Destruction of lymphoid organ architecture and hepatitis caused by CD4 T cells.

Immune responses have the important function of host defense and protection against pathogens. However, the immune response also causes inflammation and host tissue injury, termed immunopathology. For example, hepatitis B and C virus infection in humans cause immunopathological sequel with destruction of liver cells by the host's own immune response. Similarly, after infection with lymphocytic choriomeningitis virus (LCMV) in mice, the adaptive immune response causes liver cell damage, choriomeningitis and destruction of lymphoid organ architecture. The immunopathological sequel during LCMV infection has been attributed to cytotoxic CD8(+) T cells. However, we now show that during LCMV infection CD4(+) T cells selectively induced the destruction of splenic marginal zone and caused liver cell damage with elevated serum alanin-transferase (ALT) levels. The destruction of the splenic marginal zone by CD4(+) T cells included the reduction of marginal zone B cells, marginal zone macrophages and marginal zone metallophilic macrophages. Functionally, this resulted in an impaired production of neutralizing antibodies against LCMV. Furthermore, CD4(+) T cells reduced B cells with an IgM(high)IgD(low) phenotype (transitional stage 1 and 2, marginal zone B cells), whereas other B cell subtypes such as follicular type 1 and 2 and germinal center/memory B cells were not affected. Adoptive transfer of CD4(+) T cells lacking different important effector cytokines and cytolytic pathways such as IFNγ, TNFα, perforin and Fas-FasL interaction did reveal that these cytolytic pathways are redundant in the induction of immunopathological sequel in spleen. In conclusion, our results define an important role of CD4(+) T cells in the induction of immunopathology in liver and spleen. This includes the CD4(+) T cell mediated destruction of the splenic marginal zone with consecutively impaired protective neutralizing antibody responses.

Anchoring of both PKA and 14-3-3 inhibits the Rho-GEF activity of the AKAP-Lbc signaling complex.

A-kinase anchoring proteins (AKAPs) target the cAMP-regulated protein kinase (PKA) to its physiological substrates. We recently identified a novel anchoring protein, called AKAP-Lbc, which functions as a PKA-targeting protein as well as a guanine nucleotide exchange factor (GEF) for RhoA. We demonstrated that AKAP-Lbc Rho-GEF activity is stimulated by the alpha subunit of the heterotrimeric G protein G12. Here, we identified 14-3-3 as a novel regulatory protein interacting with AKAP-Lbc. Elevation of the cellular concentration of cAMP activates the PKA holoenzyme anchored to AKAP-Lbc, which phosphorylates the anchoring protein on the serine 1565. This phosphorylation event induces the recruitment of 14-3-3, which inhibits the Rho-GEF activity of AKAP-Lbc. AKAP-Lbc mutants that fail to interact with PKA or with 14-3-3 show a higher basal Rho-GEF activity as compared to the wild-type protein. This suggests that, under basal conditions, 14-3-3 maintains AKAP-Lbc in an inactive state. Therefore, while it is known that AKAP-Lbc activity can be stimulated by Galpha12, in this study we demonstrated that it is inhibited by the anchoring of both PKA and 14-3-3.

Distinct OGT-Binding Sites Promote HCF-1 Cleavage.

Human HCF-1 (also referred to as HCFC-1) is a transcriptional co-regulator that undergoes a complex maturation process involving extensive O-GlcNAcylation and site-specific proteolysis. HCF-1 proteolysis results in two active, noncovalently associated HCF-1N and HCF-1C subunits that regulate distinct phases of the cell-division cycle. HCF-1 O-GlcNAcylation and site-specific proteolysis are both catalyzed by O-GlcNAc transferase (OGT), which thus displays an unusual dual enzymatic activity. OGT cleaves HCF-1 at six highly conserved 26 amino acid repeat sequences called HCF-1PRO repeats. Here we characterize the substrate requirements for OGT cleavage of HCF-1. We show that the HCF-1PRO-repeat cleavage signal possesses particular OGT-binding properties. The glutamate residue at the cleavage site that is intimately involved in the cleavage reaction specifically inhibits association with OGT and its bound cofactor UDP-GlcNAc. Further, we identify a novel OGT-binding sequence nearby the first HCF-1PRO-repeat cleavage signal that enhances cleavage. These results demonstrate that distinct OGT-binding sites in HCF-1 promote proteolysis, and provide novel insights into the mechanism of this unusual protease activity.

