Propriétés des monocouches auto-assemblées du liquide ionique 1-(12-mercaptododécyl)-3-méthylimidazolium

Les propriétés d'une nouvelle classe de chimie de surface basée sur les monocouches auto-assemblées de liquides ioniques (ILs-SAMs), ont été étudiées pour une utilisation dans la construction de biocapteurs basés sur la résonance des plasmons de surface (SPR). Les biocapteurs sont utiles pour détecter des biomolécules spécifiques dans une matrice biologique complexe. Cependant, le signal analytique de la biomolécule spécifique peut être masqué par l’adsorption non spécifique de la matrice biologique, produisant une réponse faussement positive. Par ailleurs, l'activité des récepteurs moléculaires est souvent réduite par des techniques d'immobilisation chimique. Ainsi, il est essentiel de déterminer une surface idéale pour la préparation de biocapteurs. Les liquides ioniques sont bien connus pour favoriser l'activité des récepteurs moléculaires et cette étude enquête si cette propriété importante peut se traduire sur des capteurs SPR. Différents liquides ioniques ont été utilisés pour former des monocouches auto-assemblées sur une surface d'or. Les ILs-SAMs sont tous basés sur les sels de mercapto-(chaîne alkyle)nCH2-méthylimidazolium avec différentes chaînes alkyles (n = 3, 6, 9, 12) et différents contre-anions (Br-, BF4-, PF6-, NTf2-). Des études cinétiques de l'adsorption non spécifique de sérum bovin ont été réalisées sur des capteurs SPR avec un instrument construit sur mesure, basé sur l'interrogation des longueurs d’ondes SPR sur un prisme d’inversion d’image (dove). Par la suite, l’anti-IgG de chèvre sélective à l’IgG humain a été utilisé en tant que modèle pour la confection de biocapteurs sur les ILs-SAMs. En solution, il est possible d’effectuer des échanges du contre-anion des liquides ioniques pour un contre-anion de plus en plus hydrophobe. Cependant, l’échange inverse, soit vers des anions de plus en plus hydrophile, s’avère impossible. Toutefois, il a été observé par les travaux présentés dans ce mémoire, que les liquides ioniques immobilisés sur une surface d'or ont la capacité d'échanger leurs contre-anions réversiblement, procurant une méthode simple de moduler leurs propriétés physico-chimiques. Ce phénomène a été observé par la mesure d’angles de contacts et par les techniques spectroscopiques de l’infrarouge moyen (mid-IR), des photoélectrons de rayon-X (XPS) et par la diffusion Raman exaltée par les surfaces (SERS) ii ainsi que par la spectrométrie de masse (MS). La connaissance des propriétés d’échange d’anion est importante pour prédire le comportement de ces surfaces de liquides ioniques dans les tampons et fluides biologiques.

Fabrication des films microstructurés et leurs caractéristiques en spectroscopie de résonance des plasmons de surface

Cette thèse caractérise les propriétés optiques des matériaux plasmoniques microstructurés et procède à l’évaluation des paramètres analytiques afin de les employer comme plateforme de biodétection en spectroscopie de résonance des plasmons de surface (SPR). Aux dimensions micrométriques, les matériaux plasmoniques présentent des caractéristiques optiques propres aux nano- et macromatériaux. La cartographie physicooptiques en SPR de matériaux méso- et microscopiques s’est effectuée à l’aide de films structurés de motifs périodiques triangulaires et circulaires fabriqués par une technique modifiée de lithographie par nanosphères (nanosphere lithography, NSL). À partir de cette vue d’ensemble, quelques films structurés ont été sélectionné en fonction d’aspects analytiques tels que la sensibilité et la résolution face aux variations d’indice de réfraction (RI) pour déterminer le potentiel de ces matériaux comme plateforme de biodetection. Les propriétés optiques distinctes des films microstructurés proviennent d’interactions résonantes entre les modes de plasmons de surface (SP) localisé et délocalisé identifiés par la relation de dispersion en SPR ainsi que l’imagerie Raman. Les conditions de résonance des modes SP dépendant de paramètres expérimentaux (λ, θ, η) tel qu’observés numériquement par rigorous coupled wave analysis (RCWA) et empiriquement. Ces travaux démontrent la nature plasmonique distincte des micro-matériaux et leur potentiel d’intégration aux techniques analytiques SPR existantes. Les matériaux plasmoniques micrométriques furent également étudiés pour l’implémentation de la SPR à une pointe de microscopie à force atomique (atomic force microscopy, AFM) combinant ainsi la spectroscopie à l’imagerie topographique. Des travaux préliminaires se sont concentrés sur la signature spectroscopique de leviers en silicium (Si) et en nitrure de silicium (Si3N4), l’impact d’un revêtement d’or sur les pointes et l’influence de milieu environnant. Une image d’origine plasmonique a été obtenue avec des leviers en Si3N4 revêtus d’or en transmission dans un environnement aqueux, indiquant ainsi le potentiel de ces pointes comme micro-biocapteur SPR. Ces résultats préliminaires servent de fondement pour orienter les prochaines investigations dans ce projet.

