene foi subclonado direcionalmente e na mesma fase de leitura do vetor de expressão bacteriano (pMAL-c5x, NEB) para obtenção e futura purificação da proteína recombinante. Verificou-se a expressão da proteína recombinante LaTRF utilizando SDS-PAGE e “Western Blot”. Pelos resultados obtidos na análise de expressão em pequena escala da proteína recombinante, foi observado possíveis indícios de que esta esteja sendo expressa. Com isso, torna-se possível a tentativa de uma expressão em grande escala utilizando esse mesmo sistema bacteriano (pMAL) a fim de se obter a proteína purificada que poderá ser futuramente utilizada para ensaios de “pull-down” dentre outras aplicações

Avaliação da atividade anti -ulcerogênica, antidiarréica e antiinflamatõria de astronium fraxinifolium Schott: Uma espécie medicinal do cerrado

Este trabalho visa o estudo dos efeitos biológicos dos extratos hidroalcóolicos (HDA) obtidos das cascas e folhas de Astronium fraxinifolium (Anacardiaceae), uma espécie medicinal do Cerrado brasileiro. Com base nas indicações populares de uso da espécie no combate a diversos males como a diarréia, cólicas, inflamação e reumatismo e a confirmação pela literatura da atividade gastroprotetora da espécie congênere Astronium urundeuva, foram realizados modelos experimentais in vivo para caracterizar a propriedade anti-úlcera, antidiarrêica e antiinflamatória dos extratos hidroalcóolicos de cascas (A.f.cs) e folhas (A.f.fol) de A. fraxinifolium. A propriedade antiulcerogênica dos A.f.cs e A.f.fol, administrado pela via oral, em diferentes doses (125, 250 e 500 mg/kg) foi avaliada em modelos experimentais in vivo em que os ratos Wistar machos foram confrontados com agentes ulcerogênicos químicos como etanol absoluto e droga antiinflamatória não-esteroidal (DAINE). Os fatores envolvidos na gastroproteção dos extratos foram avaliados através da quantificação de glutationa total do raspado da mucosa, volume do suco gástrico, concentração de íons H+ e pH do suco gástrico. A atuação de fatores protetores da mucosa gástrica como óxido nítrico (NO) e compostos sulfidrílicos (SH) também foram analisados sob efeito de ambos os extratos. A propriedade antidiarrêica dos extratos (500 mg/kg, p.o.) também foi avaliada através da motilidade intestinal, índice de evacuações e acumulo de fluidos intestinais. Ambos os extratos (500 mg/kg, p.o. e 50 mg/kg, i.p.) também foram submetidos a avaliação em dois modelos experimentais (edema da pata induzida por carragenina e teste de formalina) onde as propriedades antiedematogênica e antiinflamatória foram analisadas em roedores. Ambos os extratos foram estudos fitoquimicamente em CLAE-DAE... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo)

Obtenção de uma nova proteína recombinante componente do complexo telemérico LAGT1 de Leishmania Amazonensis

Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP)