Assessment of PCR in the detection of Leishmania spp in experimentally infected individual phlebotomine sandflies (Diptera: Psychodidae: Phlebotominae)

DNA amplification by the polymerase chain reaction (PCR) was applied in the investigation of the presence of Leishmania (Kinetoplastida: Trypanosomatidae) parasites in single phlebotomine sandflies. Three phlebotomine/parasite pairs were used: Lutzomyia longipalpis/Leishmania chagasi, Lutzomyia migonei/Leishmania amazonensis and Lutzomyia migonei/Leishmania braziliensis, all of them incriminated in the transmission of visceral or cutaneous leishmaniasis. DNA extraction was performed with whole insects, with no need of previous digestive tract dissection or pooling specimens. The presence of either mouse blood in the digestive tract of the sandflies or the digestive tract itself did not interfere in the PCR. Infection by as few as 10 Leishmania sp. per individual were sufficient for DNA amplification with genus-specific primers. Using primers for L. braziliensis and L. mexicana complexes, respectively, it was possible to discriminate between L. braziliensis and L. amazonensis in experimentally infected vectors (L. migonei).

Acidentes de Serviço em Profissionais de Saúde: Identificação, Representações e Comportamentos Face à Exposição Microbiológica Acidental

Este estudo de investigação teve subjacente a preocupação com a exposição microbiológica acidental nos profissionais de saúde, sabendo que os acidentes de trabalho por exposição microbiológica acidental constituem um dos principais riscos de transmissão ocupacional de infecções por contacto com sangue e outros fluidos corporais. Os agentes infecciosos mais frequentemente envolvidos neste tipo de acidente são os vírus da hepatite B, C e o vírus da imunodeficiência humana (VIH). Teve como objectivo identificar e caracterizar os acidentes de trabalho por exposição microbiológica acidental ocorridos nos profissionais de saúde de um Hospital Central da região de Lisboa durante os anos de 2002 a 2006 e conhecer as Representações e os Comportamentos dos profissionais de saúde aquando da ocorrência de uma exposição microbiológica acidental. Tratou-se de um estudo descritivo e exploratório, inserido numa abordagem quantitativa e qualitativa. Os participantes deste estudo foram os profissionais de saúde (médicos, enfermeiros e técnicos de diagnóstico e terapêutica) que tenham sofrido um acidente de trabalho com exposição microbiológica acidental do ano de 2002 até Julho do ano de 2007, tendo-se constituído uma amostra não probabilística de 20 participantes utilizando a técnica de amostragem por conveniência e que se disponibilizaram a participar no estudo após o Consentimento Informado. Para a realização do estudo optou-se por recorrer a um conjunto de métodos de colheita de dados, privilegiando a análise documental através do questionário epidemiológico de caracterização e análise dos acidentes de trabalho e do processo de saúde individual e da realização de uma entrevista semi-directiva no âmbito da qual se aplicou um questionário de caracterização sócio-demográfica, apoio social e actividades de tempos livres, aspectos relacionados com a percepção sobre os riscos a que se encontram expostos no ambiente hospitalar e com o circuito de notificação do acidente de serviço/trabalho. Elaborou – se um guião de entrevista semi-directiva de acordo com os objectivos da investigação. Optou-se por uma metodologia quantitativa no que diz respeito à análise dos acidentes de trabalho que envolveram exposição microbiológica durante o período em estudo e dos dados sócio-demográficos do questionário aplicado no âmbito da entrevista, através do programa informático pakage