Application du SPR dans le criblage des ligands synthétiques du CD36 et sa validation

Le CD36 est un récepteur de type éboueur de classe B exprimé à la surface de nombreux types cellulaires dont les macrophages, les cellules endothéliales de la microvasculature et les plaquettes. Ce récepteur multiligand est impliqué dans plusieurs processus pathologiques notamment l’athérosclérose, l’angiogénèse et la malaria via la liaison spécifique de ligands comme les lipoprotéines oxydées de basse densité, la thrombospondine-1 et la protéine PfEMP-1, respectivement. Les peptides de la relâche de l’hormone de croissance (GHRP) ont été identifiés comme les premiers ligands synthétiques du CD36. Afin de développer de nouveaux ligands synthétiques du CD36, l’établissement d’une méthode de criblage est essentiel pour découvrir des composés avec une liaison de haute affinité pour ce récepteur. Pour y parvenir, nous avons surexprimé le domaine extracellulaire du CD36 humain dans les cellules d’insectes Sf9. La protéine soluble purifiée par chromatographie d’affinité fut immobilisée à la surface d’une plaque de résonance de plasmons de surface (SPR) pour les études de liaison. La méthodologie développée a permis de caractériser les ligands du CD36 en déterminant leurs constantes de dissociation (KD), et d’établir une relation structure-activité des ligands de la famille des azapeptides, des composés dérivés du GHRP-6. Afin de valider la méthode par spectroscopie SPR, une corrélation a été établie entre les valeurs de KD obtenues en SPR et les valeurs d’CI50 de courbes d’inhibition de la phosphorylation des MAP kinases JNK1/2 induite par un phospholipide oxydé, le POVPC, en présence de concentrations croissantes de ligands du CD36 dans les macrophages RAW 264.7.

Cage de résonance à base de films minces transparents et conducteurs de nanotubes de carbone

Mémoire numérisé par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal

Étude de l’oxydoréduction de monocouches électroactives de ferrocénylalcanethiolates par spectroscopie à résonance des plasmons de surface

L’oxydoréduction de monocouches auto-assemblées (SAMs) de ferrocénylalcanethiolates à la surface d’or (FcRSAu) a été étudiée en temps réel par la spectroscopie de résonance de plasmons de surface couplée avec l’électrochimie (E-SPR). La sensibilité de cette technique permet de déterminer des changements d’épaisseur de couche l’ordre de quelques angström résultant d’un changement de structure de la SAM. Plusieurs études antérieures ont proposé que l’oxydation électrochimique d’une SAM de FcRSAu induit une réorientation moléculaire. L’E-SPR est utilisé pour identifier l’origine de ce changement structurel. D’abord, une calibration du réfractomètre SPR utilisé a été effectuée afin de trouver une équation de conversion du signal SPR obtenu en pixel en angle d’incidence pour que l’on puisse calculer le changement d’épaisseur de monocouche à partir du changement d’angle de résonance avec le modèle de Fresnel. Par la suite, une caractérisation approfondie des SAMs de FcCnSAu (où n = 6, 8, 12, 14) en contact avec du NaClO4 acidifié a été réalisée par électrochimie, éllipsométrie, spectroscopie infrarouge et microscopie à force atomique. Les résultats obtenus montrent que l’augmentation de la longueur des chaînes alkyles donne des SAMs de ferrocènes plus épaisses et moins désordonnées. L’analyse par l’E-SPR de ces SAMs pures montre que le changement d’épaisseur induit par l’électro-oxydation dépend linéairement du nombre de méthylènes sur la chaîne alkyle. En appliquant la déconvolution mathématique aux voltampérogrammes cycliques enregistrés pour les SAM mixtes (FcC12SAu/C11SAu) de différentes compositions, on arrive à la conclusion qu’il y a un redressement des chaînes alkyles dans les domaines des ferrocènes agrégés mais la réorientation des têtes de ferrocène dans les domaines de ferrocènes agrégés ou dispersés ne peut pas être exclue. Enfin, l’effet de l’anion électrolytique sur le changement d’épaisseur de la SAM mesuré par l’E-SPR a été étudié. L’analyse électrochimique montre que la capacité de pairage d’anions avec les ferrocéniums décroit comme suit : PF6- > ClO4- > BF4- > NO3-. Tandis que l’épaisseur de la SAM donnée par le changement d’angle de résonance suit la tendance suivante : NO3- ≥ ClO4- > PF6- ≈ BF4-. Des études plus approfondies seront nécessaire pour clarifier cette tendance observée par E-SPR.