Combinative effects of β-Lapachone and APO866 on pancreatic cancer cell death through reactive oxygen species production and PARP-1 activation.

UNLABELLED: Pancreatic cancer (PC) is one of the most lethal human malignancies and a major health problem. Patients diagnosed with PC and treated with conventional approaches have an overall 5-year survival rate of less than 5%. Novel strategies are needed to treat this disease. Herein, we propose a combinatorial strategy that targets two unrelated metabolic enzymes overexpressed in PC cells: NAD(P)H: quinone oxidoreductase-1 (NQO1) and nicotinamide phosphoribosyl transferase (NAMPT) using β-lapachone (BL) and APO866, respectively. We show that BL tremendously enhances the antitumor activity of APO866 on various PC cell lines without affecting normal cells, in a PARP-1 dependent manner. The chemopotentiation of APO866 with BL was characterized by the following: (i) nicotinamide adenine dinucleotide (NAD) depletion; (ii) catalase (CAT) degradation; (iii) excessive H2O2 production; (iv) dramatic drop of mitochondrial membrane potential (MMP); and finally (v) autophagic-associated cell death. H2O2 production, loss of MMP and cell death (but not NAD depletion) were abrogated by exogenous supplementation with CAT or pharmacological or genetic inhibition of PARP-1. Our data demonstrates that the combination of a non-lethal dose of BL and low dose of APO866 optimizes significantly cell death on various PC lines over both compounds given separately and open new and promising combination in PC therapy.

Mechanisms of OGT-mediated HCF-1 protein maturation

Post-translational protein modifications are crucial for many fundamental cellular and extracellular processes and greatly contribute to the complexity of organisms. Human HCF-1 is a transcriptional co-regulator that undergoes complex protein maturation involving reversible and irreversible post-translational modifications. Upon synthesis as a large precursor protein, HCF-1 undergoes extensive reversible glycosylation with β-N-acetylglucosamine giving rise to O-linked-β-N-acetylglucosamine (O-GlcNAc) modified serines and threonines. HCF-1 also undergoes irreversible site-specific proteolysis, which is important for one of HCF-1's major functions - the regulation of the cell-division cycle. HCF-1 O-GlcNAcylation and site-specific proteolysis are both catalyzed by a single enzyme with an unusual dual enzymatic activity, the O-GlcNAc transferase (OGT). HCF-1 is cleaved by OGT at any of six highly conserved 26 amino acid repeated sequences (HCF-1PRO repeats), but the mechanisms and the substrate requirements for OGT-mediated cleavage are not understood. In the present work, I characterized substrate requirements for OGT-mediated cleavage and O-GlcNAcylation of HCF-1. I identified key elements within the HCF-1PRO-repeat sequence that are important for proteolysis. Remarkably, an invariant single amino acid side-chain within the HCF-1PRO-repeat sequence displays particular OGT-binding properties and is essential for proteolysis. Additionally, I characterized substrate requirements for proteolysis outside of the HCF-1PRO repeat and identified a novel, highly O-GlcNAcylated OGT-binding sequence that enhances cleavage of the first HCF-1PRO repeat. These results link OGT association and its O-GlcNAcylation activities to HCF-1PRO-repeat proteolysis.

On the use of an appropriate TdT-mediated dUTP-biotin nick end labeling assay to identify apoptotic cells.

Apoptosis is an essential cellular mechanism involved in many processes such as embryogenesis, metamorphosis, and tissue homeostasis. DNA fragmentation is one of the key markers of this form of cell death. DNA fragmentation is executed by endogenous endonucleases such as caspase-activated DNase (CAD) in caspase-dependent apoptosis. The TUNEL (TdT-mediated dUTP-biotin nick end labeling) technique is the most widely used method to identify apoptotic cells in a tissue or culture and to assess drug toxicity. It is based on the detection of 3'-OH termini that are labeled with dUTP by the terminal deoxynucleotidyl transferase. Although the test is very reliable and sensitive in caspase-dependent apoptosis, it is completely useless when cell death is mediated by pathways involving DNA degradation that generates 3'-P ends as in the LEI/L-DNase II pathway. Here, we propose a modification in the TUNEL protocol consisting of a dephosphorylation step prior to the TUNEL labeling. This allows the detection of both types of DNA breaks induced during apoptosis caspase-dependent and independent pathways, avoiding underestimating the cell death induced by the treatment of interest.

Isolamento e atividades biológicas de produtos naturais das esponjas monanchora arbuscula, aplysina sp. petromica ciocalyptoides e topsentia ophiraphidites, da ascídia didemnum ligulum e do octocoral carijoa riisei

The investigation of extracts from six species of marine invertebrates yielded one new and several known natural products. Isoptilocaulin from the sponge Monanchora aff. arbuscula displayed antimicrobial activity at 1.3 mg/mL against an oxacillin-resistant strain of Staphylococcus aureus. Five inactive known dibromotyrosine derivatives, 2 6, were isolated from a new species of marine sponge, Aplysina sp. The sponges Petromica ciocalyptoides and Topsentia ophiraphidites yielded the known halistanol sulfate A (7) as an inhibitor of the antileishmanial target adenosine phosphoribosyl transferase. The ascidian Didemnum ligulum yielded asterubin (10) and the new N,N-dimethyl-O-methylethanolamine (11). The octocoral Carijoa riisei yielded the known 18-acetoxypregna-1,4,20-trien-3-one (12), which displayed cytotoxic activity against the cancer cell lines SF295, MDA-MB435, HCT8 and HL60.

Structural studies on enzymes of biotechnological and biomedical interest

Structural studies of proteins aim at elucidating the atomic details of molecular interactions in biological processes of living organisms. These studies are particularly important in understanding structure, function and evolution of proteins and in defining their roles in complex biological settings. Furthermore, structural studies can be used for the development of novel properties in biomolecules of environmental, industrial and medical importance. X-ray crystallography is an invaluable tool to obtain accurate and precise information about the structure of proteins at the atomic level. Glutathione transferases (GSTs) are amongst the most versatile enzymes in nature. They are able to catalyze a wide variety of conjugation reactions between glutathione (GSH) and non-polar components containing an electrophilic carbon, nitrogen or sulphur atom. Plant GSTs from the Tau class (a poorly characterized class) play an important role in the detoxification of xenobiotics and stress tolerance. Structural studies were performed on a Tau class fluorodifen-inducible glutathione transferase from Glycine max (GmGSTU4-4) complexed with GSH (2.7 Å) and a product analogue Nb-GSH (1.7 Å). The three-dimensional structure of the GmGSTU4-4-GSH complex revealed that GSH binds in different conformations in the two subunits of the dimer: in an ionized form in one subunit and a non-ionized form in the second subunit. Only the ionized form of the substrate may lead to the formation of a catalytically competent complex. Structural comparison between the GSH and Nb-GSH bound complexes revealed significant differences with respect to the hydrogen-bonding, electrostatic interaction pattern, the upper part of -helix H4 and the C-terminus of the enzyme. These differences indicate an intrasubunit modulation between the G-and Hsites suggesting an induced-fit mechanism of xenobiotic substrate binding. A novel binding site on the surface of the enzyme was also revealed. Bacterial type-II L-asparaginases are used in the treatment of haematopoietic diseases such as acute lymphoblastic leukaemia (ALL) and lymphomas due to their ability to catalyze the conversion of L-asparagine to L-aspartate and ammonia. Escherichia coli and Erwinia chrysanthemi asparaginases are employed for the treatment of ALL for over 30 years. However, serious side-effects affecting the liver and pancreas have been observed due to the intrinsic glutaminase activity of the administered enzymes. Structural studies on Helicobacter pylori L-asparaginase (HpA) were carried out in an effort to discover novel L-asparaginases with potential chemotherapeutic utility in ALL treatment. Detailed analysis of the active site geometry revealed structurally significant differences between HpA and other Lasparaginases that may be important for the biological activities of the enzyme and could be further exploited in protein engineering efforts.

Potencial de Cajanus cajan e Crotalaria spectabilis parafitorremediação: absorção de arsênio e respostas antioxidativas

Neste estudo, avaliaram-se os efeitos tóxicos do arsênio (As) sobre o crescimento e atividade de enzimas antioxidativas dismutase do superóxido (SOD), catalase (CAT), peroxidases (POX), peroxidase do ascorbato peroxidase (APX) e glutationa redutase (GR) em plantas de Cajanus cajan e Crotalaria spectabili. Plantas das duas espécies foram expostas a diferentes concentrações de As, em solução nutritiva de Hoagland, pH 6,5. A taxa de crescimento relativo (TCR) das duas espécies reduziu-se com o aumento da concentração de As na solução nutritiva, sendo de forma mais intensa em C. cajan. A concentração de As na solução capaz de reduzir em 50% a TCR de C. cajan foi de 0,93 mg L-1, enquanto em C. spectabilis foi de 4,80 mg L-1. As duas espécies apresentaram reduzida translocação de As para a parte aérea, sendo em raízes de C. spectabilis observada a maior concentração desse elemento. C. cajan exposto ao As teve as atividades das enzimas CAT, POX e APX reduzidas, ao contrário do que ocorreu em C. spectabilis. Esta espécie, quando submetida ao As, apresentou incremento na atividade de todas as enzimas avaliadas. A maior tolerância ao As observada em C. spectabilis pode estar relacionada à maior capacidade em reter o As nas raízes e à indução das enzimas SOD, CAT, POX, APX e GR. Dessa forma, C. spectabilis é uma espécie com potencial para utilização em programas de revegetação de áreas contaminadas com As.

N-acetilcisteína diminui a congestão hepática na lesão de isquemia e reperfusão: estudo experimental

OBJETIVOS: A isquemia tem sido utilizada na cirurgia hepática desde o início do século. Embora possibilite a diminuição da perda sangüínea durante as ressecções e a manutenção do órgão à espera de um transplante, a ausência de perfusão traz como conseqüência um dano ao órgão, que se amplifica por ocasião da sua reoxigenação. A N-Acetilcisteína é uma droga capaz de repor os estoques celulares de glutationa, um antioxidante fundamental no controle das lesões resultantes do restabelecimento da perfusão sangüínea, esperando-se dessa forma que diminua a lesão acima descrita. Com o propósito de avaliar a capacidade da N-Acetilcisteína reduzir o dano hepático, utilizou-se um modelo murino de isquemia e reperfusão normotérmica. MÉTODO: Foram utilizados vinte ratos Wistar fêmeas, divididos em dois grupos. No grupo tratado, 400mg/kg de N-Acetilcisteína foram administrados pela via intravenosa, 15 minutos antes do clampeamento do pedículo do lobo esquerdo por 90 minutos. No grupo controle foi administrado o volume equivalente de solução fisiológica. Foi estabelecido um período de quatro horas de reperfusão, após o qual os animais foram sacrificados para a realização de análise histopatológica do lobo esquerdo com coloração de Hematoxilina-Eosina. A lesão tecidual foi quantificada quanto à presença de congestão, esteatose e necrose. RESULTADOS: O estudo evidenciou a capacidade de a N-Acetilcisteína diminuir significativamente a congestão. Não houve diferenças quanto à presença de esteatose e necrose. CONCLUSÃO: Os resultados obtidos permitem-nos concluir que o uso prévio da N-Acetilcisteína nos processos de isquemia e reperfusão, em normotermia, é capaz de diminuir a congestão hepática. A N-Acetilcisteína não diminui a presença de esteatose e necrose.