estatístico “Statistica/Program for Social Sciences-SPSS” para Windows (versão 12). Posteriormente optou-se por uma metodologia qualitativa no que concerne ao tratamento dos dados relativos às entrevistas efectuadas, que consistiu na análise de conteúdo temático das entrevistas. A análise dos resultados obtidos revelaram que os acidentes de trabalho ocasionados por material perfuro-cortante entre os profissionais de saúde são frequentes devido ao número elevado de manipulação destes instrumentos, principalmente de agulhas e apresentam prejuízos aos profissionais e à Instituição. Verifica-se que dos 305 acidentes notificados, a categoria profissional que tem o maior número de notificações é a dos enfermeiros com 142 acidentes no total dos anos representando 46,6%. A picada acidental é o tipo de acidente mais frequente com 205 acidentes o que representa 67% do total. O instrumento que esteve associado directamente com a ocorrência destes acidentes foram as agulhas (41,6%), nomeadamente as agulhas subcutâneas (18,8%), as agulhas intravenosas (9,4%), as agulhas intramusculares (5%), outras agulhas (8,4%). As lâminas de bisturi representam 13,1% dos acidentes ocorridos nos anos de 2002 a 2006. Estes acidentes podem oferecer riscos à saúde física e mental dos profissionais de saúde, com repercussões psicossociais, levando a mudanças nas relações sociais, familiares e de trabalho. Da forma como o indivíduo vivência e ultrapassa a situação e dos meios encontrados para lidar com o stress provocado pelo acidente, depende o seu bem-estar futuro na profissão e na Organização evitando o turnover. Todos os entrevistados manifestam a percepção que o maior risco na sua actividade é a relacionada com a exposição a agentes biológicos com ênfase na preocupação em adquirir uma doença infecto-contagiosa. A percepção do risco de contaminação através do sangue e fluidos corporais está relacionada com a ideia do VIH conduzir a uma doença fatal e incurável apesar de existir uma perspectiva de esperança e qualidade de vida devido aos avanços das terapêuticas actualmente. Os sentimentos e as emoções ocasionadas após a exposição microbiológica e manifestadas pelos participantes são a ansiedade, o medo, a angústia e a preocupação, raramente referem a frustração e a revolta por se sentirem traídos, daí a importância do apoio social que tiveram por parte da saúde ocupacional, da família e amigos, bem como dos colegas de trabalho, fundamental para ultrapassar um episódio crítico da sua vida. No entanto a representação que têm das doenças como o VIH/SIDA e das hepatites B e C, como podem ser prevenidas e o nível de controlo que sentem exercer sobre os factores de transmissão, reflectem a percepção de que as medidas preventivas podem reduzir o risco de contaminação. Uma das conclusões deste estudo prende-se com a necessidade de reformulação do circuito de notificação dos acidentes de trabalho, com o objectivo de diminuir o tempo e os vários constrangimentos durante o percurso. A análise dos dados referentes aos acidentes de serviço por exposição microbiológica, os relatórios de análise das causas, a selecção e avaliação dos instrumentos aplicados promovem a criação de uma cultura de segurança. Como medidas organizacionais, a prevenção pressupõe o treino e a formação dos profissionais de saúde nos procedimentos de prevenção da transmissão da infecção, o incentivo à notificação das exposições e o desenvolvimento de um sistema adequado de monitorização e gestão das exposições ocupacionais. Sendo que a prevenção destes acidentes passa essencialmente pela introdução de dispositivos médicos com sistemas de segurança, por práticas de trabalho seguras, e pela formação dos profissionais de saúde.

Estudo dos flebótomos (Diptera, Phlebotominae), vectores de Leishmania sp. No Concelho de Torres Novas, Portugal

Estudo dos flebótomos (Diptera, Phlebotominae), vectores de Leishmania sp. no Concelho de Torres Novas, Portugal. Sofia Isabel Martins Branco PALAVRAS-CHAVE: flebótomos, bioecologia, Leishmania, Torres Novas, Portugal. Os flebótomos são insectos vectores de vários agentes patogénicos, dos quais se destacam os protozoários do Género Leishmania. Em Portugal, as leishmanioses, canina e humana, são causadas por L. infantum, sendo o cão o principal reservatório e Phlebotomus perniciosus e P. ariasi os vectores comprovados do parasita. São conhecidos três focos de doença, mas casos de leishmaniose canina têm sido reportados em outras regiões nas quais se desconhecem as espécies flebotomínicas presentes e respectivas taxas de infecção. Neste trabalho, efectuou-se a primeira prospecção flebotomínica no Concelho de Torres Novas, Distrito de Santarém, localizado na região Centro de Portugal. Os principais objectivos foram determinar a fauna flebotomínica do Concelho, os aspectos bioecológicos, as taxas de infecção por Leishmania e os factores de risco para a transmissão vectorial. De Junho a Novembro de 2010, 275 biótopos foram prospectados com armadilhas CDC. As capturas foram realizadas em 91 localidades, nas 17 freguesias do Concelho, e incluíram habitats domésticos, peridomésticos e silváticos. Os exemplares capturados foram identificados morfologicamente, as fêmeas utilizadas para detecção molecular de DNA de Leishmania e identificação das refeições sanguíneas. Análises de regressão simples e múltipla foram utilizadas para avaliação dos factores de risco para a presença das várias espécies flebotomínicas. Testes não paramétricos foram usados para comparar densidades. Dos 1262 flebótomos capturados, quatro espécies foram assinaladas com as seguintes abundâncias relativas: P. perniciosus 73,69%, P. ariasi 8,16%, P. sergenti 6,58% e Sergentomyia minuta 11,57%. Em 82% das localidades prospectadas foi detectada pelo menos uma espécie flebotomínica e em 71,4% destas foi capturada pelo menos uma das espécies comprovadamente vectoras de L. infantum. P. perniciosus foi assinalado em todas as 17 freguesias do Concelho. Os factores de risco identificados foram: temperaturas elevadas e humidades relativas baixas, locais abrigados e ausência de vento forte, presença de pinheiros como vegetação dominante, biótopos peridomésticos, particularmente currais de ovelhas e coelheiras, ou na proximidade de ovelhas, aves de capoeira e ninhos com andorinhas. A taxa de infecção flebotomínica por L. infantum foi de 4% para P. ariasi e de 0,32% para o total de fêmeas capturadas. A maioria das fêmeas para as quais se identificou a origem da refeição sanguínea pertencia a P. perniciosus. Esta espécie apresentou um comportamento oportunista, alimentando-se numa grande variedade de hospedeiros vertebrados. A elevada abundância e distribuição das espécies vectoras, juntamente com a seroprevalência de Leishmania nos cães do Distrito (5-10%), e a captura de uma fêmea grávida de P. ariasi (infectante), sugerem que o Concelho de Torres Novas é um foco de leishmaniose no país. A maior abundância relativa de P. sergenti, comparando com prospecções realizadas noutras áreas da região Centro de Portugal, sugere que este potencial vector esteja a expandir-se para latitudes mais elevadas, aumentando o risco de introdução de L. tropica no território, por contacto com imigrantes ou viajantes infectados de áreas endémicas. A monitorização flebotomínica, e dos hospedeiros vertebrados, deverá ser continuada no Concelho para que medidas eficazes de controlo possam ser definidas e implementadas.

Normas de Actuação após Exposição Acidental a Produtos Biológicos Potencialmente Infectantes

Os autores apresentam as normas de actuação pós-exposição acidental a produtos biológicos (sangue ou fluídos) potencialmente infectados (com destaque para o VIH, AgHbS e VHC). No caso concreto de exposição ao VIH, a decisão para a recomendação da profilaxia pós-exposição deve ser tomada tendo em conta a natureza da exposição (ex: agulhas ou fluídos potencialmente infectados, em contacto com as mucosas) bem como a quantidade de sangue ou fluído envolvida na exposição. Atendendo ao aumento das resistências a um ou mais dos fármacos anti-retrovíricos recomendados na profilaxia pós-exposição (PPE), em Maio de 1997, um grupo de especialistas do CDC reviu as normas de PPE e aprovou novos esquemas terapêuticos que incluem os Inibidores das Proteases (Indinavir e Nelfinavir). Desta forma, para além do esquema básico de 4 semanas com dois fármacos (zidovudina e lamivudina) utilizado na maior parte dos casos de PPE, poder-se-á considerar, nos casos de alto risco de transmissão da infecção VIH ou suspeita de resistência a um ou mais anti-retrovíricos do esquema básico, a inclusão de um inibidor da protease. Apresenta-se um algoritmo que deverá servir de guia aos clínicos quando confrontados com a decisão de considerar a PPE aos trabalhadores de saúde, após exposição acidental a produtos potencialmente contaminados.