Étude des propriétés plasmoniques des réseaux de nanotrous

Les réseaux de nanotrous sont des structures plasmoniques ayant un énorme potentiel en tant que transducteurs pour la conception de biocapteurs. De telles structures sont prometteuses pour l’élaboration de biocapteurs capable d’effectuer du criblage à haut débit. L’intérêt de travailler avec des réseaux de nanotrous est dû à la simplicité d’excitation des polaritons de plasmons de surface en transmission directe, à la sensibilité et à la facilité de fabrication de ces senseurs. L’architecture de tels réseaux métalliques permet la conception de nanostructures ayant de multiples propriétés plasmoniques. L’intensité, la signature spectrale et la sensibilité du signal plasmonique sont grandement affectées par l’aspect physique du réseau de nanotrous. L’optimisation du signal plasmonique nécessite ainsi un ajustement du diamètre des trous, de la périodicité et de la composition métallique du réseau. L'agencement de l'ensemble de ces paramètres permet d'identifier une structure optimale possédant une périodicité de 1000 nm, un diamètre des nanotrous de 600-650 nm et un film métallique ayant une épaisseur de 125 nm d'or. Ce type de transducteur a une sensibilité en solution de 500-600 nm/RIU pour des bandes plasmoniques situées entre 600-700 nm. L'intérêt de travailler avec cette structure est la possibilité d'exciter les plasmons de polaritons de surface (SPPs) selon deux modes d'excitation : en transmission exaltée (EOT) ou en réflexion totale interne par résonance des plasmons de surface (SPR). Une comparaison entre les propriétés plasmoniques des senseurs selon les modes d'excitation permet de déterminer expérimentalement que le couplage de la lumière avec les ondes de SPP de Bloch (BW-SPPs) en transmission directe résulte en un champ électromagnétique davantage propagatif que localisé. D'un point de vue analytique, la biodétection de l'IgG en SPR est 6 fois plus sensible par rapport au mode EOT pour une même structure. Une étude du signal plasmonique associé au BW-SPP pour un certain mode de diffraction démontre que la distance de pénétration de ces structures en EOT est d'environ 140 nm. La limite de détection de l'IgG humain pour un réseau de nanotrous de 1000 nm de périodicité est d'environ 50 nM en EOT. Ce mémoire démontre la viabilité des réseaux de nanotrous pour effectuer de la biodétection par criblage à haut débit lors de prochaines recherches. L'investigation de l'effet de l'angle d'excitation en transmission exaltée par rapport au signal plasmonique associé au mode (1,0) d'un réseau de nanotrous de 820 nm d'or démontre que la sensibilité en solution n'est pas proportionnelle à la sensibilité en surface du senseur. En fait, une optimisation de l'angle d'incidence pour le mode (1,0) de diffraction des BW-SPP permet d'amplifier la sensibilité en surface du senseur jusqu'à 3-fois pour un angle de 13,3°. Ce mémoire démontre ainsi la nécessité d'optimiser l'angle d'excitation et les propriétés physiques du senseur afin de développer un transducteur de grande sensibilité basé sur l'excitation en transmission de réseaux de nanotrous.

Détection de protéines par diffusion Raman exaltée par effet de pointe (TERS)

La concentration locale des messagers chimiques sécrétés par les cellules peut être mesurée afin de mieux comprendre les mécanismes moléculaires liés à diverses maladies, dont les métastases du cancer. De nouvelles techniques analytiques sont requises pour effectuer ces mesures locales de marqueurs biologiques à proximité des cellules. Ce mémoire présentera le développement d’une nouvelle technique basée sur la réponse plasmonique sur des leviers AFM, permettant d’étudier les réactions chimiques et biologiques à la surface des leviers grâce au phénomène de résonance des plasmons de surface (SPR), ainsi qu’à la diffusion Raman exaltée par effet de pointe (TERS). En effet, il est possible de localiser l’amplification du signal Raman à la pointe d’un levier AFM, tout comme le principe de la diffusion Raman exaltée par effet de surface (SERS) basée sur la diffusion de la lumière par des nanoparticules métalliques, et permettant une large amplification du signal Raman. La surface du levier est recouverte d’une nano-couche métallique d’or, suivi par des réactions biologiques pour l’immobilisation d’un récepteur moléculaire, créant ainsi un biocapteur sur la pointe du levier. Une détection secondaire utilisant des nanoparticules d’or conjuguées à un anticorps secondaire permet également une amplification du signal SPR et Raman lors de la détection d’antigène. Ce mémoire démontrera le développement et la validation de la détection de l’immunoglobuline G (IgG) sur la pointe du levier AFM.Dans des projets futurs, cette nouvelle technique d’instrumentation et d’imagerie sera optimisée grâce à la création d’un micro-détecteur protéique généralement adapté pour l’étude de la communication cellulaire. En intégrant le signal SPR à la microscopie AFM, il sera alors possible de développer des biocapteurs SPR couplés à une sonde à balayage, ce qui permettra d’effectuer une analyse topographique et de l’environnement chimique d’échantillons cellulaires en temps réel, pour la mesure des messagers moléculaires sécrétés dans la matrice extracellulaire, lors de la communication cellulaire.

Agrégation de tensioactifs anioniques à une interface solide-aqueux induite par l'oxydation d'une monocouche auto-assemblée de ferrocenylalkanethiolates

L'oxydoréduction des monocouches auto-assemblées («Self-assembled monolayers ou SAMs) de ferrocenyldodecanethiolates sur une surface d'or (Fc(CH2)12SAu) dans des solutions aqueuses de n-alkyle sulfate de sodium (6, 8, 10 et 12 atomes de carbone) est étudiée par spectroscopie de résonance des plasmons de surface («Surface Plasmons Resonance ou SPR) couplée avec de la voltampérométrie cyclique (VC). La technique SPR est utilisée pour suivre en temps réel l'adsorption des tensioactifs en fonction du potentiel appliqué. Elle permet de quantifier l'épaisseur et le recouvrement des molécules adsorbées pour déterminer l'organisation des tensioactifs anioniques sur la SAM. La VC est utilisée afin de caractériser l'oxydation du groupement ferrocène en présence des n-alkyle sulfate de sodium qui s'associent à la SAM grâce à l'appariement entre le ferrocénium et le groupement sulfate. Des mélanges binaires d'alkylesulfates de différentes compositions sont utilisés dans le but de déterminer l'organisation induite par une réaction d'oxydoréduction. L'effet de la longueur de la chaîne d'hydrocarbures sur la quantité de tensioactifs anioniques adsorbés ainsi que les affinités relatives d'appariement des anions alkyle sulfate aux ferrocéniums sont rapportés dans ce mémoire. Ces surfaces électrosensibles permettront la détection de molécules amphiphiles et la compréhension du comportement de mélanges binaires de tensioactifs. Ainsi, ces travaux apporteront une avancée sur la modulation électrochimique de l'organisation de matériaux sur des substrats solides basée sur l'appariement d'ions.

Étude du rôle des régions variables 4 et 5 dans les changements de conformation de la gp120 du VIH-1

Le VIH infecte les cellules par fusion de sa membrane avec la membrane de la cellule cible. Cette fusion est effectuée par les glycoprotéines de l'enveloppe (Env) qui sont synthétisées en tant que précurseur, gp160, qui est ensuite clivé en gp120 et gp41. La protéine gp41 est la partie transmembranaire du complexe de l'enveloppe et l’ancre à la particule virale alors que la gp120 assure la liaison au récepteur cellulaire CD4 et corécepteur CCR5 ou CXCR4. Ces interactions successives induisent des changements de conformation d’Env qui alimentent le processus d'entrée du virus conduisant finalement à l'insertion du peptide de fusion de la gp41 dans la membrane de la cellule cible. La sous-unité extérieure gp120 contient cinq régions variables (V1 à V5), dont trois (V1, V2 et V3) étant capables d’empêcher l’adoption spontanée de la conformation liée à CD4. Cependant, le rôle de régions variables V4 et V5 vis-à-vis de ces changements de conformation reste inconnu. Pour étudier leur effet, des mutants de l'isolat primaire de clade B YU2, comprenant une délétion de la V5 ou une mutation au niveau de tous les sites potentiels de N-glycosylation de la V4 (PNGS), ont été générés. L'effet des mutations sur la conformation des glycoprotéines d'enveloppe a été analysé par immunoprécipitation et résonance de plasmon de surface avec des anticorps dont la liaison dépend de la conformation adopté par la gp120. Ni le retrait des PNGS de la V4 ni la délétion de V5 n’a affecté les changements conformationnels d’Env tels que mesurés par ces techniques, ce qui suggère que les régions variables V1, V2 et V3 sont les principaux acteurs dans la prévention de l’adoption de la conformation lié de CD4 d’Env.

Développement d’outils analytiques pour la détection de biomolécules directement dans des fluides sanguins

Cette thèse porte sur le développement de biocapteurs basés sur la technique de résonance des plasmons de surface (SPR) pour effectuer des analyses directement dans un fluide sanguin n’ayant subi aucune purification ou dilution. L’ensemble des biocapteurs discutés exploiteront un instrument SPR portable développé dans le groupe du professeur Masson. Le premier volet de la thèse portera sur le processus d’interférence lié à l’adsorption non spécifique du sérum à la surface du capteur. L’analyse des biomolécules adsorbées sera effectuée en combinant la SPR à la spectrométrie de masse. Les informations obtenues seront exploitées pour la construction de biocapteurs adaptés à l’analyse en milieu sanguin. Un premier biocapteur développé ciblera la protéine antigène prostatique spécifique (APS) contenue dans le sérum servant de biomarqueur pour dépister le cancer de la prostate. Pour détecter les faibles concentrations de cette protéine directement dans le sérum, un matériel plasmonique microstructuré sera utilisé pour amplifier les signaux obtenus et sera recouvert d’une monocouche peptidique minimisant l’adsorption non spécifique du sérum. L’instrument SPR aura été adapté pour permettre également la détection simultanée de fluorescence. Un test ELISA sera ainsi effectué en parallèle du test SPR. Chacune des techniques fournira un contrôle pour la deuxième, tout en permettant de détecter le biomarqueur au niveau requis pour dépister la maladie. La combinaison des deux méthodes permettra aussi d’élargir la gamme dynamique du test de dépistage. Pour terminer, l’instrument SPR portable sera utilisé dans le cadre de détection de petites biomolécules ayant un potentiel thérapeutique directement dans un échantillon de sang. Des peptides ayant une activité anti-athérosclérotique pourront ainsi être détectés à même un échantillon de sang ni purifié ni dilué, et ce à des concentrations de l’ordre du micromolaire. Une modification de la microfluidique via l’introduction d’une membrane poreuse au cœur de celle-ci sera la clé permettant d’effectuer de telles analyses. La présente thèse met de l’avant de nouvelles stratégies et des modifications instrumentales permettant d’analyser des protéines et des petites molécules directement dans un échantillon non purifié de sérum ou de sang. Les modifications apportées au système fluidique, à l’instrument SPR et au niveau du biocapteur employé permettront d’effectuer des biodétections dans des matrices aussi complexes que les fluides sanguins. Les présents travaux mettent en lumière la capacité d’un instrument SPR/fluorescence portable à faire en 12 minutes la biodétection d’un marqueur du cancer de la prostate directement dans un échantillon de sérum. Finalement, on rapporte ici un des premiers articles où un biocapteur SPR est utilisé à même un échantillon de sang non-purifié pour faire des biodétections.

Design and study of self-assembled functional organic and hybrid systems for biological applications