Avaliação da lesão isquêmica normotérmica do fígado: papel da oclusão do ducto biliar principal e da N-acetilcisteína

OBJETIVO: Estudar o efeito da N-acetilcisteína (NAC) na isquemia hepática. MÉTODO: Trinta e oito ratos machos EPM-1 Wistar foram distribuídos em quatro grupos. Nos Grupos 1 e 2 foi realizado 30 min de clampeamento do hilo hepático, e nos Grupos 3 e 4 os animais foram submetidos a 30 minutos de isquemia sem clampleamento do ducto biliar. Os animais dos Grupos 2 e 4 receberam 150mg.Kg-1 de NAC, endovenoso, 15 minutos antes do procedimento. Colheu-se sangue antes do procedimento e após o clampeamento do pedículo para a dosagem enzimática. Amostras de fígado foram coletadas para dosagem de glutationa, microscopia óptica e eletrônica. No estudo estatístico aplicaram-se testes não paramétricos, p < 0,05. RESULTADOS: O aumento das enzimas foi menor quando se administrou NAC, sendo semelhante na ausência do clampeamento da via biliar. À microscopia óptica houve diferença significante dos grupos S/NAC X C/NAC, mostrando que o grupo C/NAC manteve a arquitetura do parênquima durante a isquemia, independente do clampeamento do ducto biliar. Na microscopia eletrônica os grupos C/NAC e os sem clampeamento do ducto biliar apresentaram arquitetura celular preservada. A NAC não alterou a relação de glutationa reduzida/ glutationa oxidada (GSH/GSSG). CONCLUSÕES: A NAC é capaz de proteger o parênquima hepático durante a isquemia normotérmica e propõe-se que o mecanismo seja por reação direta da NAC com o óxido nítrico (NO).

Efeitos do dimetilsulfóxido no estresse oxidativo e na regeneração hepática pós-hepatectomia em ratos

OBJETIVO: avaliar a influência do DMSO sobre o estresse oxidativo e a regeneração hepática pós-HP via um modelo experimental. MÉTODO: 36 ratos Wistar machos jovens foram aleatoriamente distribuídos em dois Grupos de 18 animais: parcialmente hepatectomizados com infusão diária de solução salina (controle) e parcialmente hepatectomizados com aporte diário intraperitoneal de DMSO, todos por duas semanas. Nos tempos 36h (T1), 168h (T2) e 336h (T3) pós-HP, glutationa (GSH) foi medida no plasma e no tecido hepático, enquanto glicose e bilirrubina total foram aquilatados no sangue. A massa do fígado residual, nos mesmos tempos, foi o parâmetro utilizado para estimar a evolução da regeneração do fígado. RESULTADOS: DMSO baixou os níveis de GSH hepático e sangüíneo mas não interferiu na evolução da massa em regeneração. CONCLUSÃO: DMSO inibiu o estresse oxidativo pós-HP mas não mostrou alterações significantes na regeneração hepática em ratos.