NEW PRIMERS FOR DETECTION OF Leishmania infantum USING POLYMERASE CHAIN REACTION

SUMMARY Leishmania infantum causes visceral leishmaniasis (VL) in the New World. The diagnosis of VL is confirmed by parasitological and serological tests, which are not always sensitive or specific. Our aim was to design new primers to perform a Polymerase Chain Reaction (PCR) for detecting L. infantum. Sequences of the minicircle kinetoplast DNA (kDNA) were obtained from GenBank, and the FLC2/RLC2 primers were designed. Samples of DNA from L. infantum, Leishmania amazonensis, Leishmania braziliensis, Leishmania guyanensis, Leishmania naiffi, Leishmania lainsoni, Leishmania panamensis, Leishmania major and Trypanosoma cruzi were used to standardize the PCR. PCR with FLC2/RLC2 primers amplified a fragment of 230 bp and the detection limit was 0.2 fg of L. infantum DNA. Of the parasite species assayed, only L. infantum DNA was amplified. After sequencing, the fragment was aligned to GenBank sequences, and showed (99%) homology with L. infantum. In the analysis of blood samples and lesion biopsy from a dog clinically suspected to have VL, the PCR detected DNA from L. infantum. In biopsy lesions from humans and dogs with cutaneous leishmaniasis, the PCR was negative. The PCR with FLC2/RLC2 primers showed high sensitivity and specificity, and constitutes a promising technique for the diagnosis of VL.

Infecção experimental de Calomys callosus (Rengger, 1830), (Cricetidae - Rodentia) a quatro espécies de parasitos

Neste trabalho foram estudados exemplares do roedor, Calomys callosus, nascidos em laboratório, a infecções experimentais com quatro parasitos: Plasmodium berghei, Leishmania mexicana amazonensis, Schistosoma mansoni e Hymenolepsis nana. A positividade das infecções foi de 80% para os três primeiros parasitos e 0 para H. nana. C. callosus é um roedor de excelente adaptação em laboratório e de fácil manuseio. Acredita-se que, de acordo com os resultados obtidos neste trabalho, este animal poderia ser um bom modelo experimental de laboratório para certos agentes patogênicos.

Attempts using cryotherapy to achieve more rapid healing in patients with cutaneous leishmaniasis due to L. braziliensis braziliensis

The use of cryotherapy as an adjunct to systemic antimonial therapy (Clucantime) was studied in 17 patients with a total of23 skin lesions of leishmaniasis in an area where L. braziliensis braziliensis is the species in circulation. Cryotherapy did not speed healing and has been discarded as an auxiliary therapeutic measure in our practice. However this technique may be suitable for species o/Leishmania causing more limited superficial lesions in man without the danger of metastasis.

Conceitos de uma população local a respeito da leishmaniose mucocutânea em uma área endêmica

Uma investigação a respeito do que a população local pensa sobre vários aspectos da leishmaniose mucocutânea foi realizada em Três Braços, Bahia, uma área de alta prevalência de infecção por Leishmania braziliensis braziliensis. Os resultados obtidos indicam que essa população tem um entendimento razoavelmente bom sobre alguns aspectos epidemiológicos e tratamento dessa doença, mas demonstram seu pouco conhecimento concernente à etiologia e prevenção. Esses dados poderão ser valiosos, no futuro, em um planejamento do controle de transmissão da doença nesta comunidade.

Ensaio terapêutico com glucantime em sagüis (Callithrix jacchus) infectados com uma cepa de Leishmania donovani aparentemente resistente ao tratamento

Os autores relatam o resultado de um ensaio terapêutico em sagüis com uma cepa de Leishmania donovani isolada de um caso humano fatal de calazar, clinicamente resistente aos antimoniais (Glucantime e Pentostam), Anfotericina B ePentamidina. Os testes cutâneos realizados no paciente para avaliação da imunidade celular foram negativos à exceção do DNCB a 2%. Quatro sangüis adultos (Callithrix jacchus) foram inoculados por via intraperitoneal com uma suspensão deformas amastigotas de L. donovani. Duzentos e dez dias após, todos os animais mostravam formas amastigotas do protozoário, evidenciadas através de punção hepática por aspiração. Iniciou-se então um esquema terapêutico com glucantime (28 mgSb v/kg/dia) em três séries de 10 dias com cinco dias de intervalo entre elas em três dosprimatas,ficando o quarto animal como controle. Nos três animais tratados houve curaparasitológica da doença, o mesmo não ocorrehdo com o controle. O fato de a amostra de L. donovani ter sido, no paciente, resistente aos vários tratamentos e ter sido sensível em modelo experimental à terapêutica com glucantime, sugere a possibilidade de que fatores imunológicos do paciente possam ter contribuído para a evolução fatal da doença.