The focus of self-assembly as a strategy for the synthesis has been confined largely to molecules, because of the importance of manipulating the structure of matter at the molecular scale. We have investigated the influence of temperature and pH, in addition to the concentration of the capping agent used for the formation of the nano-bio conjugates. For example, the formation of the narrower size distribution of the nanoparticles was observed with the increase in the concentration of the protein, which supports the fact that γ-globulin acts both as a controller of nucleation as well as stabiliser. As analyzed through various photophysical, biophysical and microscopic techniques such as TEM, AFM, C-AFM, SEM, DLS, OPM, CD and FTIR, we observed that the initial photoactivation of γ-globulin at pH 12 for 3 h resulted in small protein fibres of ca. Further irradiation for 24 h, led to the formation of selfassembled long fibres of the protein of ca. 5-6 nm and observation of surface plasmon resonance band at around 520 nm with the concomitant quenching of luminescence intensity at 680 nm. The observation of light triggered self-assembly of the protein and its effect on controlling the fate of the anchored nanoparticles can be compared with the naturally occurring process such as photomorphogenesis.Furthermore,our approach offers a way to understand the role played by the self-assembly of the protein in ordering and knock out of the metal nanoparticles and also in the design of nano-biohybrid materials for medicinal and optoelectronic applications. Investigation of the potential applications of NIR absorbing and water soluble squaraine dyes 1-3 for protein labeling and anti-amyloid agents forms the subject matter of the third chapter of the thesis. The study of their interactions with various proteins revealed that 1-3 showed unique interactions towards serum albumins as well as lysozyme. 69%, 71% and 49% in the absorption spectra as well as significant quenching in the fluorescence intensity of the dyes 1-3, respectively. Half-reciprocal analysis of the absorption data and isothermal titration calorimetric (ITC) analysis of the titration experiments gave a 1:1 stoichiometry for the complexes formed between the lysozyme and squaraine dyes with association constants (Kass) in the range 104-105 M-1. We have determined the changes in the free energy (ΔG) for the complex formation and the values are found to be -30.78, -32.31 and -28.58 kJmol-1, respectively for the dyes 1, 2 and 3. Furthermore, we have observed a strong induced CD (ICD) signal corresponding to the squaraine chromophore in the case of the halogenated squaraine dyes 2 and 3 at 636 and 637 nm confirming the complex formation in these cases. To understand the nature of interaction of the squaraine dyes 1-3 with lysozyme, we have investigated the interaction of dyes 1-3 with different amino acids. These results indicated that the dyes 1-3 showed significant interactions with cysteine and glutamic acid which are present in the side chains of lysozyme. In addition the temperature dependent studies have revealed that the interaction of the dye and the lysozyme are irreversible. Furthermore, we have investigated the interactions of these NIR dyes 1-3 with β- amyloid fibres derived from lysozyme to evaluate their potential as inhibitors of this biologically important protein aggregation. These β-amyloid fibrils were insoluble protein aggregates that have been associated with a range of neurodegenerative diseases, including Huntington, Alzheimer’s, Parkinson’s, and Creutzfeldt-Jakob diseases. We have synthesized amyloid fibres from lysozyme through its incubation in acidic solution below pH 4 and by allowing to form amyloid fibres at elevated temperature. To quantify the binding affinities of the squaraine dyes 1-3 with β-amyloids, we have carried out the isothermal titration calorimetric (ITC) measurements. The association constants were determined and are found to be 1.2 × 105, 3.6× 105 and 3.2 × 105 M-1 for the dyes, 1-3, respectively. To gain more insights into the amyloid inhibiting nature of the squaraine dyes under investigations, we have carried out thioflavin assay, CD, isothermal titration calorimetry and microscopic analysis. The addition of the dyes 1-3 (5μM) led to the complete quenching in the apparent thioflavin fluorescence, thereby indicating the destabilization of β-amyloid fibres in the presence of the squaraine dyes. Further, the inhibition of the amyloid fibres by the squaraine dyes 1-3, has been evidenced though the DLS, TEM AFM and SAED, wherein we observed the complete destabilization of the amyloid fibre and transformation of the fibre into spherical particles of ca. These results demonstrate the fact that the squaraine dyes 1-3 can act as protein labeling agents as well as the inhibitors of the protein amyloidogenesis. The last chapter of the thesis describes the synthesis and investigation of selfassembly as well as bio-imaging aspects of a few novel tetraphenylethene conjugates 4-6.Expectedly, these conjugates showed significant solvatochromism and exhibited a hypsochromic shift (negative solvatochromism) as the solvent polarity increased, and these observations were justified though theoretical studies employing the B3LYP/6-31g method. We have investigated the self-assembly properties of these D-A conjugates though variation in the percentage of water in acetonitrile solution due to the formation of nanoaggregates. Further the contour map of the observed fluorescence intensity as a function of the fluorescence excitation and emission wavelength confirmed the formation of J-type aggregates in these cases. To have a better understanding of the type of self-assemblies formed from the TPE conjugates 4-6, we have carried out the morphological analysis through various microscopic techniques such as DLS, SEM and TEM. 70%, we observed rod shape architectures having ~ 780 nm in diameter and ~ 12 μM in length as evidenced through TEM and SEM analysis. We have made similar observations with the dodecyl conjugate 5 at ca. 70% and 50% water/acetonitrile mixtures, the aggregates formed from 4 and 5 were found to be highly crystalline and such structures were transformed to amorphous nature as the water fraction was increased to 99%. To evaluate the potential of the conjugate as bio-imaging agents, we have carried out their in vitro cytotoxicity and cellular uptake studies though MTT assay, flow cytometric and confocal laser scanning microscopic techniques. Thus nanoparticle of these conjugates which exhibited efficient emission, large stoke shift, good stability, biocompatibility and excellent cellular imaging properties can have potential applications for tracking cells as well as in cell-based therapies. In summary we have synthesized novel functional organic chromophores and have studied systematic investigation of self-assembly of these synthetic and biological building blocks under a variety of conditions. The investigation of interaction of water soluble NIR squaraine dyes with lysozyme indicates that these dyes can act as the protein labeling agents and the efficiency of inhibition of β-amyloid indicate, thereby their potential as anti-amyloid agents.