O estresse oxidativo na regeneração hepática em ratos

OBJETIVO: Investigar o estresse oxidativo durante a regeneração hepática em ratos submetidos à hepatectomia (HP) e, ao mesmo tempo, avaliar a função hepática enquanto em regeneração. MÉTODO: 36 ratos Wistar machos jovens foram aleatoriamente distribuídos em dois grupos de 18 animais: submetidos somente à laparotomia (controle, Grupo G1) e parcialmente hepatectomizados (experimento, Grupo G2). Nos tempos 36h (T1), 168h (T2) e 336h (T3) pós-HP, GSH foi medida no plasma e no tecido hepático, enquanto Gli e BT foram aquilatados no sangue. A massa do fígado residual foi utilizada para estimar a evolução da regeneração hepática. RESULTADOS: Houve diferença estatisticamente significativa no crescimento dos lobos residuais nos grupos controle e experimento. GSH hepático e plasmático se mostraram significantemente maior nos animais parcialmente hepatectomizados.,em todos os tempos. Hiperglicemia estatisticamente significativa ocorreu nos ratos pós-HP nos tempos T2 e T3. A BT não apresentou qualquer alteração entre os grupos. CONCLUSÃO: Durante a regeneração hepática pós-HP em ratos há um aumento do estresse oxidativo e o fígado residual permanece apto na manutenção da homeostase orgânica.

Efeitos dos ácidos graxos sobre a regeneração hepática em ratos

OBJETIVO: Estudar os efeitos dos ácidos graxos poli-insaturados (PUFA) ômega-3 e ômega-6 no estresse oxidativo e na regeneração hepática em ratos submetidos à hepatectomia parcial à 70% (HP, hepatectomia a 70%, hepatectomia parcial à Higgins-Anderson). MÉTODOS: 72 ratos Wistar machos jovens foram aleatoriamente distribuídos em quatro grupos de mesmo tamanho: controle, parcialmente hepatectomizados, e parcialmente hepatectomizados com aporte diário intraperitoneal, por duas semanas, de ou ômega-3 ou ômega-6. Nos tempos 36h (T1), 168h (T2) e 336h (T3) pós-HP, substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS) e glutationa reduzida (GSH) foram medidos no plasma e no tecido hepático, enquanto glicose e bilirrubina total foram aquilatados no sangue. A massa do fígado residual, nos mesmos tempos, foi o parâmetro utilizado para estimar a evolução da regeneração hepática. RESULTADOS: PUFA ômega-3 inibiu a regeneração hepática e induziu redução na concentração de GSH hepático sete dias pós-HP. PUFA ômega-6, ao contrário, não mostrou efeito inibitório sobre a regeneração. Houve aumento da peroxidação lipídica tanto no sangue como no fígado com a administração de ômega-6. CONCLUSÃO: PUFA ômega-3 retardou a regeneração hepática pós-HP provavelmente por inibição do estresse oxidativo. PUFA ômega-6 aumentou as concentrações de TBARS no sangue e no fígado mas não alterou a evolução do processo regenerativo hepático.

Derivação gástrica em Y-de-Roux e a atividade inflamatória do tecido adiposo

OBJETIVO: Avaliar os indicadores de estresse oxidativo e marcadores inflamatórios em obesos antes e depois da gastroplastia vertical com bandagem em Y-de-Roux. MÉTODOS: Vinte obesos classe III foram submetidos à gastroplastia vertical com bandagem em Y-de-Roux, sendo sete homens e 13 mulheres, com idade média de 39 anos e 20 indivíduos não obesos, nove homens e 11 mulheres, média de idade de 38 anos. Foram determinados os níveis de malondialdeído no plasma, índice de estresse, capacidade antioxidante total, catalase e glutationa reduzida e oxidada, e marcadores inflamatórios (proteína C reativa e á-1 glicoproteína ácida). No grupo obeso, estes parâmetros foram determinados antes e 2, 6 e 12 meses após a gastroplastia vertical com bandagem em Y-de-Roux. RESULTADOS: No pré-operatório, o grupo obeso apresentou níveis elevados de marcadores inflamatórios, de estresse oxidativo (níveis de malondialdeído e índice de estresse) e menores níveis de indicadores de defesa antioxidante em relação ao grupo controle. O emagrecimento foi acompanhado de redução progressiva do níveis de malondialdeído e do índice de estresse. Foi observado aumento da concentração de glutationa reduzida e da capacidade antioxidante total e redução dos níveis de marcadores inflamatórios. CONCLUSÃO: A redução do peso melhora o estado inflamatório e os níveis de estresse oxidativo.