Observações sobre calazar em Jacobina, Bahia. VI - Investigações sobre reservatórios silvestres e comensais

Durante os anos de 1982 a 1986, a investigação sobre mamíferos comensais e silvestres, da periferia da cidade de Jacobina, Bahia, mostrou, ao lado do escasso número de exemplares, uma reduzida variedade específica dessa fauna. Capturou-se apenas 11 espécies, entre as quais, predominou o Didelphis albiventris, que abrangeu 44% dos 213 espécimens capturados. Entre os 193 com exames já concluídos, 84 eram exemplares de D. albiventris e 2 estavam infectados pela Leishmania donovani senso lato, 1 por L. mexicana amazonensis, 1 por L. braziliensis, subespécie e 3 por Trypanosoma cruzi Também foram observadas formas suspeitas de serem amastigotas de leishmanics, nos esfregaços de órgãos de 3 exemplares de Dasyprocta aguti, 1 Cercomys cunicularius - e 1 Oryzomys eliurus. 0 restante dos exemplares, inclusive 14 de Lycalopex vetulus, estava negativo para flagelados. Apesar de reforçado por outros indicadores epidemiológicos, como a predominância específica, a freqüência domiciliar, a atratividade para a vetora Lutzomyia longipalpis, e a concomitância com casos humanos nos mesmos locais, o índice de 2,3% de infecção natural do Didelphis albiventris, não autoriza a conclusão definitiva de ser o marsupial o mais importante reservatório natural da leishmaniose visceral em Jacobina.

Sobre a sensibilidade da cultura de leucócitos circulantes na detecção de Leishmania no sangue periférico de pacientes com leishmaniose tegumentar

Foi investigada a presença de Leishmania, através da cultura de leucócitos circulantes, no sangue periférico de 60 pacientes portadores de leishmaniose tegumentar americana, nas suas diferentes formas clínicas, assim como nas principais fases evolutivas da doença. Biópsias de lesões cutâneas e/ou de mucosa desses pacientes foram obtidas com a finalidade de isolar e caracterizar os parasitas, através da técnica de anticorpos monoclonais. Dos 60 pacientes examinados, foram isoladas 40 amostras de Leishmania das lesões biopsiadas, sendo 5 de Leishmania (V.) brasiliensis, 3 de L. (V.) guyanensis, 1 de L. (V.) lainsoni, 13 de L. (L.) amazonensis e 18 não puderam ser caracterizados a nível específico, porém, reagiram com anticorpos monoclonais do grupo braziliensis. Quanto àpesquisa através das culturas de leucócitos circulantes, esta revelou resultados completamente negativos. Com base nesses achados, os autores concluíram ser pouco consistente atribuir valor à cultura de leucócitos para o diagnóstico da leishmaniose tegumentar.

Classificação da infecção chagásica no homem

A classificação da infecção pelo Trypanosoma cruzi varia de acordo com diferentes critérios. Se considerarmos o mecanismo de transmissão do parasita ela pode ser por triatomineos, transfusão de sangue, congênita, acidental em laboratório, aleitamento, transplante de órgãos e surtos epidêmicos de provável transmissão oral. Esta classificação é útil do ponto de vista epidemiológico ou para o controle da doença. A medida que vamos conhecendo melhor as populações de T. cruzi toma-se possível agrupá-las em tipos ou raças, de acordo com sua composição antigênica, seus perfis enzimáticos, comportamento nas infecções experimentais, suscetibilidade a drogas e outros parâmetros36. Tais estudos procuram estabelecer relações epidemiológicas, clínicas e geográficas. O seguinte exemplo ilustra a utilidade da classificação da infecção pelo agente etiológico. De acordo com as variações enzimáticas, Miles e cols31 verificaram que nos chagásicos do Centro e Leste do Brasil predominam as raças de T. cruzi com zimodemas 2 (Z2), que não são encontradas na região amazônica e na Venezuela, onde existe o T. cruzi Z1 e mais raramente o Z3.