Photoschaltbare Azobenzol-modifizierte selbstorganisierte Monoschichten auf Gold(111)-Oberflächen

Für die Entwicklung photoschaltbarer selbstorganisierter Monoschichten (SAMs) auf Gold(111)-Oberflächen wurden neue Azobenzol-terminierte Asparagussäure - und Liponsäurederivate synthetisiert. Um den Einfluss lateraler Wasserstoffbrückenbindungen auf Qualität und Orientierungsordnung der Schichten zu untersuchen, wurden Monolagen, die durch amid- und esterverknüpfte Verbindungen gebildet wurden, miteinander verglichen. Die Filmbildung aus der Lösung wurde in situ durch optische Frequenzverdopplung (SHG) untersucht und die Photoreaktivität mittels Kontaktwinkelmessungen, Oberflächen-Plasmonenresonanz (SPR) und Ellipsometrie verfolgt. SAMs auf Gold wurden außerdem mit Hilfe von Röntgenphotoelektronenspektroskopie (XPS), Nahkanten-Reflexions-Röntgenabsorptionsspektroskopie (NEXAFS) und Infrarot-Reflexionsabsorptionsspektroskopie (IRRAS) charakterisiert, um die Filmqualität, die Bindung ans Substrat und Orientierungsordnung im Film zu ermitteln. Da die Chemisorption auf polykristallinem Gold formal der Koordinationschemie von 1,2-Dithiolan-Derivaten gegenüber nullwertigen Edelmetall-Zentralatomen entspricht, wurden etliche Pt-Komplexe durch oxidative Addition an [Pt(PPh3)4] dargestellt. Im Zusammenhang mit der Darstellung der Asparagussäure wurde die Kristallstruktur von [pipH]2[WS4] und der neuen Verbindungen [pipH]3[WS4](HS) und [pipH]4[WS4][WOS3] (pip = Piperidin) bestimmt. Wasserstoffbrückenbindungen zwischen den Piperidinium-Kationen und den Thiowolframat-Anionen spielen eine dominante strukturelle Rolle.

Goldnanoteilchen auf Titandioxid

In dieser Arbeit wurde das Wachstum sowie die ultraschnelle Elektronendynamik des Oberflächenplasmon Polaritons von Goldnanoteilchen auf Titandioxid untersucht. Die Messung der Dephasierungszeit des Oberflächenplasmons von Nanoteilchen mit definierter Form und Größe erfolgte dabei mit der Methode des spektralen Lochbrennens. Die Nanoteilchen wurden durch Deposition von Goldatomen aus einem thermischen Atomstrahl mit anschließender Diffussion und Nukleation, d.h. Volmer-Weber-Wachstum, auf Titandioxidsubstraten hergestellt und mittels einer Kombination aus optischer Spektroskopie und Rasterkraftmikroskopie systematisch untersucht. Dabei lässt sich das Nanoteilchenensemble durch das mittlere Achsverhältnis und den mittleren Äquivalentradius charakterisieren. Die Messungen zeigen, dass die Proben große Größen- und Formverteilungen aufweisen und ein definierter Zusammenhang zwischen Größe und Form der Teilchen existiert. Während kleine Goldnanoteilchen nahezu kugelförmig sind, flachen die Teilchen mit zunehmender Größe immer mehr ab. Des Weiteren wurde in dieser Arbeit die Methode des lasergestützten Wachstums auf das System Gold auf Titandioxid angewendet. Systematische Untersuchungen zeigten, dass sich das Achsverhältnis der Teilchen durch geeignete Wahl von Photonenenergie und Fluenz des eingestrahlten Laserlichts definiert und gezielt vorgeben lässt. Die Methode des lasergestützten Wachstums erschließt damit den Bereich außerhalb der Zugänglichkeit des natürlichen Wachstums. Aufgrund der Formabhängigkeit der spektrale Lage der Plasmonresonanz ist man somit in der Lage, die optischen Eigenschaften der Nanoteilchen gezielt einzustellen und z.B. für technische Anwendungen zu optimieren. Die Untersuchung der ultraschnellen Elektronendynamik von Goldnanoteilchen auf Titandioxid mit äquivalenten Radien zwischen 8 bis 15 nm erfolgte in dieser Arbeit mit der Methode des spektralen Lochbrennes. Hierzu wurde die Dephasierungszeit des Oberflächenplasmons systematisch als Funktion der Photonenenergie in einem Bereich von 1,45 bis 1,85 eV gemessen. Es zeigte sich, dass die gemessenen Dephasierungszeiten von 8,5 bis 16,2 fs deutlich unter den in der dielektrischen Funktion von Gold enthaltenen Werten lagen, was den erwarteten Einfluss der reduzierten Dimension der Teilchen demonstriert. Um die Messwerte trotz verschiedener Teilchengrößen untereinander vergleichen und den Einfluss der intrinsischen Dämpfung quantifizieren zu können, wurde zusätzlich der Dämpfungsparameter A bestimmt. Die ermittelten A-Faktoren zeigten dabei eine starke Abhängigkeit von der Plasmonenergie. Für Teilchen mit Plasmonenergien von 1,45 bis 1,55 eV wurde ein Dämpfungsfaktor von A ~ 0,2 nm/fs ermittelt, der lediglich Oberflächenstreuung als dominierenden Dämpfungsmechanismus widerspiegelt. Hingegen wurde für Teilchen mit Plasmonenergien oberhalb von 1,55 eV ein drastischer Anstieg der Dämpfung auf A ~ 0,4 nm/fs beobachtet. Die erhöhte Dämpfung wurde dabei dem zusätzlichen Vorliegen einer chemischen Dämpfung durch das Titandioxidsubstrat zugeschrieben. Zusammenfassend zeigen die Ergebnisse somit, dass eine starke Abhängigkeit der chemischen Dämpfung von der Photonenenergie vorliegt. Es konnte erstmals nachgewiesen werden, dass die chemische Dämpfung erst ab einer bestimmten unteren Schwelle der Photonenenergie einsetzt, die für Goldnanoteilchen auf Titandioxid bei etwa 1,6 eV liegt.

Molekulare Mechanismen der cAMP-vermittelten Signaltransduktion

Zusammenfassung - Der sekundäre Botenstoff zyklisches Adenosinmonophosphat (cAMP) reguliert viele fundamentale zelluläre Prozesse wie Zellproliferation, Differenzierung, Energiemetabolismus und Genexpression. In eukaryotischen Zellen vermittelt die cAMP-abhängige Proteinkinase (PKA) die meisten biologischen Funktionen von cAMP. Die PKA besteht aus jeweils zwei regulatorischen (R) und katalytischen (C) Untereinheiten, die zusammen einen inaktiven Holoenzymkomplex bilden, der durch cAMP aktiviert wird. In dieser Arbeit wurde die Bindung von cAMP und cAMP-Analoga an die R Untereinheit der PKA unter funktionellen und mechanistischen Aspekten untersucht. Eine neue, auf Fluoreszenzpolarisation basierende Methode wurde entwickelt, um die Affinität von cAMP-Analoga in einem homogenen Ansatz schnell, reproduzierbar und nicht radioaktiv zu quantifizieren. Zur detaillierten Untersuchung des Bindungsmechanismus von cAMP und cAMP Analoga (Agonisten und Antagonisten) wurden thermodynamische Studien im direkten Vergleich mittels isothermaler Titrationskalorimetrie und kinetischen Analysen (Oberflächenplasmonresonanz, SPR) durchgeführt, wodurch thermodynamische Signaturen für das Bindungsverhalten der Nukleotide an die R Untereinheit der PKA erhalten werden konnten. Durch Interaktionsstudien an mutagenisierten R Untereinheiten wurde der intramolekulare Aktivierungsmechanismus der PKA in Bezug auf cAMP-Bindung, Holoenzymkomplex-Formierung und -Aktivierung untersucht. Die dabei erhaltenen Ergebnisse wurden mit zwei Modellen der cAMP-induzierten Konformationsänderung verglichen, und ein Aktivierungsmechanismus postuliert, der auf konservierten hydrophoben Aminosäuren basiert. Für in vivo Untersuchungen wurden zusammen mit Kooperationspartnern membranpermeable, fluoreszierende cAMP Analoga entwickelt, die Einblicke in die Dynamik der cAMP-Verteilung in Zellen erlauben. Neu entwickelte, Festphasen gebundene cAMP-Analoga (Agonisten und Antagonisten) wurden in einem (sub)proteomischen Ansatz dazu genutzt, natürliche Komplexe der R Untereinheit und des PKA-Holoenzyms aus Zelllysaten zu isolieren und zu identifizieren. Diese Untersuchungen fließen letztlich in einem systembiologischen Ansatz zusammen, der neue Einblicke in die vielschichtigen cAMP gesteuerten Netzwerke und Regulationsprozesse erlaubt.