Immunocytochemical identification of leishmania and Trypanosoma cruzi amastigotes in situ with homologous and heterologous polyclonal antibodies

The unlabelled antibody peroxidase-antiperoxidase method was used to study the immunocytochemical properties of Leishmania and Trypanosoma cruzi amastigotes in situ after tissues had been submitted to different fixation procedures. Antisera were obtained from rabbits chronically infected with different strains of T. cruzi or immunized with L. mexicana amazonensis and L. braziliensis guyanensis, and were applied on 5 µm thick sections. T. cruzi antigens were well stained by the three anti-T. cruzi sera and the two anti-heis.hmama.sera at optimum dilution between 1:1,000 and 1:2,000, regardless the parasite strain. Differently, the leishmanial antigens were revealed by Leishmania sera only at low dilutions (between 1:60 -1:160), whereas the anti-T. cruzi sera, at these low dilutions, gave rather weak stainings. Although there is no clear explanation for this immunocytochemical "reverse-monodirectional" cross-reactivity between Leishmania and T. cruzi, the present results show that polyclonal antibodies agains Leishmania species, when used for immunocytochemical detection of these parasites in situ, react more strongly with T. cruzi amastigotes than with the homologous amastigotes.

Histoplasmose em região de palato duro simulando lesão causada por Leishmania

Os autores relatam um caso de histoplasmose em indivíduo com suspeita clínica de leishmaniose mucosa. A infecção por Leishmania foi descartada, pela negatividade do teste de Montenegro e ausência do parasita. O diagnóstico de histoplasmose foi confirmado pelo encontro do fungo na lesão e o seu isolamento em Ágar-Sabouraud. O tratamento do paciente com anfotericina B resultou na remissão da lesão.

Risco de introdução de novas espécies de Leishmania na Região do Algarve

As leishmanioses são doenças parasitárias causadas por protozoários do género Leishmania, transmitidas pela picada de flebótomos fêmeas e que causam uma elevada morbilidade e mortalidade em África, América Latina, Ásia, e na Região Mediterrânica. A vigilância da prevalência das leishmanias e dos respectivos vectores, nas regiões endémicas e envolventes, são cruciais para prever o risco de introdução e disseminação de novas espécies de Leishmania que poderão dar origem a novos focos de doença(s). A monitorização da infecção por Leishmania nos flebótomos é importante para a compreensão da eco-epidemiologia e avaliação de programas de controlo. Por outro lado, a transmissão de Leishmania pode envolver um elevado número de hospedeiros vertebrados que podem ser identificados através da análise das refeições hemáticas dos vectores. A Região do Algarve é considerada um foco endémico de leishmaniose(s), humana e canina, desde a década de 1980. O principal objectivo deste estudo foi actualizar a distribuição, a abundância relativa, a densidade e outros aspectos vectoriais das espécies flebotomínicas na Região Algarvia para uma possível aplicação na vigilância epidemiológica. De Maio a Novembro de 2007, foram capturados 1595 flebótomos, de ambos os sexos, através de armadilhas luminosas tipo CDC, em 175 biótopos. Foram identificadas quatro espécies flebotomínicas: Phlebotomus perniciosus, P. ariasi, P. sergenti e Sergentomyia minuta. Após identificação realizaram-se PCRs com alvo no (i) kDNA e na região ITS-1 para detecção da presença de DNA de Leishmania nos flebótomos e (ii) gene do citocromo B mitocondrial para análise das refeições hemáticas. A presença de uma fêmea de P. perniciosus infectada com L. infantum (taxa de infecção total de 0,12%) demonstrou que o Algarve continua a ser um foco de leishmaniose. A presença de P. sergenti e P. papatasi (esta última, encontrada em estudos anteriores) poderão constituir indicadores de risco de introdução/disseminação de L. tropica e L. major devido à mobilidade de turistas e imigrantes (e outros) de áreas endémicas para esta região. A realização, pela primeira vez em Portugal, de uma técnica de biologia molecular para estudo das preferências hemáticas, demonstrou ser uma ferramenta útil, que no futuro poderá eventualmente contribuir para verificar se os vectores apresentam capacidade de adaptação a novos hospedeiros vertebrados.